CN114288266B - 一种粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒及其制备方法与应用。该制备方法包括：用胃蛋白酶和胰酶分段酶解大豆分离蛋白，在中性pH下经不同温度热处理后将其在碱性pH下孵育，搅拌再回调pH至中性，离心后收集上清液得粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒，干燥处理得粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒。所述纳米颗粒具有纳米级尺寸，平均粒径为40～150nm，ζ电位为‑15～‑30mV。本发明首次利用热耦合pH驱动调节颗粒的尺度及带电性来制备粘液渗透型纳米颗粒，使得纳米颗粒的粘液渗透能力提升，可用于功能性食品、特医食品以及医药中。本发明原料天然健康，制备过程绿色安全、能耗低，工艺操作简单，能够进行快速连续化生产，具有巨大的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于纳米载体材料领域，具体涉及一种粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒及其制备方法与应用。
背景技术
目前，胃肠道生理屏障是造成功能活性因子口服生物利用度低的主要原因。研究表明，功能活性因子经口服摄入后，在胃肠道中将依次面临消化屏障(pH屏障和消化酶屏障)、粘液屏障和肠上皮细胞屏障。尽管纳米载体对活性因子包埋递送可以保护其避免被消化降解，但高粘弹性且动态更新的粘液层具有强大的捕获和快速清除外源颗粒的能力，使得纳米载体无法扩散穿透粘液层到达上皮细胞以实现进一步吸收。近年来，随着对肠道粘液层结构及特性的深入研究，设计并开发克服粘液屏障的纳米载体也受到越来越多的关注。
粘液层是以粘蛋白为主要结构成分形成的网状凝胶，肠道粘液层厚度约为50-200μm，平均孔径约10-200nm，粘蛋白寡糖侧链中包含的末端唾液酸和硫酸盐残基使得粘液呈现电负性。粘液层可防止病菌在肠道内的侵袭并消除各种机械性刺激对上皮细胞的磨损，对肠道粘膜的完整性具有重要的保护作用。大量研究表明通过粘液溶解剂如N-乙酰半胱氨酸(NAC)和粘蛋白水解酶等修饰载体可以克服粘液凝胶屏障。然而，粘液溶解剂的使用对于粘液结构具有不可逆的破坏作用。近年来，通过调控纳米颗粒的尺度、带电性及表面亲疏水性等构建的新型纳米载体在克服粘液屏障中表现出巨大的潜力，并且不影响肠道粘液层正常的功能性质。已经发现，较小的纳米载体可以避免空间阻塞，表面高而弱带电性的载体尤其是高且等密度正负电荷的电中性纳米载体可以避免与粘液层的静电相互作用，亲水性表面的载体则能避免与粘蛋白的疏水相互作用的，特别地，尺寸小于粘液孔径的非相互作用纳米颗粒可以自由扩散通过粘液层。例如，李志斌等报道了一种亲水性高分子聚合物(PEG)修饰的金属有机框架ZIF-8纳米微球，实现了对ZIF-8纳米微球粘液穿透能力的提升。
目前关于颗粒表面性质修饰以实现粘液层有效渗透的研究大多以无机材料为主，这大大限制了其在功能性食品、特医食品以及生物医药等中的应用，并且载体颗粒制备过程复杂，相关研究工作仍主要集中在理论探究阶段，而粘液渗透型载体的高效制备技术以及产业化生产可行性非常有限。因此，以生物基大分子为原料，结合简便绿色安全的处理手段来制备粘液渗透型纳米颗粒具有强大的开发前景及应用价值。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒及其制备方法与应用。
本发明的首要目的是为了提供一种粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒的制备方法，该方法安全性高、生物相容性好。
本发明的另一目的在于提供由上述方法制得的粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒。
本发明的再一目的在于提供上述粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒在功能活性因子包埋递送中的应用。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
一种粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将大豆分离蛋白分散在水中，搅拌混合均匀，得到蛋白分散液；
(2)调节步骤(1)所述蛋白分散液的pH值，在搅拌状态下加入相应酶制剂进行分段酶解，酶解结束后调节酶解液pH至7.0-7.5，然后进行加热处理，离心得到上清液；
(3)调节步骤(2)中所述的上清液的pH为碱性，在搅拌状态下孵育后调节pH值至溶液为中性，离心取上清液，即得到所述粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒，经干燥处理可得纳米颗粒粉剂。
进一步地，步骤(1)所述大豆分离蛋白与水的质量体积比为(1-10):100(w/v，g/mL)。
优选地，步骤(1)所述大豆分离蛋白与水的质量体积比为(4-10):100(w/v，g/mL)。
进一步地，步骤(1)所述搅拌速率为120-180rpm，搅拌时间为1-3h。
优选地，步骤(1)所述搅拌速率为140-160rpm，搅拌时间为2-3h。
进一步地，步骤(2)中，所述蛋白分散液的pH值为1.5-2.5；所述分段酶解具体为：加入胃蛋白酶酶解0.5-3h，然后调节pH至7.0-8.0，加入胰酶继续酶解1-4h；所述酶制剂的质量均为大豆分离蛋白质量的0.1％-1％；所述酶解的温度为35℃-40℃；所述搅拌速率为120-180rpm。
优选地，步骤(2)中，所述蛋白分散液的pH值为2.0-2.5；所述分段酶解具体为：加入胃蛋白酶酶解1-3h，然后调节pH至7.0-7.5，加入胰酶继续酶解2-4h。
优选地，步骤(2)所述酶制剂的质量均为大豆分离蛋白质量的0.1％-0.5％。
优选地，步骤(2)所述酶解的温度为35-37℃。
进一步地，步骤(2)中，酶解过程可以通过搅拌使体系的pH稳定，搅拌速率优选为150-180rpm。
进一步地，步骤(2)中，所述热处理的温度为55-100℃，所述热处理的时间为20-40min。
优选地，步骤(2)所述热处理的温度为65-95℃。
优选地，步骤(2)所述热处理的时间为25-35min。
进一步地，步骤(2)所述离心的离心力为6000-10000g，所述离心的时间为15-30min。
优选地，步骤(2)所述离心的离心力为8000-10000g。
优选地，步骤(2)所述离心的时间为20-30min。
进一步地，步骤(3)中，所述上清液的pH为10.0-12.0；所述孵育的时间为0.5-1.5h。
进一步地，步骤(3)中，所述上清液的pH为11.0-12.0；所述孵育的时间为1.0-1.5h。
进一步地，步骤(3)中，所述调节pH值为7.0-7.5。所述搅拌速率为120-180rpm。
进一步地，步骤(3)所述离心的离心力为6000-10000g，所述离心的时间为15-30min。
优选地，步骤(3)所述离心的离心力为8000-10000g。
优选地，步骤(3)所述离心的时间为20-30min。
进一步地，步骤(3)所述干燥的方式为冷冻干燥及喷雾干燥中的一种，其中冷冻干燥的温度为-40℃～-50℃，冷冻干燥的真空度小于1mbar，冷冻干燥的时间为20-30h，喷雾干燥的进风温度为160-180℃，喷雾干燥的排风温度为70-90℃。
优选地，步骤(3)所述干燥的方式选用冷冻干燥时，冷冻干燥的时间为20-25h。
优选地，步骤(3)所述干燥的方式选用喷雾干燥时，喷雾干燥的进风温度为170-180℃，喷雾干燥的排风温度为80-90℃。
本发明提供一种由上述的制备方法制备得到的粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒。
上述粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒在功能活性因子包埋递送中的应用。
本发明提供的粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒，是由大豆蛋白经限制性酶解后，首次利用热耦合pH驱动调节颗粒的尺度及带电性制备得到的粘液渗透型纳米颗粒，使得纳米颗粒的粘液渗透能力提升，其平均粒径为40～150nm，ζ电位为-15～-30mV。
本发明提供的粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒可应用于功能活性因子的包埋递送中，以提高功能活性因子的生物利用度，为功能活性因子在新型功能性食品、特医食品以及生物医药领域中的应用提供一定的理论及技术支撑。
本发明原料天然健康，制备过程绿色安全、能耗低，工艺操作简单，能够进行快速连续化生产，具有巨大的应用价值。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明提供的粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒的制备方法，首次利用热耦合pH驱动限制性酶解定向释放的大豆蛋白两亲性结构自组装，调控颗粒的尺度及带电性，成功制备了粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒，可作为纳米载体应用于功能活性因子的包埋递送以提高功能因子的生物利用度。
(2)本发明提供的粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒的制备方法，原料安全健康、生物相容性好，制备工艺简单，易工业化生产，制备过程未涉及有毒有害试剂，具有很好的开发应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1-4中制得的四种粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒的粒径分布图。
图2为本发明实施例1-4中制得的四种粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒的扫描电子显微镜形貌图。
图3为本发明实施例1-4中制得的四种粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒在肠粘液中的渗透率变化折线图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施例1
一种粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将大豆分离蛋白与去离子水混合，160rpm的转速下搅拌3h得到大豆分离蛋白分散液，所述大豆分离蛋白与去离子水的质量体积比为8:100(w/v，g/mL)；
(2)调节蛋白分散液的pH为1.5，加入胃蛋白酶开始酶解，胃蛋白酶的质量为大豆分离蛋白质量的0.1％(w/w)，酶解反应时间为3h；第一阶段酶解反应后调节酶解反应液的pH为7.2，加入胰酶进行第二阶段酶解，胰酶的质量为大豆分离蛋白质量的0.5％(w/w)，酶解反应时间为3h，酶解结束后调节酶解液pH至7.0。整个酶解过程中转速为150rpm，反应温度为35℃。接着在65℃条件下进行热处理，热处理时间为25min，离心得到热处理上清液(离心力为10000g，离心时间为30min)；
(3)调节步骤(2)所述热处理上清液的pH值为11.0，在该pH下搅拌孵育1h，搅拌速率为140rpm，然后回调反应液pH为7.2，离心取上清液(离心力为8000g，离心时间为20min)，即得到粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒，冷冻干燥(冷冻干燥的温度为-40℃，冷冻干燥的真空度小于1mbar，冷冻干燥的时间为30h)得到所述粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒样品。该实施例制备得到的样品命名为SPNPs-1，其中SPNPs为soy protein nanoparticles的简称。
实施例2
一种粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将大豆分离蛋白与去离子水混合，150rpm的转速下搅拌2h得到大豆分离蛋白分散液，所述大豆分离蛋白与去离子水的质量体积比为4:100(w/v，g/mL)；
(2)调节蛋白分散液的pH为2.5，加入胃蛋白酶开始酶解，胃蛋白酶的质量为大豆分离蛋白质量的0.2％(w/w)，酶解反应时间为2.5h；第一阶段酶解反应后调节酶解反应液的pH为7.0，加入胰酶进行第二阶段酶解，胰酶的质量为大豆分离蛋白质量的0.5％(w/w)，酶解反应时间为2h,酶解结束后调节酶解液pH至7.5。整个酶解过程中转速为160rpm，反应温度为36℃。接着在55℃条件下进行热处理，热处理时间为40min，离心得到热处理上清液(离心力为10000g，离心时间为15min)；
(3)调节步骤(1)所述热处理上清液的pH值为11.5，在该pH下搅拌孵育1h，搅拌速率为160rpm，然后回调反应液pH为7.0，离心取上清液(离心力为9000g，离心时间为20min)，即得到粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒，冷冻干燥(冷冻干燥的温度为-50℃，冷冻干燥的真空度小于1mbar，冷冻干燥的时间为25h)得到所述粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒样品。该实施例制备得到的样品命名为SPNPs-2，其中SPNPs为soy protein nanoparticles的简称。
实施例3
一种粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将大豆分离蛋白与去离子水混合，180rpm的转速下搅拌3h得到大豆分离蛋白分散液，所述大豆分离蛋白与去离子水的质量体积比为10:100(w/v，g/mL)；
(2)调节蛋白分散液的pH为2.0，加入胃蛋白酶开始酶解，胃蛋白酶的质量为大豆分离蛋白质量的1％(w/w)，酶解反应时间为1h；第一阶段酶解反应后调节酶解反应液的pH为7.5，加入胰酶进行第二阶段酶解，胰酶的质量为大豆分离蛋白质量的1％(w/w)，酶解反应时间为1h,酶解结束后调节酶解液pH至7.0。整个酶解过程中转速为180rpm，反应温度为37℃。接着在85℃条件下进行热处理，热处理时间为30min，离心得到热处理上清液(离心力为9000g，离心时间为25min)；
(3)调节步骤(1)所述热处理上清液的pH值为12，在该pH下搅拌孵育2h，搅拌速率为180rpm，然后回调反应液pH为7.5，离心取上清液(离心力为10000g，离心时间为30min)，即得到粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒，然后喷雾干燥(所述喷雾干燥的进风温度为170℃，排风温度为85℃)得到所述粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒样品。该实施例制备得到的样品命名为SPNPs-3，其中SPNPs为soy protein nanoparticles的简称。
实施例4
一种粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将大豆分离蛋白与去离子水混合，120rpm的转速下搅拌1h得到大豆分离蛋白分散液，所述大豆分离蛋白与去离子水的质量体积比为1:100(w/v，g/mL)；
(2)调节蛋白分散液的pH为2.5，加入胃蛋白酶开始酶解，胃蛋白酶的质量为大豆分离蛋白质量的0.5％(w/w)，酶解反应时间为0.5h；第一阶段酶解反应后调节酶解反应液的pH为8.0，加入胰酶进行第二阶段酶解，胰酶的质量为大豆分离蛋白质量的0.1％(w/w)，酶解反应时间为4h,酶解结束后调节酶解液pH至7.0。整个酶解过程中转速为120rpm，反应温度为40℃。接着在100℃条件下进行热处理，热处理时间为20min，离心得到热处理上清液(离心力为6000g，离心时间为30min)；
(3)调节步骤(1)所述热处理上清液的pH值为10，在该pH下搅拌孵育0.5h，搅拌速率为120rpm，然后回调反应液pH为7.5，离心取上清液(离心力为6000g，离心时间为15min)，即得到粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒，然后喷雾干燥(所述喷雾干燥的进风温度为180℃，排风温度为90℃)得到所述粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒样品。该实施例制备得到的样品命名为SPNPs-4，其中SPNPs为soy protein nanoparticles的简称。
对比例1
不做任何处理的原始大豆蛋白样品。对比例1的原始大豆蛋白样品命名为SPI，其中SPI为soy protein的简称。
将对比例1中未进行任何处理的原始大豆蛋白样品和实施例1-4中制备的粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒样品进行如下分析。
粒径、聚合物分散性指数(PDI)、表面电位及表面疏水性的测定：采用纳米粒度仪(Malvern Nano-ZS)测定所制得的粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒的平均粒径、PDI(Polydispersity Index，多相分散系数)及表面电位，结果如表1所示。粒径分布图如图1所示。
形貌观察分析：将对比例1中的原始大豆蛋白样品和实施例1-4中干燥后的粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒样品均匀涂抹固定于导电双面胶上，喷金后用场发射扫描电镜上进行形貌观察，结果如图2所示。
粘液渗透性研究：从新鲜屠宰的猪小肠中提取肠粘液，冻存备用；用FITC(Fluorescein Isothiocyanate，异硫氰酸荧光素)荧光剂对蛋白颗粒进行荧光标记，然后用Transwell小室模型研究所制得的蛋白纳米颗粒在肠粘液中的渗透性，粘液渗透率通过在特定时间取样测定荧光强度进行定量，结果如图3所示。
如表1所示，未处理的原始大豆蛋白样品的粒径为71nm，PDI为0.53，表面电位为-35mV；而实施例1-4制备得到的粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒的平均粒径大小为40-150nm，PDI均小于0.3，表面电位为-15～-30mV。这一结果表明制备得到的粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒尺度可控，分散均一(PDI<0.3)，表面带电性低，具备高粘液渗透的潜力。
如图1和图2所示，未处理的原始大豆蛋白样品呈现双峰分布，以大聚集体的形式存在；实施例1-4制备得到的粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒粒径分布图均为单峰分布，形貌为均匀的球状颗粒，粒径在几十纳米到二百纳米之间。这一结果证明了经本发明提供的制备方法成功制备了性质稳定的粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒。
由图3可知，与未处理的原始大豆蛋白样品相比，实施例1-4制备得到的粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒在肠粘液中具有优异的粘液渗透性，其中SPNPs-1样品4h后粘液渗透率可达20％，为SPI粘液渗透率的6倍。
表1
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、组合、修饰等均应属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将大豆分离蛋白分散在水中，搅拌混合均匀，得到蛋白分散液；
(2)调节步骤(1)所述蛋白分散液的pH值为1.5-2.5，在搅拌状态下加入相应酶制剂进行分段酶解，酶解结束后调节酶解液pH至7.0-7.5，然后进行加热处理，离心得到上清液，所述分段酶解具体为：加入胃蛋白酶酶解0.5-3h，然后调节pH至7.0-8.0，加入胰酶继续酶解1-4h，所述热处理的温度为55-100℃；
(3)调节步骤(2)中所述的上清液的pH为碱性，在搅拌状态下孵育后调节pH值至溶液为中性，离心取上清液，即得到所述粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒，经干燥处理可得纳米颗粒粉剂。
2.根据权利要求1所述的粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述大豆分离蛋白与水的质量体积比为(1-10):100(w/v，g/mL)。
3.根据权利要求1所述的粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述搅拌速率为120-180rpm，搅拌时间为1-3h。
4.根据权利要求1所述的粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述酶制剂的质量均为大豆分离蛋白质量的0.1％-1％；所述酶解的温度为35℃-40℃；所述搅拌速率为120-180rpm。
5.根据权利要求1所述的粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述热处理的时间为20-40min。
6.根据权利要求1所述的粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述离心的离心力为6000-10000g，所述离心的时间为15-30min。
7.根据权利要求1所述的粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述上清液的pH为10.0-12.0；所述孵育的时间为0.5-1.5h，所述调节pH值为7.0-7.5，所述搅拌速率为120-180rpm。
8.根据权利要求1所述的粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述离心的离心力为6000-10000g，所述离心的时间为15-30min；所述干燥的方式为冷冻干燥及喷雾干燥中的一种，其中冷冻干燥的温度为-40℃～-50℃，冷冻干燥的真空度小于1mbar，冷冻干燥的时间为20-30h，喷雾干燥的进风温度为160-180℃，喷雾干燥的排风温度为70-90℃。
9.权利要求1-8任一项所述的制备方法制备得到的一种粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒。
10.权利要求9所述的粘液渗透型大豆蛋白纳米颗粒在功能活性因子包埋递送中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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