CN114287342B - 一种适用于多种桑树品种新梢及叶愈伤组织诱导的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适用于多种桑树品种新梢及叶愈伤组织诱导的方法，并适用于11种桑树品种，包括8种广东桑：沙2×伦109、抗青10号、伦教40号、塘10×伦109、抗青283、粤桑11号、试11、和龙桑；1种江苏桑：育71‑1；2种浙江桑：强桑1号、强桑5号。将采集的桑枝剪切后插入无菌水水培，能保证桑枝侧芽高萌发率，结合本发明的外植体消毒方法，能显著降低顶芽及叶片的污染率、褐化率，保证成活率。同时本发明还确定了一种适用于多种桑树品种新梢和叶愈伤组织诱导培养基。采用本发明的诱导方法，将预培养得到的外植体接种于该培养基后，所得桑树品种新梢及叶愈伤组织形成率高。
Description
技术领域
本发明涉及植物技术领域，具体地，涉及一种适用于多种桑树品种新梢及叶愈伤组织诱导的方法。
背景技术
桑树(Morus spp.)是一种经济价值高、药食两用的多年生乔木或灌木，据2020版《中国药典》记载，桑白皮、桑叶、桑果和桑根皆可入药(Thomas T D.Advances in mulberrytissue culture[J].Journal of Plant Biology,2002,45(1):7-21；Wojciech Litwińczuk B J.Micropropagation of Mountain Mulberry(Morus bombycis Koidz.)'Kenmochi'on Cytokinin-Free Medium[J].Plants(Basel,Switzerland),2020,9(11):1533.；曾鹏,郭朝晖,韩自玉,肖细元,彭驰.桑树(Morus alba L.)原位修复某尾矿区重金属污染土壤[J].环境化学,2020,39(05):241-249.；中华人民共和国药典,国家药典委员会.《中华人民共和国药典》[M].中国医药科技出版社.2020.)。桑树在蚕桑业、食品工业、畜牧饲料及医药领域等正发挥着越来越重要的经济、社会和生态作用，正逐渐形成桑树产业。
在生产实践中，抗青10号、沙2×伦109、塘10×伦109和伦教40号这4个品种桑因其成林桑园亩产桑叶量均在2470kg以上，具有产叶量大的特点，被大量用在桑叶生产上，具有非常高的经济价值(鲁成,计东风.中国桑树栽培品种[M].重庆：西南师范大学出版社，2017.；祁伟亮,王萍,杨财容,刘松青,任迎虹,2020,果桑品种德果1号的芽组织培养繁殖试验,蚕业科学,46(5):545-552)。同时，桑树青枯病是一种土传毁灭性性病害，是威胁华南地区蚕桑生产的主要细菌性病害之一，根据文献报道(朱方容,朱光书,林强,岑贞陆,蒙姣荣,陈小青,曾燕蓉,邱长玉,欧阳秋飞,76个桑树杂交组合对青枯病的抗性鉴定与评价,蚕业科学,2014,40(05):781-789；鲁成,计东风.中国桑树栽培品种[M].重庆：西南师范大学出版社，2017.；祁伟亮,王萍,杨财容,刘松青,任迎虹,果桑品种德果1号的芽组织培养繁殖试验,蚕业科学,2020,46(05):545-552)，这4种广东桑对青枯病菌具有不同水平的抗性，抗青10号对桑青枯病菌具有强抗性，伦教40号为中抗，而塘10×伦109和沙2×伦109对桑青枯病易感，其中，抗青10号不仅具有产叶量高、高抗青枯病特点，还具有发芽早、成熟快、叶质好和凋萎慢等特点，并被大量利用在养蚕和桑芽菜等生产中。因此这4个品种桑树具有非常高的研究和经济价值，例如在桑的抗病性等分子机制、快速扩繁及获得无菌无毒苗等。然而，抗青10号和伦教40号没有种子，都是无性繁殖，而塘10×伦109和沙2×伦109虽有种子，但作为杂交桑很难保持母本性能。生产中这4个品种桑主要通过扦插、压条或嫁接等方法进行扩繁，由于其生产繁殖方法具有严重的局限性，如无法除去母本的病原菌、易受病原菌侵害和优良性能下降等问题。因此，愈伤组织对于这4个品种桑树的优良性能的保存、分子机制研究与科研材料的保存、快速实现品种繁殖、无毒无菌材料的获得、育种、进行快速和标准统一的作物生产等等具有重要的意义(Rezaei-Zafarghandi MS,Rahmati-JoneidabadM.Effects of thidiazuron on i n vitro shoot regeneration of Morusalba.BioTechnologia.2020；101(1):55-61.；仝爱群,2007,桑树组培快繁技术研究,山东农业大学硕士论文)。
目前国内外的研究主要集中在桑树的新品种选育(王振江,戴凡炜,罗国庆,林森,李智毅,唐翠明,早熟果桑新品种‘粤椹145’,园艺学报,2020,47(S2):2916-2917)、病害发生与防治(孙雅楠,哀嘉彬,唐爱妙,吴鉴艳,张传清,浙江桑葚菌核病的病原菌鉴定及其对4种杀菌剂的抗性检测,果树学报,2020,37(12):1934-1940；王继承,孙勋勋,罗龙辉,刘吉平,4种桑树土传病原生防细菌的分离与鉴定,蚕业科学,2020,46(01):31-36)、有效化学成分的分离鉴定[1]朱志飞,刘金玲,樊启猛,刘有志,吴月峰,周晋,贺福元.基于指纹图谱段带总量统计矩法和信息熵的桑源药材成分比较分析研究[J].中国中药杂志,2021,46(10):2547-2555.)等方面；文献中未见有一种培养基能适用于多种桑树品种和桑树种质资源保护的愈伤组织诱导。同时，桑新梢和叶在组织培养中，容易被各类真菌和细菌污染，影响愈伤组织的诱导，而过度的使用消毒药剂，不仅会造成环境污染，还会影响愈伤组织成活率。而消毒不当则达不到除菌的目的(李颖,李春燕.多菌灵和青霉素在组培污染中的应用[J].林业科技,2002,w(01):6-8.)。
同时，不同植物品种之间，愈伤组织的形成对培养基要求不同，例如卢绪兴等(卢绪兴,徐军涛,刘发余,孙业忠.农桑12、14号组培快繁技术研究[J].北方蚕业,2004,2(02):15-16)研制的培养基，就不适合抗青10号、沙2×伦109、塘10×伦109和伦教40号，这4个品种桑品种的愈伤组织诱导。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供适用于多种桑树品种新梢及叶愈伤组织诱导的方法，并适用于11种桑树品种，包括8种广东桑：沙2×伦109、抗青10号、伦教40号、塘10×伦109、抗青283、粤桑11号、试11、和龙桑(Morus alba var.Tortuosa)；1种江苏桑：育71-1；2种浙江桑：强桑1号、强桑5号。
本发明的第一个目的是提供适用于多种桑树品种新梢及叶愈伤组织诱导的方法。
本发明的第二个目的是提供一种培养基。
本发明的第三个目的是提供一种桑枝粉。
本发明的第四个目的是提供一种桑枝粉的提取液。
本发明的第五个目的是提供桑枝粉和/或桑枝粉提取液的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种适用于多种桑树品种新梢及叶愈伤组织诱导的方法，所述桑树品种为沙2×伦109、抗青10号、伦教40号、塘10×伦109、育71-1、抗青283、粤桑11号、试11、强桑1号、强桑5号和龙桑的一种或几种，所述诱导的方法包括以下步骤：
S1：采集桑枝：桑枝去叶后剪至长度为9～11cm，在无菌水中水培至侧芽萌发形成3～4cm的新梢，取新梢和/或幼叶作为组培外植体材料；
S2：消毒外植体：所述外植体为新梢，将新梢用无菌水中清洗3～4次后，用质量浓度为75～80％乙醇溶液浸泡30～35s，再用无菌水冲洗3～4次，质量浓度0.04～0.05％氯化汞浸泡20～22min后，再用无菌水清洗6～7次，在含有质量浓度0.19～0.21％青霉素和质量浓度0.19～0.21％链霉素的无菌水中，26～27℃下浸泡11.5～12.5h，再用质量浓度0.09～0.11％氯化汞浸泡8～9min后，用无菌水冲洗；
所述外植体为幼叶，将幼叶先用无菌水清洗3～4次后，用质量浓度75～80％乙醇溶液浸泡30～35s，再用无菌水冲洗3～4次，质量浓度0.09～0.11％氯化汞标准液浸泡10～11min后，再用无菌水清洗；
S3：外植体预培养：将步骤S2消毒后的外植体剪切后接种到含有琼脂和蔗糖的培养基上培养；
S4：诱导愈伤组织：将步骤S3预培养后的外植体接种到含有6-苄氨基嘌呤、α-萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸、噻苯隆和桑枝粉的提取液的MS培养基上进行培养，得到愈伤组织。
所述幼叶为桑枝侧芽萌发后形成。
优选地，步骤S1中，培养条件为温度26～27℃，湿度79～81％，光照11.5～12.5h/d，光照强度1500～2000lx，培养15～16d。
更优选地，步骤S1中，培养条件为温度25℃，湿度80％，光照12h/d，光照强度1500～2000lx，培养15d。
优选地，步骤S2中，消毒新梢时，将新梢用无菌水中清洗3次后，用质量浓度80％乙醇溶液浸泡30s，再用无菌水冲洗3次，质量浓度0.05％氯化汞浸泡20min后，再用无菌水清洗6次，在含有质量浓度0.2％青霉素和质量浓度0.2％链霉素的无菌水中，25℃下浸泡12h，再用质量浓度0.1％氯化汞浸泡8min后，用无菌水冲洗；
消毒叶时，将叶先用无菌水清洗3次后，用质量浓度80％乙醇溶液浸泡30s，用无菌水冲洗3次，质量浓度0.1％氯化汞标准液浸泡10min后，再用无菌水清洗。
优选地，步骤S3中，所述外植体为新梢，剪切至2～3cm长后，接种到含有琼脂7g/L和蔗糖30g/L，初始pH为5.8的培养基中，置于黑暗条件下，25℃预培养7d；所述外植体为幼叶，剪切后接种到含有琼脂7g/L和蔗糖30g/L，初始pH为5.8培养基中，置于黑暗条件下，25℃预培养7d。
优选地，步骤S4中，所述桑枝粉的制备方法为：取桑树枝条，60～65℃烘干至恒重，粉碎至直径为1.5～2mm。
更优选地，步骤S4中，所述桑枝粉的制备方法为：取沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×伦109的质量比分别为0～0.5：0.5～1：0～1：0.5～1的桑树枝条，60～65℃烘干至恒重，粉碎至直径为1.5～2mm。
更优选地，步骤S4中，所述桑枝粉的制备方法为：取沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×伦109的质量比分别为0～0.5：0.5～1：0～1：0.5～1的桑树枝条，剪碎后在真空干燥箱中于60～65℃烘干至恒重，粉碎机中粉碎至直径为1.5～2mm。
更优选地，步骤S4中，所述桑枝粉的制备方法为：取沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×伦109的质量比分别为0：0.5：0.5：0.5，或0：1：1：1，或0.5：0.5：1：0.5，或0.5：1：0：0.5，或0.5：1：1：0.5的桑树枝条，剪碎后在真空干燥箱中于60～65℃烘干至恒重，粉碎机中粉碎至直径为1.5～2mm。
更优选地，步骤S4中，所述桑枝粉的制备方法为：取沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×伦109的质量比分别为0.5：1：1：0.5的桑树枝条，剪碎后在真空干燥箱中于60～65℃烘干至恒重，粉碎机中粉碎至直径为1.5～2mm。
最优选地，步骤S4中，所述桑枝粉的制备方法为：取沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×伦109的质量比分别为0.5：1：1：0.5的桑树枝条，剪碎后在真空干燥箱中于60℃烘干至恒重，粉碎机中粉碎至直径为2mm。
优选地，步骤S4中，所述桑枝粉的提取液为所述的桑枝粉的水提取液，所述桑枝粉的水提取液的制备方法为：取所述的桑枝粉，用水煮沸，15～16min后，固液分离，得到桑枝粉的提取液。
更优选地，所述桑枝粉的水提取液的制备方法为：取所述的桑枝粉，用水煮沸，15min后，四层纱布过滤，得到桑枝粉的提取液。
优选地，步骤S4中，每1L MS培养基中，含有2～3mg 6-苄氨基嘌呤、0～0.2mgα-萘乙酸、0.25～0.5mg 2，4-二氯苯氧乙酸、0.25～0.5mg噻苯隆，还含有水提取0～0.5g沙2×伦109桑枝粉、0.5～1g抗青10号、0～1g伦教40号桑枝粉和0.5～1g塘10×伦109桑枝粉制备得到桑枝粉的提取液。
更优选地，每1L MS培养基含有2mg 6-苄氨基嘌呤、0.2mgα-萘乙酸、0.5mg2，4-二氯苯氧乙酸和0.5mg噻苯隆，还含有水提取0.5g沙2×伦109桑枝粉、1g抗青10号桑枝粉、1g伦教40号桑枝粉和0.5g塘10×伦109桑枝粉制备得到桑枝粉的提取液。
一种培养基，所述培养基为每1L含有2～3mg 6-苄氨基嘌呤、0～0.2mgα-萘乙酸、0.25～0.5mg 2，4-二氯苯氧乙酸和0.25～0.5mg噻苯隆，还含有水提取0～0.5g沙2×伦109桑枝粉、0.5～1g抗青10号、0～1g伦教40号桑枝粉和0.5～1g塘10×伦109桑枝粉制备得到桑枝粉的提取液的MS培养基。
优选地，所述培养基每1L还含有水提取0g沙2×伦109桑枝粉、0.5g抗青10号桑枝粉、0.5g伦教40号桑枝粉和0.5g塘10×伦109桑枝粉，
或0g沙2×伦109桑枝粉、1g抗青10号桑枝粉、1g伦教40号桑枝粉和1g塘10×伦109桑枝粉，
或0.5g沙2×伦109桑枝粉、0.5g抗青10号桑枝粉、1g伦教40号桑枝粉和0.5g塘10×伦109桑枝粉，
或0.5g沙2×伦109桑枝粉、1g抗青10号桑枝粉、0g伦教40号桑枝粉和0.5g塘10×伦109桑枝粉，
或0.5g沙2×伦109桑枝粉、1g抗青10号桑枝粉、1g伦教40号桑枝粉和0.5g塘10×伦109桑枝粉制备得到桑枝粉的提取液。
更优选地，所述培养基每1L还含有水提取.5g沙2×伦109桑枝粉、1g抗青10号桑枝粉、1g伦教40号桑枝粉和0.5g塘10×伦109桑枝粉制备得到桑枝粉的提取液。
一种桑枝粉，所述桑枝粉的制备方法为：取桑树枝条，60～65℃烘干至恒重，粉碎至直径为1.5～2mm。
优选地，所述桑枝粉的制备方法为：取沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×伦109的质量比分别为0～0.5：0.5～1：0～1：0.5～1的桑树枝条，60～65℃烘干至恒重，粉碎至直径为1.5～2mm。
更优选地，所述桑枝粉的制备方法为：取沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×伦109的质量比分别为0～0.5：0.5～1：0～1：0.5～1的桑树枝条，剪碎后在真空干燥箱中于60～65℃烘干至恒重，粉碎机中粉碎至直径为1.5～2mm。
更优选地，所述桑枝粉的制备方法为：取沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×伦109的质量比分别为0：0.5：0.5：0.5，或0：1：1：1，或0.5：0.5：1：0.5，或0.5：1：0：0.5，或0.5：1：1：0.5的桑树枝条，剪碎后在真空干燥箱中于60～65℃烘干至恒重，粉碎机中粉碎至直径为1.5～2mm。
更优选地，所述桑枝粉的制备方法为：取沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×伦109的质量比分别为0.5：1：1：0.5的桑树枝条，剪碎后在真空干燥箱中于60～65℃烘干至恒重，粉碎机中粉碎至直径为1.5～2mm。
最优选地，所述桑枝粉的制备方法为：取沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×伦109的质量比分别为0.5：1：1：0.5的桑树枝条，剪碎后在真空干燥箱中于60℃烘干至恒重，粉碎机中粉碎至直径为2mm。
一种桑枝粉的提取液，所述桑枝粉的提取液为所述的桑枝粉的水提取液，所述桑枝粉的水提取液的制备方法为：取所述的桑枝粉，用水煮沸，15～16min后，固液分离，得到桑枝粉的提取液。
优选地，所述桑枝粉的水提取液的制备方法为：取所述的桑枝粉，用水煮沸，15min后，四层纱布过滤，得到桑枝粉的提取液。
所述的桑枝粉和/或桑枝粉的提取液在制备多种桑树品种新梢及叶愈伤组织诱导培养基中的应用，所述桑树品种为沙2×伦109、抗青10号、伦教40号、塘10×伦109、育71-1、抗青283、粤桑11号、试11、强桑1号、强桑5号和龙桑中的一种或几种。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种适用于多种桑树品种新梢及叶愈伤组织诱导的方法。其中桑树品种是广东生产上常见的桑青枯病抗性差异较明显的品种，为沙2×伦109、抗青10号、伦教40号、塘10×伦109、育71-1、抗青283、粤桑11号、试11、强桑1号、强桑5号和龙桑。将采集的桑枝剪切后直接插入无菌水水培，能保证桑枝侧芽高萌发率，结合本发明的外植体消毒方法，能显著降低顶芽及叶片的污染率、褐化率，保证成活率。同时本发明还确定了一种适用于多种桑树品种新梢和叶愈伤组织诱导培养基，该培养基为每1L含有2～3mg 6-苄氨基嘌呤、0～0.2mgα-萘乙酸、0.25～0.5mg 2，4-二氯苯氧乙酸、0.25～0.5mg噻苯隆和0～0.5g沙2×伦109桑枝粉、0.5～1g抗青10号、0～1g伦教40号桑枝粉和0.5～1g塘10×伦109桑枝粉的提取液的MS培养基。采用本发明的诱导方法，将预培养得到的外植体接种于该培养基后，所得桑树品种新梢及叶愈伤组织形成率高，其中沙2×伦109、抗青10号、伦教40号、塘10×109新梢愈伤组织形成率分别为94.66％、97.33％、96％、93.33％；叶片愈伤组织形成率分别为：98.66％、100％、94.66％、97.33％。同时也适用于育71-1、抗青283、粤桑11号、试11、强桑1号、强桑5号和龙桑的新梢愈伤组织诱导，其中对育71-1、抗青283、粤桑11号、试11、强桑1号、强桑5号和龙桑的新梢愈伤组织形成率分别为：84.00％、90.67％、78.67％、70.67％、76.00％、78.67％和64.00％；叶片愈伤组织形成率分别为：86.67％、92.00％、76.00％、80.00％、82.67％、82.67％和70.67％。本发明研究一种能适用于多种桑树品种的愈伤组织诱导方法，不仅能提高工作效率，还能降低人力、物力及时间等成本。本发明以愈伤组织形成率为指标，确定了一种适用于多种桑树品种新梢及叶愈伤组织诱导的方法，该消毒方法和培养基组合，不仅适用于抗青10号、沙2×伦109、塘10×伦109和伦教40号，还适用于育71-1、抗青283、粤桑11号、试11、强桑1号、强桑5号和龙桑，并为桑树抗病机制研究、快速扩繁和无菌无毒苗的获得等品种保存及育种提供实验材料和实验基础。
附图说明
图1为不同浓度6-BA对4个品种桑树新梢愈伤组织诱导的影响，图中同品种柱形图上不同小写字母表示水平间差异显著(P<0.05)。
图2为不同浓度NAA对4个品种桑树新梢愈伤组织诱导的影响，图中同品种柱形图上不同小写字母表示水平间差异显著(P<0.05)。
图3为不同浓度2，4-D对4个品种桑树新梢愈伤组织诱导的影响，图中同品种柱形图上不同小写字母表示水平间差异显著(P<0.05)。
图4为不同浓度TDZ对4个品种桑树新梢愈伤组织诱导的影响，图中同品种柱形图上不同小写字母表示水平间差异显著(P<0.05)。
图5为4个品种桑树新梢在正交试验确定的4种最优培养基中的愈伤组织诱导情况，图中同品种柱形图上不同小写字母表示水平间差异显著(P<0.05)。
图6为桑枝粉组分配比对桑新梢愈伤组织诱导，图中同品种柱形图上不同小写字母表示水平间差异显著(P<0.05)。
图7为最佳培养基对4个品种桑树新梢及叶片愈伤组织诱导验证实验，图中同品种柱形图上不同小写字母表示水平间差异显著(P<0.05)。
图8为4个品种桑树新梢及叶片愈伤组织，其中A～D分别为沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×伦109的新梢愈伤组织；E～H分别为沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×伦109的叶愈伤组织。
图9为桑树品种分别为育71-1、抗青283、粤桑11号、试11、强桑1号、强桑5号、龙桑、荆桑、鸡桑、桂优12、台湾桑、无籽大10、黑珍珠和农桑14的新梢和叶片愈伤组织形成率。
图10为桑树品种分别为育71-1、抗青283、粤桑11号、试11、强桑1号、强桑5号和龙桑的新梢愈伤组织。
图11为桑树品种分别为育71-1、抗青283、粤桑11号、试11、强桑1号、强桑5号和龙桑的叶片愈伤组织。
图12为外植体培养前不同水培方法对桑芽萌发的影响。
图13为次氯酸钠消毒法对4个品种桑树顶芽及叶片污染率、褐化率和成活率的影响。
图14为氯化汞消毒法对4个品种桑树顶芽及叶片污染率、褐化率和成活率的影响。
图15为本发明实施例1的消毒法对4个品种桑树顶芽及叶片污染率、褐化率和成活率的影响。
图16为采用6-BA浓度为2.0mg/L和NAA浓度为0.2mg/L的MS(HB8469)培养基诱导桑新梢和叶愈伤组织的形成率。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
选择采自华南农业大学亚太地区蚕桑培训中心桑园(北纬23°9’43”，东经113°20’46”)2021年4～9月份的沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×伦109的桑枝，并带有侧芽且直径为0.5～1cm。
MS(HB8469)培养基购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，所述培养基配方为：硝酸钾1900(mg/L)、硝酸铵1650(mg/L)、磷酸二氢钾170(mg/L)、硫酸镁370(mg/L)、氯化钙440(mg/L)、碘化钾0.83(mg/L)、硼酸6.2(mg/L)、硫酸锰22.30(mg/L)、硫酸锌8.6(mg/L)、钼酸钠0.25(mg/L)、硫酸铜0.025(mg/L)、氯化钴0.025(mg/L)、乙二胺四乙酸二钠37.3(mg/L)、硫酸亚铁27.8(mg/L)、肌醇100(mg/L)、甘氨酸2(mg/L)、盐酸硫胺素0.1(mg/L)、盐酸吡哆醇0.5(mg/L)、烟酸0.5(mg/L)、蔗糖30000(mg/L)、琼脂7000(mg/L)、pH值5.7±0.1；植物生长调节剂α-萘乙酸(NAA，N814985-25g)、6-苄氨基嘌呤(6-BA，B802626-25g)、噻苯隆(TDZ，T818542-25mg)和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D，D806753-100g)均购自上海麦克林生化科技有限公司；链霉素(AS325-25g)及聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40，DH269)。
实施例1一种桑新梢和叶愈伤组织培养的预处理方法
1.外植体培养
桑枝去叶后剪至长度约10cm，插入40mL无菌水中，置于25℃、80％湿度、光照12h/d和光照强度1500～2000lx的人工气候培养箱中培养15d，侧芽萌发后形成的3～4cm新梢与其幼叶为组培外植体材料。
2.外植体消毒
新梢消毒方法：取下上述步骤1培养后的新梢，去掉叶片，于无菌水中清洗3次后，在质量浓度80％乙醇溶液中浸泡30s后，用无菌水冲洗3遍，再用质量浓度0.05％氯化汞标准液浸泡20min后，用无菌水清洗6遍，于200mL含有质量浓度0.2％青霉素+质量浓度0.2％链霉素的无菌水中，25℃下浸泡12h，最后用质量浓度0.1％氯化汞标准液浸泡8min后，用无菌水冲洗干净。
叶片消毒方法：将新梢第3、4片叶子先无菌水中清洗3次后，在质量浓度80％乙醇溶液中浸泡30s，用无菌水冲洗3遍，再用质量浓度0.1％氯化汞标准液浸泡10min后，用无菌水清洗6遍。
3.外植体预培养
新梢预培养：将步骤3消毒后的新梢，剪切至2～3cm长后，接种到含有琼脂7g/L和蔗糖30g/L，初始pH为5.8的培养基中，置于黑暗条件下，25℃预培养7d。
叶片预培养，将步骤3消毒后的叶片，剪切至2×3cm大小后，接种到含有琼脂7g/L和蔗糖30g/L，初始pH为5.8培养基中，置于黑暗条件下，25℃预培养7d。
所培养的外植体用于后续诱导愈伤组织。
实施例2不同浓度6-BA对4个品种桑树新梢愈伤组织诱导的影响
1.实验方法
选择沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×109，共4个品种桑，按照实施例1的桑新梢愈伤组织培养的预处理方法进行预处理，得到无污染、无褐化且生长良好的预培养新梢外植体，将其分别接种于含有6-BA的浓度分别为0mg/L、1mg/L、2mg/L、3mg/L和4mg/L，NAA浓度为0.2mg/L、2，4-D浓度为0mg/L和TDZ浓度为0mg/L的MS(HB8469)的培养基中，对桑新梢进行愈伤组织诱导。4个品种桑树品种材料，分别接种为25个，平行3次，置于黑暗条件下，25℃培养20d后，再置于光照强度1500～2000lx，光照12h/d，培养10d后，统计4个品种桑品种愈伤组织诱导率。
2.实验结果
结果如图1所示，在含有6-BA浓度为2mg/L，NAA浓度为0.2mg/L的MS(HB8469)培养基中，抗青10号和伦教40号愈伤组织诱导率最高，分别为32％和21.333％，且显著高于其他四组(P<0.05)；在6-BA浓度为3mg/L，NAA浓度为0.2mg/L的MS(HB8469)时，沙2×伦109和塘10×109愈伤组织诱导率最高，分别为32％和34.66％，且显著高于其他四组(P<0.05)。培养基质添加6-BA与NAA两种激素，沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×109愈伤组织形成率均在35％以下，并且不同品种之间愈伤组织形成率差异大。
实施例3不同浓度NAA对4个品种桑树新梢愈伤组织诱导的影响
1.实验方法
选择沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×109，共4个品种桑，按照实施例1的桑新梢愈伤组织培养的预处理方法进行预处理，得到无污染、无褐化且生长良好的预培养新梢外植体，将其分别接种于含有NAA浓度分别为0mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L和0.8mg/L，6-BA浓度为2mg/L、2，4-D浓度为0mg/L和TDZ浓度为0mg/L的MS(HB8469)的培养基中，对桑新梢进行愈伤组织诱导。其余培养条件见实施例2。
2.实验结果
结果如图2所示，在含有NAA浓度为0.2mg/L，6-BA浓度为2mg/L的MS(HB8469)培养基中，抗青10号和伦教40号愈伤组织诱导率最高，分别为32％和21.333％，且显著高于其他四组(P<0.05)；NAA浓度为0.4mg/L，6-BA浓度为2mg/L的MS(HB8469)时，沙2×伦109和塘10×109愈伤组织诱导率最高，分别为24％和21.333％，且显著高于NAA浓度分别为0mg/L和0.8mg/L时，愈伤组织诱导率(P<0.05)。培养基质添加6-BA与NAA两种激素，沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×109愈伤组织形成率均在35％以下，并且不同品种之间愈伤组织形成率差异大。
实施例4不同浓度2,4-D对4个品种桑树新梢愈伤组织诱导的影响
1.实验方法
选择沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×109，共4个品种桑，按照实施例1的桑新梢愈伤组织培养的预处理方法进行预处理，得到无污染、无褐化且生长良好的预培养新梢外植体，将其分别接种于含有2，4-D浓度分别为0mg/L、0.25mg/L、0.5mg/L、0.75mg/L和1.0mg/L，6-BA浓度为2mg/L，NAA浓度为0.2mg/L和TDZ浓度为0mg/L的MS(HB8469)的培养基中，对桑新梢进行愈伤组织诱导。其余培养条件见实施例2。
2.实验结果
结果如图3所示，在含有2，4-D浓度为0.25mg/L，6-BA浓度为2mg/L和NAA浓度为0.2mg/L的MS(HB8469)培养基中，伦教40号、塘10×109愈伤组织诱导率最高，分别为52％和48％，伦教40号愈伤组织形成率显著高于其他4组(P<0.05)，塘10×109显著高于2，4-D浓度分别为0mg/L、0.75mg/L以及1mg/L(P<0.05)的处理。
2，4-D浓度为0.5mg/L，6-BA浓度为2mg/L和NAA浓度为0.2mg/L的MS(HB8469)培养基时，沙2×伦109和抗青10号愈伤组织诱导率最高，分别为38.66％和50.66％，抗青10号显著性高于2，4-D浓度分别为0mg/L、0.75mg/L以及1mg/L(P<0.05)的处理，沙2×109显著性高于2，4-D浓度分别为0mg/L、1mg/L(P<0.05)的处理。在培养基中添加少量的2，4-D能够将这4个品种桑树新梢愈伤组织形成率提高到50％左右，表明其能显著提高4种不同桑树新梢愈伤组织诱导能力(P<0.05)。
实施例5不同浓度TDZ对4个品种桑树新梢愈伤组织诱导的影响
1.实验方法
选择沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×109，共4个品种桑，按照实施例1的桑新梢愈伤组织培养的预处理方法进行预处理，得到无污染、无褐化且生长良好的预培养新梢外植体，将其分别接种于含有TDZ浓度分别为0mg/L、0.25mg/L、0.5mg/L、0.75mg/L和1.0mg/L，6-BA浓度为2mg/L，2，4-D浓度为0mg/L和NAA浓度为0.2mg/L的MS(HB8469)的培养基中，对桑新梢进行愈伤组织诱导。其余培养条件见实施例2。
2.实验结果
结果如图4所示，在含有TDZ浓度为0.25mg/L，6-BA浓度为2mg/L和NAA浓度为0.2mg/L的MS(HB8469)培养基中，抗青10号、伦教40号和塘10×109的愈伤组织诱导率最高，分别为69.33％、60％和56％，且均显著性高于其他4组；
TDZ浓度为0.5mg/L，6-BA浓度为2mg/L和NAA浓度为0.2mg/L的MS(HB8469)培养基时，沙2×伦109愈伤组织诱导率最高为64％，显著性高于TDZ浓度分别为0mg/L、0.75mg/L以及1mg/L(P<0.05)的处理。在培养基中添加少量的TDZ能够将这4个品种桑树新梢愈伤组织形成率提高到接近70％，表明其能显著提高4种不同桑树新梢愈伤组织诱导能力(P<0.05)。
实施例6正交实验确定4个品种桑树新梢愈伤组织诱导培养基
1.实验方法
依据上述实施例2～5关于4种激素6-BA、NAA、2，4-D和TDZ单因素最优实验结果，设计L9(34)正交实验，如表1所示，A代表6-BA，浓度分别为1mg/L、2mg/L和3mg/L；B代表NAA，浓度分别为0mg/L、0.2mg/L和0.4mg/L；C代表2，4-D，浓度分别为0mg/L、0.25mg/L和0.5mg/L；D代表TDZ，浓度分别为0mg/L、0.25mg/L和0.5mg/L；设计四因素三水平正交实验。
选择沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×109，共4个品种桑，按照实施例1的桑新梢愈伤组织培养的预处理方法进行预处理，得到无污染、无褐化且生长良好的预培养新梢外植体，将其分别接种于含有不同植物激素配比的愈伤组织诱导培养基中，对桑新梢进行愈伤组织诱导，培养条件见实施例2。
用Origin 2019b、IBM SPSS Statistics、微软公司Excle软件进行统计分析，各指标计算公式如下：
新梢愈伤组织形成率＝无污染形成新黄色组织的新梢外植体个数/新梢接种的总数×100％。
叶愈伤组织形成率＝无污染形成新黄色组织的叶外植体个数/叶片接种的总数×100％。
取3组数据平均值，进行方差分析、极差分析和多重比较等。
表1 4个品种桑树新梢愈伤组织诱导培养基正交试验设计因素水平
2.试验结果
结果由表2可知，沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×伦109，4个品种桑树品种在实验号为1～9种不同植物激素配方培养基中，4个品种桑树品种愈伤组织形成率具有明显差异(P<0.05)。沙2×109愈伤组织形成率在第5组和第7组最高，为65.33％，在第9组中最低，为14.67％；抗青10号在第7组愈伤组织形成率最高，为92％，在第9组中最低，为29.33％；伦教40号在第7组愈伤组织形成率最高为90.67％，在第1组和第9组最低，均为17.33％；塘10×109在第7组愈伤组织形成率最高，为88％，在3组中最低，为17.33％。表明1～9组中，第7组最适合用于4个品种桑树品种愈伤组织的诱导。
极差分析表明，4种植物激素因素的不同水平对沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×伦109愈伤组织诱导影响有差异。在沙2×伦109、伦教40号和塘10×伦109愈伤组织诱导中4种激素对其愈伤组织形成率影响大小分别为A＝B＝C＝D＝0，在抗青10号中分别为A＝B＝D＝0<C＝0.02。由极差分析结果可知，6-BA、NAA、2，4-D和TDZ对4个品种桑树品种愈伤组织形成率影响显著(P<0.05)。
由四种不同因素水平的多重比较分析可知，在沙2×伦109愈伤组织中6-BA浓度为2mg/L形成率显著高于1mg/L和3mg/L(P<0.05)；NAA浓度为0.2mg/L时愈伤组织形成率最高，且显著高于0.4mg/L(P<0.05)，0mg/L时不显著(P>0.05)；2，4-D浓度为0.5mg/L显著高于0mg/L和0.25mg/L(P<0.05)；TDZ浓度为0.5mg/L最高，且显著高于0mg/L(P<0.05)，高于TDZ为0.25mg/L时，但不显著(P>0.05)。也可以看出随着培养基中NAA添加量的增加，抗青10号、伦教40号、塘10×伦109愈伤组织形成率也随之下降，而沙2×伦109是在NAA为0.2mg/L时达到最高后下降，这表明添加培养基中只添加NAA生长激素或添加过高的NAA都不利于这4个品种桑树愈伤组织的诱导。综合四种因素最优水平，沙2×伦109愈伤组织诱导最优组合为A2B2C3D3。同理上述多重比较分析抗青10号与伦教40号愈伤组织诱导最优组合均为A2B1C3D2，塘10×伦109为A3B1C2D2。
表2 4个品种桑树新梢愈伤组织诱导培养基正交试验结果
注：表中数据为3次重复的平均值。试验号为1～9的处理的同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)；S1～S3、K1～K3、L1～L3和T1～T3分别在不同激素水平下，沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×伦109愈伤组织形成率的均值；S1～S3、K1～K3、L1～L3和T1～T3同列数据后不同小写字母表示水平间差异显著(P<0.05)；Sig代表显著性差异。
可以看出，实验中比较好的组合为第7组(3mg/L 6-BA+0mg/L NAA+0.5mg/L 2，4-D+0.25mg/L TDZ)，通过方差分析沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×伦109最优组合分别A2B2C3D3(2mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.5mg/L 2，4-D+0.5mg/L TDZ)、A2B1C3D2(2mg/L 6-BA+0mg/L NAA+0.5mg/L 2，4-D+0.25mg/L TDZ)和A3B1C2D2(3mg/L 6-BA+0mg/L NAA+0.25mg/L 2,4-D+0.25mg/L TDZ)，选择沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×伦109，共4个品种桑，按照实施例1的桑新梢愈伤组织培养的预处理方法进行预处理，得到无污染、无褐化且生长良好的预培养新梢外植体，将其接种于这4种培养基中，对桑新梢进行愈伤组织诱导，培养方法与实施例2相同。
结果如图5所示：沙2×伦109在A2B2C3D3中愈伤组织形成率为84％，且显著高于其余三组(P<0.05)；抗青10号在A2B2C3D3中愈伤组织形成率为90.66％，且显著高于其余三组(P<0.05)；伦教40号在第7组中愈伤组织形成率最高为86.6％但与A2B2C3D3、A3B1C2D2差异不明显(P>0.05)；塘10×伦109在A2B2C3D3和A3B1C2D2均最高为84％。因此MS(HB8469)培养基中含有2～3mg/L 6-BA、0～0.2mg/L NAA、0.25～0.5mg/L 2，4-D和0.25～0.5mg TDZ都能使愈伤组织形成率达到较高水平，同时A2B2C3D3是适用于4个品种桑树品种愈伤组织诱导培养基。
实施例7桑枝粉中四种组分配比对桑新梢愈伤组织诱导的影响
1.试验方法
桑枝干粉的制备方法：选择将沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×伦109四种桑树品种枝条，分别剪碎后在真空干燥箱中于60℃烘干至恒重，粉碎机中粉碎至直径为2mm，并设计L16(44)正交实验。
沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×伦109制作的桑枝粉采用1～16种不同配比，用水煮沸，15min后，四层纱布过滤后的提取液加入MS(HB8469)+2mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA+0.5mg/L 2，4-D+0.5mg/LTDZ培养基中。按照实施例1的桑新梢愈伤组织培养的预处理方法进行预处理，得到无污染、无褐化且生长良好的预培养新梢外植体，将其分别接种于上述含有不同桑枝粉的提取液配比的愈伤组织诱导培养基中，对桑新梢进行愈伤组织诱导，其余培养条件与实施例2相同。各指标计算公式如实施例6所示。
如表3所示：
A代表沙2×伦109桑枝粉，每1L上述MS(HB8469)培养基还分别含有水提取0g、0.5g、1g和1.5g沙2×伦109桑枝粉制备得到桑枝粉的提取液；
B代表抗青10号桑枝粉，每1L上述MS(HB8469)培养基还分别含有水提取0g、0.5g、1g和1.5g抗青10号桑枝粉制备得到桑枝粉的提取液；
C代表伦教40号桑枝粉，每1L上述MS(HB8469)培养基还分别含有水提取0g、0.5g、1g和1.5g伦教40号桑枝粉制备得到桑枝粉的提取液；
D代表塘10×伦109桑枝粉，每1L上述MS(HB8469)培养基还分别含有水提取0g、0.5g、1g和1.5g塘10×伦109桑枝粉制备得到桑枝粉的提取液。
表3桑枝粉各组分添加量对桑新梢愈伤组织诱导正交试验设计因素水平
2.试验结果
结果由表4可知，四种桑树新梢愈伤组织形成率具有明显差异(P<0.05)。沙2×伦109、抗青10号、伦教40号、塘10×伦109愈伤组织形成率均在第2组最高，分别为90.67％、97.33％、90.67％和93.33％；沙2×伦109及抗青10号愈伤组织形成率最低均为第15组，分别为53.33％和60％；伦教40号在第13组愈伤组织形成率达到最低为45.33％；塘10×伦109愈伤组织形成率最低，为第14、15组，均为45.33％。
由表4的极差分析表明，4种因素的不同水平对沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×伦109愈伤组织诱导影响有差异。在沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×伦109愈伤组织诱导中四种桑枝粉的提取液对其愈伤组织形成率影响大小分别为A＝B＝C＝D＝0。由极差分析结果可知，这四种桑树桑枝粉的提取液对四种桑树品种愈伤组织形成率影响显著(P<0.05)。
由4种不同因素水平的多重比较分析可知，在沙2×伦109愈伤组织中沙2×伦109桑枝粉为0.5g形成率显著高于0g、1g、和1.5g(P<0.05)；抗青10号桑枝粉为0.5g时愈伤组织形成率最高，且显著高于0g、1g、和1.5g(P<0.05)；伦教40号桑枝粉为1g显著高0g、0.5g、和1.5g(P<0.05)；塘10×伦109桑枝粉为0.5g最高，且显著高于0g、1g、和1.5g(P<0.05)，沙2×伦109愈伤组织诱导最优组合为A2B2C3D2。同理上述多重比较分析抗青10号与伦教40号及塘10×伦109愈伤组织诱导最优组合分别为A2B3C1D2、A2B2C3D2、A2B3C3D2。
表4桑枝粉各组分配比对桑新梢愈伤组织诱导正交结果
注：表中数据为3次重复的平均值。处理1～16的同列数据后不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)；S1～S4、K1～K4、L1～L4、T1～T4分别在不同桑枝粉配比水平下，沙2×伦109、抗青10号、伦教40号、塘10×伦109愈伤组织形成率的均值；S1～S4、K1～K4、L1～L4、T1～T4同列数据后不同小写字母表示水平间差异显著(P<0.05)；Sig代表显著性差异。
桑枝粉的提取液比较好的组合为第2组(沙2×伦109桑枝粉0g+抗青10号桑枝粉0.5g+伦教40号桑枝粉0.5g+塘10×伦109桑枝粉0.5g)，第3组(沙2×伦109桑枝粉0g+抗青10号桑枝粉1g+伦教40号桑枝粉1g+塘10×伦109桑枝粉1g)通过方差分析沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×伦109最优组合分别A2B2C3D2(沙2×伦109桑枝粉0.5g/+抗青10号桑枝粉0.5g+伦教40号桑枝粉1g+塘10×伦109桑枝粉0.5g)、A2B3C1D2(沙2×伦109桑枝粉0.5g+抗青10号桑枝粉1g+伦教40号桑枝粉0g+塘10×伦109桑枝粉0.5g)、A2B3C3D2(沙2×伦109桑枝粉0.5g+抗青10号桑枝粉1g+伦教40号桑枝粉1g+塘10×伦109桑枝粉0.5g)，将四种桑树品种预培养后新梢接种于这五种培养基中培养。
结果如图6所示：沙2×伦109在A2B2C3D2中愈伤组织形成率为97.33％，且显著高于其余三组(P<0.05)；抗青10号在A2B3C3D2中愈伤组织形成率为98.67％；伦教40号在第3组中愈伤组织形成率最高为94.67％但与A2B2C3D2、A2B3C3D2差异不明显(P>0.05)；塘10×伦109在第2组最高为94.67％但与A2B2C3D2、A2B3C3D2。A2B2C3D2、A2B3C3D2中A2B3C3D2组间方差小于A2B2C3D2，因此，选择A2B3C3D2作为适用于四种桑树品种愈伤组织诱导培养基桑枝粉的提取液添加配比，培养基最终配方为：MS(HB8469)+2mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.5mg/L 2，4-D+0.5mg/LTDZ+桑枝粉的提取液(水提取沙2×伦109桑枝粉0.5g+抗青10号桑枝粉1g+伦教40号桑枝粉1g+塘10×伦109桑枝粉0.5g的桑枝粉制备得到桑枝粉的提取液)。因此每1L MS(HB8469)+2mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.5mg/L 2,4-D+0.5mg/LTDZ培养基中还含有水提取0～0.5g沙2×伦109桑枝粉、0.5～1g抗青10号、0～1g伦教40号桑枝粉和0.5～1g塘10×伦109的桑枝粉制备得到桑枝粉的提取液，都能使愈伤组织形成率达到较高水平，同时A2B3C3D2是适用于4个品种桑树品种愈伤组织诱导培养基。
实施例8桑新梢和叶愈伤组织诱导培养基
每1L MS(HB8469)培养基含有2mg 6-BA、0.2mg NAA、0.5mg 2，4-D、0.5mg TDZ，还含有水提取沙2×伦109桑枝粉0.5g、抗青10号桑枝粉1g、伦教40号桑枝粉1g和塘10×伦109桑枝粉0.5g的桑枝粉制备得到桑枝粉的提取液。
其中桑枝粉的提取液的制备方法见实施例7。
实施例9桑新梢和叶愈伤组织诱导
1.实验方法
选择沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×伦109，共4个品种桑，按照实施例1的桑新梢和叶愈伤组织培养的预处理方法进行预处理，得到无污染、无褐化且生长良好的预培养新梢和叶外植体，将其接种于实施例8的桑新梢和叶愈伤组织诱导培养基中，对桑新梢和叶进行愈伤组织诱导，培养方法与实施例2相同。
2.实验结果
结果如图7所示，新梢及叶片愈伤组织诱导均在90％以上，其中沙2×伦109、抗青10号、伦教40号、塘10×伦109新梢愈伤组织形成率分别为94.66％、97.33％、96％、93.33％；94.66％、97.33％、96％、93.33％叶片愈伤组织形成率分别为：98.66％、100％、94.66％、97.33％、98.66％、100％、94.66％、97.33％。
如图8所示，分别为实施例9实验中沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×伦109新梢及叶的愈伤组织。可见愈伤组织生长状况良好，新梢愈伤组织形成，主要从接触培养基的基部开始膨大，形成一团黄色的，组织质地较为硬的一团无规则组织。叶愈伤组织形成，主要从叶柄和受伤叶脉形成一团质地较为硬黄色无规则组织。
实施例10愈伤组织诱导方法对其他桑树品种愈伤组织形成率的影响
1.实验方法
选择广东桑：育71-1、抗青283、粤桑11号、龙桑、广东荆桑、试11、无籽大10、黑珍珠；浙江桑：强桑1号、强桑5号、农桑14；日本桑：鸡桑；广西桑：桂优12；台湾桑：长果桑，共14个品种桑，按照实施例1的桑新梢和叶愈伤组织培养的预处理方法进行预处理，得到无污染、无褐化且生长良好的新梢和叶外植体，将其接种于实施例8的桑新梢和叶愈伤组织诱导培养基中，对桑新梢和叶片进行愈伤组织诱导，培养方法与实施例2相同。
2.实验结果
结果如图9所示，本发明的愈伤组织诱导方法对于育71-1、抗青283、粤桑11号、试11、强桑1号、强桑5号及龙桑的新梢及叶片愈伤组织诱导形成率均超过60％，新梢愈伤组织形成率分别为：84.00％、90.67％、78.67％、70.67％、76.00％、78.67％、64.00％；叶片愈伤组织形成率分别为：86.67％、92.00％、76.00％、80.00％、82.67％、82.67％、70.67％；如图10和图11所示，分别为育71-1、抗青283、粤桑11号、试11、强桑1号、强桑5号及龙桑的新梢和叶片的愈伤组织。可见愈伤组织生长状况良好，新梢愈伤组织形成，主要从接触培养基的基部开始膨大，形成一团黄色的，组织质地较为硬的一团无规则组织。
而其他品种新梢愈伤组织诱导均低于60％，叶片愈伤组织诱导均低于65％。本发明的技术方法诱导荆桑、鸡桑、桂优12、台湾桑、无籽大10、黑珍珠和农桑14的新梢愈伤组织形成率分别为20％、26.67％、56％、18.67％、14.67％、18.67％和20％；叶片愈伤组织形成率分别为：30.67％、29.33％、64％、29.33％、32％、21.333％和14.67％。
因此本发明的愈伤组织诱导方法不仅可以适用沙2×伦109、抗青10号、伦教40号和塘10×伦109，还适用于育71-1、抗青283、粤桑11号、试11、强桑1号、强桑5号及龙桑的新梢及叶片愈伤组织诱导，都具有很好的愈伤组织形成率。
同时也可以看出，本发明的技术方案不太适用于荆桑、鸡桑、桂优12、台湾桑、无籽大10、黑珍珠和农桑14的新梢及叶片愈伤组织诱导。因此研究一种适用于多种桑新梢和叶愈伤组织诱导的方法和培养基是有难度的，不同植物品种之间，愈伤组织的形成对培养条件的要求不同。本发明确定了一种能适用于多种桑树品种的愈伤组织诱导方法和培养基，不仅能提高工作效率，还能降低人力、物力及时间等成本。
对比例1桑枝水培条件对桑枝侧芽萌发率的影响
1.实验方法
(1)桑枝未消毒加抗生素水培
采摘桑枝后，用洗衣粉清洗表面杂质，将清洗后的桑枝条直接放入含有质量浓度0.02％氯霉素、质量浓度0.02％链霉素和质量浓度0.05％多菌灵的无菌水中，后续在人工气候培养箱中的培养方法与实施例1中外植体培养方法相同，观察侧芽萌发情况，记录萌发率。
(2)桑枝加亚迪欣消毒后无菌水水培
采摘的桑枝后，用洗衣粉清洗表面杂质。
配制蚕用亚迪欣10g/L溶液，再将洗净后的桑枝条放入配制好的蚕用亚迪欣溶液中浸泡消毒12h，后取出插入含有40mL无菌水中，后续在人工气候培养箱中的培养方法与实施例1中外植体培养方法相同，观察侧芽萌发情况，记录萌发率。
2.实验结果
结果如图12所示，桑枝未消毒加抗生素水培的处理方法，不利于桑枝条侧芽的萌发，4个品种桑枝的萌发率分别为6.67％、21.333％、17.33％和5.33％，均低于22％
采用桑枝加亚迪欣消毒后无菌水水培的处理方法，4个品种桑枝的萌发率分别为76％、81.333％、81.333％和74.67％，虽然超过74％的桑枝条侧芽能正常萌发，但在实验过程中发现水培后的水培液变混浊，并且部分桑枝条腐烂，萌发后的桑芽有枯萎等症状，不适合用于组织培养。
而采用实施例1中步骤2的外植体培养方法，4个品种桑枝的萌发率分别为98.67％、100％、100％和92％，超过92％的桑枝条侧芽能正常萌发，甚至能达到100％，而消毒过后的桑枝条在无菌水培过程中，水培液依然清澈，桑枝条腐烂不明显，且生长状态良好。因此采用实施例1中步骤2的外植体培养方法可以保证桑枝条侧芽的正常萌发，使其生长状态良好，可以为桑树抗青枯病的抗性机制研究、快速扩繁和无菌无毒苗的获得提供基础。
对比例2外植体消毒条件对桑顶芽和叶污染率、褐化率和成活率的影响
1.实验方法
(1)次氯酸钠消毒法
将田间抗青10号、沙2×伦109、塘10×伦109和伦教40号4个品种桑树顶端4～5cm桑顶芽及幼叶采回，先用质量浓度5％肥皂水水洗5min后，自来水流水冲洗2h，用质量浓度75％乙醇消毒30s，再用20g/L的NaClO消毒8min。将顶芽及叶片经过如上消毒处理后，去2cm顶芽，接种在含有2mg/L 6-BA和0.2mg/L NAA的MS(HB8469)培养基中，培养10d后，统计污染率、褐化率和成活率，每组接种25个，平行3次。
(2)氯化汞消毒法
将田间抗青10号、沙2×伦109、塘10×伦109和伦教40号4个品种桑树顶端4～5cm桑顶芽及幼叶采回，用含有质量浓度5％洗衣粉水中浸泡10min，流水冲洗2h后，用质量浓度70％的酒精处理20～30s，无菌水冲洗1～2次，用质量浓度0.1％升汞溶液处理8min后，无菌水冲洗5～8次。将顶芽及叶片经过如上消毒处理后，去2cm顶芽，接种在含有2mg/L 6-BA和0.2mg/L NAA的MS(HB8469)培养基中，培养10d后，统计污染率、褐化率、成活率、每组接种25个，平行3次。
(3)实施例1的消毒法
将抗青10号、沙2×伦109、塘10×伦109和伦教40号4个品种桑树顶芽及叶片经过采用实施例1的方法进行水培和消毒处理后，去2cm顶芽，接种在含有2mg/L 6-BA和0.2mg/LNAA的MS(HB8469)培养基中，培养10d后，统计污染率、褐化率、成活率、每组接种25个，平行3次。
次氯酸钠消毒法的结果如图13所示：4种材料顶芽污染率均超过84％，叶片污染率均超过65％，成活率均低于1.5％。表明此方法微生物污染太过严重，不适用于4种材料的消毒方法。
氯化汞消毒法的结果如图14所示：4种材料顶芽的污染率均超过50％，叶片的污染率均超过37％；顶芽的褐化率均高于9％，叶片的褐化率均高于29％；顶芽的成活率均低于29％，叶片的成活率均低于27％。表明此方法较于上述次氯酸钠方法，污染率有所下降，但由于成活率低，叶片褐化率高等原因，不适用于4种材料的消毒方法。
实施例1的消毒法的结果如图15所示：4种材料顶芽的污染率均低于44％，叶片的污染率均低于4％；顶芽和叶片的褐化率均低于4％；顶芽的成活率均高于56％，叶片的成活率均高于93％。表明此方法较于上述次两种消毒方法，污染率明显下降，新梢褐化率为0％，叶片褐化率也低于4％，成活率大大提高，新梢最高的成活率为抗青10号，为69.33％，叶片成活率最高可达到96％，因此适用于4种材料的消毒方法。
对比例3其他培养基对桑新梢及叶片愈伤组织形成率的影响
1.实验方法
选择抗青10号、沙2×伦109、塘10×伦109和伦教40号，共4个品种桑，按照实施例1的桑新梢和叶愈伤组织培养的预处理方法进行预处理，得到无污染、无褐化且生长良好的预培养新梢和叶片外植体，将其接种于含有2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA的MS(HB8469)培养基中，对桑新梢和叶片进行愈伤组织诱导。所述培养基配方来源于文献：卢绪兴,徐军涛,刘发余,孙业忠.农桑12、14号组培快繁技术研究[J].北方蚕业,2004,2(02):15-16。
2.试验结果
结果如图16所示，抗青10号新梢及叶片愈伤组织形成率最高分别为32％、50％；沙2×伦109、伦教40号、塘10×伦109新梢形成率差异不显著，分别为：21.3333％、21.333％、20％，叶片愈伤组织形成率差异不显著，分别为38.85％、35.81％、38.09％。4个品种桑新梢和叶片的愈伤组织形成率较低，表明该文献中的培养基并不适宜于4个品种桑新梢及叶片的愈伤组织诱导。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种适用于多种桑树品种新梢及叶愈伤组织诱导的方法，其特征在于，所述桑树品种为沙2×伦109、抗青10号、伦教40号、塘10×伦109、育71-1、抗青283、粤桑11号、试11、强桑1号、强桑5号和龙桑的一种或几种，所述诱导的方法包括以下步骤：
S1：采集桑枝：桑枝去叶后剪至长度为9～11 cm，在无菌水中水培至侧芽萌发形成3～4cm的新梢，取新梢和/或幼叶作为组培外植体材料；
S2：消毒外植体：所述外植体为新梢，将新梢用无菌水清洗3～4次后，用质量浓度为75～80%乙醇溶液浸泡30～35 s，再用无菌水冲洗3～4次，质量浓度0.04～0.05%氯化汞浸泡20～22 min后，再用无菌水清洗6～7次，在含有质量浓度0.19～0.21%青霉素和质量浓度0.19～0.21%链霉素的无菌水中，26～27 ℃下浸泡11.5～12.5 h，再用质量浓度0.09～0.11%氯化汞浸泡8～9 min后，用无菌水冲洗；
所述外植体为幼叶，将幼叶先用无菌水清洗3～4次后，用质量浓度75～80%乙醇溶液浸泡30～35 s，再用无菌水冲洗3～4次，质量浓度0.09～0.11%氯化汞标准液浸泡10～11 min后，再用无菌水清洗；
S3：外植体预培养：将步骤S2消毒后的外植体剪切后接种到由琼脂和蔗糖组成的培养基上培养；
S4：诱导愈伤组织：将步骤S3预培养后的外植体接种到由6-苄氨基嘌呤、α-萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸、噻苯隆、桑枝粉的提取液、MS培养基组成的愈伤组织诱导培养基上进行培养，得到愈伤组织；其中6-苄氨基嘌呤浓度为2～3 mg/L，α-萘乙酸为0～0.2 mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸为0.25～0.5 mg/L，噻苯隆为0.25～0.5 mg/L，桑枝粉提取液为水提取0～0.5g沙2×伦109桑枝粉、0.5～1 g抗青10号、0～1 g伦教40号桑枝粉和0.5～1 g 塘10×伦109桑枝粉制备得到。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，培养条件为温度26～27 ℃，湿度79～81%，光照11.5～12.5 h/d，光照强度1500～2000 lx，培养15～16 d。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中，所述外植体为新梢，剪切至2～3cm长后，接种到由琼脂7 g/L和蔗糖30 g/L组成，初始pH为5.8的培养基中，置于黑暗条件下，25 ℃预培养7 d；所述外植体为幼叶，剪切后接种到由琼脂7 g/L和蔗糖30 g/L组成，初始pH为5.8培养基中，置于黑暗条件下，25 ℃预培养7 d。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中，愈伤组织诱导培养基由MS基本培养基、2 mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.2 mg/L α-萘乙酸、0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0.5 mg/L噻苯隆及水提取0.5 g沙2×伦109桑枝粉、1 g抗青10号桑枝粉、1 g伦教40号桑枝粉和0.5g塘10×伦109桑枝粉制备得到桑枝粉的提取液组成。
5.一种桑树新梢及叶愈伤组织诱导培养基，其特征在于，所述培养基由MS基本培养基、2～3 mg/L 6-苄氨基嘌呤、0～0.2 mg/L α-萘乙酸、0.25～0.5 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、0.25～0.5 mg/L 噻苯隆及桑枝粉提取液组成，所述桑枝粉提取液为水提取0～0.5 g沙2×伦109桑枝粉、0.5～1 g抗青10号、0～1 g伦教40号桑枝粉和0.5～1 g 塘10×伦109桑枝粉制备得到。
6.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于，所述桑枝粉提取液中桑枝粉含量为0 g沙2×伦109桑枝粉、0.5 g抗青10号桑枝粉、0.5 g伦教40号桑枝粉和0.5 g塘10×伦109桑枝粉，
或0 g沙2×伦109桑枝粉、1 g抗青10号桑枝粉、1 g伦教40号桑枝粉和1 g塘10×伦109桑枝粉，
或0.5 g沙2×伦109桑枝粉、0.5 g抗青10号桑枝粉、1 g伦教40号桑枝粉和0.5 g塘10×伦109桑枝粉，
或0.5 g沙2×伦109桑枝粉、1 g抗青10号桑枝粉、0 g伦教40号桑枝粉和0.5 g塘10×伦109桑枝粉，
或0.5 g沙2×伦109桑枝粉、1 g抗青10号桑枝粉、1 g伦教40号桑枝粉和0.5 g塘10×伦109桑枝粉。
7.权利要求1～6任一项中所述桑枝粉和/或桑枝粉提取液在制备多种桑树品种新梢及叶愈伤组织诱导培养基中的应用，所述桑树品种为沙2×伦109、抗青10号、伦教40号、塘10×伦109、育71-1、抗青283、粤桑11号、试11、强桑1号、强桑5号和龙桑中的一种或几种。
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