CN114288315B - 一种包含ccp110抑制剂的药物组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种包含CCP110抑制剂的药物组合物。本发明充分揭示了CCP110在癌症尤其是子宫内膜癌细胞中的作用，发现CCP110在子宫内膜癌患者的肿瘤样本中明显高表达，且与病人生存预后密切相关，阐明了CCP110调控子宫内膜癌的新机制，找到抑制子宫内膜癌的关键靶点。本发明对CCP110在子宫内膜癌发生、发展过程中的具体机制进行了深入研究，明确了CCP110对子宫内膜癌细胞凋亡、增殖及迁移和侵袭能力的影响，通过抑制CCP110能够有效下调细胞内CCP110蛋白表达水平，显著抑制细胞的生长增殖活性，降低其迁移及侵袭的能力。本发明对于子宫内膜癌的发生发展机制进行了全新的阐明，对于后期相关药物开发以及临床诊断和治疗提供了全新的思路，具有极大的社会意义及市场前景。

Description

一种包含CCP110抑制剂的药物组合物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种包含CCP110抑制剂的药物组合物及其应用，特别是涉及一种包含CCP110抑制剂的用于预防和/或治疗子宫内膜癌的药物组合物及其应用。

背景技术

子宫内膜癌（endometrial carcinoma，EC）是绝经期及围绝经期女性常见的生殖系统恶性肿瘤，位居第二位，在发达国家女性恶性肿瘤中占据第四位。近年来，EC新发病例人数及死亡人数成倍增加，威胁着全世界妇女的健康。中国国家癌症中心统计分析结果显示，随着人们生活模式的改变、饮食结构的调整以及激素类食品药品的无意识暴露，子宫内膜癌的发病率呈逐年上升且发病年龄呈年轻化趋势，严重影响了老年妇女的健康寿命及育龄期妇女的生殖健康，给家庭及社会带来中大的影响。

子宫内膜癌的发生发展是环境因素和遗传变异相互作用的结果，涉及多种基因和转录因子的差异性表达、细胞信号转导通路调节异常以及细胞微环境稳态失衡等一系列因素，不同的病理改变和分子特征决定了EC患者的风险水平和预后情况。目前为止，调控子宫内膜癌发生发展以及转移的机制仍未完全阐明。明确子宫内膜癌发生发展的分子机制对于寻找可治疗子宫内膜癌的关键靶标至关重要。

子宫内膜癌细胞经常表现为中心体扩增，每个细胞含多个中心体，这也是其他癌细胞的特征。中心体是一种细胞器，作为细胞的主要微管组织中心。中心体扩增通过诱导染色体错误分离和微管细胞骨架的调节促进肿瘤生长，导致恶性细胞的定向迁移和侵袭增强。中心体扩增具有细胞骨架优势，可增强细胞极化、高尔基体依赖性囊泡运输和基质侵袭。

CCP110（亦称：中心丝卷曲螺旋蛋白110）是一种进化保守的中心体蛋白，对中心体功能很重要，控制细胞迁移。CCP110过表达导致中心体扩增并增加细胞的侵袭性表型。现有技术中关于CCP110与癌症发生发展的关系尚不明确，而对于CCP110在癌症尤其是子宫内膜癌的预防、治疗以及预后过程中的相关作用及影响更是少有研究，临床治疗缺乏有效的治疗手段。因此，阐明子宫内膜癌发生发展的分子机制，寻找可治疗子宫内膜癌的关键靶标及药物至关重要。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中所存在的癌症尤其是子宫内膜癌发生发展及转移的分子机制不够明确、缺乏有效的治疗手段的技术问题，从而针对CCP110表达水平与子宫内膜癌的关系进行了研究，明确CCP110对子宫内膜癌发生发展的影响，揭示CCP110调控子宫内膜癌的新机制，找到抑制子宫内膜癌的关键靶点，为了解子宫内膜癌的发病机制以及为临床治疗和药物开发提供切实的实验证据和科学依据。

为了解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案得以实现的。

本发明第一方面提供了一种用于预防和/或治疗癌症的药物组合物，包括CCP110抑制剂。

作为优选地，所述癌症选自肺癌、肾癌、肠癌、胃癌、淋巴癌、肝癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌中的一种或多种；最优选地，所述癌症选自子宫内膜癌。

作为优选地，所述CCP110抑制剂选自基于CCP110基因设计的siRNA（siCCP110）。

作为优选地，所述基于CCP110基因设计的siRNA（siCCP110）序列如SEQ ID NO：1所示。

作为优选地，所述药物组合中还包括顺铂、紫杉醇、醋酸甲孕酮、醋酸甲地孕酮、羟已酸孕酮和甲基炔诺酮中的一种或多种。

本发明第二方面提供了上述药物组合物用于制备预防和/或治疗癌症药物中的用途。

作为优选地，所述癌症选自肺癌、肾癌、肠癌、胃癌、淋巴癌、肝癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌中的一种或多种；最优选地，所述癌症选自子宫内膜癌。

本发明第三方面提供了一种用于预防和/或治疗癌症的药物制剂，包括CCP110抑制剂以及至少一种药学上可接受的载体。

作为优选地，所述癌症选自肺癌、肾癌、肠癌、胃癌、淋巴癌、肝癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌中的一种或多种；最优选地，所述癌症选自子宫内膜癌。

作为优选地，所述CCP110抑制剂选自基于CCP110基因设计的siRNA（siCCP110）。

作为优选地，所述基于CCP110基因设计的siRNA（siCCP110）序列如SEQ ID NO：1所示。

作为优选地，所述药物制剂中还包括顺铂、紫杉醇、醋酸甲孕酮、醋酸甲地孕酮、羟已酸孕酮和甲基炔诺酮中的一种或多种。

作为优选地，所述药物制剂的剂型选自片剂、胶囊剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、凝胶剂、栓剂中的一种或多种。

作为优选地，所述药学上可接受的载体选自填充剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、着色剂、防腐剂、矫味剂、抗氧化剂、溶剂中的一种或多种。

本发明第四方面提供了CCP110抑制剂用于制备预防和/或治疗癌症药物中的用途。

作为优选地，所述癌症选自肺癌、肾癌、肠癌、胃癌、淋巴癌、肝癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌中的一种或多种；最优选地，所述癌症选自子宫内膜癌。

作为优选地，所述CCP110抑制剂选自基于CCP110基因设计的siRNA（siCCP110）。

作为优选地，所述基于CCP110基因设计的siRNA（siCCP110）序列如SEQ ID NO：1所示。

现有技术对于癌症尤其是子宫内膜癌发生与发展的原因和机制尚不明确，同样地，对于CCP110在癌症尤其是子宫内膜癌中的作用未有报道，而CCP110在在子宫内膜癌细胞发生、增殖、迁移、侵袭、凋亡等活动中的具体调节机制更是未有阐明。

本发明发明人则对CCP110与子宫内膜癌的相关作用及机制进行了深入研究，充分揭示了CCP110在癌症尤其是子宫内膜癌细胞中的作用，发现CCP110在子宫内膜癌患者的肿瘤样本中明显高表达，且与病人生存预后密切相关，阐明了CCP110调控子宫内膜癌的新机制，找到抑制子宫内膜癌的关键靶点。本发明对CCP110在子宫内膜癌发生、发展、迁移、侵袭、凋亡等过程中的具体机制进行了深入研究，明确了CCP110对子宫内膜癌细胞凋亡、增殖及迁移和侵袭能力的影响，通过CCP110抑制剂siCCP110能够有效下调细胞内CCP110蛋白表达水平，显著抑制细胞的生长增殖活性，降低其迁移及侵袭的能力。

本发明相对于现有技术具有如下技术效果：

（1）本发明充分揭示了CCP110在子宫内膜癌中的作用，阐明了CCP110调控子宫内膜癌的新机制，找到抑制子宫内膜癌的关键靶点，为了解子宫内膜癌的发病机制以及为临床治疗和药物开发提供确实的实验证据和科学依据。

（2）本发明对CCP110在子宫内膜癌发生、发展、迁移、侵袭、凋亡等过程中的具体功能作用进行了深入研究，对于子宫内膜癌的发生发展机制进行了全新的阐明，为子宫内膜癌的疾病进展及靶向治疗提供了充分的理论依据，为后期相关药物开发以及临床诊断和治疗提供了全新的思路，具有极大的社会意义及市场前景。

附图说明

图1为子宫内膜癌组织及癌旁组织中CCP110表达水平示意图。

图2为样本表达水平（中位数分界）与子宫内膜癌患者预后生存的关系示意图。

图3为子宫内膜癌组织及癌旁组织免疫组化分析示意图。

图4为siCCP110对Isikawa细胞中CCP110表达影响示意图。

图5为siCCP110对HEC-1B细胞中CCP110表达影响示意图。

图6为siCCP110对Isikawa细胞增殖影响示意图。

图7为siCCP110对HEC-1B细胞增殖影响示意图。

图8为siCCP110对Isikawa和HEC-1B细胞细胞克隆形成实验影响示意图。

图9为siCCP110对Isikawa和HEC-1B细胞细胞克隆形成实验影响定量分析结果示意图。

图10为为siCCP110对Isikawa和HEC-1B细胞细胞凋亡实验影响示意图。

图11 siCCP110对Isikawa和HEC-1B细胞细胞克隆形成实验影响定量分析结果示意图。

图12为siCCP110对子宫内膜癌细胞迁移影响结果示意图。

图13为siCCP110对子宫内膜癌细胞迁移影响定量结果示意图。

图14为siCCP110对子宫内膜癌细胞侵袭影响结果示意图。

图15为siCCP110对子宫内膜癌细胞侵袭影响定量结果示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在无特别说明的情况下，本发明上下文中所列出的包括HEC-1B、Ishikawa等细胞系从American Type Culture Collection（ATCC、Manassas、VA、USA）购入并根据ATCC指南进行培养。所有细胞系均通过中国典型培养物保藏中心（武汉）的短串联重复分析鉴定，并使用PCR检测试剂盒（上海Biothrive Sci）验证是否存在支原体污染，同时在液氮中冷冻保存并用于后续实验。本发明所使用的试剂中，均通过市售获得。对于临床标本的使用，均与患者签署了知情同意书，相关程序及方法符合医学伦理学要求以及药物临床试验质量管理规范。本发明所使用的实验方法，例如siRNA设计、载体构建、细胞转染、肿瘤细胞培养、Western blot、分子克隆、小分子干扰技术、免疫组化、Transwell实验、划痕实验等均为本领域的常规方法和技术。

生物学实验重复中选择具有代表性的结果呈现在上下文附图中，数据按照图示中规定的以mean±SD和mean±SEM展示。所有实验至少重复三次。数据采用GraphPad Prism5.0或SPSS 20.0软件进行分析。采用t检验或方差分析比较两组或两组以上的平均值差异。p＜0.05被认为是一个显著的差异。

实施例1 CCP110在子宫内膜癌组织中表达水平及相关性研究

（1）收集子宫内膜癌患者手术切除的子宫内膜癌组织及癌旁组织，并与患者签署知情同意书；

（2）将每块组织样本分成两部分，一部分在离体30分钟内冻存于液氮中，随后转-80℃；另一部分保存于3.7%多聚甲醛中；

（3）将-80℃中样本用于用于蛋白的提取及Western blot（WB）；将多聚甲醛中样本用于病理切片及随后的免疫组化染色。

病理诊断根据TNM分期按照美国癌症联合(AJCC)制定的分期标准。收集临床随访资料：年龄、性别、临床分级、复发及转移与否、放化疗与否、病理分型、肿瘤大小及生存预后情况（病例数至少50例以上)。

结果分别如图1-3所示。结果显示，通过利用Western blot对组织中CCP110的定量分析发现，在子宫内膜癌组织样本中，其CCP110表达水平明显高于癌旁正常组织，该差异具有统计学意义（p＜0.001）（参见图1）。

对子宫内膜癌患者的预后生存情况进行分析发现，体内高表达有CCP110的患者预后生存情况明显不如CCP110低表达的患者，该差异具有统计学意义（参见图2）。

通过对子宫内膜癌组织及癌旁组织的免疫组化分析，更进一步地明确了CCP110在子宫内膜癌组织中高表达（参见图3）。

根据上述结果可知，与正常子宫内膜组织相比，子宫内膜癌组织中CCP110蛋白水平显著提高，且高表达CCP110的患者预后生存情况明显不如CCP110低表达的患者，显示CCP110的表达水平与子宫内膜癌具有十分密切的关系。

实施例2 CCP110抑制剂对子宫内膜癌细胞中CCP110表达的影响

针对CCP110的mRNA序列设计并合成了siRNA（siCCP110），其中siCCP110序列为aagacguuccaggacaucauc（如SEQ ID NO：1所示），将其分别转染至HEC-1B及Ishikawa细胞中，通过WB对两种细胞中的CCP110蛋白表达水平进行检测。

结果如图4-5所示。结果显示，在HEC-1B及Ishikawa两种细胞中，利用CCP110抑制剂siCCP110均能有效降低细胞中CCP110蛋白的表达，从而验证了该siCCP110的有效性及特异性。

实施例3 CCP110及抑制剂对子宫内膜癌细胞增殖的影响

（1）取对数生长期的Ishikawa和HEC-1B细胞以及转染有siCCP110的Ishikawa和HEC-1B细胞，胰酶消化并计数，按各种细胞的倍增时间选择合适的细胞密度，接种到96孔板中（3个重复）；

（2）于37℃培养箱中进行培养，并分别于24h、48h、72h以及96h搜集细胞，每孔加10μL CCK-8，将培养板在培养箱内孵育1-4h，测定450nm吸光度，评估细胞的增殖状况。

结果如图6所示。结果显示，在利用siCCP110对CCP110基因进行沉默后，Ishikawa细胞的增殖能力显著减弱，可显著抑制子宫内膜癌细胞生长，使得Ishikawa细胞的增殖活性明显降低，差异具有统计学意义。

进一步地，采用HEC-1B细胞重复上述实验，结果如图7所示。结果同Ishikawa类似，在利用siCCP110对CCP110基因进行沉默后，HEC-1B细胞的增殖能力同样显著减弱，可显著抑制子宫内膜癌细胞生长，使得HEC-1B细胞的增殖活性明显降低，差异具有统计学意义。

根据上述结果可知，与正常子宫内膜癌细胞相比，通过利用CCP110抑制剂对其进行干预，能够有效降低CCP110在子宫内膜癌细胞中的表达，从而明显抑制子宫内膜癌细胞的生长，降低子宫内膜癌细胞的增殖活性。

实施例4 CCP110及抑制剂对子宫内膜癌细胞克隆形成的影响

（1）取对数生长期的Ishikawa和HEC-1B细胞以及转染有siCCP110的Ishikawa和HEC-1B细胞,分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用；

（2）将细胞悬液后稀释, 按1000/孔的密度接种于含10mL 37℃预温培养液的皿中,并轻轻转动,使细胞分散均匀，置37℃ 5% CO₂及饱和湿度的细胞培养箱中培养；

（3）当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养，弃去上清液,用PBS小心浸洗2次，每孔加入含0.5%结晶紫的甲醇1mL，染色30min；弃甲醇，用水清洗残留的甲醇；即可观察到细胞克隆；显微镜下观察，细胞数＞50个才计为一个有效克隆。

结果如图8-9所示。结果显示，通过抑制CCP110的表达能够显著抑制子宫内膜癌细胞的克隆形成，差异具有统计学意义。

实施例5 CCP110及抑制剂对子宫内膜癌细胞凋亡的影响

（1）取对数生长期的Ishikawa和HEC-1B细胞以及转染有siCCP110的Ishikawa和HEC-1B细胞，胰酶消化并计数，按各种细胞的倍增时间选择合适的细胞密度，接种到96孔板中（3个重复）；

（2）于37℃培养箱中进行培养，48h后收集细胞于10ml离心管中，每样本细胞数为5×10⁶/mL，于1000r/min离心5min，弃去培养液；

（3）用PBS缓冲液洗涤1次，1000r/min离心5min；

（4）用100μL的标记缓冲液重悬细胞，室温下避光孵育15min；

（5）1000r/min离心5min，沉淀细胞用PBS润洗1次。

（6）加入10μL Annexin V-FITC，4℃下孵育 30min，避光并不时振动；

（7）加入200μL标记缓冲液，利用流式细胞分析仪进行检测。

结果如图10-11所示。结果显示，在利用siCCCP110对CCP110基因进行沉默后，Ishikawa和HEC-1B细胞的增殖能力显著减弱，且可显著抑制前列腺癌细胞生长并诱导细胞凋亡，使得Ishikawa和HEC-1B细胞的凋亡率明显升高，差异具有统计学意义。

实施例6 CCP110及抑制剂对子宫内膜癌细胞迁移的影响

（1）使用marker笔在6孔板背后均匀画出横线，大约每隔0.5-1cm一道，横穿过孔，每孔至少穿过5条线；

（2）在6孔板每个孔中加入约5×10⁵个Isikawa或HEC-1B细胞，于37℃，5% CO₂条件培养过夜；

（3）12h后在孔内对照6孔板背后的横线进行划痕操作；

（4）使用PBS清洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基，于37℃，5% CO₂条件进行培养。

（5）24h后对细胞数量进行检测并计数。

结果如图12-13所示。结果显示，无论是对于Isikawa细胞还是HEC-1B细胞，在利用CCP110抑制剂siCCP110进行处理后，均能够显著抑制该细胞的迁移能力，该差异相对于未作任何处理的对照组具有统计学意义。

实施例7 CCP110及抑制剂对子宫内膜癌细胞侵袭的影响

（1）提前将所有细胞培养试剂及Trasnwell chamber至于37℃进行预热；

（2）取对数期Isikawa细胞或HEC-1B细胞，消化后采用PBS和无血清培养基先后洗涤一次，随后采用无血清培养基悬浮细胞，调整浓度为2×10⁵/mL；

（3）室温下于下室（即24孔板底部）内加入800μL含10%血清的培养基，上室加入100μL细胞玄烨，继续培养24h；

（4）取出chamber，吸干上室液体，移到预先加入有800μL甲醇的孔中，室温固定30min；

（5）取出chamber，吸干上室固定液，移到预先加入有800μL Giemsa染液的孔中，室温染色20min；

（6）轻轻用清水冲洗浸泡数次，取出chamber，吸去上室液体，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞；

（7）用镊子揭下膜，底面朝上晾干，移至载玻片上用中性树胶封片；

（8）显微镜下取多个随机视野进行拍照并进行细胞计数。

结果如图14-15所示。结果显示，无论是对于Isikawa细胞还是HEC-1B细胞，在利用CCP110抑制剂siCCP110进行处理后，均能够显著抑制该细胞的侵袭能力，该差异相对于未作任何处理的对照组具有统计学意义。

综合上述结果，本发明充分揭示了CCP110在癌症尤其是子宫内膜癌细胞中的作用，发现CCP110在子宫内膜癌患者的肿瘤样本中明显高表达，且与病人生存预后密切相关，阐明了CCP110调控子宫内膜癌的新机制，找到抑制子宫内膜癌的关键靶点。本发明对CCP110在子宫内膜癌发生、发展、迁移、侵袭、凋亡等过程中的具体机制进行了深入研究，明确了CCP110对子宫内膜细胞凋亡、增殖及迁移和侵袭能力的影响，通过CCP110抑制剂siCCP110能够有效下调细胞内CCP110蛋白表达水平，显著抑制细胞的生长增殖活性，降低其迁移及侵袭的能力。本发明对于子宫内膜癌的发生发展机制进行了全新的阐明，对于后期相关药物开发以及临床诊断和治疗提供了全新的思路，具有极大的社会意义及市场前景。

以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 暨南大学附属第一医院(广州华侨医院)

<120> 一种包含CCP110抑制剂的药物组合物及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagacguucc aggacaucau c 21

Claims (1)

1.CCP110抑制剂用于制备治疗子宫内膜癌的药物中的用途，所述CCP110抑制剂选自基于CCP110基因设计的siRNA，所述基于CCP110基因设计的siRNA序列如SEQ ID NO：1所示。

Images