CN114286859A - 工程化肌原细胞组合物及其用途 - Google Patents

工程化肌原细胞组合物及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN114286859A
CN114286859A CN202080040018.8A CN202080040018A CN114286859A CN 114286859 A CN114286859 A CN 114286859A CN 202080040018 A CN202080040018 A CN 202080040018A CN 114286859 A CN114286859 A CN 114286859A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
myogenic
cell
engineered
muscle
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080040018.8A
Other languages
English (en)
Inventor
黄仕强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Zoology of CAS
Original Assignee
Institute of Zoology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Zoology of CAS filed Critical Institute of Zoology of CAS
Publication of CN114286859A publication Critical patent/CN114286859A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/34—Muscles; Smooth muscle cells; Heart; Cardiac stem cells; Myoblasts; Myocytes; Cardiomyocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3826—Muscle cells, e.g. smooth muscle cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3895—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells using specific culture conditions, e.g. stimulating differentiation of stem cells, pulsatile flow conditions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0012—Cell encapsulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0658—Skeletal muscle cells, e.g. myocytes, myotubes, myoblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0362—Animal model for lipid/glucose metabolism, e.g. obesity, type-2 diabetes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0381—Animal model for diseases of the hematopoietic system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/56—Fibrin; Thrombin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)

Abstract

本申请提供使用工程化肌原细胞向所述个体递送所述药剂的组合物和方法。本发明还提供了从成体肌原细胞产生重编程的肌原细胞的方法，以及重编程的肌原细胞用于治疗和药剂递送的用途。

Description

工程化肌原细胞组合物及其用途
本申请要求2019年5月29日提交的国际申请PCT/CN2019/088977的优先权，其全部内容整体地并入本文。
技术领域
本申请涉及工程化肌原细胞，包括重编程的肌原细胞。本申请还涉及肌原细胞在治疗和药剂递送方面的用途。
背景技术
药物递送系统是许多治疗产品的必要且关键的成分。然而，传统的药物递送系统地无法满足对治疗药剂价格平民化、个性化和长效药物递送的重大需求，尤其是社会上经济弱势患者群体的需求。例如，反复注射或输注生物药剂对患有慢性疾病或病况的患者来说既昂贵又不方便。缺乏对基本维生素和必需营养素的触达导致在许多发展中国家中婴儿死亡率高。疫苗所需要的冷链物流配送，在当今世界许多地区仍然难以提供。
基于细胞的系统近期被用于药物递送。红细胞、血小板、免疫细胞(如单核细胞、中性粒细胞和T细胞)、细菌细胞和神经干细胞已被开发为有希望的药物载体(Li T.et.al.，2018)。然而，给药后，此类系统中使用的细胞不会保持定位在给药的部位。此外，由于免疫原性，外源细胞通常不会在体内长期存在。曾经设计出免疫分离的细胞胶囊用于在遗传疾病动物模型中递送重组蛋白(Stockley TL.et.al.，2000；van Raamsdonk JM et al.，2002)。然而，我们仍迫切需要一种安全、多用途、能持久、基于细胞的药物递送系统。
随着肌肉干细胞进入不可逆转的衰老状态，其再生特性也会随着衰老过程下降，因此无法增殖或分化，这对移植和再生医学具有重要意义(Lau et.al.，2019)。骨骼肌的再生能力取决于肌肉干细胞和肌肉祖细胞，所述肌肉干细胞和肌肉祖细胞能够响应于组织损伤而增殖，它们融合且分化以再生出肌纤维，或者自我更新以复原干细胞池(Blau et al.，2015；Buckingham andRelaix,2015；Cheung and Rando，2013；Yin et al.，2013)。在衰老动物中，正向衰老(pro-senescent)干细胞不能响应于损伤增殖和分化，而一般而言，幼年动物的干细胞则能够表现出强劲的再生响应。例如，许多昆虫和两栖动物的幼年体在受伤后可以再生组织，但它们的成年体却不能(Shah et al.，2011；Smith-Bolton et al.,2009)。幼年的鱼相比年老的鱼更强劲地再生组织(Anchelin et al.，2011)，而胎儿和围产期哺乳动物比成年哺乳动物更强劲地再生多个组织(Deuchar，1976；Porrello et al.，2011；Sadek et al.,2014)。查尔斯·达尔文(Charles Darwin)和其他学者(Darwin etal.，1887；Pearson，1984)曾长期探讨幼年和组织再生之间的这种正相关关系，但幼年和再生背后的确切机制仍然是个谜。
骨骼肌占年轻人体重约40％。肌肉减少症是指伴随衰老过程骨骼肌质量和功能逐渐下降。伴随衰老过程，所述肌肉表现出严重的再生缺陷，导致老年人因肌肉减少症和恶病质而衰弱。外在微环境的变化和干细胞固有机制都可能导致这种再生衰退(Blau et al.，2015；Grounds et al.，2014；Lee et al.，2012)。最近的研究表明，成体肌肉干细胞的数量和功能随着衰老过程而衰退，特别是在老年转变(geroconversion)和衰老之后(Bernet etal.，2014；Brack and Rando，2012；Cosgrove et al.,2014；Price et al.,2014；SousaVictor et al.,2014；Tierney et al.,2014)。相比之下，与成体肌肉祖细胞相比，胚胎、胎儿和围产期肌肉祖细胞具有更大的增殖能力，而成体肌肉祖细胞又具有比年老成体肌肉祖细胞更高的增殖能力(Blau et al.，1983；Decary et al.，1996，1997；Tierney et al.，2016)。存在此情况，尽管胚胎和围产期(perinatal)祖细胞在胚胎发生和胎儿发育过程中也经历了多轮有丝分裂。例如，众所周知，Pax3+肌肉祖细胞产生所有胚胎、胎儿和成体肌原细胞和肌纤维(Buckingham and Relaix，2015；Engleka et al.，2005；Hutcheson et al.，2009；Schienda et al.，2006)。同时，大家也知道，所述肌肉祖细胞的生存期会随着发育和衰老而不可避免地缩短，但导致这种现象的分子原理仍还是个谜。
所有在此涉及的公开、专利、专利申请和公布的专利申请通过整体引用而并入本文。
发明内容
本申请提供使用工程化肌原细胞(例如，所述肌肉干细胞、成肌细胞和/或其分化细胞)进行药物递送的组合物和方法。此外，本发明也提供了从成体肌原细胞产生重编程的肌原细胞(例如，更生的和/或去分化的肌原细胞)的方法，以及重编程的肌原细胞在基于细胞的治疗或药剂递送中的用途。
本申请在一方面提供了一种向需要药剂的个体递送所述药剂的方法，包括向所述个体局部给药包括工程化肌原细胞的组合物，其中所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞、成肌细胞和/或其分化细胞，其中，将所述工程化肌原细胞植入所述个体的给药部位，并且其中所述工程化肌原细胞经基因修饰以允许将所述药剂递送至所述个体。在一些实施方案中，所述组合物肌注给药。在一些实施方案中，将所述组合物皮下给药。
根据上述任何一种方法的一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞。在一些实施方案中，所述肌肉干细胞是从成体肌原细胞(例如成肌细胞)产生的重编程(例如，更生和/或去分化)所述肌肉干细胞。在一些实施方案中，所述肌肉干细胞是由成体体细胞产生的转分化的肌肉干细胞。在一些实施方案中，所述肌肉干细胞为Pax7+Pax3+MyoD-肌生成素-、Pax7+Pax3-MyoD-肌生成素-和/或Pax7-Pax3+MyoD-肌生成素-的。
根据上述任何一种方法的一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括成肌细胞(myoblasts)。在一些实施方案中，所述成肌细胞由胚胎干细胞(ESC)或诱导多能干细胞(iPSC)产生。在一些实施方案中，所述成肌细胞是由成体肌原细胞(adults myogeniccells)(例如成肌细胞)产生的重编程(例如，更生和/或去分化)的肌原细胞。在一些实施方案中，所述成肌细胞是由成体体细胞(Somatic Cells)产生的转分化的成肌细胞。在一些实施方案中，所述成肌细胞为Pax7-Pax3+MyoD+肌生成素和/或Pax7+Pax3-MyoD+肌生成素细胞。
根据上述任何一种方法的一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括由肌肉干细胞或成肌细胞产生的肌细胞。在一些实施方案中，所述肌细胞由成肌原细胞分化来，其中所述成肌细胞由ESC或iPSC分化来。在一些实施方案中，所述肌细胞由重编程(例如，更生和/或去分化)的肌干细胞或由成体肌原细胞产生的成肌细胞分化来。在一些实施方案中，所述肌细胞由重编程(例如，转分化)的肌肉干细胞或由成体体细胞产生的成肌细胞分化来。在一些实施方案中，所述肌细胞为Pax3-Pax7-MyoD+肌生成素+细胞。
根据上述任何一种方法的一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括重编程的肌原细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括由成体肌原细胞产生的重编程的肌原细胞。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞是由成体肌原细胞产生的更生的肌原细胞。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞是由成体肌原细胞产生的去分化肌原细胞。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞是来自成体体细胞的转分化肌原细胞。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞包括肌肉干细胞、成肌细胞和/或肌细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括从重编程的肌原细胞分化来的肌管或肌纤维。
根据上述任何一种方法的一些实施方案中，所述组合物为工程化肌原细胞的悬浮液。在一些实施方案中，所述组合物通过注射给药。
根据上述任何一种方法的一些实施方案中，所述组合物为包括所述工程化肌原细胞的肌肉构建物。在一些实施方案中，所述组合物作为局部植入物给药。在一些实施方案中，所述肌肉构建物包括肌管。在一些实施方案中，所述肌肉构建物包括肌纤维。在一些实施方案中，所述肌肉构建物包括PAX7+肌原细胞。
根据上述任何一种方法的一些实施方案中，所述组合物还包括载体。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞与所述载体混合。在一些实施方案中，所述载体包括细胞外基质(ECM)分子。在一些实施方案中，所述载体包括
Figure BDA0003380468030000041
在一些实施方案中，所述载体包括细胞粘附分子。在一些实施方案中，所述细胞粘附分子为纤维蛋白。在一些实施方案中，所述组合物中载体的量不超过约95％(重量/重量)。
根据上述任何一种方法的一些实施方案中，所述工程化肌原细胞不是由永生化细胞系产生的。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞是非致瘤的。
根据上述任何一种方法的一些实施方案中，所述植入的工程化肌原细胞为所述个体形成肌肉组织，其中所述肌肉组织允许向所述个体递送所述药剂。在一些实施方案中，所述肌肉组织产生所述药剂。在一些实施方案中，所述药剂的产生是可诱导的。在一些实施方案中，所述药剂的产生是组成性的。在一些实施方案中，所述肌肉组织允许向所述个体局部递送所述药剂。在一些实施方案中，所述肌肉组织允许将所述药剂递送至所述个体全身。在一些实施方案中，所述肌肉组织可以从所述个体的周围组织招募血管。在一些实施方案中，所述肌肉组织与所述个体的周围组织融合。在一些实施方案中，在将所述药剂递送至所述个体至少约2个月后(例如，至少约3个月、6个月、1年、5年、10年或更长时间中的任一项)，可以从所述个体移除所述肌肉组织。
根据上述任何一种方法的一些实施方案中，对所述个体给药所述组合物一次。在一些实施方案中，通过给药所述工程化肌原细胞，所述工程化细胞向所述个体递送所述药剂至少约2个月(例如，至少约3个月、6个月、1年、5年、10年或更长时间中的任何一个)。
根据上述任何一种方法的一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括编码所述药剂的异源核酸序列。在一些实施方案中，所述药剂选自由代谢物、营养素、小分子药物、生物药剂、病毒、细胞外囊泡、疫苗和报告分子组成的组。在一些实施方案中，所述药剂由所述工程化肌原细胞分泌。在一些实施方案中，所述药剂在工程化肌原细胞的细胞表面上表达。在一些实施方案中，所述药剂从植入的肌原细胞扩散到所述个体中的周围组织。在一些实施方案中，所述药剂主动地从植入的肌原细胞运输到周围组织。在一些实施方案中，通过细胞-细胞桥和/或纳米管将所述药剂从植入的肌原细胞递送至周围组织。在一些实施方案中，通过将所植入的肌原细胞融合到周围组织来递送所述药剂。在一些实施方案中，通过细胞-细胞连接将所述药剂从植入的肌原细胞递送至周围组织。
根据上述任何一种方法的一些实施方案中，所述工程化肌原细胞允许递送多种药剂。
根据上述任何一种方法的一些实施方案中，所述组合物包括至少约105个工程化肌原细胞。
根据上述任何一种方法的一些实施方案中，所述工程化肌原细胞是自体的。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞是同种异体的。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞对所述个体无免疫原性。
根据上述任何一种方法的一些实施方案中，所述个体是人类个体。在一些实施方案中，所述个体不超过约3岁。在一些实施方案中，所述个体约为18岁或年龄更大。
本申请在一方面提供了一种治疗或诊断个体疾病或病况的方法，包括使用根据上述任一项的方法向所述个体递送所述药剂，其中所述药剂治疗或诊断所述疾病或病况。在一些实施方案中，所述疾病或病况是慢性疾病或病况。在一些实施方案中，所述疾病或病况为糖尿病或血友病。
本申请在一个方面提供了一种制备疾病或病况的非人动物模型的方法，包括使用根据上述任一项的方法向非人动物递送所述药剂，其中所述药剂与所述疾病或病况相关。在一些实施方案中，将所述药剂递送至非人动物的血流。在一些实施方案中，所述药剂为人类蛋白质、RNA或代谢物。在一些实施方案中，所述非人类动物选自由哺乳动物(例如，猪、牛、羊、山羊、马等)、鸟类(例如，鸡、鸭、火鸡等)、鱼、无脊椎动物、爬行动物和两栖动物组成的组。在一些实施方案中，所述非人动物是啮齿动物，例如小鼠或大鼠。在一些实施方案中，所述非人动物是非人灵长类动物。
本申请的一个方面提供了一种包括工程化肌原细胞、包括细胞外基质分子以及纤维蛋白的水凝胶载体的组合物，其中所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞、成肌细胞和/或其分化细胞，其中，所述工程化肌原细胞与所述载体混合。在一些实施方案中，所述载体包括
Figure BDA0003380468030000061
在一些实施方案中，所述组合物中载体的量不超过约95％(重量/重量)。在一些实施方案中，所述组合物为肌肉构建物。在一些实施方案中，所述组合物是供食用的非人类肉制品。
本申请在一个方面提供了一种试剂盒，用于向所述个体递送所述药剂，所述试剂盒包括工程化肌原细胞的组合物，其中所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞、成肌细胞和/或其分化细胞，并且其中所述工程化肌原细胞经基因修饰以允许所述药剂的递送；以及向所述个体局部给药所述组合物的装置。
根据上述任何一种组合物或试剂盒的一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞。在一些实施方案中，所述肌肉干细胞是从肌原细胞(例如成肌细胞)产生的重编程(例如，更生和/或去分化)的肌肉干细胞。在一些实施方案中，所述肌肉干细胞是由成体体细胞产生的转分化肌肉干细胞。在一些实施方案中，所述肌肉干细胞为Pax7+Pax3+MyoD-肌生成素-、Pax7+Pax3-MyoD-肌生成素-和/或Pax7-Pax3+MyoD-肌生成素-的。
根据上述任何一种组合物或试剂盒的一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括成肌细胞。在一些实施方案中，所述肌原细胞由胚胎干细胞(ESC)或诱导多能干细胞(iPSC)分化来。在一些实施方案中，所述成肌细胞是由肌原细胞(例如成肌细胞)产生的重编程(例如，更生和/或去分化)成肌细胞。在一些实施方案中，所述成肌细胞是由成体体细胞产生的转分化肌原细胞。在一些实施方案中，所述成肌细胞为Pax7-Pax3+MyoD+肌生成素-和/或Pax7+Pax3-MyoD+肌生成素-细胞。
根据上述任何一种组合物或试剂盒的一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括由肌肉干细胞或成肌细胞产生的肌细胞。在一些实施方案中，所述肌细胞由肌原细胞分化来，其中所述成肌细胞由ESC或iPSC分化来。在一些实施方案中，所述肌细胞由重编程(例如，更生和/或去分化)的肌干细胞或由肌原细胞产生的成肌细胞分化来。在一些实施方案中，所述肌细胞由重编程(例如，转分化)的肌肉干细胞或由成体体细胞产生的成肌细胞分化来。在一些实施方案中，所述肌细胞为Pax3-Pax7-MyoD+肌生成素+细胞。
根据上述任何一种组合物或试剂盒的一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括重编程的肌原细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括由成体肌原细胞产生的重编程的肌原细胞。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞是由成体肌原细胞产生的更生的肌原细胞。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞是由成体肌原细胞产生的去分化肌原细胞。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞是来自成体体细胞的转分化肌原细胞。
根据上述任何一种组合物或试剂盒的一些实施方案中，所述组合物为工程化肌原细胞的悬浮液。在一些实施方案中，所述组合物是包括所述工程化肌原细胞的肌肉构建物。在一些实施方案中，所述组合物作为局部植入物给药。在一些实施方案中，所述肌肉构建物包括肌管。在一些实施方案中，所述肌肉构建物包括肌纤维。在一些实施方案中，所述肌肉构建物包括PAX7+肌原细胞。
根据上述任何一种组合物或试剂盒的一些实施方案中，所述工程化肌原细胞不是由永生化细胞系产生的。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞是非致瘤的。
本发明还提供了包括用于向所述个体递送所述药剂的工程化肌原细胞的组合物，以及包括工程化肌原细胞的组合物在制备用于向需要药剂的个体递送所述药剂的药物中的用途，其中所述组合物是根据上述任一项的组合物。
本申请的另一方面提供了一种从成体肌原细胞产生重编程的肌原细胞的方法，包括：(a)将胚胎调节因子、端粒相关调节因子和细胞周期调节因子引入成体肌原细胞，以提供转导的肌原细胞；和(b)在一定条件下培养转导的肌原细胞以获得重编程的肌原细胞。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞是肌肉干细胞。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞是成肌细胞。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞是肌细胞。
根据上述产生重编程的肌原细胞的方法的任一项的一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞是更生(rejuvenated)的肌原细胞。在一些实施方案中，所述成体肌原细胞表达高水平的p21WAF1、p16INK4a和let-7微RNA。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞表达低水平的p21WAF1、p16INK4a和let-7微RNA。在一些实施方案中，所述成体肌原细胞可经历不超过约30轮群体倍增。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞可经历至少约90轮群体倍增。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞是去分化的。在一些实施方案中，所述成体肌原细胞不表达PAX3或表达低水平的PAX3。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞为PAX3+。
根据上述产生重编程的肌原细胞的方法的任一项的一些实施方案中，所述胚胎调节因子为LIN28A。在一些实施方案中，所述端粒相关调节因子为TERT(例如，hTERT)。在一些实施方案中，所述细胞周期调节因子是p53抑制剂。在一些实施方案中，所述p53抑制剂是靶向p53的短发夹RNA(shRNA)。在一些实施方案中，步骤(a)包括将编码LIN28A蛋白的第一核酸、编码TERT蛋白的第二核酸和编码靶向p53的shRNA的第三核酸引入成体肌原细胞。在一些实施方案中，第一核酸、第二核酸和/或第三核酸存在于一个或多个载体中。在一些实施方案中，所述一个或多个载体是病毒载体。
根据上述产生重编程的肌原细胞的方法的任一项的一些实施方案中，所述成体肌原细胞是人类细胞。在一些实施方案中，在包括带有约20％胎牛血清(FBS)的Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM)的培养基中培养转导的肌原细胞。
本申请的一个方面提供了通过根据上述任何一种产生重编程的肌原细胞的方法制备的重编程的肌原细胞。
本申请的另一方面提供了一种向需要药剂的个体递送所述药剂的方法，包括向所述个体局部给药所述组合物，所述组合物包括有效量的根据上述任何一种重编程的肌原细胞或其分化细胞的重编程的肌原细胞，其中，所述重编程的肌原细胞或其分化细胞经基因修饰以允许将所述药剂递送至所述个体。
本申请还提供了一种治疗有治疗需要的个体的肌肉疾病或病况的方法，包括向所述个体给药有效量的根据上述任何一种重编程的肌原细胞或其分化细胞的重编程的肌原细胞。在一些实施方案中，所述成体肌原细胞从所述个体获得。在一些实施方案中，所述疾病或病况为肌肉减少症或恶病质。
本申请进一步提供包括重编程的肌原细胞的组合物，其用于药剂递送或治疗的用途，以及包括重编程的肌原细胞的组合物在制备用于将所述药剂递送至所述个体或治疗个体疾病的药物中的用途。
本申请在另一方面提供了一种用于产生重编程的肌原细胞的试剂盒，包括：(a)编码LIN28A蛋白的第一核酸，(b)编码TERT蛋白的第二核酸，以及(c)p53抑制剂(例如，编码针对p53的shRNA的第三核酸)。
本申请进一步提供用于上述任一方法的药物组合物、试剂盒和制品。
本发明的这些以及其他方面和优势将从随后的详细描述和所附权利要求中变得显而易见。应当理解，本文所描述的各种实施例的一个、一些或全部可以组合以形成本发明的其他实施例。
附图说明
图1显示了工程化肌原(“iMusc”)细胞和人类骨骼肌(“hSkM”)细胞的肌内植入在NOD Scidγ小鼠胫骨前肌原位移植1年后的状态。
图2显示了图1小鼠肌肉(胫骨前肌)注射部位(黑色箭头)横截面的苏木精和伊红(H&E)组织学染色。左列显示iMusc细胞的注入位置，右列显示hSkM细胞的注入位置。
图3显示了肌内iMusc移植物横截面中骨骼肌标记物泛肌球蛋白重链和人类线粒体抗原的免疫荧光染色(移植1年后的状态)。
图4显示了肌内iMusc移植物横截面中肌肉中间丝标记物结蛋白和骨骼肌肌节Z盘横纹标记物辅肌动蛋白(α-actinin)的免疫荧光染色(移植1年后的状态)。
图5显示了肌内移植物横截面中骨骼肌标记物泛肌球蛋白重链(MHC)、成体快速收缩肌MHC亚型和肌管规格因子肌生成素的免疫荧光染色(移植1年后的状态)。
图6显示了通过将iMusc细胞接种到
Figure BDA0003380468030000091
-纤维蛋白支架中，通过钢钉和丝线固定，并允许其生长和成熟6周，体外培养人iMusc构建物。将电线连接到钢针上，以刺激iMusc构建物的肌肉收缩。
图7显示了肌肉干细胞标记物PAX7、肌管标记物肌生成素和骨骼肌标记物泛肌球蛋白重链(MHC)的免疫荧光染色，显示了PAX7+iMusc细胞和肌生成素/泛MHC+iMusc肌管在
Figure BDA0003380468030000101
-纤维蛋白支架中的共培养。
图8显示了在NOD Scidγ小鼠背部皮肤下皮下移植8周后，与小鼠血管吻合的代表性iMusc构建物的显微照片。
图9显示了皮下iMusc构建物横截面中PAX7和泛肌球蛋白重链(MHC)的免疫荧光染色，描绘了植入1年后PAX7+iMusc细胞和泛MHC+iMusc肌管在皮下环境中的持久性。
图10显示了含有iMusc构建物的皮下横截面中成体快速收缩肌MHC亚型和泛肌球蛋白重链(MHC)的免疫荧光染色，描绘了植入1年后成体快速MHC+iMusc肌管在皮下环境中的持久性。
图11显示了皮下iMusc构建物横截面的苏木精和伊红(H&E)组织学染色。植入1年后可以观察到iMusc细胞、吻合的毛细血管和小鼠皮肤。
图12显示了通过qRT PCR确定的iMusc肌纤维(MF)构建物在体内和体外相对于原代人类骨骼肌(hSkM)成肌细胞(MB)、肌细胞(MC)或肌管(MT)的肌生成标记物的基因表达。
图13显示了植入NOD-Scid-γ小鼠股四头肌iMusc衍生成肌细胞(包裹在
Figure BDA0003380468030000102
-纤维蛋白基质(插入图)半球体中)的结果的显微照片(植入1年后的状态)。
图14显示了植入NOD-Scid-γ小鼠1年后，iMusc半球体植入股四头肌(虚线轮廓)的H&E组织学图像。
图15显示了iMusc半球移植物横截面中肌节Z盘条纹标记物辅肌动蛋白的免疫荧光染色(植入1年后的状态)。
图16显示了iMusc(紫色)半球移植物中CD31+(红色)血管毛细血管募集现象的免疫荧光染色。
图17显示了GFP转基因(紫色)、骨骼肌标记物泛肌球蛋白重链(MHC；绿色)和人类层粘连蛋白A/C抗原(红色)在移植到NOD-Scidγ小鼠未受损伤胫骨前肌1年后的GFP-iMusc衍生成肌细胞移植物横截面中的免疫荧光染色图像。
图18显示了GFP转基因(紫色)、骨骼肌标记物泛肌球蛋白重链(MHC；绿色)和人类层粘连蛋白A/C抗原(红色)在移植到NOD Scidγ小鼠未受损伤胫骨前肌1年后的GFP iMusc衍生成肌细胞移植物横截面中的免疫荧光染色图像。
图19显示了GFP转基因(紫色)、骨骼肌标记物泛肌球蛋白重链(MHC；绿色)和人类层粘连蛋白A/C抗原(红色)在移植到NOD Scidγ小鼠心脏毒素损伤的胫骨前肌1年后的GFPiMusc衍生成肌细胞移植物横切面中的免疫荧光染色。
图20显示了GFP转基因(紫色)、骨骼肌标记物泛肌球蛋白重链(MHC；绿色)和人类层粘连蛋白A/C抗原(红色)在移植到NOD-Scid-γ小鼠心脏毒素损伤的胫骨前肌后1年的GFP-iMusc衍生成肌细胞移植物的纵切面的免疫荧光染色。
图21显示了GFP+(紫色)、人层粘连蛋白A/C+(红色)在移植到NOD-Scidγ小鼠冷冻损伤的胫骨前肌1年后在体内与小鼠肌纤维融合的iMusc细胞的免疫荧光染色。
图22A-G显示了延长年老成体原代人类骨骼肌(HSKM)祖细胞自我更新的因素的小筛结果。图22A显示了相对于年轻成体HSKM成肌细胞，年老成体HSKM成肌细胞中细胞周期抑制剂mRNA的定量RT-PCR。图22B显示了相对于年轻成体HSKM成肌细胞，年老成体HSKM成肌细胞中let-7微小RNA的定量RT-PCR。图22C显示了相对于年轻成体HSKM成肌细胞，年老成体HSKM成肌细胞端粒长度的定量RT-PCR。图22D显示了年轻HSKM成肌细胞(黑色)和年轻成体HSKM成肌细胞的群体倍增曲线，这些肌原细胞通过病毒sh-p53(S，粉红色)和LIN28A(LS，绿色)或hTERT(TS，紫色)或LIN28A和hTERT(LTS，红色)转导。年轻成体HSKM和其他转基因成肌细胞经60天在第30轮群体倍增前开始衰老，而LTS肌原细胞(红色)经120天和第90轮群体倍增后继续稳定增殖。图22E显示了相对于100天龄LTS肌原细胞，100天龄成体HSKM成肌细胞中与衰老相关的β-半乳糖苷酶阳性(SA-β-gal+)细胞的定量。图22F显示了相对于年轻成体HSKM成肌细胞，LTS肌原细胞中p27KIP1、p21WAF1、p16INK4a和let-7微小RNA的定量RT-PCR。图22G显示了年轻的HSKM和LTS肌原细胞中肌管蛋白标记物肌球蛋白重链(MHC)的免疫荧光染色，相对于在肌管培养基中进行肌原分化的年老HSKM成肌细胞和永生化(hTERT-CyclinD1-CDK4R24C)肌原细胞。细胞用DAPI复染以显示肌核。比例尺100μm*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图23显示了在肌肉祖细胞衰老和分化过程中p53蛋白的表达。在年轻和年老的成体HSKM和LTS肌原细胞和肌管中p53蛋白相对于微管蛋白的蛋白质印迹。
图24显示了年轻HSKM和其他转基因成肌细胞的群体倍增曲线。用hTERT和shp53(TS，橙色)或LIN28A hTERT和shp53(LTS，红色)转导的年轻HSKM成肌细胞(黑色)和年轻成体HSKM成肌细胞的增殖率依次增加。还尝试了p16INK4a(sh-p16，紫色)、p14Arf(sh-p14，蓝色)和RB1(sh-RB1，绿色)的慢病毒shRNA敲除，但由于它们看起来早熟衰老，因此未进行随访。
图25显示了LTS因子的表达水平。LTS肌原细胞中Lin28、hTERT和p53 mRNA的定量RT-PCR，相对于年轻成体HSKM成肌细胞。**P<0.01，***P<0.001
图26显示了LTS因子对端粒长度的影响。年轻LTS肌原细胞与年轻HSKM成肌细胞端粒长度的定量RT-PCR。**P<0.01。
图27显示了LTS因子对肌肉祖细胞分化的影响。相对于LTS肌管，年轻HSKM肌管中肌管蛋白标记物辅肌动蛋白(绿色)和核肌生成素(红色)的免疫荧光染色。用DAPI(蓝色)对细胞进行复染以显示肌核。比例尺100μm。
图28显示了LTS因子对肌原分化标记的影响。定量RT-PCR检测LTS肌管中与年轻成体HSKM肌管相关的肌原标记物的mRNA。
图29A-29K表明，LTS更生了体内衰老肌肉祖细胞的再生性能。图29A显示了用于原位移植到NOD SCID g(NSG)小鼠的衰老患者的成肌细胞的衍生和处理的示意图。图29B显示了衰老恶病质患者#1的HSKM成肌细胞(cHSKM-1，浅绿色)、老年恶病质患者#14的HSKM成肌细胞(cHSKM-14，浅蓝色)及其相应的LTS处理系(cLTS-1和cLTS-14，绿色和蓝色)的群体倍增曲线。图29C显示了相对于恶病质患者的cHSKM成肌细胞(浅绿色和浅蓝色)，cLTS肌原细胞(绿色和蓝色)中Lin28、Tert、p53和p21 mRNA的定量RT-PCR。图29D显示了原位移植到NSG小鼠肌肉中后GFP+cLTS1成肌细胞和肌管的免疫荧光染色(放大20倍)。图29E显示原位移植到NSG小鼠肌肉后GFP+cLTS1肌纤维的免疫荧光染色(放大40倍)。图29F显示了将GFP+cLTS1成肌细胞原位移植到NSG小鼠肌肉(放大40倍)后，GFP+肌纤维区域的免疫荧光染色。图29G显示了原位移植GFP+cLTS1成肌细胞(放大40倍)后NSG小鼠肌肉横切面中GFP的免疫荧光染色。图29H显示了GFP+cLTS1成肌细胞移植后植入效率的量化。图29I显示了具有代表性的NSG小鼠残骸，将LTS肌原细胞原位移植到NSG小鼠的肌肉中。图.29J-29K显示了年老TS和LTS肌原细胞的典型核型分析，分别为[41，X，-X，dic(8；17)(q24.3；p13)，-16，-18，-20，+mar](图29J)和[46，XX](图29K)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图30A-30C表明LTS肌肉祖细胞年龄较小且分化程度较低。图30A显示了LTS肌原细胞和肌管转录组数据的主成分分析(PCA)图，相对于HSKM年轻、中级和年老的成肌细胞以及年轻的HSKM肌管。图30B显示了年轻HSKM、TS和LTS肌原细胞和肌管中PAX3和TWIST2蛋白相对于GAPDH蛋白的蛋白质印迹。图30C显示了相对于年轻成体HSKM成肌细胞，LTS肌原细胞中PAX3、MYOD、MYF5、MYOG、ACTA1、MYH1、MYH3、MYH8和MYH7的定量RT-PCR。
图31A-31E表明Let-7抑制不足以解释肌肉祖细胞的LTS更生。图31A显示了在对照组(Ctrl)、let-7a、let-7b或let-7a和let-7b组合(let-7a+b)模拟转染后，相对于年轻成体HSKM成肌细胞，TS和LTS肌原细胞中let-7微小RNA的定量RT-PCR。图31B显示了对照RNA干扰(Ctrl)、let-7a、let-7b或let-7a和let-7b组合(let-7a+b)模拟转染TS和LTS肌原细胞后相对于年轻成体HSKM成肌细胞的细胞计数。图31C显示了在对照RNAi(Ctrl-RNAi)、let-7a、let-7b或let-7a和let-7b(let-7a+b)模拟转染后，相对于年轻成体HSKM成肌细胞，TS和LTS肌原细胞中SA-β-gal+细胞的定量。图31D显示了对照(Ctrl)、let-7a(a)、let-7b(b)或let-7a和let-7b(a&b)组合模拟转染后，年轻成体HSKM、TS和LTS肌原细胞中IMP1/2/3和HMGA2蛋白相对于GAPDH蛋白的蛋白质印迹。图31E显示了LTS肌原细胞转录组图谱的基因集富集分析(GSEA)。
图.31A-31L显示LIN28A对LTS肌肉祖细胞的代谢作用。图31A显示了相对于年轻成体HSKM成肌细胞，LTS肌原细胞中基础OxPhos的海马分析。图31B显示了相对于年轻成体HSKM成肌细胞，LTS肌原细胞中最大OxPhos的海马分析。图31C显示了相对于年轻成体HSKM成肌细胞，LTS肌原细胞糖酵解的海马分析。图31D显示了根据JC-1染料红：绿荧光比率，相对于年轻成体HSKM成肌细胞，LTS肌原细胞中线粒体膜电位(Δψm)的定量。图31E显示了根据线粒体-Grx1-roGFP2探针的平均氧化百分比，相对于年轻成体HSKM成肌细胞，LTS肌原细胞中线粒体ROS的定量。图31F显示了LTS肌原细胞(红色)和成体HSKM成肌细胞(黑色)中糖酵解代谢物的LC-MS/MS定量。G6P、葡萄糖-6-磷酸、F6P、果糖-6-磷酸、G3P、甘油醛-3-磷酸。图31G显示了LTS肌原细胞(红色)和成体HSKM成肌细胞(黑色)中Krebs循环代谢物的LC-MS/MS定量。aKG、α-酮戊二酸。图31H显示了LTS肌原细胞(红色)和成体HSKM成肌细胞(黑色)中氧化还原和生物能相关代谢物的LC-MS/MS定量。NADH、降低的NAD。NAD、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、谷胱甘肽、二硫谷胱甘肽、AMP即一磷酸腺嘌呤、ADP即二磷酸腺嘌呤。图31I显示了在使用活性氧调节药物百草枯(PQ)、过氧化氢(H2O2)、二硫苏糖醇(DTT)或溶媒(Veh)处理后，根据线粒体-Grx1-roGFP2探针的平均氧化百分比，年轻成体HSKM、TS和LTS肌原细胞中线粒体活性氧的定量。图31J显示了在使用溶媒对照(CTRL)、过氧化氢(H2O2)或二硫苏糖醇(DTT)处理后，相对于TS成肌细胞，LTS肌原细胞中低氧/HIF1A靶mRNA的定量RT-PCR。图31K显示了在使用溶媒对照(CTRL)、过氧化氢(H2O2)或二硫苏糖醇(DTT)处理后，相对于TS成肌细胞，LTS肌原细胞中糖酵解相关mRNA的定量RT-PCR。图31L显示了在使用溶媒对照(CTRL)、过氧化氢(H2O2)或二硫苏糖醇(DTT)处理后，相对于TS成肌细胞，LTS肌原细胞中OxPhos相关mRNA的定量RT-PCR。
图32显示了LTS因子对线粒体DNA(mtDNA)丰度(abundance)的影响。与核参比基因B2M相关的线粒体NADH泛醌氧化还原酶链1(MT-ND1)和4(MT-ND4)的定量RT-PCR，以评估成体HSKM成肌细胞相对于LTS肌原细胞的线粒体DNA拷贝数。*P<0.05。
图33显示了LTS因子对线粒体生物发生的影响。TS和LTS肌原细胞中线粒体柠檬酸合酶蛋白相对于GAPDH蛋白的蛋白质印迹，相对于成体HSKM成肌细胞。
图34A-34E显示了LTS祖细胞依赖mtROS驱动的HIF1A增殖。图34A显示了用二硫苏糖醇(DTT)或溶媒对照处理后年轻成体HSKM、TS和LTS肌原细胞中缺氧响应元件(HRE)-荧光素酶报告分子的定量。图34B显示了在使用溶媒对照(Veh)、过氧化氢(H2O2)或二硫苏糖醇(DTT)滴定法处理TS和LTS肌原细胞后，相对于年轻成体HSKM成肌细胞的细胞计数。图34C显示了使用溶媒对照(Veh)或HIF-1a抑制剂KC7F2处理后TS和LTS肌原细胞相对于年轻成体HSKM成肌细胞的细胞计数。图34D显示了在使用溶媒对照或糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖(2DG)处理后，相对于年轻成体HSKM成肌细胞，TS和LTS肌原细胞中的细胞计数。图34E显示了LIN28A如何防止肌肉祖细胞衰老和促进自我更新的模型。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图35A-35B显示了LTS因子对8-氧代鸟嘌呤的影响。图35A显示了成体HSKM和LTS肌原细胞中氧化损伤生物标记物8-氧代鸟嘌呤(绿色)的免疫荧光染色。用DAPI(蓝色)对细胞进行复染以显示肌核。图35B显示了成体HSKM和LTS肌原细胞中8-氧代鸟嘌呤免疫荧光信号的定量。*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001。
图36显示了分化的iMusc Insm细胞(即用人胰岛素原cDNA转导的iMusc细胞)和iMusc neo细胞(即未经转基因的对照iMusc细胞)中的胰岛素mRNA水平
图37显示了分化的iMusc Insm细胞和iMusc neo细胞分泌的胰岛素蛋白水平。
图38显示了在暴露于来自iMusc Insm细胞和iMusc neo细胞的48小时条件培养基中的hSkM细胞中，将13C掺入果糖-6-磷酸(F6P)。
图39显示了移植有iMusc Insm细胞或iMusc neo细胞的糖尿病裸鼠的血浆胰岛素水平。
图40显示了移植有iMusc Insm细胞或iMusc neo细胞的糖尿病裸鼠的血糖水平。
图41显示了分化的iMusc-FIX细胞(即用hFIX cDNA转导的iMusc细胞)和iMuscneo细胞(即未经转基因的对照iMusc细胞)中的人类IX(hFIX)因子mRNA水平。
图42显示了分化的iMusc FIX细胞和iMusc neo细胞中的肌生成素(Myog)mRNA水平。
图43显示了分化的iMusc FIX细胞和iMusc neo细胞分泌的hFIX蛋白水平。
图44显示了移植有iMusc FIX细胞和iMusc neo细胞的血友病裸鼠的血浆hFIX蛋白水平。
图45显示了移植有iMusc FIX细胞和iMusc neo细胞的血友病裸鼠的活化部分凝血活酶时间(aPTT)。
具体实施方式
本申请提供使用工程化肌原细胞作为体内递送载具的组合物和方法。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞是由胚胎干细胞或诱导多能干细胞、重编程(例如，更生和/或去分化或转分化)肌原细胞或其分化细胞(例如，肌细胞、肌管和/或肌纤维)产生的成肌细胞。将所述组合物局部给药于个体以允许所述工程化肌原细胞为所述个体植入并将外源性药剂长期递送至所述个体。所述植入的肌原细胞可产生在给药部位持续较长时间(例如，至少约2个月、3个月、6个月、1年、2年、5年、10年或更长时间)的肌肉组织，并且具有较低的免疫原性或致瘤性风险。令人惊讶的是，植入的肌肉组织可以从个体周围组织中招募脉管系统，从而使分泌的药剂能够通过个体的循环系统全身递送。本文所述的方法和组合物为包括营养素和生物药物在内的多种药剂提供了一种通用且成本上有效益的递送系统。
此外，本申请提供了通过将三种因子(例如LIN28A、TERT和p53抑制剂)的组合引入成体肌原细胞中，从成体肌原细胞产生重编程的肌原细胞(例如，更生的成肌细胞)的方法。重编程的肌原细胞具有更强的增殖能力，维持正常的核型，在传代后期正常进行肌生成，并且不发生肿瘤或异常谱系分化。与原代成体肌原细胞相比，所述重编程的肌原细胞还显示出显著更佳的植入效率，因此可用于本文所述的药物递送方法和其他基于细胞的再生疗法。
因此，本申请的一个方面提供了一种向需要药剂的个体递送所述药剂的方法，包括局部(例如，所述肌内或皮下)向所述个体给药包括工程化肌原细胞的组合物，其中所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞，成肌细胞和/或其分化细胞，其中所述工程化肌原细胞在所述个体的给药部位植入，并且其中所述工程化肌原细胞经基因修饰以允许将所述药剂递送(例如，局部或全身递送)到所述个体。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括编码所述药剂的异源核酸序列。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括由胚胎干细胞或诱导多能干细胞产生的成肌细胞，或其分化细胞，诸如肌细胞、肌管和/或肌纤维。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括重编程成肌细胞或其分化细胞，例如肌细胞、肌管和/或肌纤维。在一些实施方案中，所述组合物为肌肉构建物，其包括工程化肌原细胞或其分化细胞和水凝胶载体(例如，
Figure BDA0003380468030000171
和纤维蛋白)。
本申请的另一方面提供了一种从成体肌原细胞产生重编程(例如，更生和/或去分化)的肌原细胞的方法，包括：(a)将胚胎调节因子(例如LIN28A)、端粒相关调节因子(例如TERT)以及细胞周期调节因子(例如，所述p53抑制剂，例如靶向p53的shRNA)引入成体肌原细胞，以提供转导的肌原细胞；和(b)在条件下培养转导的肌原细胞以获得重编程的肌原细胞。
本申请还提供了治疗方法、组合物、试剂盒和制品。
I.术语定义
除非下文另有定义，否则本文中使用的术语与本领域一般使用的术语相同。
如本文所用，“肌原细胞”是指能够增殖和/或分化产生肌肉组织的细胞。肌原细胞包括但不限于肌肉干细胞、成肌细胞、肌细胞、肌管和肌纤维。本文所述肌原细胞可产生骨骼肌、平滑肌和/或心肌。
如本文所用，“干细胞”是一种未分化细胞，其特征在于通过有丝分裂自我更新的能力以及分化为子代细胞的潜力，包括自我更新的祖细胞、非更新的祖细胞和终末分化的细胞。在哺乳动物干细胞中，可以区分胚胎干细胞和体细胞。“胚胎干细胞”或“ESC”驻留在胚泡中并产生胚胎组织，而体细胞驻留在成体组织中用于组织再生和修复。“肌肉干细胞”是指在成体肌肉组织中发现的干细胞，例如卫星细胞。干细胞可以是自然产生的干细胞，也可以通过使用核重编程因子将分化细胞(如体细胞)重编程为干细胞而“诱导”。“诱导多能干细胞”或“iPSC”是指由非多能干细胞人工制备的多能干细胞。术语“多能的”或“多能性”是指能够产生后代的细胞，这些后代在适当条件下可以分化为细胞类型，这些细胞类型共同表现出与来自三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞谱系相关的特征。多能干细胞可以为产前、产后或成年生物体的组织做出贡献。标准的接受技艺测试，如8-12周龄SCID小鼠形成畸胎瘤的能力，可用于建立细胞群的多潜能。然而，多种多能干细胞特性的鉴定也可用于多能干细胞的鉴定。本领域已经描述了iPSC和制备iPSC的方法。例如，参见通过引用将其全部并入本文的US8058065B2、US8129187B2、US8278104B2和US9499797B2。
如本文所用，“肌肉祖细胞”指具有分化为肌肉细胞潜能的未分化细胞。肌肉祖细胞包括但不限于肌肉干细胞和成肌细胞。原代成体肌肉祖细胞增殖能力有限，进入衰老状态，失去增殖和分化能力。相比之下，胚胎和胎儿肌肉前体细胞尽管经历了多轮有丝分裂，但增殖能力增强，并在损伤和移植后表现出强劲的再生响应。
如本文所用，“重编程的肌原细胞”指具有增强增殖和分化能力并延迟衰老的人工操纵的成体肌原细胞。重编程的肌原细胞可以进行发育重编程和/或年龄重编程。“发育性重编程的肌原细胞”是指人工操纵的成体肌原细胞，其发育阶段低于衍生重编程的肌原细胞的成体肌原细胞(称为“去分化”的过程)，或人工操纵的成体细胞，其发育谱系与重编程的肌原细胞来源的成体细胞不同(这一过程称为“转分化”)。“年龄重编程的肌原细胞”和“更生肌原细胞”交替使用，指下述人工操纵的成体肌原细胞，其增殖周期比重编程的肌原细胞来源的成体肌原细胞要长。
如本文所用，“成肌细胞”是指能够分化产生肌肉细胞的单核肌肉祖细胞。
如本文所用，“肌细胞”是指由肌肉祖细胞分化产生的单核肌细胞。
如本文所用，“肌管”指由肌细胞融合产生的多核肌细胞。
如本文所用，“肌纤维”指由肌管发育而来的终末分化、多核和横纹肌细胞。
如本文所用，“植入(名词)”或“植入(动词)”是指移植细胞、构筑物或组织在宿主体内至少存活约7周(例如至少为2个月、3个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更长时间的任一项)。植入的细胞在宿主体内执行正常的细胞功能，包括增殖、分化、代谢、基因表达等。植入的细胞、构建物或组织可能与宿主周围的组织融合，也可能不融合。
如本文所用，“治疗(名词)”或“治疗(动词)”是一种获得有益或预期结果(包括临床结果)的方法。就本发明而言，有益的或期望的临床结果包括但不限于以下一个或多个：减少由疾病引起的一个或多个症状，减少疾病的程度，稳定疾病或病况(例如，防止或延迟疾病或病况的恶化)，预防或延迟疾病或病况的传播，预防或延迟疾病或病况的发生或复发，延迟或减缓疾病或病况的进展，改善疾病状态，提供疾病或病况的缓解(部分或全部)，减少治疗疾病或病况所需的一种或多种其他药物的剂份，延缓疾病或病况的进展，提高生活质量和/或延长生存期。“治疗”还包括减少疾病或病况的病理后果。本发明的方法考虑了治疗的这些方面中的任何一个或多个。
如本文所用，术语“个体”、“受试者”和“患者”在本文中互换使用以描述哺乳动物，包括人类。个体包括但不限于人、牛、绵羊、猪、马、猫、狗、啮齿动物或灵长类动物。在一些实施方案中，所述个体是人。在一些实施方案中，所述个体患有疾病或病况。在一些实施方案中，所述个体需要治疗。
如本领域所理解，“有效量”是指足以产生所需治疗结果的组合物(例如，所述工程化肌原细胞)的量。对于治疗用途，有益或期望的结果包括，例如，减少由疾病或病况(生化、组织学和/或行为)引起的一个或多个症状，包括疾病或病况发展过程中出现的并发症和中间病理表型，提高疾病或病况患者的生活质量，减少治疗疾病或病况所需的其他药物的剂份，增强其他药物的效果，延缓疾病或病况的进展，和/或延长患者的生存期。
如本文所用，术语“细胞”和“细胞培养”可互换使用，且所有此类名称包括子代。众所周知，由于有意或无意的突变，所有后代的DNA含量可能并不完全相同。包括与原代细胞具有相同功能或生物活性的变体后代。
应当理解，本文描述的本发明的方面和实施方案包括“组成为”和/或“基本上组成为”的方面和实施方案。
本文中“约”值或参数的指涉包括(并描述了)针对该值或参数本身的变化。例如，提及“约X”的描述包括对“X”的描述。
如本文中使用的术语“约X-Y”与“约X到约Y”具有相同的含义。
如本文所用，“非”值或参数的指涉通常指并描述“非”值或参数。例如，该方法不用于治疗X型癌症意味着该方法用于治疗非X型。
如本文所用，单数形式"a,""an,"和“所述”包括复数指涉，除非上下文明确排除。
本文中使用的“和/或”一词，如“A和/或B”，旨在包括A和B；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样，本文中使用的术语“和/或”以及诸如“A、B和/或C”之类的短语旨在涵盖以下实施方案中的每一个：A、B和C；A、B，或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
II.递送方法
本申请提供了使用工程化肌原细胞或其构建物向需要药剂的个体递送所述药剂的方法。
在一些实施方案中，本申请提供了一种向需要药剂的个体递送所述药剂的方法，包括向所述个体局部给药包括工程化肌原细胞的组合物，其中所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞、成肌细胞和/或其分化细胞，其中，所述工程化肌原细胞在所述个体的给药部位植入，并且其中所述工程化肌原细胞经基因修饰以允许将所述药剂递送至所述个体。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括编码所述药剂的异源核酸序列。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞将所述药剂递送至所述个体局部。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞通过血液系统将所述药剂递送至所述个体。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞不是由永生化细胞系产生的。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞，例如，Pax7+Pax3+MyoD-肌生成素-、Pax7+Pax3-MyoD-肌生成素-和/或Pax7-Pax3+MyoD-肌生成素-细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括成肌细胞，例如，Pax7-Pax3+MyoD+肌生成素-和/或Pax7+Pax3-MyoD+肌生成素-细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括通过分化肌肉干细胞或成肌细胞(例如肌细胞、肌管和/或肌纤维)而产生的细胞。在一些实施方案中，所述植入的工程化肌原细胞为所述个体形成肌肉组织，其中肌肉组织允许向所述个体递送所述药剂。在一些实施方案中，在所述工程化肌原细胞向所述个体递送所述药剂至少约2个月后(例如，至少约3个月、6个月、1年、5年、10年或更长时间中的任一项)，可以从所述个体移除所述肌肉组织。在一些实施方案中，所述药剂由所述工程化肌原细胞分泌。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞允许递送多种药剂。
在一些实施方案中，提供了一种向需要药剂的个体递送所述药剂的方法，包括向所述个体局部给药包括所述工程化肌原细胞的组合物，其中所述所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞、成肌细胞和/或其分化细胞，其中所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞、成肌细胞和/或其分化细胞在所述个体的给药部位植入基因细胞，其中所述所述工程化肌原细胞通过经基因修饰以允许将所述药剂递送至所述个体。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括编码所述药剂的异源核酸序列。在一些实施方案中，所述药剂递送至所述个体局部。在一些实施方案中，所述药剂通过血液系统递送至所述个体全身。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞不是由永生化细胞系产生的。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞，例如，Pax7+Pax3+MyoD-肌生成素-、Pax7+Pax3-MyoD-肌生成素-和/或Pax7-Pax3+MyoD-肌生成素-细胞。在一些实施方案中，所述工程肌细胞包括成肌细胞，例如，Pax7-Pax3+MyoD+肌生成素-和/或Pax7+Pax3-MyoD+肌生成素-细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括通过分化肌肉干细胞或成肌细胞(诸如肌细胞、肌管和/或肌纤维)而产生的细胞。在一些实施方案中，所述植入的工程化肌原细胞为所述个体形成肌肉组织，其中肌肉组织允许向所述个体递送所述药剂。在一些实施方案中，在所述工程化肌原细胞向所述个体递送所述药剂至少约2个月后(例如，至少约3个月、6个月、1年、5年、10年或更长时间中的任一项)，可以从所述个体移除所述肌肉组织。.在一些实施方案中，所述药剂由所述所述工程化肌原细胞分泌。在一些实施方案中，所述所述工程化肌原细胞允许递送多种药剂。
在一些实施方案中，本申请提供了一种向需要药剂的个体递送所述药剂的方法，包括向所述个体肌内给药包括工程化肌原细胞的组合物，其中所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞、成肌细胞和/或其分化细胞，其中，所述工程化肌原细胞在所述个体的给药部位植入，并且其中所述工程化肌原细胞经基因修饰以允许将所述药剂递送至所述个体。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括编码所述药剂的异源核酸序列。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞将所述药剂递送至所述个体局部。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞通过血液系统将所述药剂递送至所述个体全身。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞不是由永生化细胞系产生的。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞，例如，Pax7+Pax3+MyoD-肌生成素-、Pax7+Pax3-MyoD-肌生成素-和/或Pax7-Pax3+MyoD-肌生成素-细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括成肌细胞，例如，Pax7-Pax3+MyoD+肌生成素-和/或Pax7+Pax3-MyoD+肌生成素-细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括通过分化肌肉干细胞或成肌细胞(例如肌细胞、肌管和/或肌纤维)而产生的细胞。在一些实施方案中，植入的工程化肌原细胞为所述个体形成肌肉组织，其中肌肉组织允许向所述个体递送所述药剂。在一些实施方案中，在将所述药剂递送至所述个体至少约2个月后(例如，至少约3个月、6个月、1年、5年、10年或更长时间中的任一项)，从个体移除所述肌肉组织。在一些实施方案中，所述药剂由所述工程化肌原细胞分泌。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞允许递送多种药剂。
在一些实施方案中，提供了一种向需要药剂的个体递送所述药剂的方法，包括向所述个体皮下给药包括工程化肌原细胞的组合物，其中所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞、成肌细胞和/或其分化细胞，其中，所述工程化肌原细胞植入所述个体的给药部位，并且其中所述工程化肌原细胞经基因修饰以允许将所述药剂递送至所述个体。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括编码所述药剂的异源核酸序列。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞将所述药剂递送至所述个体局部。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞通过血液系统将所述药剂递送至所述个体全身。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞不是由永生化细胞系产生的。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞，例如，Pax7+Pax3+MyoD-肌生成素-、Pax7+Pax3-MyoD-肌生成素-和/或Pax7-Pax3+MyoD-肌生成素-细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括成肌细胞，例如，Pax7-Pax3+MyoD+肌生成素-和/或Pax7+Pax3-MyoD+肌生成素-细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括通过分化肌肉干细胞或成肌细胞(例如肌细胞、肌管和/或肌纤维)而产生的细胞。在一些实施方案中，所述植入的工程化肌原细胞为所述个体形成肌肉组织，其中肌肉组织向所述个体递送所述药剂。在一些实施方案中，在将所述药剂递送至所述个体至少约2个月后(例如，至少约3个月、6个月、1年、5年、10年或更长时间中的任一项)，可以从所述个体移除所述肌肉组织。在一些实施方案中，所述药剂由所述工程化肌原细胞分泌。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞允许递送多种药剂。
在一些实施方案中，提供了一种向需要药剂的个体递送所述药剂的方法，包括通过注射(例如，肌内或皮下)向所述个体局部给药包括工程化肌原细胞悬浮液的组合物，其中所述工程化肌原细胞包括由胚胎干细胞(ESC)或诱导多能干细胞(iPSC)和/或其分化的肌细胞产生的成肌细胞，其中所述工程化肌原细胞植入所述个体的给药部位，并且其中所述工程化肌原细胞经基因修饰以允许将所述药剂递送至所述个体。在一些实施方案中，所述组合物进一步包括载体，诸如包括细胞外基质(ECM)分子的载体。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括编码所述药剂的异源核酸序列。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞将所述药剂递送至所述个体局部。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞通过血液系统将所述药剂递送至所述个体全身。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞不是由永生化细胞系产生的。在一些实施方案中，所述成肌细胞是Pax7-Pax3+MyoD+肌生成素-和/或Pax7+Pax3-MyoD+肌生成素-细胞。在一些实施方案中，所述植入的工程化肌原细胞为所述个体形成肌肉组织，其中肌肉组织允许向所述个体递送所述药剂。在一些实施方案中，在将所述药剂递送至所述个体至少约2个月后(例如，至少约3个月、6个月、1年、5年、10年或更长时间中的任一项)，可以从所述个体移除所述肌肉组织。在一些实施方案中，所述药剂由所述工程化肌原细胞分泌。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞允许递送多种药剂。
在一些实施方案中，本申请提供了一种向需要药剂的个体递送所述药剂的方法，包括通过注射(例如，肌内或皮下)向所述个体局部给药包括工程化肌原细胞悬浮液的组合物，其中，所述工程化肌原细胞包括重编程的机缘细胞(例如肌肉干细胞、成肌细胞或肌细胞)，其中在所述个体的给药部位植入所述工程化肌原细胞，并且其中所述工程化肌原细胞经基因修饰以允许将所述药剂递送至所述个体。在一些实施方案中，所述组合物进一步包括载体，例如包括细胞外基质(ECM)分子的载体。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括编码所述药剂的异源核酸序列。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞将所述药剂递送至所述个体局部。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞通过血液系统将所述药剂递送至所述个体全身。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞不是由永生化细胞系产生的。在一些实施方案中，所述成肌细胞为Pax7-Pax3+MyoD+肌生成素-和/或Pax7+Pax3-MyoD+肌生成素-细胞。在一些实施方案中，所述植入的工程化肌原细胞在所述个体中形成肌肉组织，其中肌肉组织允许向所述个体递送所述药剂。在一些实施方案中，在将所述药剂递送至所述个体至少约2个月后(例如，至少约3个月、6个月、1年、5年、10年或更长时间中的任一项)，可以从所述个体移除所述肌肉组织。在一些实施方案中，所述药剂由所述工程化肌原细胞分泌。在一些实施方案中，所述工程化细胞允许递送多种药剂。
在一些实施方案中，本申请提供了一种向需要药剂的个体递送所述药剂的方法，包括通过注射(例如，肌内或皮下)向所述个体局部给药包括工程化肌原细胞悬浮液的组合物，其中，所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞、成肌细胞或其分化的细胞，其中所述工程化肌原细胞植入所述个体的植入部位并允许将所述药剂递送至所述个体。在一些实施方案中，所述肌肉构建物包括PAX7+肌原细胞。在一个实施方案中，所述肌肉构建物包括分散在载体中的工程化肌原细胞，所述载体诸如为包括ECM分子和细胞粘附分子(例如
Figure BDA0003380468030000241
和纤维蛋白)的载体。在一些实施方案中，所述肌肉构建物包括至少约105(例如，至少约106)个工程化肌原细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞将所述药剂递送至所述个体局部。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞通过血液系统将所述药剂递送至所述个体全身。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞不是由永生化细胞系产生的。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞，例如，Pax7+Pax3+MyoD-肌生成素-、Pax7+Pax3-MyoD-肌生成素-和/或Pax7-Pax3+MyoD-肌生成素-细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括成肌细胞，例如，Pax7-Pax3+MyoD+肌生成素-和/或Pax7+Pax3-MyoD+肌生成素-细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括分化的肌肉干细胞或成肌细胞(诸如肌细胞、肌管或肌纤维)产生的细胞。在一些实施方案中，所述植入的工程化成肌细胞在所述个体中形成肌肉组织，其中所述肌肉组织允许将所述药剂递送至所述个体。在一些实施方案中，在将所述药剂递送至所述个体至少约2个月后(例如，至少约3个月、6个月、1年、5年、10年或更长时间中的任一项)，可以从所述个体移除所述肌肉组织。在一些实施方案中，所述药剂由所述工程化肌原细胞分泌。在一些实施方案中，所述药剂在所述工程化肌原细胞的细胞表面表达。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞允许递送多种药剂。
在一些实施方案中，本申请提供了一种向需要药剂的个体递送所述药剂的方法，包括局部(例如，所述肌内或皮下)将包括工程化肌原细胞的肌肉构建物植入个体中，其中所述工程化肌原细胞包括由ESC或iPSC产生的成肌细胞或其分化细胞(例如肌细胞、肌管和/或肌纤维)，其中所述工程化肌原细胞植入所述个体的植入部位并允许将所述药剂递送至所述个体。在一些实施方案中，所述肌肉构建物包括PAX7+肌原细胞。在一些实施方案中，所述肌肉构建物包括分散在载体中的工程化肌原细胞，例如所述载体包括ECM分子和细胞粘附分子(例如
Figure BDA0003380468030000242
和纤维蛋白)的载体。在一些实施方案中，所述肌肉构建物包括至少约105(例如，至少约106)个工程化肌原细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞将所述药剂递送至所述个体局部。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞通过血液系统将所述药剂递送至所述个体全身。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞不是由永生化细胞系产生的。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括成肌细胞，例如，Pax7-Pax3+MyoD+肌生成素-和/或Pax7+Pax3-MyoD+肌生成素-细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括通过分化肌肉干细胞或成肌细胞(例如肌细胞、肌管和/或肌纤维)而产生的细胞。在一些实施方案中，所述植入的工程化肌原细胞为所述个体形成肌肉组织，其中肌肉组织允许向所述个体递送所述药剂。在一些实施方案中，在将所述药剂递送至所述个体至少约2个月后(例如，至少约3个月、6个月、1年、5年、10年或更长时间中的任一项)，可以从所述个体移除所述肌肉组织。在一些实施方案中，所述药剂由所述工程化肌原细胞分泌。在一些实施方案中，所述药剂在工程化肌原细胞的细胞表面上表达。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞允许递送多种药剂。
在一些实施方案中，本申请提供了一种向需要药剂的个体递送所述药剂的方法，包括局部(例如，所述肌内或皮下)将包括工程化肌原细胞的肌肉构建物植入个体中，其中所述工程化肌原细胞包括由胚胎多能干细胞或诱导多能干细胞产生的成肌细胞，或其分化细胞(例如，所述肌细胞、肌管和/或肌纤维)，其中将所述工程化肌原细胞植入个体的部位，并将所述药剂递送给所述个体。在一些实施方案中，所述肌肉构建物包括PAX7+肌原细胞。在一些实施方案中，所述肌肉构建物包括分散在载体中的工程化肌原细胞，例如包括ECM分子和细胞粘附分子(例如
Figure BDA0003380468030000251
和纤维蛋白)的载体。在一些实施方案中，所述肌肉构建物包括至少约105(例如，至少约106)个工程化肌原细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞将所述药剂递送至所述个体局部。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞通过血液系统将所述药剂递送至所述个体全身。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞不是由永生化细胞系产生的。在一些实施方案中，所述成肌细胞为Pax7-Pax3+MyoD+肌生成素-或Pax7+Pax3-MyoD+肌生成素-细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞植入为所述个体形成肌肉组织，其中肌肉组织允许向所述个体递送所述药剂。在一些实施方案中，在将所述药剂递送至所述个体至少约2个月后(例如，至少约3个月、6个月、1年、5年、10年或更长时间中的任一项)，可以从所述个体移除所述肌肉组织。在一些实施方案中，所述药剂由所述工程化肌原细胞分泌。在一些实施方案中，该药剂在工程化肌原细胞的细胞表面上表达。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞允许递送多种药剂。
在一些实施方案中，本申请提供了一种向需要药剂的个体递送所述药剂的方法，包括通过注射局部(例如，所述肌内或皮下)将工程化肌原细胞的肌肉悬浮液的组合物给药至所述个体，其中所述工程化肌原细胞包括Pax7-Pax3+MyoD+肌生成素-和/或Pax7+Pax3-MyoD+肌生成素-细胞，和/或其分化的肌细胞，其中所述工程化肌原细胞在所述个体的给药部位植入，其中所述植入的工程化肌原细胞为所述个体形成肌肉组织，而且其中所述工程化肌原细胞被基因修饰以允许将所述药剂递送至所述个体。在一些实施方案中，所述Pax7-Pax3+MyoD+肌生成素-和/或Pax7+Pax3-MyoD+肌生成素-细胞由ESC和iPSC产生。在一些实施方案中，通过引入下述至成体肌原细胞来产生Pax7-Pax3+MyoD+肌生成素-和/或Pax7+Pax3-MyoD+肌生成素-细胞：编码LIN28A蛋白的第一核酸、编码TERT蛋白的第二核酸和p53抑制剂(例如，编码靶向p53的shRNA的第三核酸)。在一些实施方案中，所述组合物进一步包括载体，诸如包括细胞外基质(ECM)的载体。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括编码所述药剂的异源核酸序列。在一些实施方案中，将所述药剂递送至所述个体局部。在一些实施方案中，将所述药剂递送至所述个体全身。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞由永生化细胞系产生。在一些实施方案中，在向所述个体递送所述药剂至少2个月后(例如，至少3个月、6个月、1年、5年、10年或更长时间中的任何一个)，可以从所述个体中移除所述肌肉组织。在一些实施方案中，所述药剂由工程化肌原细胞分泌。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞允许递送多种药剂。
在一些实施方案中，本申请提供了一种向需要药剂的个体递送所述药剂的方法，包括向所述个体局部(例如，所述肌内或皮下)注射给药包括工程化肌原细胞悬浮液的组合物，其中所述工程化肌原细胞包括Pax7-Pax3+MyoD+肌生成素-和/或Pax7+Pax3-MyoD+肌生成素-细胞和/或其分化的肌细胞，其中所述工程化肌原细胞植入所述个体注射的部位中，其中所述植入的工程化肌原细胞在所述个体中形成肌肉组织，并且其中所述工程化肌原细胞经基因修饰以允许将所述药剂递送至所述个体。在一些实施方案中，所述Pax7-Pax3+MyoD+肌生成素-和/或Pax7+Pax3-MyoD+肌生成素-细胞由胚胎多能干细胞或诱导多能干细胞产生。在一些实施方案中，Pax7-Pax3+MyoD+肌生成素-和/或Pax7+Pax3-MyoD+肌生成素-细胞通过将编码LIN28A蛋白的第一核酸、编码TERT蛋白的第二核酸和p53抑制剂(例如，编码靶向p53的shRNA的第三核酸)引入成体肌原细胞而产生。在一些实施方案中，所述组合物进一步包括载体，例如所述载体包括细胞外基质(ECM)的载体分子。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括编码所述药剂的异源核酸序列。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞将所述药剂递送至所述个体局部。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞通过血液系统将所述药剂递送至所述个体全身。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞不是由一种永生化细胞系。在一些实施方案中，在将所述药剂递送至所述个体至少2个月后(例如，至少3个月、6个月、1年、5年、10年或更长时间中的任一项)，可以从所述个体移除所述肌肉组织。在一些实施方案中，所述药剂是由所述工程化肌原细胞分泌。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞允许递送多种药剂。
在一些实施方案中，本申请提供了一种向需要药剂的个体递送所述药剂的方法，包括局部(例如，所述肌内或皮下)将包括工程化肌原细胞的肌肉构建物植入个体中，其中，所述工程化肌原细胞包括Pax7-Pax3+MyoD+肌生成素-和/或Pax7+Pax3-MyoD+肌生成素-细胞，其中所述工程化肌原细胞在所述个体的给药部位植入，其中所述植入的工程化肌原细胞在所述个体中形成肌肉组织，并且其中所述工程化肌原细胞经基因修饰以允许将所述药剂递送至所述个体。在一些实施方案中，Pax7-Pax3+MyoD+肌生成素-和/或Pax7+Pax3-MyoD+肌生成素-细胞由胚胎多能干细胞或诱导多能干细胞产生。在一些实施方案中，Pax7-Pax3+MyoD+肌生成素-和/或Pax7+Pax3-MyoD+肌生成素-细胞通过将编码LIN28A蛋白的第一核酸、编码TERT蛋白的第二核酸和p53抑制剂(例如，编码靶向p53的shRNA的第三核酸)转染或转入成体肌原细胞而产生。在一些实施方案中，所述肌肉构建物进一步包括载体，例如所述载体包括细胞外基质(ECM)分子和细胞粘附分子(例如
Figure BDA0003380468030000271
和纤维蛋白)。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括编码所述药剂的异源核酸序列。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞将所述药剂递送至所述个体局部。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞通过血液系统将所述药剂递送至所述个体全身。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞不是由永生化细胞系产生的。在一些实施方案中，在将所述药剂递送至所述个体至少约2个月后(例如，至少约3个月、6个月、1年、5年、10年或更长时间中的任一项)，可以从所述个体移除所述肌肉组织。在一些实施方案中，所述药剂由所述工程化肌原细胞分泌。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞允许递送多种药剂。
在一些实施方案中，本申请提供了一种向需要药剂的个体递送所述药剂的方法，包括向所述个体给药包括工程化肌原细胞的组合物，其中所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞、成肌细胞和/或其分化细胞，其中，所述工程化肌原细胞植入所述个体的给药部位，并且其中所述工程化肌原细胞经基因修饰以允许将所述药剂递送至所述个体。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括编码所述药剂的异源核酸序列。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞将所述药剂递送至所述个体局部。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞通过血液系统将所述药剂递送至所述个体全身。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞不是由永生化细胞系产生的。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞，例如，Pax7+Pax3+MyoD-肌生成素-、Pax7+Pax3-MyoD-肌生成素-和/或Pax7-Pax3+MyoD-肌生成素-细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括成肌细胞，例如，Pax7-Pax3+MyoD+肌生成素-和/或Pax7+Pax3-MyoD+肌生成素-细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括由ESC或iPSC产生的肌原细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括重编程的肌原细胞(例如成肌细胞)。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞是有成体肌原细胞产生的更生的和/去分化的肌原细胞。通过将编码LIN28A蛋白的第一核酸、编码TERT蛋白的第二核酸和p53抑制剂(例如，编码靶向p53的shRNA的第三核酸)引入成体肌原细胞产生所述重编程的肌原细胞。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞是由成体体细胞(例如成纤维细胞)产生的转分化的肌原细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括由分化的肌肉干细胞或成肌细胞(诸如肌细胞、肌管和/或肌纤维)产生的细胞。在一些实施方案中，所述植入的工程化肌原细胞在所述个体中形成肌肉组织。在一些实施方案中，在将所述药剂递送至所述个体至少约2个月后(例如，至少约3个月、6个月、1年、5年、10年或更长时间中的任一项)，可以从所述个体移除所述肌肉组织。在一些实施方案中，所述药剂由所述工程化肌原细胞分泌。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞允许递送多种药剂。
所述工程化肌原细胞可具有下文第四节“工程化肌原细胞”中所述的任何特征或特征组合。所述工程化肌原细胞可以从各种来源获得。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞是自体的。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞是同种异体的。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞对所述个体无免疫原性。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞由细胞系产生。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞不是由永生化细胞系产生的。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞是由从所述个体获得的原代细胞产生。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞是从供体获得的原代细胞产生。
在一些实施方案中，所述方法还包括向所述个体给药有效量的免疫抑制剂，以最小化工程化肌原细胞的排斥反应。免疫抑制剂的实例包括但不限于甲氨蝶呤、环磷酰胺、环孢霉素、环孢霉素A、氯喹、羟基氯喹、柳氮磺胺吡啶(磺胺吡啶)、金盐、D-青霉胺、来氟米特、硫唑嘌呤、阿那金、英夫利昔单抗(瑞米卡德)、依那西普、TNF-α、阻滞剂、，一种针对炎性细胞因子的生物药剂和非甾体抗炎药(NSAIDs)。
本文所述的任何方法可进一步包括一个或多个步骤，用于体外生产工程化肌原细胞或其肌肉构建物。本申请所述的任何方法可使用任何适合于肌原细胞体外增殖和/或分化的方法。例如，见Chua et al.，2019；和Fukawa et al.，2016。在一些实施方案中，所述方法包括从所述个体或供体获得工程化肌原细胞(例如，所述肌肉干细胞、成肌细胞或肌肉祖细胞)。在一些实施方案中，所述方法包括如下文第三节“更生方法”中所述的从成体肌原细胞产生重编程的肌原细胞的方法的任一项。在一些实施方案中，所述方法包括从成体体细胞(例如，成纤维细胞)产生重编程的肌原细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在允许工程化肌原细胞增殖的条件下体外培养所述工程化肌原细胞。在一些实施方案中，所述方法包括：在允许所述成肌细胞不发生分化地增殖的条件下在体外培养所述工程化肌原细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞在包括含有约20％FBS的DMEM的增殖培养基中培养。在一些实施方案中，所述方法包括：在允许所述工程化肌肉干细胞分化为成肌细胞、肌细胞、肌管和/或肌纤维的条件下在体外培养所述工程化肌肉干细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在体外培养所述工程化肌原细胞，条件允许下所述工程化肌原细胞可分化为肌细胞、肌管和/或肌纤维。在一些实施方案中，所述方法包括在将所述工程化肌原细胞排列为成排的肌管和/或肌纤维的条件下体外培养所述工程化肌原细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞在包括DMEM/F12、2％马血清和1％L-谷氨酰胺的分化培养基中培养。在一些实施方案中，在向所述个体给药前，所述方法将所述工程化肌原细胞体外培养至少约3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或更长时间。
本申请所述的任何方法可进一步包括用于制备肌肉构建物的一个或多个步骤。本申请所述任何一个方法可使用任何合适的方法来制备肌肉构建物。例如，参见Velcro锚定纤维蛋白构建物(如Hinds et al.,2011)和缝合锚定纤维蛋白构建物(如Khodabukus andBaar，2009)，所述肌肉构建物的三维生物打印，如通过同轴打印(如Testa，2018)和使用组织衍生生物墨水(如Choi，2019)，以及在三维印刷模具上培养肌肉祖细胞(例如，Capel，2019)。在一些实施方案中，所述方法包括在体外条件下培养所述工程化肌肉祖细胞(例如成肌细胞)以产生肌肉构建物。在一些实施方案中，所述工程化肌肉祖细胞(例如成肌细胞)在水凝胶载体(例如包括
Figure BDA0003380468030000301
和纤维蛋白的载体)中培养以产生肌肉构建物。在一些实施方案中，所述方法将工程化肌肉祖细胞(例如成肌细胞)培养在水凝胶(诸如纤维蛋白)的表面上，并用缝线锚定以产生肌肉构建物。在一些实施方案中，所述工程化肌肉祖细胞(例如成肌细胞)在三维(“3D”)实体模具中培养以产生预成形肌肉构建物。在一些实施方案中，所述工程化肌肉祖细胞(例如成肌细胞)用墨水进行3D打印以产生限定的3D肌肉构建物。
在一些实施方案中，本申请提供了一种制备供食用的非人类肉制品的方法，所述方法包括在合适条件下培养包括工程化肌原细胞的组合物以产生肌肉构建物，其中所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞、成肌细胞和/或其分化细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞可经基因修饰以允许递送所述药剂。
本申请所述包括工程化肌原细胞的组合物可以是细胞悬浮液或肌肉构建物。在一些实施方案中，所述组合物为适于注射的溶液。在一些实施方案中，所述组合物是适于外科植入的水凝胶。合适的局部给药途径包括但不限于肌内和皮下给药。所述组合物可在体内任何适当位置肌内注射，包括但不限于手臂三角肌、大腿股外侧肌、臀部腹黄肌和臀部背黄肌。所述组合物可在体内任何适当位置皮下给药，包括但不限于上臂外侧区域、腹部、大腿前部、上背部和臀部上部区域。
在一些实施方案中，所述组合物包括载体。在一些实施方案中，所述载体包括细胞粘附分子，诸如纤维蛋白。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞与载体混合。在一些实施方案中，所述载体包括细胞外基质分子。在一些实施方案中，所述载体包括
Figure BDA0003380468030000311
在一些实施方案中，所述载体包括细胞粘附分子，诸如纤维蛋白。
在一些实施方案中，所述植入的肌原细胞或其构建物在所述个体的给药部位产生肌肉组织。所述肌肉组织在所述给药部位停留较长时间(例如，至少2个月、3个月、6个月、1年、5年、10年或更长的时间)。在一些实施方案中，所述肌肉组织与所述个体的周围组织融合。在一些实施方案中，所述肌肉组织未与所述个体的周围组织融合。在一些实施方案中，所述肌肉组织在体内被包裹在水凝胶载体中。在一些实施方案中，所述肌肉组织未在体内包裹。在一些实施方案中，所述肌肉组织从个体的周围组织招募血管(例如，毛细血管)。在一些实施方案中，所述肌肉组织可招募血管以向所述个体血液系统递送所分泌的药剂。在一些实施方案中，所述药剂可局部递送至所述个体的周围组织的细胞中。
在一些实施方案中，所述肌肉组织为所述个体体内持续存在至少约7周、8周、2个月、3个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、5年、10年、20年、30年、40年、50年或更长时间。在一些实施方案中，其中所述个体为啮齿动物(例如，小鼠)，所述肌肉组织可在所述个体体内持续存在至少8个月、9个月、10个月、11个月、1年或更长时间。在一些实施方案中，所述方法在药剂被递送到所述个体后，可以从所述个体移除所述肌肉组织。在一些实施方案中，所述方法不从个体移除所述肌肉组织。在一些实施方案中，在药剂已递送至所述个体一段长时间后，例如至少7周、8周、2个月、3个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、5年、10年、20年、30年、40年、50年或更长时间，可以从所述个体移除所述肌肉组织。在一些实施方案中，其中所述个体为啮齿类动物(例如，小鼠)，在药剂已递送至所述个体至少8个月、9个月、10个月、11个月、1年或更长时间后，可以从所述个体移除所述肌肉组织。在一些实施方案中，所述肌肉组织允许向所述个体将所述药剂递送至少7周、8周、2个月、3个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、5年、10年、20年、30年、40年、50年或更长时间中的任一项。在一些实施方案中，其中个体为啮齿动物(例如，小鼠)，将所述药剂递送至所述个体至少约8个月、9个月、10个月、11个月、1年或更长时间中的任一项。
经基因修饰的工程化肌原细胞可将药剂递送至所述个体。在一些实施方案中，经基因修饰的工程化肌原细胞表达所述药剂。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞经基因修饰可表达一个或多个分子(例如，代谢物、DNA、RNA和/或蛋白质)，以递送所述药剂。合适的基因修饰包括但不限于引入突变(例如indel、选择性剪接、替代等)、基因敲入或敲除以及表观基因修饰。所述药剂可以是工程化肌原细胞的天然产物，也可以是肌原细胞的外源产物。在一些实施方案中，所述方法包括编辑所述工程化肌原细胞的一个或多个内源性基因以改变所述工程化肌原细胞所述药剂的表达(例如，增加表达或诱导表达)。在一些实施方案中，所述方法包括将编码所述药剂的调节因子的异源核酸序列转入所述工程化肌原细胞以改变所述工程化肌原细胞(例如，增加表达或诱导表达)所述药剂的表达。在一些实施方案中，将一个或多个编码所述药剂的异源核酸序列转入所述工程化肌原细胞以允许所述工程化肌原细胞表达所述药剂。
所述工程化肌原细胞可通过多种方式向所述个体递送所述药剂。在一些实施方案中，所述药剂由所述工程化肌原细胞分泌。在一些实施方案中，所述药剂在工程化肌原细胞的细胞表面上表达。在一些实施方案中，所述药剂可从植入的肌原细胞扩散到所述个体中的周围组织。在一些实施方案中，所述药剂可主动地从植入的肌原细胞递送至周围组织。在一些实施方案中，所述药剂可通过细胞-细胞桥和/或纳米管从植入的肌原细胞递送至周围组织。在一些实施方案中，所述药剂可通过将所植入的肌原细胞融合到周围组织来递送。在一些实施方案中，所述药剂可由植入的肌原细胞形成的肌肉组织中的脉管系统递送。在一些实施方案中，所述药剂可通过细胞-细胞连接从植入的肌原细胞递送至周围组织。
所述植入的工程化肌原细胞或肌肉构建物允许递送多种药剂，包括但不限于小分子(例如代谢物、营养素、药物、大环内酯类)、核酸(例如，DNA如双链DNA、单链DNA、适体、纳米结构、DNA酶等，RNA如mRNA、shRNA、siRNA、lincRNA、微小RNA、环状RNA、适体、核酶、tRNA、tmRNA、snRNA、rRNA、导向RNA等，人工核酸如LNA、PNA、吗啉、修饰DNA、修饰RNA等，包括治疗性核酸)，肽、蛋白质(例如，生长因子、细胞因子、激素、抗体、受体、诱饵受体、受体配体、酶或人工蛋白质)、病毒、细胞外小泡、疫苗(例如，DNA、RNA或蛋白质疫苗)和报告分子(例如，生物标记物或带标签的融合蛋白)。所述药剂可以是天然存在的，也可以是人工设计的。所述药剂可以在细胞表面分泌或表达。在一些实施方案中，所述植入的工程化肌原细胞或肌肉构建物可组成性地产生所述药剂。在一些实施方案中，所述药剂的产生是可诱导的。
在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞产生单一药剂。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞产生多种(例如，2、3、4、5、6、10、20或更多种)药剂。
所述组合物可在所述个体一生中对所述个体给药一次。在一些实施方案中，所述组合物可多次(例如，2、3、4、5、6、10、20或更多次中的任一项)给药。在一些实施方案中，每次给药包括不同类型的工程化肌原细胞(例如，能够递送不同药剂的肌原细胞)的组合物。
所述组合物可给药于需要药剂的任何个体，尤其是慢性病的药剂递送。在一些实施方案中，所述个体是哺乳动物。在一些实施方案中，所述个体是人。在一些实施方案中，所述个体是疾病或病况的非人动物模型。在一些实施方案中，所述个体是非人灵长类动物。在一些实施方案中，所述个体是啮齿动物，例如小鼠或大鼠。在一些实施方案中，所述个体是婴儿。在一些实施方案中，所述个体是儿童。在一些实施方案中，所述个体不超过18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2岁、1岁或6个月大中的任一项。在一些实施方案中，所述个体是成年人。在一些实施方案中，所述个体是至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80岁或更大年岁中的任一项。
本申请进一步提供了治疗或诊断个体疾病或病况的方法，包括使用本文所述的任何一种递送方法向所述个体递送所述药剂，其中所述药剂可治疗或诊断所述疾病或病况。
在一些实施方案中，本申请提供了一种治疗个体疾病或病况的方法，包括局部向所述个体给药包括工程化肌原细胞的组合物，其中所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞、成肌细胞和/或其分化细胞，其中，所述工程化肌原细胞植入到所述个体的给药部位，其中所述工程化肌原细胞经基因修饰以向所述个体递送所述药剂，并且其中所述治疗药剂治疗所述疾病或病况。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括编码所述治疗药剂的异源核酸序列。在一些实施方案中，所述组合物肌内给药。在一些实施方案中，所述组合物皮下给药。在一些实施方案中，所述组合物递送所述药剂至所述个体局部。在一些实施方案中，所述组合物递送所述药剂至所述个体全身。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞不是由永生化细胞系产生的。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞，例如，Pax7+Pax3+MyoD-肌生成素-、Pax7+Pax3-MyoD-肌生成素-和/或Pax7-Pax3+MyoD-肌生成素-细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括成肌细胞，例如，Pax7-Pax3+MyoD+肌生成素-和/或Pax7+Pax3-MyoD+肌生成素-细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括由胚胎多能干细胞或诱导多能干细胞产生的成肌细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括重编程的肌原细胞(例如成肌细胞)。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞是由成体肌原细胞产生的更生和/或去分化的肌原细胞。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞可通过将编码LIN28A蛋白的第一核酸、编码TERT蛋白的第二核酸和p53抑制剂(例如，编码靶向p53的shRNA的第三核酸)转入成体肌原细胞来产生。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞是由成体体细胞(例如，成纤维细胞)产生的转分化肌原细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括通过分化肌肉干细胞或成肌细胞(例如肌细胞、肌管和/或肌纤维)而产生的细胞。在一些实施方案中，所述植入的工程化肌原细胞可为所述个体形成肌肉组织，其中肌肉组织允许向所述个体输送治疗药剂。在一些实施方案中，在将所述药剂递送至所述个体至少约2个月后(例如，至少约3个月、6个月、1年、5年、10年或更长时间中的任一项)从所述个体移除所述肌肉组织。在一些实施方案中，所述治疗药剂由所述工程化肌原细胞分泌。在一些实施方案中，所述药剂在工程化肌原细胞的细胞表面上表达。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞允许递送多种药剂。
本文所述的给药方法特别适合用于治疗或诊断需要长期给药的疾病或病症。示范性疾病或病况包括但不限于营养不良、代谢性疾病或病况(如糖尿病)、遗传性疾病(如血友病)等。
在一些实施方案中，本申请提供了一种为所述个体治疗糖尿病(例如，I型糖尿病)的方法，包括向所述个体局部给药包括含有编码胰岛素的核苷酸序列的工程化肌原细胞的组合物，其中所述工程化肌原细胞包括肌干细胞，肌原细胞和/或其分化细胞，其中所述工程化肌原细胞植入所述个体的给药部位，并且其中所述工程化肌原细胞经基因修饰以向所述个体的血液系统递送胰岛素。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括编码胰岛素的异源核酸序列。
在一些实施方案中，本申请提供了一种为所述个体治疗血友病(例如B型血友病)的方法，包括向所述个体局部给药包括核苷酸序列编码IX因子的工程化肌原细胞的组合物，其中所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞、成肌细胞和/或其分化细胞，其中所述工程化肌原细胞植入所述个体的给药部位，并且其中所述工程化肌原细胞经基因修饰以通过个体的血液系统将IX因子递送至所述个体。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括编码IX因子的异源核酸序列。
本申请还提供了制备疾病或病况的非人动物模型的方法，包括使用本文所述的任何一种递送方法向非人动物递送所述药剂，其中所述药剂与所述疾病或病况相关。
在一些实施方案中，本申请提供了一种制备疾病或病况的非人动物模型的方法，包括向非人动物局部给药包括工程化肌原细胞的组合物，其中所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞、成肌细胞和/或其分化细胞，其中，所述工程化肌原细胞植入所述非人动物的给药部位，其中所述工程化肌原细胞经基因修饰以将与所述疾病或病况相关的药剂递送至所述非人动物，从而提供所述非人动物模型。在一些实施方案中，所述药剂将递送至非人动物的血液系统。在一些实施方案中，所述药剂为人类蛋白质、RNA或代谢物。在一些实施方案中，所述非人类动物选自哺乳动物(例如，猪、牛、羊、山羊、马等)、鸟类(例如，鸡、鸭、火鸡等)、鱼、无脊椎动物、爬行动物和两栖动物。在一些实施方案中，所述非人动物是啮齿动物，例如小鼠或大鼠。在一些实施方案中，所述非人动物是非人灵长类动物。
在一些实施方案中，本申请提供了一种治疗疾病或病况的非人动物模型的方法，包括向非人动物局部给药包括工程化肌原细胞的组合物，其中所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞、成肌细胞和/或其分化细胞，其中所述工程化肌原细胞植入非人动物的给药部位，其中所述工程化肌原细胞经基因修饰以允许递送治疗非人动物的疾病或病况的药剂。在一些实施方案中，所述药剂递送至非人动物的血液中。在一些实施方案中，所述药剂为人类蛋白质、RNA或代谢物。在一些实施方案中，所述非人类动物选自哺乳动物(例如猪、牛、羊、山羊、马等)、鸟类(例如鸡、鸭、火鸡等)、鱼类、无脊椎动物、爬行动物和两栖动物。在一些实施方案中，所述非人动物是啮齿动物，如小鼠或大鼠。在一些实施方案中，所述非人动物是非人灵长类动物。
在一些实施方案中，本申请提供了使用本文所述的方法的任一项制备的疾病或病况的非人动物模型。在一些实施方案中，本申请提供了筛选用于治疗疾病或病况的治疗药剂的方法，包括向患有所述疾病或病况的非人动物模型给药使用本文所述的方法的任一项所制备的治疗药剂，并通过评估非人动物模型中与所述疾病或病况相关的一个或多个参数来确定所述治疗药剂的疗效。
III.产生重编程的肌原细胞的方法
本申请还提供了从成体肌原细胞生产重编程(例如，更生和/或去分化)的肌原细胞(例如，所述肌肉干细胞、成肌细胞和/或肌细胞)的方法。所述方法包括将在胎儿发育中高度调节的三个因子的核心组转入成体肌原细胞，例如胚胎调节因子、端粒相关调节因子和细胞周期调节因子。例如，通过将LIN28A、TERT(例如，hTERT)和p53抑制剂引入成体肌原细胞(在本文中也称为“LTS肌原细胞”)而产生的重编程的肌原细胞与成体肌原细胞相比具有显著增强的增殖、分化和植入能力。在一些实施方案中，与成体肌原细胞相比，所述重编程的肌原细胞是去分化的。在一些实施方案中，与成体肌原细胞相比，所述重编程的肌原细胞是更生(rejuvenated)的。在一些实施方案中，与成体肌原细胞相比，所述重组肌原细胞既去分化又更生(rejuvenated)。
在一些实施方案中，本申请提供了一种从成体肌原细胞产生重编程的肌原细胞的方法，包括：a)将胚胎调节因子、端粒相关调节因子和细胞周期调节因子引入成体肌原细胞，以提供转导的肌原细胞；和b)在合适条件下培养转导的肌原细胞以获得更生的肌原细胞。在一些实施方案中，所述肌原细胞是人类细胞。在一些实施方案中，所述肌原细胞是肌肉干细胞、成肌细胞或肌细胞。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞是更生(rejuvenated)的。在一些实施方案中，所述成体肌原细胞表达高水平的p21WAF1、p16INK4a和let-7微RNA。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞表达低水平的p21WAF1、p16INK4a和let-7微RNA。在一些实施方案中，所述成体肌原细胞可经历不超过约30轮群体倍增。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞可经历至少约90轮群体倍增。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞是去分化的。在一些实施方案中，所述成体肌原细胞不表达PAX3，或表达低水平的PAX3。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞为PAX3+。
胚胎调节因子、端粒相关调节因子和细胞周期调节因子可是任何合适的分子形式，包括蛋白质、核酸(DNA、RNA如RNAi、miRNA、mRNA等)和小分子。在一些实施方案中，所述胚胎调节因子是RNA结合调节因子。在一些实施方案中，所述胚胎调节因子是let-7微小RNA的调节因子。在一些实施方案中，所述胚胎调节因子为LIN28A。在一些实施方案中，所述端粒相关调节因子是稳定端粒的调节因子。在一些实施方案中，所述端粒相关调节因子为端粒蛋白复合体。在一些实施方案中，所述端粒相关调节因子为TERT。在一些实施方案中，所述细胞周期调节因子是p53抑制剂。
在一些实施方案中，本申请提供了一种从成体肌原细胞产生重编程的肌原细胞的方法，包括：a)将LIN28A、TERT和p53抑制剂引入成体肌原细胞，以提供转导的肌原细胞；和b)在合适条件下培养转导的肌原细胞以获得重编程的肌原细胞。在一些实施方案中，所述肌原细胞是人类细胞。在一些实施方案中，所述肌原细胞是肌肉干细胞、成肌细胞或肌细胞。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞是更生的。在一些实施方案中，所述成体肌原细胞表达高水平的p21WAF1、p16INK4a和let-7微RNA。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞表达低水平的p21WAF1、p16INK4a和let-7微RNA。在一些实施方案中，所述成体肌原细胞可经历不超过约30轮群体倍增。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞可经历至少约90轮群体倍增。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞是去分化的。在一些实施方案中，所述成体肌原细胞不表达PAX3，或表达低水平的PAX3。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞为PAX3+。
在一些实施方案中，本申请提供了一种从成体肌原细胞产生重编程的肌原细胞的方法，包括：a)将编码LIN28A蛋白的第一核酸、编码TERT蛋白的第二核酸以及编码靶向p53的shRNA的第三核酸引入成体肌原细胞以提供转导的肌原细胞；和b)在合适条件下培养转导的肌原细胞以获得重编程的肌原细胞。在一些实施方案中，所述肌原细胞是人类细胞。在一些实施方案中，所述肌原细胞是肌肉干细胞、成肌细胞或肌细胞。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞是更生的。在一些实施方案中，所述成体肌原细胞表达高水平的p21WAF1、p16INK4a和let-7微RNA。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞表达低水平的p21WAF1、p16INK4a和let-7微RNA。在一些实施方案中，所述成体肌原细胞可经历不超过约30轮群体倍增。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞可经历至少约90轮群体倍增。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞是去分化的。在一些实施方案中，所述成体肌原细胞不表达PAX3，或表达低水平的PAX3。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞为PAX3+。在一些实施方案中，所述转导的肌原细胞在包括含有约20％FBS的DMEM的培养基中培养。
在一些实施方案中，所述成体肌原细胞从人类个体获得。所述成体肌原细胞可从至少18岁的个体获得，其诸如为至少约20、30、40、50、60、70、80岁或更大年岁。在一些实施方案中，成体肌原细胞可从健康供体获得。在一些实施方案中，所述成体肌原细胞是早衰肌原细胞。在一些实施方案中，所述成体肌原细胞从具有肌减少症的个体获得。在一些实施方案中，所述成体肌原细胞可从具有恶病质的个体获得。在一些实施方案中，所述成体肌原细胞从患有癌症的个体获得。在一些实施方案中，所述成体肌原细胞源自肌原细胞系。在一些实施方案中，所述成体肌原细胞可经历不超过40、35、30、25、20、15、10、5或更少轮群体倍增中的任一项。在一些实施方案中，所述成体肌原细胞具有高表达水平的细胞周期抑制剂，其诸如为p21WAF1、p27KIP1和p16INK4a，和/或抗增殖因子，其诸如为let-7微RNA，例如let-7b/g。在一些实施方案中，所述成体肌原细胞中细胞周期抑制剂(例如p21WAF1、p27KIP1或p16INK4a)和/或抗增殖因子(例如let-7微小RNA)的表达水平(例如mRNA表达水平或蛋白质表达水平)为重编程的肌原细胞中相应的细胞周期抑制剂和/或抗增殖因子的表达水平的至少约2、3、5、10、20、50、100倍或更多倍中的任一项。
本文所用的“LIN28A蛋白质”包括保持LIN28A活性的Lin-28同系物A的任何自然存在形式或其变体(例如，与LIN28A相比，在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性范围内)。在一些实施方案中，与天然存在的Lin28A多肽相比，所述变体在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，所述LIN28A蛋白质为人类LIN28A蛋白质。在一些实施方案中，所述LIN28A蛋白质是NCBI序列NP_078950.1的蛋白质。
本文使用的“TERT蛋白”包括端粒酶逆转录酶的任何自然存在形式，或维持TERT活性的其变体(例如，与TERT相比，至少在50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的活性范围内)。在一些实施方案中，与天然存在的TERT多肽相比，所述变体在整个序列或序列的一部分(例如，50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，所述TERT蛋白质为人类TERT(hTERT)蛋白质。在一些实施方案中，所述TERT蛋白质被鉴定为NCBI参比序列NP937983.2的蛋白质。
“p53抑制剂”是指降低p53活性和/或表达的分子。本文所用的“p53”系指由人类p53基因或任何感兴趣的非人类物种中的同源基因编码的蛋白质的任何异构体。P53也称为肿瘤蛋白P53(TP53)、肿瘤抗原P53、磷蛋白P53、肿瘤抑制因子P53、抗原NY-CO-13或转化相关蛋白53(TRP53)。p53的小鼠同源物由Trp53基因编码。在一些实施方案中，所述p53抑制剂降低p53蛋白的活性。在一些实施方案中，所述p53抑制剂降低p53基因的表达。在一些实施方案中，所述p53抑制剂降低p53蛋白的活性和p53基因的表达。p53抑制剂的实例包括但不限于核酸、蛋白质、显著阴性蛋白质、肽、寡糖、多糖、脂质、磷脂、糖脂、单体、聚合物、小分子和有机化合物。在一些实施方案中，所述p53抑制剂为匹菲他林。在一些实施方案中，所述p53抑制剂是核酸。在一些实施方案中，所述p53抑制剂是短发夹RNA(shRNA)。在一些实施方案中，所述p53抑制剂是小干扰RNA。在一些实施方案中，所述p53抑制剂是蛋白质。在一些实施方案中，所述p53抑制剂是显著阴性蛋白质。
使用本领域的任何已知方法将胚胎调节因子(例如LIN28A)、端粒相关调节因子(例如TERT)和细胞周期调节因子(例如p53抑制剂)引入成体肌原细胞。在一些实施方案中，通过将编码LIN28A蛋白质的第一核酸、编码TERT(例如，hTERT)蛋白质的第二核酸和编码p53抑制剂(例如，靶向p53的shRNA)的第三核酸转染到成体肌原细胞中来引入LIN28A、TERT和p53抑制剂。术语“转染”或“转入”是指通过非病毒或基于病毒的方法将核酸分子引入细胞的过程。非病毒转染方法包括不使用病毒DNA或病毒颗粒作为传递系统将核酸分子导入细胞的任何适当转染方法。示例性非病毒转染方法包括磷酸钙转染、脂质体转染、核转染、声穿孔、通过热休克、磁转染、囊泡和电穿孔进行的转染。在一些实施方案中，所述方法使用电穿孔将核酸分子引入细胞中。对于基于病毒的转染方法，可在本文所述方法中使用任何有用的病毒载体。病毒载体的实例包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、慢病毒和腺相关病毒载体。在一些实施方案中，可使用逆转录病毒载体将核酸分子引入细胞。
在一些实施方案中，编码LIN28A蛋白、TERT蛋白和p53抑制剂的核酸存在于单个载体中。在一些实施方案中，编码LIN28A蛋白质的核酸、编码TERT蛋白质的核酸和编码p53抑制剂的核酸存在于不同(例如，2或3个)所述载体中。在一些实施方案中，编码LIN28A蛋白、TERT蛋白和p53抑制剂的核酸在转导的肌原细胞中瞬时表达。在一些实施方案中，编码LIN28A蛋白、TERT蛋白和p53抑制剂的核酸整合在转导的肌原细胞的基因组中。在一些实施方案中，所述核酸为DNA。在一些实施方案中，所述核酸为RNA，例如mRNA。
在一些实施方案中，所述转导的肌原细胞经历扩增且经历选择过程。所述选择过程可包括在转染时引入成体肌原细胞的选择标记物。所述选择标记物可为编码具有酶活性的多肽的基因、抗生素抗性基因或荧光蛋白质。酶活性包括但不限于乙酰转移酶和磷酸转移酶的活性。在一些实施方案中，所述选择标记物赋予转导的所述肌原细胞在存在毒素的情况下增殖的能力。这种毒素通常抑制细胞扩增和/或导致细胞死亡。例如所述毒素包括但不限于潮霉素、新霉素、嘌呤霉素和庆大霉素。在一些实施方案中，所述毒素为潮霉素。通过选择标记物物的酶活性，所述毒素可转化为非毒素，其不再抑制扩增并导致转导的肌原细胞的细胞死亡。暴露于毒素后，缺乏选择标记物的细胞可以被消除，从而防止扩增。
重编程的肌原细胞可通过评估分子标记物(如PAX3、PAX7、MYOD、MYF5、MYOG、ACTA1、MYH1、MYH3、MYH8和MYH7)的表达来鉴定。重编程的肌原细胞也可以通过评估其细胞形态、增殖和分化能力来鉴定。在一些实施方案中，与成体肌原细胞相比，所述重编程的肌原细胞表达更高水平的PAX3和MYOD，以及更低水平的ACTA1、MYH1、MYH3和MYH8。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞中PAX3的表达水平(例如，mRNA表达水平或蛋白质表达水平)至少是成体肌原细胞中PAX3表达水平的2、3、5、10、20、50、100倍或更多倍中的任一项。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞具有60、70、75、80、85、90、95、100、110、120或更多轮群体倍增。
在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞具有增强的氧化磷酸化(OxPhos)、增加的线粒体活性氧自由基(mtROS)水平和增强的促分裂信号传导。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞具有增强的应激响应(例如，未折叠蛋白质响应和DNA损伤修复)。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞增加了糖酵解。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞增加了HIF1A的表达水平。
在一些实施方案中，本申请提供了一种在成体肌原细胞中激活HIF1A的方法，包括将编码LIN28A蛋白的核酸引入成体肌原细胞。在一些实施方案中，该方法进一步包括将编码TERT的核酸和p53抑制剂(例如，靶向p53的shRNA)引入成体肌原细胞。在一些实施方案中，该方法诱导HIF1A介导的氧不足响应。在一些实施方案中，该方法诱导HIF1A介导的糖酵解。
在一些实施方案中，本申请提供了一种在成体肌原细胞中诱导mtROS产生的方法，包括将编码LIN28A蛋白的核酸引入成体肌原细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将编码TERT的核酸和p53抑制剂(例如，靶向p53的shRNA)引入成体肌原细胞。
在一些实施方案中，本申请提供了一种在成体肌原细胞中诱导线粒体毒物兴奋信号传导的方法，包括向成体肌原细胞引入编码LIN28A蛋白的核酸。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将编码TERT的核酸和p53抑制剂(例如，靶向p53的shRNA)引入成体肌原细胞。在一些实施方案中，所述方法诱导氧不足应激响应。在一些实施方案中，所述方法诱导糖酵解响应。在一些实施方案中，所述方法诱导DNA损伤修复。在一些实施方案中，所述方法诱导未折叠蛋白质响应。
在一些实施方案中，所述转导的肌原细胞或重编程的肌原细胞在有适当细胞营养的环境中无分化地增殖。所述环境可以是液体环境、固体环境和/或半固体环境(例如，琼脂、凝胶等)。在一些实施方案中，所述转导的肌原细胞或重编程的肌原细胞可培养在合适的培养基中。培养基可支持细胞的增殖和/或分化。在一些实施方案中，所述培养基包括含有约20％FBS的DMEM。在一些实施方案中，所述培养基包括DMEM/F12、约2％马血清和约1％L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，所述转导的肌原细胞或重编程的肌原细胞可在体外培养至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天中的任一项。在一些实施方案中，所述转导的肌原细胞或重编程的肌原细胞可在体外培养不超过14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1天中的任一项。
在一些实施方案中，本申请提供了根据本文所述的产生重编程的肌原细胞的方法的任一项制备的重编程(例如，更生和/或去分化)的肌原细胞。在一些实施方案中，本申请提供了一种重编程的肌原细胞，其包括成体肌原细胞(例如成肌细胞)，其包括编码LIN28A蛋白质的第一异源核酸序列、编码TERT蛋白质的第二异源核酸序列和编码p53抑制剂的第三异源核酸序列(例如，靶向p53的shRNA)。在一些实施方案中，所述重编程的肌原细胞不包括编码胚胎或胎儿发育中其他调节因子的异源核酸。
本文还提供了使用本文所述的任何一种重编程的肌原细胞产生肌细胞、肌管、肌纤维或肌肉构建物的方法。所述方法包括在适当条件下培养重编程的肌原细胞以诱导重编程的肌原细胞的分化。例如，在一些实施方案中，所述方法包括在包括DMEM/F12、约2％马血清和约1％L-谷氨酰胺的生长培养基中培养重编程的肌原细胞(例如成肌细胞)。
本文所述的重编程的肌原细胞可用于上文第二节所述的任何一种递送方法。在一些实施方案中，提供了一种向需要药剂的个体递送所述药剂的方法，包括向所述个体局部给药包括工程化肌原细胞的组合物，其中所述工程化肌原细胞包括重编程的肌原细胞(例如，所述肌肉干细胞、成肌细胞和/或肌细胞)和/或其分化细胞(例如，肌管和/或肌纤维)，其中所述重编程的肌原细胞通过将胚胎调节因子(例如，编码LIN28A蛋白的第一核酸)、端粒相关调节因子(例如，编码TERT蛋白的第二核酸，例如hTERT)，以及细胞周期调节因子(例如，所述p53抑制剂，例如编码靶向p53的shRNA的第三核酸)引入成体肌原细胞而产生，其中所述工程化肌原细胞植入所述个体的给药部位，并且其中所述工程化肌原细胞经基因修饰以允许将所述药剂递送到所述个体。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括编码所述药剂的异源核酸序列。在一些实施方案中，所述组合物肌内给药。在一些实施方案中，所述组合物皮下给药。在一些实施方案中，将所述药剂递送至所述个体局部。在一些实施方案中，将所述药剂递送至所述个体全身。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞植入个体形成肌肉组织，其中肌肉组织允许向所述个体递送所述药剂。在一些实施方案中，在将所述药剂递送至所述个体至少约2个月后(例如，至少约3个月、6个月、1年、5年、10年或更长时间中的任一项)，可以从所述个体移除所述肌肉组织。在一些实施方案中，所述药剂由所述工程化肌原细胞分泌。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞允许递送多种药剂。
重编程的肌原细胞也可通过向所述个体递送所述药剂治疗或诊断所述个体的疾病或病况。重编程的肌原细胞也可用于治疗下述个体，其需要组织修复，或患有肌肉疾病或病况，如肌肉减少症或恶病质。
在一些实施方案中，本申请提供了一种治疗有治疗需要的个体的肌肉疾病或病况的方法，包括向所述个体给药有效量的重编程的肌原细胞或其分化细胞(例如，所述肌细胞、肌管和/或肌纤维)，其中，使用本文所述的产生重编程的肌原细胞的方法的任一项产生重编程的肌原细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括从个体获得成体肌原细胞，并使用成体肌原细胞产生重编程的肌原细胞。在一些实施方案中，所述疾病或病况为肌肉减少症或恶病质。
通常，所述重编程的肌原细胞或其分化细胞的剂份、时间表和给药途径可根据个体的大小和状况以及标准药物实践确定。示例性给药途径包括静脉内、动脉内、腹腔内、肌内、皮下或经皮给药。在一些实施方案中，可皮下给药重编程的肌原细胞或其分化细胞。在一些实施方案中，可肌内给药重编程的肌原细胞或其分化细胞。在一些实施方案中，可通过注射给药重编程的肌原细胞或其分化细胞。在一些实施方案中，可通过外科植入给药所述重编程的肌原细胞或其分化细胞。
向所述个体给药的细胞剂份可根据(例如)所给药的特定类型的细胞、给药途径以及所治疗的特定类型的疾病或病况而变化。所述剂份应足以产生理想的响应，例如针对疾病或病况的治疗响应，但无严重毒性或不良事件。在一些实施方案中，可以治疗有效量给药重编程的肌原细胞或其分化细胞。
IV.工程化肌原细胞
本申请还提供可用于本文所述的递送方法或治疗方法中的工程化肌原细胞(包括重编程的肌原细胞)或其组合物。还提供了包括本文所述的任何工程化肌原细胞(包括重编程的肌原细胞)的肌肉构建物。
本申请的一个方面提供了一种供食用的非人类肉制品，其包括本文所述的任何一种工程化肌原细胞(包括重编程的肌原细胞)。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞来自选自哺乳动物(例如，猪、牛、羊、山羊、马等)、鸟类(例如，鸡、鸭、火鸡等)、鱼类、无脊椎动物、爬行动物和两栖动物组成的组的动物。
在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞可增殖和/或分化以产生骨骼肌组织。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞可增殖和/或分化以产生平滑肌组织。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞可增殖和/或分化以产生心肌组织。
在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞具有高植入效率。所述植入效率可使用本领域已知方法进行测量，包括，例如，在从接受工程化肌原细胞移植的个体获得的组织样本中对工程化肌原细胞的源特异性标记物进行免疫染色。例如，可通过量化表达特定移植物特异性标记物(例如人类层粘连蛋白A(用于人类工程化肌原细胞)或荧光蛋白(例如，GFP))的细胞的百分比面积或百分比并确定不同样本截面的峰值或平均百分比值来确定植入效率。
在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括具有高增殖能力的肌肉祖细胞(例如肌肉干细胞或成肌细胞)或其分化细胞。所述增殖能力可以通过确定群体倍增来评估，倍增是指群体中的细胞自体外初步分离以来倍增的总次数。这通常是四舍五入到最接近的整数的估计值。用于计算种群倍增的公式如下：n＝3.32(log UCY-log l)+X，其中n＝给定继代培养结束时的最终种群倍增数，UCY＝该点的细胞产量，l＝用作开始该继代培养的接种物的细胞数，X＝用于启动被定量的继代培养的接种物的加倍水平。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞是具有至少约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多轮群体倍增的肌肉祖细胞。
在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括PAX7+细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括PAX3+细胞。在一些实施方案中，至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高百分比的工程化肌原细胞为PAX7+细胞或PAX3+细胞。在一些实施方案中，相比于终末分化的肌纤维细胞，所述PAX7+细胞的PAX7(mRNA或蛋白质水平)的表达水平至少约2、5、10、15、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000倍或更高。在一些实施方案中，相比于终末分化的肌纤维细胞，所述PAX3+细胞PAX3(mRNA或蛋白质水平)的表达水平至少约2、5、10、15、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000倍或更高。
合适的肌原细胞包括但不限于肌肉干细胞(如卫星细胞)、胚胎和胎儿肌原细胞、由胚胎多能干细胞或诱导多能干细胞产生的成肌细胞、重编程的肌原细胞(如更生和/或去分化肌原细胞)，如下文第三节所述的细胞或转分化肌原细胞，或由此类肌肉干细胞、成肌细胞或重编程的肌原细胞产生的分化细胞。
在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞由(或基本上由)所述肌肉干细胞组成。在一些实施方案中，所述肌肉干细胞是自然产生的肌肉干细胞，例如卫星细胞。在一些实施方案中，所述肌肉干细胞是从肌原细胞(例如成肌细胞)产生的重编程(例如，更生和/或去分化)所述肌肉干细胞。在一些实施方案中，所述肌肉干细胞是由成体体细胞(例如，成纤维细胞)产生的转分化肌肉干细胞。在一些实施方案中，所述肌肉干细胞包括Pax7+Pax3+MyoD-肌生成素-细胞、Pax7+Pax3-MyoD-肌生成素-细胞、Pax7-Pax3+MyoD-肌生成素-细胞或其组合。在一些实施方案中，所述肌肉干细胞为Pax7+Pax3+MyoD-肌生成素-细胞。在一些实施方案中，所述肌肉干细胞为Pax7+Pax3-MyoD-肌生成素-细胞。在一些实施方案中，所述肌肉干细胞为Pax7-Pax3+MyoD-肌生成素-细胞。
肌肉干细胞可以使用本领域已知的方法获得。参见，例如，通过培养年轻个体的分离肌肉干细胞和通过差异粘附培养肌肉干细胞(例如，Skuk，2010)，通过FACS分类成体肌肉干细胞(例如，Conboy，2010)，以及通过从ESC或iPSC制备肌肉干细胞(例如，Darabi，2008；Borchin，2013；Shelton，2016)，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括成肌细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞和肌原细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞由肌原细胞组成(或基本上由肌原细胞组成)。在一些实施方案中，肌原细胞包括胚胎肌原细胞、胎儿肌原细胞、由胚胎多能干细胞产生的成肌细胞、由诱导多能干细胞产生的成肌细胞、重编程的肌原细胞或其组合。在一些实施方案中，所述肌原细胞不是初级肌原细胞。在一些实施方案中，所述肌原细胞是胚胎或胎儿肌原细胞。在一些实施方案中，所述肌原细胞由胚胎干细胞产生。在一些实施方案中，所述肌原细胞由诱导多能干细胞产生。在一些实施方案中，所述肌原细胞是由成体肌原细胞(例如LTS肌原细胞，即用编码LIN28A蛋白、TERT蛋白和靶向p53的shRNA的一种或多种核酸转导的成体肌原细胞)产生的重编程(例如，更生和/或去分化)的肌原细胞。在一些实施方案中，所述成肌细胞是由肌原细胞产生的更生的肌原细胞。在一些实施方案中，所述肌原细胞是由成体体细胞(例如，成纤维细胞)产生的转分化成肌细胞。在一些实施方案中，所述成肌细胞包括Pax7-Pax3+肌细胞+肌生成素-细胞、Pax7+Pax3-myoD+肌生成素-细胞或其组合。在一些实施方案中，所述成肌细胞为Pax7-Pax3+MyoD+肌生成素-细胞。在一些实施方案中，所述成肌细胞为Pax7+Pax3-MyoD+肌生成素-细胞。在一些实施方案中，所述肌原细胞具有如图30C或图31E所示的基因表达特征。在一些实施方案中，与成体肌原细胞相比，所述肌原细胞具有高表达水平的PAX3和/或MYOD，而与成体肌原细胞相比，所述肌原细胞的MYF5、ACTA1、MYH1、MYH3和/或MYH8的表达水平较低。在一些实施方案中，所述肌原细胞在缺氧靶点、糖酵解基因、线粒体氧化磷酸化(OxPhos)基因、XBP1S介导的未折叠蛋白响应中的基因以及p53介导的DNA损伤修复响应(DDR)中的基因中具有上调的表达水平。在一些实施方案中，所述肌原细胞在干扰素应答靶中具有下调的表达水平。
肌原细胞可使用本领域已知方法从胚胎多能干细胞或诱导多能干细胞产生，例如见Darabi，2008；Borchin，2013；Shelton，2016，其全部内容通过引用并入本文。本申请可使用下文第三节所述的方法的任一项产生重编程(例如，更生和/或去分化)的肌原细胞。此外，所述肌肉祖细胞(如肌肉干细胞和肌原细胞)可通过使用肌原转录因子和/或小分子药物直接重编程成体体细胞产生，例如，通过瞬时表达MyoD结合GSK3转分化小鼠成纤维细胞GSK3抑制剂(如CHIR99021)，TGF-抑制剂(如RepSox)和/或cAMP激动剂(如Forskolin)。参见BarNur，2018，其全部内容通过引用并入本文。肌原细胞可通过在适当条件下培养，例如在包括DMEM和约20％FBS的增殖培养基中培养肌原细胞，可使肌原细胞不分化地增殖，并且每次在约80％融汇(confluency)之前传代。
在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括通过在体外分化上述任一肌肉干细胞或成肌细胞而产生的肌细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞和由肌肉干细胞产生的肌细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括成肌细胞和由肌原细胞产生的肌细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞、成肌细胞和肌细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞由(或基本上由)所述肌细胞组成。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括(或基本上包括)由胚胎肌原细胞产生的肌细胞、胎儿肌原细胞、由胚胎多能干细胞产生的成肌细胞、由诱导多能干细胞产生的成肌细胞、重编程的肌原细胞或其组合。在一些实施方案中，所述肌细胞(myocytes)通过由诱导多能干细胞产生的成肌细胞分化来。在一些实施方案中，所述肌细胞(myocytes)是由成体肌原细胞产生的更生(rejuvenated)所述肌细胞(myocytes)。在一些实施方案中，所述肌细胞(myocytes)通过分化由诸如LTS肌肉祖细胞的成体肌肉祖细胞(例如成肌细胞)产生的重编程肌肉祖细胞(例如成肌细胞)来产生。在一些实施方案中，所述肌细胞通过分化从成体体细胞(例如成纤维细胞)产生的转分化肌肉祖细胞(例如成肌细胞)来产生。在一些实施方案中，所述肌细胞为Pax3-Pax7-MyoD+肌生成素+细胞。
肌细胞可通过在适当条件下培养成肌细胞由成肌细胞产生。例如，肌原细胞可达到100％融汇(confluency)，并在包括DMEM/F12、约2％马血清和约1％L-谷氨酰胺的分化培养基中培养约2天。
在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括通过在体外分化根据上述任一肌肉干细胞或成肌细胞的肌肉干细胞或成肌细胞而产生的肌管。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞和由肌肉干细胞产生的肌管。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括成肌细胞和由肌原细胞产生的肌管。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括成肌细胞、由肌原细胞产生的肌细胞和由肌原细胞产生的肌管。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞、成肌细胞、肌细胞和肌管。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞由(或基本上由)肌管组成。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括(或基本上包括)由胚胎肌原细胞产生的肌管、胎儿肌原细胞、由胚胎干细胞产生的成肌细胞、由诱导多能干细胞产生的成肌细胞、重编程的肌原细胞或其组合。在一些实施方案中，所述肌管通过分化由诱导多能干细胞产生的成肌细胞而产生。在一些实施方案中，所述肌管通过分化诸如LTS肌原细胞的成体肌原细胞(例如成肌细胞)产生的重编程的肌原细胞(例如成肌细胞)来产生。在一些实施方案中，所述肌管通过分化从成体体细胞(例如成纤维细胞)产生的转分化肌肉祖细胞(例如成肌细胞)来产生。在一些实施方案中，所述肌管为肌生成素+MRF4+MHC+肌间线蛋白+细胞。
“MHC”指肌球蛋白重链。
在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括通过在体外分化根据上述任一肌肉干细胞或成肌细胞的肌肉干细胞或成肌细胞而产生的肌纤维。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞和由肌肉干细胞产生的肌纤维。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括成肌细胞和由肌原细胞产生的肌纤维。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括由肌原细胞产生的肌管和肌纤维。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括成肌细胞、由肌原细胞产生的肌管和由肌原细胞产生的肌纤维。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括成肌细胞、由肌原细胞产生的肌细胞、由肌原细胞产生的肌管以及由肌原细胞产生的肌纤维。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞、成肌细胞、肌细胞、肌管和肌纤维。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞由(或基本上由)肌纤维组成。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括(或基本上包括)由胚胎肌原细胞产生的肌纤维、胎儿肌原细胞、由胚胎多能干细胞产生的成肌细胞、由诱导多能干细胞产生的成肌细胞、重编程的肌原细胞或其组合。在一些实施方案中，所述肌纤维通过分化由诱导多能干细胞产生的成肌细胞而产生。在一些实施方案中，所述肌纤维通过分化成体肌原细胞(例如成肌细胞)产生的重编程的肌原细胞(例如成肌细胞)产生的，例如LTS肌原细胞。在一些实施方案中，所述肌纤维通过分化由成体体细胞(例如成纤维细胞)产生的转分化肌肉祖细胞(例如成肌细胞)产生的。在一些实施方案中，所述肌纤维是具有辅肌动蛋白+条纹的多核细胞。在一些实施方案中，所述肌纤维是成体快速MHC+细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞具有如图12所示的基因表达特征。
肌管和肌纤维可通过在适当条件下培养肌原细胞产生。例如，可将达到约100％融汇(confluency)的肌原细胞在包括DMEM/F12、约2％马血清和约1％L-谷氨酰胺的分化培养基中培养约13天。
经基因修饰的工程化肌原细胞可向接受工程化肌原细胞的个体递送感兴趣的药剂。在一些实施方案中，所述经基因修饰的工程化肌原细胞可表达该药剂。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞可经基因修饰以表达一个或多个分子(例如，代谢物、DNA、RNA和/或蛋白质)，以递送所述药剂。合适的基因修饰包括但不限于引入突变(例如indel、选择性剪接、替代等)、基因敲入或敲除以及表观基因修饰。所述药剂可以是所述工程化肌原细胞的天然产物，也可以是所述肌原细胞的外源产物。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括一个或多个编码所述药剂的异源核酸序列。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括编码所述药剂的异源核酸序列，其中所述异源核酸序列可操作地连接到启动子。在一些实施方案中，所述启动子是组成型启动子。在一些实施方案中，所述启动子是可诱导启动子。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括一个或多个异源核酸序列，所述序列编码合成所述药剂的遗传电路。在一些实施方案中，可对所述工程化肌原细胞的一个或多个内源性基因进行编辑以产生所述药剂。在一些实施方案中，可编辑所述工程化肌原细胞的一个或多个内源性基因以允许所述工程化肌原细胞改变所述药剂的表达(例如，增加表达或诱导表达)。在一些实施方案中，将编码所述药剂的调节因子的异源核酸序列引入所述工程化肌原细胞以允许所述工程化肌原细胞改变(例如，增加表达或诱导表达)所述药剂的表达。
在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞产生单一药剂。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞产生多种(例如，2、3、4、5、6、10、20或更多种)药剂。
肌原细胞可经工程化以产生多种药剂，包括但不限于代谢物、营养素(例如维生素)、小分子药物、生物药剂、报告分子及其组合。所述生物药剂包括但不限于寡肽、DNA(如双链DNA、单链DNA、适配子、纳米结构、DNA酶等)、RNA(如mRNA、shRNA、siRNA、lincRNA、微小RNA、circRNA、适配子、核酶、tRNA、tRNA、snRNA、rRNA、导向RNA等)、人工核酸(如LNA、PNA、吗啉、修饰DNA、修饰RNA等)、蛋白质(例如，生长因子、细胞因子、激素、抗体、受体、诱骗受体、受体配体、酶或人工蛋白质)、病毒、细胞外小泡、疫苗(例如，DNA、RNA或蛋白质疫苗)和报告分子(例如，生物标记物、带标签的融合蛋白等).在一些实施方案中，所述药剂为胰岛素或IX因子。所述药剂可是天然存在或人工设计。在一些实施方案中，所述药剂可由工程化肌原细胞分泌。在一些实施方案中，所述药剂可在工程化肌原细胞的细胞表面上表达。在一些实施方案中，所述药剂在细胞内表达。
本申请可使用一个或多个载体将用于产生一种或多种药剂或用于产生一种或多种递送一种或多种药剂的分子的异源核酸序列引入肌原细胞。本领域已知多种载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。通常，合适的载体包括在至少一种生物体中起作用的复制源、启动子序列、方便的限制性内切酶位点和一个或多个可选择标记物物。术语“载体”还应解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，诸如聚赖氨酸化合物、脂质体等。
在一些实施方案中，所述载体是病毒载体。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗载体、单纯疱疹病毒载体及其衍生物。病毒载体技术在本领域是众所周知的，例如，Sambrook等人(2001,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,NewYork)以及其他病毒学和分子生物学手册中对其进行了描述。
工程化肌原细胞可从任何合适来源获得。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞为哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞是人类细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞由细胞系产生。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞不是从细胞系产生的。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞不是由永生化细胞系产生的。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞为原代细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞是自体的。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞从需要使用工程化肌原细胞进行药物递送或治疗的个体获得。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞是同种异体的。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞从健康供体获得。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞对所述个体无免疫原性。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞由通用干细胞或通用肌肉祖细胞(例如，肌原细胞)产生，其经基因编辑以抑制或去除免疫识别所需的基因。
本文还提供包括工程化肌原细胞或重编程的肌原细胞的组合物，诸如药物组合物。
在一些实施方案中，所述组合物适于对所述个体进行局部给药。在一些实施方案中，所述组合物包括所述工程化肌原细胞的悬浮液或包括所述工程化肌原细胞的肌肉构建物。在一些实施方案中，所述组合物为肌肉干细胞、成肌细胞和/或从所述肌肉干细胞或成肌细胞分化的肌细胞的悬浮液。在一些实施方案中，所述组合物是包括肌肉干细胞和/或肌原细胞的肌肉构建物。在一些实施方案中，所述组合物是包括由肌肉干细胞和/或肌原细胞产生的分化细胞的肌肉构建物。在一些实施方案中，所述组合物为肌肉构建物，其包括从胚胎多能干细胞或诱导多能干细胞产生的成肌细胞或从重新编程(例如，更生和/或去分化或转分化)的肌原细胞分化来的肌管和/或肌纤维。所述细胞悬浮液可适于注射，例如肌内或皮下注射。所述肌肉构建物可适合局部植入，诸如植入肌肉或脂肪组织。
在一些实施方案中，所述组合物包括载体。在一些实施方案中，所述载体为液体。在一些实施方案中，所述载体为半液体。在一些实施方案中，所述载体为半固态。在一些实施方案中，所述载体处于凝胶状态。在一些实施方案中，所述载体是培养基，例如适合细胞增殖和/或分化的培养基。在一些实施方案中，所述载体为水凝胶载体。在一些实施方案中，所述载体是生物相容性载体。在一些实施方案中，所述载体包括细胞外基质(ECM)分子，包括但不限于层粘连蛋白、胶原、巢蛋白、硫酸肝素蛋白多糖、生长因子、胶原酶和/或纤溶酶原激活剂。在一些实施方案中，所述载体包括细胞粘附分子，诸如纤维蛋白。在一些实施方案中，所述载体包括
Figure BDA0003380468030000512
在一些实施方案中，所述载体包括纤维蛋白，例如通过将包括纤维蛋白原的组合物与凝血酶混合制备的纤维蛋白聚合物。在一些实施方案中，所述组合物包括抑制蛋白酶介导的纤维蛋白基质降解的抗纤维蛋白溶解剂。合适的抗纤溶剂包括但不限于抑肽酶、ε-氨基己酸、氨甲环酸和蛋白酶抑制剂，诸如大豆胰蛋白酶抑制剂等。
在一些实施方案中，所述组合物中载体的量不超过95％、90％、85％、80％、75％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％(重量/重量)或更少量中的任一项。在一些实施方案中，所述载体包括至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％(体积/体积)或更多的
Figure BDA0003380468030000513
在一些实施方案中，所述载体包括不超过95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％中任一项的
Figure BDA0003380468030000511
在一些实施方案中，所述组合物包括至少100、200、500、1000、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、3000g/ml或更多中的任一项的纤维蛋白。在一些实施方案中，所述组合物不超过3000、2000、1900、1800、1600、1500、1400、1300、1200、1000、500、200或100g/ml中的任一项的纤维蛋白。
在一些实施方案中，所述载体可生物降解。在一些实施方案中，所述载体在体内降解时间不超过5年、4年、3年、2年、1年、6个月、3个月、1个月或更短时间中的任一项。在一些实施方案中，所述载体至少在2个月、3个月、6个月、10个月、1年、2年、3年、4年、5年或更长时间内不会降解。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞与所述载体混合。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞分散在所述载体中。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞被载体包埋。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞被载体包裹。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞不被载体包裹。
所述组合物包括适当数量的工程化肌原细胞。在一些实施方案中，所述组合物包括单个工程化肌原细胞。在一些实施方案中，所述组合物包括10、20、50、100、200、500、1x103、2x103、5x103、1x104、2x104、5x104、1x105、5x105、1x106、1.5x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、5x107或更多个细胞。在一些实施方案中，所述组合物包括不超过1x107、5x106、2x106、1x106、5x105、2x105、1x105、5x104、2x104、1x104、5x103、2x103、1x103、500、200、100、50、20、10或更少个细胞中的任一项。在一些实施方案中，所述组合物包括1-100、10-1000、100-1000、1x103-1x104、1x104-1x105、1x105-5x105、5x105-1x106、1x106-2x106、2x106-3x106、3x106-4x106、4x106-5x106、5x106-6x106、6x106-7x106、7x106-8x106、8x106-1x108、1x106-3x106、3x106-5x106、5x106-7x106、2x106-2x107、5x106-2x107或1x106-2x107个细胞中的任一项。在一些实施方案中，所述组合物为包括至少约1x106个肌原细胞的细胞悬浮液。在一些实施方案中，所述组合物是包括从至少由约1x105个肌原细胞分化的肌管和/或肌纤维的肌肉构建物。
在一些实施方案中，所述组合物是包括药学上可接受的载体的药学组合物或制剂。如本文所用，“药学上可接受的”或“药理学上可相容的”是指在并非生物学上或其他上不受欢迎的材料，例如，所述材料可并入向所述个体给药的药物组合物中，而不会引起任何显著的不良生物效应或以有害方式与含有该材料的组合物的任何其他组分相互作用。药学上可接受的载体或赋形剂最好符合毒理学和生产测试的要求标准和/或包括在美国食品和药物管理局编制的非活性成分指南中。药物的配方和给药技术可在“雷明顿制药科学”中找到，Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版，通过引用并入本文。本文所述的药物组合物可包括其他药剂、赋形剂或稳定剂以改善组合物的性质。最终形式可以是无菌的，并且也可以容易地通过注射装置，例如空心针。适当选择溶剂或赋形剂可获得并保持适当的粘度。在一些实施方案中，所述组合物适于给人给药。在一些实施方案中，所述组合物适于通过肌内或皮下给药方式给药。
在一些实施方案中，本申请提供了一种包括工程化肌原细胞、包括细胞外基质分子(例如
Figure BDA0003380468030000531
)和纤维蛋白的水凝胶载体的组合物，其中所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞、成肌细胞和/或其分化细胞，其中，所述工程化肌原细胞与所述载体混合。
在一些实施方案中，本申请提供了一种包括工程化肌原细胞、包括
Figure BDA0003380468030000532
和纤维蛋白的水凝胶载体的组合物，其中所述工程化肌原细胞包括成肌细胞，其中所述工程化肌原细胞与载体混合。在一些实施方案中，所述肌原细胞为Pax7-Pax3+MyoD+肌生成素-或Pax7+Pax3-MyoD+肌生成素-细胞。在一些实施方案中，所述肌原细胞由胚胎多能干细胞或诱导多能干细胞产生。在一些实施方案中，所述肌原细胞是由成体肌原细胞产生的更生的肌原细胞。在一些实施方案中，所述肌原细胞通过将编码LIN28A蛋白的第一核酸、编码TERT蛋白的第二核酸和p53抑制剂(例如，编码靶向p53的shRNA的第三核酸)引入肌原细胞中来产生。在一些实施方案中，所述组合物为肌肉构建物。
在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞被水凝胶载体包埋。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞均匀分散在水凝胶载体内。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞被水凝胶载体包裹。
在一些实施方案中，水凝胶载体和细胞之间的重量比至少约为4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1或更多。在一些实施方案中，所述水凝胶载体中的工程化肌原细胞的密度至少为10、50、100、500、1000、1x103、2x103、5x103、1x104、2x104、5x104、1x105、5x105、1x106、5x107、1x107、5x108、1x108、5x109、1x109、5x1010、1x1010、5x1011、1x1011、5x1011、或1x1012细胞/ml中的任一项。
在一些实施方案中，水凝胶载体的粘度约为100-3000mPa·s。在一些实施方案中，所述水凝胶载体的粘度约为100-500、500-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、100-1000、1000-3000、1000-2000或500-2500m·Pa中的任何一粘度。在一些实施方案中，所述水凝胶载体具有约50kPa至约2000MPa的弹性模量。在一些实施方案中，所述水凝胶载体的弹性模量至少约为50kPa、100kPa、150kPa、200kPa、250kPa、300kPa、400kPa、500kPa、600kPa、700kPa、800kPa、900kPa、1MPa、5MPa、10MPa、50MPa、100MPa、500MPa、750MPa、1000MPa、1500MPa或更高值中的任一项。在一些实施方案中，所述水凝胶载体的弹性模量约为50kPa-100kPa、100kPa-200kPa、200kPa-500kPa、500kPa-1MPa、1MPa-10MPa、10MPa-100MPa、100MPa-500MPa、500MPa-1000MPa、1000MPa-2000MPa、50kPa-250kPa、100kPa-1MPa、1MPa-100MPa-2000MPa或50kPa-2000MPa中的任一项。在一些实施方案中，所述水凝胶载体至少约为60％、65％、80％、85％、90％、95％、98％或更多水合度中的任一项。在一些实施方案中，所述水凝胶载体的pH值和盐浓度适合于工程化肌原细胞的增殖和/或分化。在一些实施方案中，所述水凝胶载体的pH值在约6.0和8.0之间。
V.试剂盒以及制品
本申请进一步提供用于本文所述的任何一种递送方法、生产重编程的肌原细胞的方法以及治疗或诊断方法的试剂盒、药剂、单位剂份和制品。
在一些实施方案中，本申请提供了一种用于向所述个体递送所述药剂的试剂盒，其包括包括可递送所述药剂的工程化肌原细胞的组合物，其中所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞、成肌细胞和/或其分化细胞，以及用于向所述个体局部给药所述组合物的装置。在一些实施方案中，所述装置用于肌内或皮下给药。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞，例如，Pax7+Pax3+MyoD-肌生成素-、Pax7+Pax3-MyoD-肌生成素-和/或Pax7-Pax3+MyoD-肌生成素-细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括成肌细胞，例如，Pax7-Pax3+MyoD+肌生成素-和/或Pax7+Pax3-MyoD+肌生成素-细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括由胚胎多能干细胞或诱导多能干细胞产生的成肌细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括由成体肌原细胞产生的重编程的肌原细胞，例如，通过将编码LIN28A蛋白的第一核酸、编码TERT蛋白的第二核酸引入成体肌原细胞，以及p53抑制剂，例如编码靶向p53的shRNA的第三核酸。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括由成体体细胞(例如，成纤维细胞)产生的转分化肌原细胞。在一些实施方案中，所述工程化肌原细胞包括通过分化肌肉干细胞或成肌细胞(例如肌细胞、肌管和/或肌纤维)而产生的细胞。在一些实施方案中，所述组合物为肌肉构建物。在一些实施方案中，所述组合物是包括分散在载体中的工程化肌原细胞的肌肉构建物，所述载体例如包括ECM分子和细胞粘附分子，例如
Figure BDA0003380468030000551
和纤维蛋白。在一些实施方案中，所述试剂盒用于治疗个体中的疾病或病况。
在一些实施方案中，本申请提供了一种用于从成体肌原细胞产生重编程的肌原细胞的试剂盒，包括：(a)胚胎调节因子；(b)端粒相关调节因子；和(c)细胞周期调节因子。在一些实施方案中，所述试剂盒包括一个或多个载体，其包括：(a)编码LIN28A的第一核酸，(b)编码TERT的第二核酸，和(c)编码p53抑制剂的第三核酸。在一些实施方案中，所述p53抑制剂是靶向p53的shRNA。在一些实施方案中，所述试剂盒用于治疗肌肉疾病或病况。在一些实施方案中，所述试剂盒用于向所述个体递送所述药剂。
所述试剂盒可包含额外的组件，诸如容器、试剂、培养基、缓冲液等，以促进所述方法的任何实施方案的执行。例如，在一些实施方案中，所述试剂盒还包括细胞收集和储存装置，其可用于收集个体的肌肉干细胞和/或肌原细胞(例如成肌细胞)。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于肌干细胞或肌原细胞增殖和/或分化的培养基或容器(例如，皮氏培养皿和培养板)。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于评估工程化肌原细胞或植入肌原细胞的生物标记物的免疫染色或组织学试剂。
本申请的试剂盒采用合适的包装。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、罐子、软包装(例如聚酯薄膜或塑料袋)等。所述试剂盒可以选择性地提供附加组件，例如解释性信息。因此，本申请还提供制造物品，其包括小瓶(例如密封小瓶)、瓶、罐、软包装等。
试剂盒还可包括与工程化肌原细胞的使用有关的说明书。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括指导手册，例如描述根据本文所述的递送方法、产生重编程的肌原细胞的方法或治疗或诊断方法中的任何一种的方案的手册。所述说明书还可包括关于使用试剂盒进行预期治疗或诊断的工程化肌原细胞(包括重编程的肌原细胞)的剂份、投药时间表和给药途径的信息。
本申请还提供了包括本文所述的工程化肌原细胞(包括重编程的肌原细胞)的单位剂份形式以及制剂。这些单位剂份可以一单位剂份或多单位剂份储存在合适的包装中，也可以进一步消毒和密封。在一些实施方案中，所述组合物(例如药物组合物)包括在一次性小瓶(例如一次性密封小瓶)中。在一些实施方案中，每个一次性小瓶包括至少约106个细胞。在一些实施方案中，每个一次性使用小瓶包括足够的工程化肌原细胞，以扩增至至少约106个细胞。在一些实施方案中，所述组合物(例如药物组合物)包括在多用途小瓶中。在一些实施方案中，所述组合物(例如药物组合物)以散装形式包括在容器中。
本领域技术人员将认识到，按照本发明的范围和精神可以有多个实施方案。现在将参考以下非限制性示例性实施方案和实施例更详细地描述本发明。以下示例性的实施方案和实施例进一步说明了本发明，但当然，不应被解释为以任何方式限制其范围。
示例性的实施方案
本申请提供以下实施方案：
1.一种向需要药剂的个体递送所述药剂的方法，包括向所述个体局部给药包括工程化肌原细胞的组合物，其中所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞、成肌细胞和/或其分化细胞，其中，所述工程化肌原细胞在所述个体的给药部位植入，并且其中所述工程化肌原细胞经基因修饰以允许将所述药剂递送至所述个体。
2.实施方案1所述的方法，其中所述组合物经肌内给药。
3.实施方案1所述的方法，其中所述组合物经皮下给药。
4.实施方案1-3中任一实施方案所述的方法，其中所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞。
5.根据实施方案4所述的方法，其中所述肌肉干细胞为Pax7+Pax3+MyoD-肌生成素-、Pax7+Pax3-MyoD-肌生成素-和/或Pax7-Pax3+MyoD-肌生成素-细胞。
6.根据实施方案1-5中任一实施方案所述的方法，其中所述工程化肌原细胞包括成肌细胞。
7.根据实施方案6所述的方法，其中所述成肌细胞由胚胎干细胞(ESC)或诱导多能干细胞(iPSC)产生。
8.根据实施方案6或7所述的方法，其中所述成肌细胞为Pax7-Pax3+MyoD+肌生成素-和/或Pax7+Pax3-MyoD+肌生成素-细胞。
9.根据实施方案1-8中任一实施方案所述的方法，其中所述工程化肌原细胞包括由肌肉干细胞或成肌细胞产生的肌细胞。
10.根据实施方案10所述的方法，其中所述肌细胞由成肌细胞分化来，其中所述成肌细胞由胚胎多能干细胞或诱导多能干细胞产生。
11.根据实施方案9或10所述的方法，其中所述肌细胞为Pax3-Pax7-MyoD+肌生成素+细胞。
12.根据实施方案1-11中任一实施方案所述的方法，其中所述工程化肌原细胞为重编程的肌原细胞。
13.实施方案12所述的方法，其中所述工程化肌原细胞是由成体肌原细胞产生的更生和/或去分化肌原细胞。
14.根据实施方案12所述的方法，其中所述工程化肌原细胞是由成体体细胞产生的转分化肌原细胞。
15.根据实施方案1-14中任一实施方案所述的方法，其中所述组合物为工程化肌原细胞的悬浮液。
16.实施方案15所述的方法，其中通过注射给药所述组合物。
17.实施方案1-14中任一实施方案所述的方法，其中所述组合物为包括工程化肌原细胞的肌肉构建物。
18.实施方案17所述的方法，其中所述组合物作为局部植入物给药。
19.实施方案17或18所述的方法，其中所述肌肉构建物包括肌管。
20.实施方案17-19中任一实施方案所述的方法，其中所述肌肉构建物包括肌纤维。
21.实施方案17-20中任一实施方案所述的方法，其中所述肌肉构建物包括PAX7+肌原细胞。
22.实施方案1-21中任一实施方案所述的方法，其中所述组合物进一步包括载体。
23.实施方案22所述的方法，其中所述工程化肌原细胞与所述载体混合。
24.如实施方案22或23所述的方法，其中所述载体包括细胞外基质(ECM)分子。
25.根据实施方案24所述的方法，其中所述载体包括
Figure BDA0003380468030000571
26.实施方案22-25中任一实施方案所述的方法，其中所述载体包括细胞粘附分子。
27.实施方案26所述的方法，其中所述细胞粘附分子为纤维蛋白。
28.实施方案22-27中任一实施方案所述的方法，其中所述组合物中所述载体的量不大于约95％(重量/重量)。
29.实施方案1-28中任一实施方案所述的方法，其中所述工程化肌原细胞不是由永生化细胞系产生的。
30.实施方案1-29中任一实施方案所述的方法，其中所述植入的工程化肌原细胞在所述个体中形成肌肉组织，其中所述肌肉组织允许向所述个体递送所述药剂。
31.实施方案30所述的方法，其中所述肌肉组织产生所述药剂。
32.实施方案31所述的方法，其中所述药剂的产生是可诱导的。
33.实施方案31所述的方法，其中所述药剂的产生是组成性的。
34.实施方案30-33中任一实施方案所述的方法，其中所述肌肉组织允许将所述药剂递送至所述个体局部。
35.实施方案30-33中任一实施方案所述的方法，其中所述肌肉组织允许将所述药剂递送至所述个体全身。
36.实施方案30-35中任一实施方案所述的方法，其中所述肌肉组织从所述个体的周围组织招募血管。
37.实施方案30-36中任一实施方案所述的方法，其中所述肌肉组织与所述个体中的周围组织融合。
38.实施方案30-37中任一实施方案所述的方法，其中，在将所述药剂递送至所述个体至少约2个月后，从所述个体移除所述肌肉组织。
39.根据实施方案1-38中任一实施方案所述的方法，其中对所述个体给药一次所述组合物。
40.根据实施方案1-39中任一实施方案所述的方法，其中所述工程化肌原细胞包括编码所述药剂的异源核酸序列。
41.如实施方案1-40中任一实施方案所述的方法，其中，通过给药所述工程化肌原细胞，将所述药剂递送至所述个体至少约2个月。
42.根据实施方案1-41中任一实施方案所述的方法，其中所述药剂选自由代谢物、营养素、小分子药物、生物药剂、病毒、细胞外囊泡、疫苗和报告分子组成的组。
43.根据实施方案1-42中任一实施方案所述的方法，其中所述药剂由所述工程化肌原细胞分泌。
44.根据实施方案1-42中任一实施方案所述的方法，其中所述药剂在所述工程化肌原细胞的细胞表面上表达。
45.根据实施方案1-44中任一实施方案所述的方法，其中所述工程化肌原细胞允许递送多种药剂。
46.根据实施方案1-45中任一实施方案所述的方法，其中所述组合物包括至少约105个所述工程化肌原细胞。
47.根据实施方案1-46中任一实施方案所述的方法，其中所述工程化肌原细胞是自体的。
48.根据实施方案1-46中任一实施方案所述的方法，其中所述工程化肌原细胞是同种异体的。
49.根据实施方案1-48中任一实施方案所述的方法，其中所述工程化肌原细胞对所述个体无免疫原性。
50.根据实施方案1-49中任一实施方案所述的方法，其中所述工程化肌原细胞是非致瘤性的。
51.根据实施方案1-50中任一实施方案所述的方法，其中所述个体为人类个体。
52.根据实施方案51所述的方法，其中所述个体不超过约3岁。
53.根据实施方案51所述的方法，其中所述个体约为18岁或更大。
54.一种治疗或诊断个体疾病或病况的方法，包括使用实施方案1-53中任一实施方案的方法向所述个体递送所述药剂，其中所述药剂治疗或诊断所述疾病或病况。
55.根据实施方案54所述的方法，其中所述疾病或病况为慢性疾病或病况。
56.根据实施方案55所述的方法，其中所述疾病或病况为代谢性疾病。
57.根据实施方案56所述的方法，其中所述疾病或病况为糖尿病，诸如I型糖尿病。
58.根据实施方案55所述的方法，其中所述疾病或病况为血友病，诸如B型血友病。
59.一种制备疾病或病况的非人动物模型的方法，包括使用实施方案1-53中任一实施方案的方法向非人动物递送所述药剂，其中所述药剂与所述疾病或病况相关。
60.根据实施方案59所述的方法，其中所述药剂被递送到所述非人动物的血液中。
61.根据实施方案59或60所述的方法，其中所述药剂为人类蛋白质、RNA或代谢物。
62.根据实施方案59-61中任一实施方案所述的方法，其中所述非人动物为啮齿动物，诸如小鼠或大鼠。
63.一种包括工程化肌原细胞、包括细胞外基质分子和纤维蛋白的水凝胶载体的组合物，其中所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞、成肌细胞和/或其分化细胞，并且其中所述工程化肌原细胞与所述载体混合。
64.根据实施方案63所述的组合物，其中所述载体为
Figure BDA0003380468030000601
65.如实施方案63或64所述的组合物，其中所述组合物为肌肉构建物。
66.如实施方案65所述的组合物，其中所述组合物为供食用的非人类肉制品。
67.一种用于向所述个体递送所述药剂的试剂盒，其包括所述工程化肌原细胞的组合物，其中所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞、成肌细胞和/或其分化细胞，并且其中所述工程化肌原细胞经基因修饰以允许递送所述药剂；以及用于向所述个体局部给药所述组合物的装置。
68.包括工程化肌原细胞的组合物在制备用于向需要药剂的个体递送所述药剂的药物中的用途，其中配制所述药剂用于局部给药，其中所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞、成肌细胞和/或其分化细胞，其中，所述工程化肌原细胞在所述个体的给药部位植入，并且其中所述工程化肌原细胞经基因修饰以允许将所述药剂递送至所述个体。
69.一种从成体肌原细胞产生重编程的肌原细胞的方法，包括：
(a)将胚胎调节因子、端粒相关调节因子和细胞周期调节因子引入成体肌原细胞以提供转导的肌原细胞；和
(b)在特定条件下培养转导的肌原细胞，以获得重编程的肌原细胞。
70.根据实施方案69所述的方法，其中所述重编程的肌原细胞是肌肉干细胞、成肌细胞或肌细胞。
71.根据实施方案69或70所述的方法，其中所述重编程的肌原细胞是更生(rejuvenated)的。
72.根据实施方案69-71中任一实施方案所述的方法，其中所述成体肌原细胞表达高水平的p21WAF1、p16INK4a和let-7微RNA。
73.根据实施方案69-72中任一实施方案所述的方法，其中所述成体肌原细胞可经历不超过约30轮群体倍增。
74.如实施方案69-73中任一实施方案所述的方法，其中所述重编程的肌原细胞可经历至少约90轮群体倍增。
75.根据实施方案69-74中任一实施方案所述的方法，其中所述重编程的肌原细胞是去分化的。
76.根据实施方案69-75中任一实施方案所述的方法，其中所述重编程的肌原细胞为PAX3+。
77.根据实施方案69-76中任一实施方案所述的方法，其中所述胚胎调节因子为LIN28A。
78.根据实施方案69-77中任一实施方案所述的方法，其中所述端粒相关调节因子为TERT。
79.根据实施方案69-78中任一实施方案所述的方法，其中所述细胞周期调节因子为p53抑制剂。
80.根据实施方案79所述的方法，其中所述p53抑制剂是靶向p53的短发夹RNA(shRNA)。
81.实施方案1-76中任一实施方案的方法，其中步骤(a)包括将编码LIN28A蛋白质的第一核酸、编码TERT蛋白质的第二核酸和编码靶向p53的shRNA的第三核酸引入成体肌原细胞。
82.根据实施方案81的方法，第一核酸、第二核酸和/或第三核酸存在于一个或多个载体中。
83.根据实施方案82所述的方法，其中所述一个或多个载体为病毒载体。
84.根据实施方案69-83中任一实施方案所述的方法，其中所述成体肌原细胞为人类细胞。
85.根据实施方案69-84中任一实施方案所述的方法，其中所述转导的肌原细胞在包括含有约20％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)的培养基中培养。
86.通过实施方案69-85中任一实施方案的方法制备的重编程的肌原细胞。
87.一种向需要药剂的个体递送所述药剂的方法，包括向所述个体局部给药包括有效量的实施方案86的重编程的肌原细胞或其分化细胞的组合物，其中，所述重编程的肌原细胞或其分化细胞经基因修饰以允许将所述药剂递送至所述个体。
88.一种治疗有治疗需要的个体的肌肉疾病或病况的方法，包括向所述个体给药有效量的实施方案86的重编程的肌原细胞或其分化细胞。
89.根据实施方案87或88所述的方法，其中所述成体肌原细胞从所述个体获得。
90.如实施方案88或89所述的方法，其中所述疾病或病况为肌肉减少症或恶病质。
91.一种用于产生重编程的肌原细胞的试剂盒，包括：(A)编码LIN28A蛋白的第一核酸，(b)编码TERT蛋白的第二核酸，和(c)p53抑制剂。
92.一种治疗疾病或病况的非人动物模型的方法，包括使用实施方案1-53中任一实施方案的方法向非人动物递送所述药剂，其中所述药剂治疗所述疾病或病况。
实施例
以下实施例旨在纯粹作为本申请的实施例，因此不应被视为以任何方式限制本发明。以下实施例和详细说明仅是说明性的而非限制性的。
实施例一：长期、安全地植入工程化肌原细胞和其构建物
该实施例展示了通过小鼠肌内或皮下移植长期植入工程化肌原(本文称为“iMusc”)细胞及其构建物。将iMusc肌原细胞或肌细胞悬液肌内注射到小鼠肌肉中。使用iMusc肌原细胞制备的iMusc构建物可以移植到小鼠皮肤下。包括包裹在
Figure BDA0003380468030000621
-纤维蛋白基质中的iMusc肌原细胞的半球状iMusc构建物可以肌内移植。发明人发现，iMusc细胞和构建物能够分化成肌纤维，这些肌纤维在移植部位持续存在一年以上，并从周围的小鼠肌肉组织中募集血管。此外，iMusc组织能够表达转基因(如GFP)，不会阻碍身体周围组织和器官的功能，并且不会随着时间的推移发展成肿瘤。iMusc细胞可以被设计执行多种功能，例如代谢掉代谢物(如脂肪酸、葡萄糖、果糖、酒精等)，并分泌营养素和生物药剂。这些特性使iMusc细胞成为有用的细胞载体，将药物局部递送至宿主周围组织，或通过分泌进入血液系统。
方法
iMusc细胞的维持与分化
肌原细胞是根据本领域的已知方案从人类胚胎干细胞(ESC)或诱导多能干细胞(iPSC)制备的。例如，见Darabi，2008；Borchin，2013；Shelton，2016年。为了维持肌原细胞(本文称为“iMusc肌原细胞”)为肌原细胞，将细胞维持在增殖培养基(PM；DMEM，20％FBS，1％Pen-Strep)中，并在每次80％融合前传代。为了将iMusc肌原细胞分化为肌细胞，使iMusc肌原细胞达到100％融汇，并在分化培养基(DM；DMEM/F12，2％马血清，1％Pen-Strep，1％L-谷氨酰胺)中培养2天。为了进一步分化为肌管和肌纤维，iMusc肌细胞在DM中再维持11天。
细胞肌内移植
通过腹腔(IP)注射70mg/kg体重的氯胺酮和7mg/kg体重的二甲苯嗪的混合物麻醉NOD-SCIDγ小鼠。麻醉通过捏脚趾进行监测。根据制造商的稀释系数，将300万iMusc肌原细胞重悬浮在20μL
Figure BDA0003380468030000631
中，然后使用胰岛素注射器(BD)直接注入胫骨前肌。或者，将300万iMusc肌原细胞重悬浮在7.92μL未稀释
Figure BDA0003380468030000632
0.08μL抑肽酶(Sigma，80μg/ml)和2μL凝血酶(Sigma，10U/ml)的主混合物中，溶解于DM中。然后将再悬浮的细胞接种在皮氏培养皿上，形成半球液滴。添加0.8μL纤维蛋白原并在半球内混合。半球体通过悬滴法在37℃下固化(1小时)。然后将凝固的半球体移植到胫骨前肌。
iMusc构建物的制备
所有iMusc构建物均在6孔板的单个孔中工程建造。每个孔涂有2克聚二甲基硅氧烷(PDMS)凝胶。为了制备2g PDMS凝胶，将1.8g 184型硅橡胶基底和0.2g固化剂(陶氏化学公司)均匀混合，以确保混合均匀。接下来，将PDMS凝胶置于真空中30分钟，以去除混合过程中产生的气泡。将凝胶轻轻倒入6孔板中，并进一步抽真空，直到未观察到气泡。培养皿在37℃培养箱中固化过夜。6毫米长的外科丝线水平固定，相隔12毫米，使用不锈钢细针固定在每个盘子的中心。该构建物用70％乙醇(30分钟)灭菌，用PBS洗涤3次，然后用紫外线辐射(30分钟)进一步灭菌。通过将PBS吸入培养箱(1小时)干燥构建物。将396μL DM、100μL凝血酶(Sigma，10U/ml)和4μL抑肽酶(Sigma，80μg/ml)的主混合物添加到孔中。在均匀添加200μL纤维蛋白原(Sigma，20mg/ml)之前，确保均匀地涂覆该孔并正确定位缝线。轻轻摇动平板，在室温(10分钟)下使纤维蛋白凝胶聚合。纤维蛋白凝胶在培养箱中进一步聚合(1小时)。将400000个细胞接种在2ml干细胞中的纤维蛋白凝胶表面。轻轻摇动平板，使细胞均匀分布在整个孔中。在将iMusc构建物用于NOD-SCIDγ小鼠背部皮肤下的皮下移植之前，每3天更换一次DM培养基，持续2周。
结果
我们首次发现，通过将稀释的
Figure BDA0003380468030000642
细胞悬液肌内注射到NOD Scidγ小鼠的胫骨前肌中，可以将人类iMusc肌原细胞或肌细胞植入(图1)。如图2所示，原位移植一年后，通过注射部位的苏木精和伊红(H&E)组织学检测人类iMusc细胞。反之，在移植后一年的小鼠中，在类似的肌内注射部位检测到很少的人类骨骼肌细胞。如图3-5所示，移植后1年，iMusc肌原细胞移植物强烈分化为MHC+、肌间线蛋白+、辅肌动蛋白+、肌生成素+肌纤维。
在第二个实验中，我们用iMusc肌原细胞在体外制备了人iMusc构建物(图6)。免疫染色结果显示，在iMusc构建物中，PAX7+iMusc细胞和肌生成素/泛MHC+iMusc肌管(图7)。将iMusc构建物皮下植入NOD Scidγ小鼠背部皮肤下(图8)。如图9-10所示，植入后一年，人PAX7+iMusc细胞、肌生成素/泛MHC+iMusc肌管和成体快速MHC+iMusc肌管持续存在于皮下环境中。令人惊讶的是，如图11所示，iMusc组织能够从周围的小鼠肌肉组织中募集毛细血管。图12中的定量RT-PCR结果表明，来自小鼠的iMusc肌纤维组织具有与体外构建的iMusc肌纤维类似的肌生成基因表达谱。与来自原代人类骨骼肌的肌原细胞(如成肌细胞、肌细胞和肌管)相比，iMusc肌纤维组织水平更高地表达几乎所有肌原标记物。例如，与来自原代人类骨骼肌的肌管相比，iMusc肌纤维组织表达更高水平的PAX7、MYH8、MYH7、CASQ1、MYOZ1、TNNI2和MYL3。
在第三个实验中，我们制备了一个半球体iMusc构建物，其具有包裹在
Figure BDA0003380468030000641
-纤维蛋白基质中的iMusc肌原细胞，并将半球体植入NOD Scidγ小鼠的股四头肌(图13)。如H&E组织学所示，iMusc植入物在植入后持续一年(图14)。iMusc肌原细胞分化为辅肌动蛋白+横纹肌纤维(图15)，并募集血管毛细血管(图16)。
在第四组实验中，我们将编码GFP转基因的iMusc心肌细胞注射到NOD Scidγ小鼠未受损伤的胫骨前肌中。移植后一年，iMusc肌细胞分化为表达GFP的肌球蛋白重链(MHC)+肌纤维(图17)。同样，将编码GFP转基因的iMusc肌原细胞注射到NOD Scidγ小鼠未受损伤(图18)或心脏毒素损伤(图19-20)的胫骨前肌中。iMusc肌原细胞分化为表达GFP的肌球蛋白重链(MHC)+肌纤维(图17-20)。如图21所示，将GFP+人核纤层蛋白A/C+iMusc细胞移植到NOD-Scidγ小鼠冷冻损伤的胫骨前肌中一年后与小鼠的肌纤维融合。
值得注意的是，iMusc细胞和其构建物在移植后一年停留在移植位置。这与基于红细胞的递送系统形成了鲜明对比，在这种系统中，所述细胞载体在全身循环，以递送生物药剂。iMusc细胞和构建物产生了肌肉组织，这些肌肉组织从周围的小鼠组织中招募血管系统，从而允许药物分泌到血液系统中，从而递送至全身。然而，在移植后一年，在小鼠移植部位外没有发现人类抗原。此外，组织病理学报告显示移植后一年小鼠没有发生恶性肿瘤，这表明iMusc细胞和构建物作为长期载体是安全的，不同于具有较高致瘤风险的基于细胞系的系统。
我们已经证明，在体外以及体内局部给药时，iMusc细胞和其构建物的生长和分化是完全可控的。iMusc移植物持续时间长，能够在肌肉和皮下环境中表达转基因。iMusc移植物也不会妨碍身体周围组织和器官的正常功能。我们正在工程建造具有生物分泌功能的iMusc细胞。这种iMusc细胞和构建物可以肌内或皮下移植到所述个体中，以提供有用的药剂(如生物药等)的长期局部或全身递送。
实施例二:使用iMusc治疗遗传性疾病
在遗传疾病的小鼠模型中可以显示工程化iMusc细胞和其构建物对全身递送重组蛋白的治疗效果。
用于1型糖尿病(T1D)的经修饰的胰岛素(Insm)
构建与验证
iMusc肌原细胞通过逆转录病毒稳定转导，CMV启动子连接到含有furin内蛋白酶位点的人胰岛素原cDNA，而不是激素原转化酶位点(“iMusc Insm”；Groskreutz et al.，1994)。为了测试分化的iMusc细胞是否合成并处理胰岛素原，在允许iMusc neo(未转基因的对照iMusc细胞)和iMusc Insm细胞在1％KSR存在下分化14天后，通过qRT PCR和ELISA(Mercodia)测量胰岛素表达，在每2-3天的分化后测量iMusc胰岛素mRNA(图36)。为了测量生物活性胰岛素的分泌水平，在14天的分化过程中，1x106 iMusc neo和iMusc Insm细胞在添加20mM葡萄糖的无血清培养基中培养过夜，洗涤，然后在含有0.5％BSA和抑肽酶(0.1mg/ml)的相同培养基中培养。每隔几小时从培养基中取出等份，持续4天，并通过ELISA(Mercodia)测量胰岛素水平。分泌出高水平的胰岛素蛋白(图37)。
体外功能
为了确定分泌的胰岛素是否能增加葡萄糖代谢，我们收集了来自iMusc neo和iMusc Insm细胞的48小时条件培养基。分化14天后，未转导的hSkM(人类骨骼肌)细胞在补充有5mM葡萄糖的无血清培养基中培养过夜，洗涤，然后在含有5mM[U-13C]葡萄糖的iMuscneo和iMusc Insm细胞的48小时条件培养基中培养。暴露30分钟、60分钟和6小时后，清洗细胞，获取提取物，并送至LC-MS/MS分析(Waters)，以测试细胞内糖酵解中间产物果糖-6-磷酸中的13C掺入率。我们发现，在暴露于iMusc Insm条件培养基后，糖酵解通量较高(P<0.01)，表明iMusc Insm条件培养基中较高水平的胰岛素刺激hSkM细胞的糖代谢(图38)。
iMusc-Insm细胞移植入糖尿病裸鼠体内
为了确定分化的iMusc Insm细胞是否能够在体内产生生物活性胰岛素和治疗糖尿病，通过直接骨骼肌注射将5x106个iMusc Insm和iMusc新肌原细胞移植到6-8周龄雄性裸鼠体内(B6.Cg-Foxn1nu/J；JacksonLabs)每日腹腔注射40mg/kg链脲佐菌素(TocrisBioscience)，溶解于0.1M柠檬酸盐缓冲液(pH 4.5)中，连续5天，建立糖尿病模型。在注射细胞后的3周内，每隔3-7天在餐后小鼠中测量糖血症和胰岛素血症。血糖用血糖仪(罗氏)测定，血浆胰岛素用ELISA(Mercodia)测定。
我们的研究结果表明，链脲佐菌素处理后，餐后胰岛素水平从131+16IU/ml下降至～63IU/ml。移植iMusc neo细胞后，餐后胰岛素水平保持在50-75IU/ml的低水平(图39)。然而，在移植iMusc Insm细胞后，餐后胰岛素水平在第14天稳定地恢复到～149IU/ml(P<0.01)(图39)。反之，链脲佐菌素处理后，餐后葡萄糖水平从～110mg/dl增加到～346mg/dl。移植iMusc neo细胞后，餐后葡萄糖水平继续增加至>500mg/dl(图40)。然而，移植iMuscInsm细胞后，第14天餐后葡萄糖水平稳定下降至约229mg/dl(P<0.01)(图40)。
用于B型血友病的IX(FIX)因子
制备与验证
iMusc肌原细胞通过逆转录病毒稳定转导，CMV启动子连接到人类FIX cDNA(“iMusc FIX”)。为了测试分化的iMusc细胞是否合成和处理了人类IX(hFIX)因子，在允许iMusc neo和iMusc FIX细胞在1％KSR存在下分化14天后，通过qRT PCR和ELISA(Abcam)测定表达，并且在每2-3天的分化后测量iMusc hFIX mRNA(图41)。肌生成素(Myog)基因的表达被用作分化的标记物(图42)。为了测量人类IX因子的分泌水平，分化14天后，1x106iMusc neo和iMusc FIX细胞在添加20mM葡萄糖的无血清培养基中培养过夜，洗涤，然后在含有0.5％BSA和抑肽酶(0.1mg/ml)的相同培养基中培养。24小时后从培养基中取出等份，并通过ELISA(Abcam)测量人类IX因子的水平。iMusc FIX细胞分泌高水平的FIX蛋白(P<0.01，图43)。
iMusc-FIX细胞移植入血友病裸鼠体内
为了促进iMusc固定细胞的体内试验，将B型血友病小鼠(B6.129P2-Fgtm1Dws/j；Jackson Labs)与裸鼠(B6.Cg-Foxn1nu/J；Jackson Labs)杂交，获得F9-/Y；Foxn1nu/nu小鼠2代。为了确定分化的iMusc-FIX细胞是否能够在体内产生生物活性的IX因子并治疗B型血友病，通过直接骨骼肌注射将30x106 iMusc-FIX和iMusc-neo细胞移植到6-8周龄的F9-/Y中；Foxn1nu/nu小鼠。采用酶联免疫吸附试验(Abcam)测量血浆人类IX因子水平。移植iMusc neo细胞后，hFIX水平保持在接近零(图44)。然而，移植iMusc-FIX细胞后，第14天hFIX水平稳定增加至～726ng/ml(P<0.01)(图44)。在注射细胞后的2周内，每周用纤维蛋白计时器-COA系统测量活化部分凝血活酶时间(aPTT)。移植iMusc neo细胞后，aPTT保持在107-120秒的较高水平(图45)。然而，移植iMusc FIX细胞后，第14天aPTT稳定下降至～63秒(P<0.01)(图45)。
实施例三：重编程的肌原细胞
在衰老过程中，成体肌肉干细胞的再生能力下降，因为它们进入衰老状态，失去了增殖和分化能力。相比之下，胚胎和胎儿肌肉祖细胞尽管经历了多轮有丝分裂，但仍具有较高的增殖能力，并且在损伤和移植后表现出更强劲的再生响应。胚胎和胎儿祖细胞如何延缓衰老，并在经历多轮有丝分裂的情况下保持其增殖和分化能力，目前尚不清楚。目前还不清楚确定的胚胎因子是否能使成体肌肉祖细胞再生，从而在不重新编程其谱系或细胞命运的情况下赋予其扩展的增殖和分化能力。在此我们报道了，需要LIN28A、hTERT和sh-p53(LTS)的最小组合以防止成体肌肉祖细胞的衰老，它们都是胎儿发育过程中受到严格调控的因子。LTS肌肉祖细胞显示出扩展的增殖能力，维持正常的核型，在传代后期正常进行肌生成，并且没有表现出肿瘤发生或异常谱系分化。LTS治疗挽救了老年恶病质患者肌肉祖细胞的促衰老表型，并促进了其在体内骨骼肌再生的植入。当我们研究LIN28A在LTS组合中作用的机制基础时，我们发现let-7微RNA不能完全解释LIN28A如何促进肌肉祖细胞自我更新。相反，LIN28A温和地促进成体肌肉祖细胞中的氧化磷酸化(OxPhos)，以优化线粒体活性氧自由基(mtROS)和促分裂信号。优化的mtROS诱导多种应激响应和糖酵解，从而促进成体肌肉祖细胞自我更新。mtROS水平的扰动特异性地消除了LIN28A驱动的HIF1A和糖酵解，从而使LTS祖细胞自我更新，而不影响正常或TS祖细胞。我们的发现将胚胎因子与成体祖细胞再生中的线粒体毒物兴奋联系起来，并对恶病质和肌肉减少症中与衰老相关的肌肉退行性变产生影响。
方法
细胞培养与分化
从一名20岁女性受试者的股四头肌(Gibco)中分离出的年轻成体原代人类骨骼肌(HSKM)祖细胞被接种到涂有0.1％明胶溶液(Merck-Millipore)的平板上，并在37℃、5％CO2和生长培养基(包括DMEM/F-12(Gibco)和20％胎牛血清(FBS)(GE Healthcare)、1％L-谷氨酰胺(Gibco)和1％青霉素链霉素(Gibco)下培养。在每次传代时，在达到80％汇合后，所述细胞被胰蛋白酶化并以1:4稀释。当年轻成体HSKM祖细胞80-100％汇合时，用分化培养基替换生长培养基，包括DMEM/F-12、2％敲除血清置换(Gibco)、1％L-谷氨酰胺(Gibco)和1％青霉素-链霉素(Gibco)。这些年轻的成体HSKM祖细胞在增殖阶段被证实为100％的MYOD+，分化后肌原标记物表达旺盛(Chua et al.，2019)。
恶病质患者细胞系
老年人原代骨骼肌肉祖细胞来源于肿瘤切除手术期间患有恶病质(年龄/体重：80岁/55千克和84岁/44千克)的两名老年患者供体的腹直肌。程序按照道德法规和机构审查委员会指南执行。根据先前公布的方案分离肌肉祖细胞(Skuk et al.，2010)。细胞维持在培养基中，并用上述分化培养基分化。
病毒产生
以10％的融汇率接种GP2-293细胞(克隆技术)，并用12μL:3.33μg:0.66μg PEI(1mg/ml)：逆转录病毒质粒(Addgene#1773，#26357)：VSV-g包膜质粒(Addgene#8454)的混合物转染。以10％的融汇率接种293FT-HEK细胞(Clontech)，并用42μL:7μg:6.3μg:0.7μgPEI(1mg/ml)：慢病毒质粒(Addgene#19119)：dR8.2包装质粒(Addgene#8455)：VSV-g包膜质粒(Addgene#8454)转染。293FT和GP2细胞最初在含有10％FBS(GE Healthcare)、1％L-谷氨酰胺(Gibco)和1％青霉素链霉素(Gibco)的DMEM(Gibco)中培养。转染后24小时，用含20％FBS(GE)、1％L-谷氨酰胺(Gibco)和1％青霉素链霉素(Gibco)的DMEM(Gibco)替换生长培养基。在48小时至96小时窗口内收集病毒上清液，并用0.45μm过滤器(Sartorius)过滤。
病毒转导与选择
将HSKM细胞或患者来源的肌原细胞接种在含有DMEM-F12(Gibco)和20％FBS(GE)、1％L-谷氨酰胺(Gibco)、1％青霉素-链霉素(Gibco)的生长培养基中的6孔培养板(Falcon)中。然后用浓缩病毒上清液(聚凝胺)转导细胞，并培养16-24小时。用含有潮霉素、嘌呤霉素或G418(所有抗生素均来自InvivoGen)的生长培养基选择转导细胞。
群体倍增曲线
将1.5x104细胞接种在6孔板(Falcon)的一个明胶包被孔中，生长培养基包括DMEM/F-12(Gibco)、20％胎牛血清(FBS)(GE)、1％L-谷氨酰胺(Gibco)和1％青霉素-链霉素(Gibco)。当达到80-100％的融汇率时，用0.25％胰蛋白酶(Gibco)提起细胞并计数，然后传代培养1.5x104个细胞。重复这个过程，直到细胞不能再达到80％的融汇率，或者直到100天。记录的细胞计数计算为累积群体倍增水平和相应的培养天数。
定量聚合酶链式反应
RNA由TRIzol(Thermo Fisher)提取，并根据制造商的说明用Superscript III(Thermo Fisher)反转录。根据制造商的说明，在ABI Prism 7900HT(应用生物系统)上使用KAPASYBRFAST进行qPCR之前将得到的cDNA稀释5倍。
蛋白质印迹
用RIPA缓冲液(Thermo Fisher)提取蛋白质，补充蛋白酶抑制剂鸡尾酒I和II(Sigma)和磷酸酶抑制剂鸡尾酒组III(Calbiochem)。使用Pierce BCA蛋白质分析试剂盒(Thermo Fisher)对蛋白质进行定量，并使用Sunrise Tecan平板阅读器进行分析。在SDS-PAGE和电转移到PVDF膜(GE Healthcare)上后，使用以下主要抗体和浓度进行蛋白质印迹：GAPDH(sc-365062；Santa Cruz；1:10000)、PAX3(AB_528426；DSHB；0.5μg/ml)、Twist2(ab66031；Abcam；1μg/ml)、IMP1/2/3(sc-271785；Santa Cruz；1:1000)、HMGA2(5269S；CellSignaling；1:1000)、微管蛋白(ab210797；Abcam；1:1000)、p53(sc-126；Santa Cruz；1:100)、柠檬酸合成酶(G-3)(sc-390693；Santa Cruz；1:1000)。用二级抗体结合HRP，1:2500(PromegaW401B，W402B)对印迹进行染色，并用ECL prime western印迹检测试剂盒(GEHealthcare)进行可视化。
免疫荧光
首先用PBS(Thermo Fisher)清洗细胞，并用4％PFA(MS)固定。用以下主要抗体和浓度对细胞进行染色：MHC IIb EFFLURO 660(50-6503-32；Thermo Fisher；1:100)、辅肌动蛋白(sc-7453；Santa Cruz；1:500)、肌生成素(sc-576；Santa Cruz；1:200)、氧鸟嘌呤-8(ab206461；Abcam；1:400)。以下二级抗体也与非共轭一级抗体一起使用，即山羊抗鼠AlexaFluor488(A11001；Thermo Fisher；1:500)、山羊抗兔AlexaFluor 594(A11012；Thermo Fisher；1:500)、山羊抗鼠AlexaFluor 647(A21235；Thermo Fisher；1:500)。根据制造商的建议，DAPI(d9542；Sigma)被用作核计数器染色剂。染色细胞Zeiss荧光显微镜下观察。
微小RNA定量PCR
利用TRIzol(Thermo Fisher)提取的500ng总RNA通过MiScriptRT试剂盒(Qiagen)扩增。根据制造商的说明，使用ABI Prism 7900HT(Applied Bio systems)上的miScriptSYBR GreenPCR试剂盒(Qiagen)对产生的cDNA文库进行实时定量PCR。以下miScriptPrimerAssays(Qiagen)用于RT qPCR、Hs_let-7a_2(MS00031220)、Hs_let-7b_1(MS00003122)、Hs_let-7e_3(MS0003 1227)、Hs_let-7g_2(MS00008337)、Hs_RNU6-2_11(MS00033740)和Hs_SNORD61_11(MS00033705)。
Illumina转录组学与分析
TRIzol(Thermo Fisher)用于提取总RNA，并通过乙醇沉淀纯化。使用IlluminaTotal Prep RNA扩增试剂盒(Thermo Fisher)生成cRNA文库，并根据制造商的说明书与HumanHT-12v4.0 BeadChips(Illumina)进行杂交。用珠子阵列阅读器(Illumina)扫描珠子芯片，并用Illumina BeadScan和Genome Studio提取结果。采用基因集富集分析(GSEA)(Broad Institute)进行进一步分析。数据集的主成分分析在R 3.1.2版本中使用stats数据包的prcomp函数进行计算。
细胞外流量和耗氧量测量
将细胞接种在海马XFe96细胞培养板(Agilent)上，密度为6000-8000个细胞/孔，并使用培养基培养24小时。随后，将培养基更换为Seahorse最小培养基，并按照制造商的说明在无二氧化碳37℃培养箱中培养1小时。使用平板装载以下营养素/药物，端口A–10mM葡萄糖(用于糖酵解)或10mM丙酮酸盐(用于OxPhos)；端口B–1μM寡霉素；端口C–0.5μM FCCP；端口D–0.5μM抗霉素A。根据制造商的程序，在Seahorse XF细胞外流量分析仪(Agilent)上进行分析。
衰老相关β-半乳糖苷酶测定
根据制造商的说明书，使用衰老细胞组织化学染色试剂盒(Sigma-Aldrich)测定衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性。在TS100倒置光学显微镜(Nikon)和相机模块上拍摄了六幅具有代表性的图像。对于每个细胞系，用切割的X-gal染色的细胞(表明SA-β-gal的存在)被计数为所有图像中细胞总数的百分比。
Cytogenetics细胞遗传学
将细胞接种在包被明胶的六孔板中，培养至最大50％的融汇率，以避免成肌细胞融合。细胞首先用秋水仙碱和BrdU处理一夜，然后用EDTA收获。在玻片制备、Giemsa显带和安装之前，使用固定液溶液(1:3＝冰醋酸：甲醇)固定颗粒细胞。为每个细胞系准备20个中期扩散，以进行详细分析和核型分析。
let-7微小RNA模拟物
将HSKM、TS和LTS细胞以4x104细胞/孔的密度接种在包被明胶的六孔板中，并用培养基维持。将PEI(14.5纳克/微升)、成熟的Mirvana-hsa-let-7a-5p(#4464066；分析ID:MC10050；Thermo Fisher)和/或hsa-let-7b-5p(#4464066；分析ID:MC11050；ThermoFisher)模拟物(0.25微升)或Cy5结合的扰码RNA干扰对照物与无血清DMEM混合至总体积为200微升。将该混合物转染到每个孔中。
KC7F2、ROS调节因子和2-脱氧葡萄糖(2-DG)
将HSKM、TS和LTS细胞以4x104细胞/孔的密度接种在包被明胶的六孔板中，并用培养基维持。播种后一天，将培养基替换为含有百草枯(Sigma-Aldrich；2μM)、过氧化氢(ICMPharma；100μM)、DTT(Thermo Fisher；250μM)、2-脱氧葡萄糖(Sigma-Aldrich；2.5mM)、KC7F2(Sigma-Aldrich；10μM)或DMSO/H2O对照物的培养基。对于ROS调节因子，处理后72小时内允许细胞生长，而对于2-DG，处理后8天内允许细胞生长。
用mito-Grx1-roGFP2进行流式细胞术氧化状态测定
根据病毒产生小节，使用pLPCX-mito Grx1-roGFP2质粒创建逆转录病毒。用roGFP2逆转录病毒转导HSKM、TS和LTS细胞48小时。将细胞扩增至15cm的组织培养板，然后使用带有BD FACS AriaII细胞分选机的FITC通道采集roGFP2+细胞的荧光激活细胞分选。将HSKM、TS和LTS细胞以4x104细胞/孔的密度接种在包被明胶的六孔板中，并用培养基维持。播种后一天，用含有百草枯(Sigma-Aldrich；2μM)、过氧化氢(ICM Pharma；100μM)或DTT(Thermo Fisher；250μM)的培养基替换培养基。让细胞生长48小时，然后使用BD LSRFortessa x-20分析仪收集细胞进行流式细胞术。HSKM、TS和LTS细胞用作各自roGFP2+对应物的非荧光门控对照。对于每个细胞系，捕获FSC、SSC、405nm/AmCyan和488nm/FITC通道。FCS文件从FACS Diva导出并导入FlowJo，在FlowJo中导出原始值CSV文件。计算405nm/488nm比率的原始值，然后对每个细胞系和条件进行平均。根据先前公布的方法计算氧化百分比值(Hanson et al.，2004)，其中车辆控制和DTT处理条件下的405/488值之间的差值除以过氧化氢和DTT处理条件下的405/488值之间的差值。
肌内注射
4个月大的NSG小鼠通过腹腔注射用氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物(分别为70mg/kg和7mg/kg)麻醉。成功的麻醉取决于对脚趾挤压缺乏反应。在注射细胞之前和在载体对照物中对胫骨前肌(TA)进行肌肉冷冻损伤。这涉及到在暴露的TA肌肉上应用干冰冷却的4-mm金属探针，持续3个周期10秒。将300000个HSKM或cLTS细胞重悬浮到20μLhESC合格的
Figure BDA0003380468030000721
基质(BD)中，根据制造商的建议进行稀释。然后使用胰岛素注射器(BD)将细胞和基质悬浮液注入TA肌肉。手术后48小时皮下注射meloxicam(5mg/kg/24小时)镇痛。
结果
LTS因子阻止祖细胞衰老，同时允许正常分化
为了解决这个问题，我们使用年轻人和老年人原代成体骨骼肌(HSKM)祖细胞来筛选各种非谱系特异性的胚胎调节因子。我们将年轻的祖细胞定义为少于5轮群体倍增，将年老的祖细胞定义为超过20轮群体倍增。首先，我们发现，与年轻成体HSKM祖细胞相比，年老成体HSKM祖细胞显示出显著更高水平的细胞周期抑制剂，如p21WAF1、p27KIP1和p16INK4a(图22A)。此外，let-7微RNA的抗增殖家族，尤其是let-7b/g，在年老成体HSKM祖细胞中的累积水平也高于年轻成体HSKM祖细胞(图22B)，这与人类肌肉样本的研究一致(Drummond etal.，2011)。相反，年老HSKM祖细胞的端粒明显短于年轻HSKM祖细胞(图22C)。尽管p53和p14ARF的mRNA表达水平有下调趋势，但我们后来发现，在年老肌肉祖细胞中，所述p53蛋白积累到更高水平(图23)。这些初步结果促使我们对胚胎因子进行小范围筛选，试图阻止或逆转促衰老趋势。我们筛选了多种胚胎调节因子，包括LIN28A调节累积的let-7微小RNA和其他发育靶点，hTERT延长和恢复端粒，以及针对p53(也反式激活p21WAF1)、p16INK4a、p14ARF或Rb的短发夹状RNA(shRNA)抑制细胞周期阻滞诱导物(Beauséjour et al.，2003；Christyet al.，2015；Coletti et al.，2002；Kudlow et al.，2008；Pajcini et al.，2010；Schwarzkopfet al.，2006)。与此相反，我们忽略了筛选任何克服现有衰老而不是防止衰老的突变癌基因，这些突变癌基因可能导致祖细胞转化或异常分化(Chua et al.,2019)我们的结果表明，年轻成体原代HSKM祖细胞最终经历衰老，在约30轮群体倍增时乙状结肠趋于稳定(plateauing sigmoidally)，并且没有任何单一因素可以单独阻止衰老(图22D和24)。然而，当LIN28A与hTERT和sh-p53结合时(LTS；图25)，人类肌肉祖细胞可以自我更新和无限增殖，超过90轮群体倍增，整个过程中具有线性群体倍增曲线。此外，每个因子在LTS组合中都是必需的，因为缺少这三个因子中的任何一个都会导致衰老(图22D)或凋亡。当检测100天龄成体HSKM祖细胞和100天龄LTS祖细胞的衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色时，96.7％的野生型HSKM祖细胞为SA-β-gal+，而只有2.2％的LTS祖细胞为SA-β-gal+，表明LTS组合对衰老具有深刻的保护作用(图22E)。当详细检查时，我们发现LTS组合(LTS)确实阻止了衰老诱导的p21WAF1、p16INK4a和let-7微RNA的积累(图22F)，同时延长了端粒(图26)。
然后我们测试了LTS祖细胞是否仍能正常分化。我们预计转化的祖细胞无法正常分化，因为祖细胞需要完全退出细胞周期才能进行终末分化。令人惊讶的是，我们发现100天龄的LTS祖细胞仍然能够像年轻的HSKM祖细胞一样，强有力地分化为肌球蛋白重链MHC+、辅肌动蛋白+,肌生成素+多核肌管(图22G和27)。
反之，含有致癌基因CDK4R24C、细胞周期蛋白D1和hTERT的永生化HSKM祖细胞未能正确分化，仅表达非常弱的MHC水平，很少有多核肌管(图22G)。同样，100天龄衰老的HSKM祖细胞不能分化成多核肌管(图22G)。我们还通过使LTS祖细胞经历成脂、成骨和成软骨的分化条件，测试LTS祖细胞是否重新编程为原代间充质或中胚层祖细胞。我们没有发现明显的脂肪生成、骨生成或软骨生成。我们还分析了LTS细胞的成肌标志物的mRNA表达。LTS肌管在某些肌原标记物(ACTA1、MYH1、MYH8)的表达仅略弱，但在一些其他肌原标记物(MYF5、MYOD、MYH7)的表达也略强，同时在一些肌原标记物(MYOG、MYH3)中与年轻成体HSKM肌管相比保持类似的表达(图28)。这些结果表明LTS祖细胞可以正常分化。
LTS因子可以使衰老的肌肉祖细胞更生以供移植
为了测试LTS因子在患病肌肉祖细胞中的作用，我们转导从老年癌症恶病质患者中获得的肌肉祖细胞。我们之前发现，癌症恶病质可导致心肌细胞生长和凋亡受到抑制(Fukawa et al.，2016)。当我们培养老年恶病质患者的HSKM祖细胞时，我们还发现它们在6轮群体倍增中迅速衰老(图29A-29B)，数量明显少于健康年轻成体肌肉祖细胞(约30轮群体倍增，图22D)。然而，经LTS因子处理后(图29B)，恶病质HSKM祖细胞成功地通过线性群体倍增曲线避免了快速衰老(图29A)。为了测试LTS治疗是否能产生用于细胞治疗的可植入祖细胞，LTS恶病质祖细胞被大量扩增，而对照HSKM祖细胞被汇集在一起。冷冻损伤后，将等量的GFP+LTS和对照祖细胞原位注射到NOD-Scid-γ(NSG)小鼠的胫骨前肌。GFP免疫荧光染色显示，注射4周后，LTS恶病质祖细胞显著植入(图29D-29G)，而在再生肌肉中观察到少量GFP+对照祖细胞植入。GFP+LTS人类祖细胞大多分化为细长的肌纤维(图29D)，或与小鼠肌纤维融合，在肌纤维内形成GFP+结构域(图29E-29F)，而少数在肌纤维周围作为自我更新的人类祖细胞存在(图29G)。总的来说，LTS治疗显著提高了人类肌肉祖细胞的植入效率(图29H)，这通常非常低(Gussoni et al.，1997；Mendell，1995)。因此，即使是年老的肌肉祖细胞的再生功能也可以通过LTS治疗得到恢复。
我们还对检测LTS祖细胞是否会导致肿瘤感兴趣。NSG小鼠(图29I)是检测肿瘤发生最严格的模型(Quintana et al.，2008)。然而，即使在12个月后也未观察到肿瘤。当我们对晚期传代的TS祖细胞进行染色体分析时，所述细胞仍显示正常核型，而晚期传代的TS祖细胞显示各种非整倍体核型，包括大量染色体的丢失，以及双着丝粒、环状和标记染色体的出现(图29J-29K)。这些结果表明，尽管p53水平较低，LTS可能促进染色体稳定性。因此，LTS因子在体外或体内均未将任何祖细胞转化为癌细胞。
LTS肌原细胞比原代肌原细胞衰老以及分化程度更低
我们将LTS与原代HSKM细胞生成的肌原细胞和肌管以及年轻成体和年老成体进行比较，使用转录组学分析来评估其细胞状态。主成分分析(PCA)显示，不同的细胞类型因老化和分化状态而明显分离(图30A)。在HSKM成肌细胞和肌管之间定义的分化载体与LTS细胞的分化载体大致平行，表明肌生成导致两种细胞类型中多维RNA表达的类似变化。由HSKM年轻、中级和年老肌原细胞定义的衰老载体与所述分化载体近似正交。根据分化和衰老载体定义的轴，与年轻成体HSKM祖细胞相比，LTS祖细胞的衰老和分化程度较低(图30A)。
为了证实此观察，我们对多种肌原标记物进行了qRT PCR，以评估年轻成体HSKM和LTS祖细胞的分化状态。我们的结果表明，LTS祖细胞的PAX3(一种胚胎肌原转录因子)表达显著高于HSKM祖细胞(图30C)。肌原细胞承诺因子MYOD较高(图30C)，而肌原细胞决定因子MYF5较低(图30C)，肌原细胞分化因子MYOG同样较低(图30C)。相比之下，LTS祖细胞中的大多数其他肌原分化标记物甚至低于HSKM祖细胞，包括骨骼肌肌动蛋白A1 ACTA1(图30C)和几种肌球蛋白重链亚型(图30C)。
我们还对LTS、TS和HSKM细胞中的PAX3和TWIST2蛋白表达进行了蛋白质印迹分析。与HSKM和TS祖细胞相比，LTS祖细胞显示出最高的PAX3蛋白水平(图30B)。所有的祖细胞在分化为肌管时，PAX3和TWIST2蛋白水平均显著下降(图30B)，并且与预期的肌生成一样(Liuet al.，2017；Quintana et al.，2008)。增加的PAX3蛋白是一种胚胎肌原转录因子，支持LTS祖细胞的转录组学观察。
LIN28A通过影响非let-7依赖性的mRNA的表达帮助更生
为了剖析LIN28A的更生作用的机制，我们回到体外培养的原代人类祖细胞。我们早些时候的RNA分析研究表明，let-7家族成员在衰老的祖细胞中积累到更高水平(图22B)。TS和LTS转导都降低了let-7水平，LIN28A进一步抑制了let-7b、let-7e和let-7g水平(图31A)。为了测试LIN28A在肌肉祖细胞中的复壮效应是否由let-7介导，我们转染成熟的let-7模拟物，试图消除转基因LIN28A对增殖的影响(图31A)。然而，我们发现let-7a、let-7b或两者都对LTS祖细胞的增殖率没有任何影响(图31B)。此外，let-7过表达也未能增加衰老SA-β-gal+细胞的数量(图31C)，尽管重要的let-7靶点如IMP1/2/3和HMGA2(Shyh Chang和Daley，2013)几乎已被let-7过表达完全耗尽(图31D)。这些结果表明，仅靠let-7抑制不能完全解释LIN28A对肌肉祖细胞自我更新的影响。
因此，我们重新分析了LTS祖细胞的转录组学特征，并通过GSEA将其与TS祖细胞进行比较。奇怪的是，上下调节的信号几乎完全由干扰素响应靶点控制(图31E)。这表明TS祖细胞正在经历炎症诱导的衰老，LTS有助于防止衰老，这与干扰素响应在衰老过程中被激活的发现一致(De Cecco et al.，2019)。我们的分析表明，LIN28A的作用主要是代谢性的，其顶级的上调标签的组成为缺氧靶点、糖酵解基因和线粒体氧化磷酸化(OxPhos)基因，以及应激响应标签，诸如XBP1S介导的未折叠蛋白响应(UPR)和由p53介导的DNA损伤修复(DDR)响应(图31E)。
LIN28A优化OxPhos和mtROS以诱导HIF1A糖酵解
为了验证OxPhos和糖酵解确实上调，我们使用海马细胞外流量分析仪。我们对LTS祖细胞耗氧率的分析表明，LTS祖细胞确实显示出显著更高的基础和最大OxPhos率(图31A和31B)。此外，LTS祖细胞也显示出较高的糖酵解率(图31C)。我们还发现LTS祖细胞的线粒体膜电位Δψm显著增加(图31D)。相反，线粒体DNA和蛋白质的生物合成没有增加，这表明，虽然线粒体OxPhos活性水平增加，但线粒体的总生物合成没有增加(图32和33)。由于LIN28A已被证明与OxPhos mRNA结合以调节OxPhos蛋白表达(Huang，2012；Shyh Chang etal.，2013a；Zhang et al.，2016)，LIN28A诱导的OxPhos可能通过增加ETC通量和增加Δψm来增加mTRO。先前的研究表明，高线粒体膜电位Δψm可以将线粒体活性氧产生位点转移到更为还原的状态，从而增加线粒体活性氧(mtROS)产生的倾向(Miwa and Brand，2003；Senaand Chandel，2012)。为了验证这一假设，我们使用线粒体Grx1-roGFP2报告分子(Gutscheret al.，2008)测定活细胞中的mtROS水平。我们的结果表明，LTS祖细胞的mtROS略高于HSKM祖细胞(图31E)。当我们进行LC-MS/MS代谢组学分析时，我们确认LTS祖细胞中确实增加了几种糖酵解中间产物和线粒体Krebs循环中间产物(图31F和31G)。LC-MS/MS代谢组学还显示，作为氧化应激指标的GSSG/GSH比率在LTS祖细胞中较高(图31H)。
由于mtROS是HIF1A的激活剂，HIF1A反过来激活糖酵解基因，因此mtROS还可以解释为什么氧不足以及糖酵解标签上调(Chandel et al.，1998，2000；Emerling et al.，2005；Majmundar et al.，2010；Semenza et al.，1994；Sena and Chandel，2012)。如果LIN28A确实特别优化mtROS以防止衰老，那么ROS调节药物对LTS祖细胞的影响应比TS或HSKM祖细胞大得多。为了验证这一假设，我们让不同的肌肉祖细胞接受各种活性氧调节药物，并检查它们对mtROS、基因表达和增殖率的影响。我们发现H2O2最可靠地增加了mtROS，而DTT最可靠地减少了所有祖细胞类型中的mtROS(图31I)。当我们对祖细胞进行H2O2和DTT处理时，我们发现H2O2和DTT处理都可以抑制LTS祖细胞中的HIF1A靶点(图31J)和糖酵解基因(图31K)，但在TS祖细胞中没有，表明最佳mtROS水平正在驱动LTS祖细胞中下游HIF1A靶点和糖酵解基因表达。相反，H2O2和DTT处理均未能干扰LTS祖细胞中较高的OxPhos mRNA水平，表明OxPhos mRNA位于mtROS水平的上游(图31L)。这也支持LIN28A->OxPhos->理想mtROS->HIF1A-糖酵解->增殖能力的模型。
LIN28A优化mtROS以激活HIF1A用于祖细胞自我更新
使用HIF1A响应元件荧光素酶报告分子(Emerling et al.，2008)，我们验证了相对于TS和HSKM祖细胞，LIN28A在LTS祖细胞中诱导HIF1A介导的氧不足响应，并且这种应激响应依赖于ROS水平(图34A)。我们还观察到LTS祖细胞中DNA氧化损伤生物标记物8-氧胍水平较低(图35A-35B)，这是这些应激响应的影响。
引人注目的是，当我们检查其增殖能力时，我们发现H2O2和DTT滴定均以投药量依赖性的方式显著抑制LTS祖细胞增殖，对TS或HSKM祖细胞增殖没有显著影响(图34B)。与上述模型一致，我们发现HIF1A抑制剂KC7F2显著抑制LTS祖细胞增殖，对TS或HSKM祖细胞增殖也没有显著影响(图34C)。相比之下，糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖导致LTS、TS和HSKM祖细胞增殖不严重但显著的减少(图34D)，表明糖酵解依赖性不是LTS祖细胞特有的。综上所述，这些结果表明LIN28A特别优化了mtROS的产生，以促进祖细胞的增殖能力。引人注目的是，mtROS诱导了氧不足应激响应、糖酵解响应以及DDR和UPR以使肌肉祖细胞更生(图34E)。在其文章中，这种更生的代谢应激响应统称为线粒体毒物兴奋(mitohormesis)(Yun和Finkel，2014)。
结果讨论
我们已经证明，早衰但年老的人类肌肉祖细胞积累let-7微RNA、p53、p21WAF1、p16INK4a，并在衰老过程中显示端粒丢失。一个包括胚胎因子的小筛选显示，一组最小的LIN28A、端粒酶和p53(LTS)shRNA敲除足以显著延长成体人类肌肉祖细胞的生存期。我们证明这些胎儿样肌肉祖细胞具有扩展的自我更新和肌原分化能力，而不会转化为癌细胞。当来自癌症恶病质患者的年老和功能失调的肌肉祖细胞被LTS因子治疗时，其固有的自我更新和肌原分化能力被恢复，并且它们现在可以促进体内肌肉的再生。在机制上，我们发现let-7微小RNA及其对IMPs、HMGA2和相关IGF-PI3K-mTOR信号传导的影响(Li et al.，2012；Zhu et al.，2011)不能完全解释LIN28A对肌肉祖细胞的影响。LIN28A通过增强线粒体OxPhos来防止肌原细胞衰老，从而优化线粒体ROS并诱导一系列促进祖细胞自我更新的代谢响应——这一过程在其他情况下称为线粒体毒物兴奋。因此，通过LIN28A、hTERT和p53抑制重新激活胚胎代谢程序可以防止衰老祖细胞的衰老表型，而无需重新编程其谱系规格，并在体外和体内恢复其原始功能。
很少有研究调查LIN28A在人类祖细胞中的作用。我们和其他人的研究表明，转基因Lin28a小鼠在多个组织室中表现出增强的胎儿样形态发生和再生(Shyh-Chang et al.,2013a；Urbach et al.,2014；Yang et al.,2015；Takashima et al.,2016；Elsaeidi etal.,2018)。但很少有研究调查其在人类祖细胞中的作用，特别是在骨骼肌中。此外，尽管先前的研究表明Lin28a在调节糖酵解和OxPhos中的作用(Shyh-Chang et al.,2013a；Urbachet al.,2014；Yang et al.,2015；Takashima et al.,2016；Elsaeidi et al.,2018),但没有发现其在优化用于线粒体毒物兴奋的mtROS以促进祖细胞自我更新方面的重要性。
线粒体毒物兴奋(Mitohormesis)被定义为对轻度线粒体应激的协调代偿响应，该响应可快速激活核质信号通路，并最终改变基因表达以保护细胞免受应激性干扰(Yun andFinkel，2014)。虽然TS组合对mtROS几乎没有影响，最终未能增强自我更新，但LTS组合将mtROS上调至最佳水平，并成功阻止了成体骨骼肌的祖细胞衰老。这些结果支持了一个新概念，即尽管过量的mtROS在许多情况下会导致多种促衰老表型，但在适当的细胞类型中，适量的轻度mtROS可能有益(Sena and Chandel，2012)。有趣的是，最近的研究还表明，小鼠胚胎肌生成需要少量但不过量的mtROS，由Pitx2和Pitx3严格调控(L'honoréet al.，2014，2018)。因此，我们的研究证实了mtROS与祖细胞生存期之间存在非线性关系的观点，并提供了一个优化mtROS的基因组合，以延长原代人类祖细胞的自我更新。
我们的基因表达分析表明，在LTS的情况下，LIN28A能够强烈刺激HIF1A介导的氧不足应激响应、糖酵解响应、XBP1S介导的UPR和p53介导的DDR。有趣但并不奇怪的是，在p53基因敲除的情况下，LIN28A介导的mtROS会恢复一些p53活性(Sena and Chandel，2012)。我们以前的研究表明，所述p53网络在祖细胞中受到严格调控和微调(Le at al.，2011)。虽然与原代祖细胞相比，所述p53蛋白水平总体上仍然较低(图23)，但一些p53活性的恢复可能是确保肌肉祖细胞自我更新和分化的关键，同时防止染色体不稳定和恶性肿瘤。事实上，以前的研究表明，所述p53在调节肌生成和许多其他谱系的适当分化中很重要(Coletti etal.,2002；Flamini et al.,2018；Schwarzkopfet al.,2006)。p53介导的DDR也可能是8-氧胍水平较低的主要原因，尽管mtROS水平较高。除了p53介导的DDR外，XBP1S介导的UPR蛋白毒性应激响应也被LIN28A介导的mtROS激活。ROS介导的蛋白质氧化长期以来被认为会引起蛋白毒性，从而激活UPR蛋白毒性应激响应(Malhotra and Kaufman，2007)。事实上，最近的研究表明，UPR对于DNA修复酶(包括碱基切除修复(BER)途径)的正常功能是必需的，以去除8-氧胍(Poletto et al.,2017；Xipell et al.,2016)。因此，普遍定期审议还与复员方案进行交叉对话，以先发制人地保护祖先免受基因毒性压力。UPR刺激的另一个途径是自噬(Ron and Walter，2007)，这在拯救年老小鼠肌肉干细胞免于衰老方面很重要(García-Prat at al.，2016)。另一个与p53介导的DDR交叉对话的mtROS诱导途径是HIF1A介导的氧不足应激响应(Majmundar et al.，2010)。先前的研究表明，mtROS激活HIF1A以驱动缺氧应激响应(Majmundaret al.，2010；Sena and Chandel，2012)。此外，众所周知，HIF1A可以反式激活糖酵解基因(Majmundar et al.，2010)。结合先前的研究表明，氧不足应激响应对哺乳动物心脏再生和裸鼹鼠的恢复能力很重要(Nakada et al.,2017；Park et al.,2017)，我们的研究表明，所述氧不足应激响应可能是哺乳动物更生(rejuvenation)中线粒体毒物兴奋(mitohormesis)的一个重要环节。
活性氧自由基还可以直接刺激糖酵解流量(Mullarky and Cantley，2015)。糖酵解中间产物，如果糖-6-磷酸，可以转移到PPP中，以促进NADPH合成以减少氧化应激，并促进核苷酸合成以促进干细胞增殖。其他糖酵解中间产物，如3-磷酸甘油酸和丙酮酸，可用于氨基酸合成，而磷酸二羟丙酮和乙酰辅酶A可用于合成代谢生长的脂质合成(Shyh Chang etal.，2013b)。NADPH和氨基酸合成对于在氧化应激响应中合成谷胱甘肽特别重要，这也被UPR激活(Ron and Walter，2007)。与HSKM祖细胞相比，LTS祖细胞中氧化和还原性谷胱甘肽总量的增加证明了这一点(图31H)。NAD+和NADH也被LTS上调(图31H)，但NAD+/NADH比率没有显著变化，这表明尽管NAD+和Sirt1活性的变化对调节肌肉干细胞自我更新和肌肉再生至关重要(Ryall et al.，2015；Zhang et al.，2016)，在这种情况下，NAD+和Sirt1不太可能对LTS的影响负责。然而，这些保护性代谢途径的相互强化性质表明，线粒体毒物兴奋是一种保守的、协调良好的应激响应途径，用于控制细胞生存期。LIN28A可能激活线粒体毒物兴奋刺激程序，以保护祖细胞并确保其在胚胎发育期间自我更新。这些线粒体毒物兴奋应激响应机制也可能进一步阐明为什么单独使用LIN28A不足以诱导致癌转化或诱导多能干细胞重编程，但却能促进细胞增殖和自我更新。
有趣的是，LIN28A介导的更生也诱导一定程度的去分化，以产生PAX3+骨骼肌肉祖细胞(图30B)。基因功能丧失研究表明，Pax3+祖细胞对于生成四肢所有肌原细胞至关重要，包括所有胚胎、胎儿和成体肌原细胞和肌纤维(Buckingham and Relaix，2015；Engleka etal.，2005；Hutcheson et al.，2009；Schienda et al.，2006)。一些成体卫星细胞也被报道表达Pax3(Buckingham and Relaix，2015；Conboy and Rando，2002)。因此，在与hTERT和sh-p53的合作下，LIN28A可以将PAX3-肌肉祖细胞去分化为PAX3+肌肉祖细胞，从而提高在受损骨骼肌中的移植和再生能力。
总之，我们的研究提供了一个窗口，展示了如何通过诱导优化线粒体毒物兴奋的胚胎程序，通过代谢阻止衰老的祖细胞进入衰老。鉴于衰老确实在伤口愈合和肿瘤抑制中起着重要作用，未来的工作可能集中于在组织祖细胞中短暂激活此类胚胎代谢程序的治疗，而不是永久性转基因(Demaria et al.，2014)。这些疗法可以补充目前采用抗衰老疗法来恢复我们先天再生能力的努力(Baker et al.，2011；Chang et al.，2016；Farr et al.，2017；Jeon et al.，2017；Xu et al.，2018)，对与衰老相关的疾病(诸如恶病质和肌肉减少症)的再生医学产生影响。
参考文献
Anchelin,M.,et al.(2011).PLoS One 6,e16955.
Baker,D.J.,et al.(2011).Nature 479,232–236.
Balzer,E.,et al.(2010).Development 137,891–900.
Bar-Nur,O.,et al.(2018).Stem Cell Reports 10(5),1501-1521.
Beauséjour,C.M.,et al.(2003).EMBO J.22,4212–4222.
Bernet,J.D.,et al.(2014).Nat.Med.20,265–271.
Bigot,A.,et al.(2008).Biol.Cell 100,189–199.
Blau,H.M.,et al.(1983).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80,4856–4860.
Blau,H.M.,Cosgrove,B.D.,and Ho,A.T.V(2015).Nat.Med.21,854–862.
Borchin,B.,Chen,J.,and Barberi,T.(2013)Stem Cell Rep.1(6),620-631.
Brack,A.S.,and Rando,T.A.(2012).Cell Stem Cell 10,504–514.
Briske-Anderson,et al.(1997).Proc.Soc.Exp.Biol.Med.214,248–257.
Buckingham,M.,and Relaix,F.(2015).Cell Dev.Biol.44,115–125.
Capel,A.J.,et al.(2019).Front.Bioeng.Biotechnol.,7,20.
De Cecco,et al.(2019).Nature 566,73–78.
Chandel,N.S.,et al.(1998).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95,11715–11720.
Chandel,N.S.,et al.(2000).J.Biol.Chem.275,25130–25138.
Chang,J.,et al.(2016).Nat.Med.22,78–83.
Cheung,T.H.,and Rando,T.A.(2013).Nat.Rev.Mol.Cell Biol.14,329–340.
Choi,Y.,et al.(2019).Biomaterials 206:160-169.
Christy,B.,et al.(2015).p53 and rapamycin are additive.Oncotarget 6.
Chua,M.-W.J.,et al.(2019).Assessment of different strategies forscalable production and proliferation of human myoblasts.Cell Prolif.doi:10.1111/cpr.12602.
Chung,C.Y.,et al.(1999).Biochem.Biophys.Res.Commun.265,246–251.
Coletti,D.,et al.(2002).EMBO J.21,631–642.
Conboy,I.M.,and Rando,T.A.(2002).Dev.Cell 3,397–409.
Conboy,M.J.,et al.,(2010).Protocols for Adult Stem Cells,Methods inMolecular BiologyTM(Methods and Protocols),vol 621.Humana Press.
Copley,M.R.,et al.(2013).Nat.Cell Biol.15,916–925.
Cosgrove,B.D.,et al.(2014).Nat.Med.20,255–264.
Darabi,R.,et al.(2008)Nat.Med.14,134-143.
Darwin,C.,Darwin,F.,and Darwin,F.(1887).The life and letters ofCharles Darwin,including an autobiographical chapter.Edited by his son,Francis Darwin.(London,:John Murray,).
Decary,S.,Mouly,V.,and Butler-Browne,G.S.(1996).Hum.Gene Ther.7,1347–1350.
Decary,S.,et al.(1997).Hum.Gene Ther.8,1429–1438.
Demaria,M.,et al.(2014).Dev.Cell 31,722–733.
Deuchar,E.(1976).J.Embryol.Exp.Morphol.35,345–354.
Drummond,M.J.,et al.(2011).Physiol.Genomics 43,595–603.
Elsaeidi,F.,et al.(2018).J.Neurosci.38,2246–2261.
Emerling,B.M.,et al.(2005).Mol.Cell.Biol.25,4853–4862.
Emerling,B.M.,et al.(2008).Proc.Natl.Acad.Sci.105,2622–2627.
Engleka,K.A.,et al.(2005).Dev.Biol.280,396–406.
Esquenet,M.,et al.(1997).J.Steroid Biochem.Mol.Biol.62,391–399.
Farr,J.N.,et al.(2017).Nat.Med.23,1072–1079.
Flamini,V.,et al.(2018).Stem Cell Reports 10,970–983.
Fukawa,T.,et al.(2016).Nat.Med.22,666–671.
García-Prat,L.,et al.(2016).Autophagy 12,612–613.
Groskreutz,D.J.,et al.(1994).J.Biol.Chem.269(8),6241-5.
Grounds,M.D.(2014).Bioarchitecture 4,81–87.
Gussoni,E.,Blau,H.M.,and Kunkel,L.M.(1997).Nat.Med.3,970–977.
Gutscher,M.,et al.(2008).Nat.Methods 5,553–559.
Hanson,G.T.,et al.(2004).J.Biol.Chem.279,13044–13053.
Hinds,S.et al.(2011).Biomaterials,32(14),3575-3583.
Huang,Y.(2012).Wiley Interdiscip.Rev.RNA 3,483–494.
Hutcheson,D.A.,et al.(2009).Genes Dev.23,997–1013.
Jeon,O.H.,et al.(2017).Nat.Med.23,775–781.
Kastenhuber,E.R.,and Lowe,S.W.(2017).Cell 170,1062–1078.
Khodabukus,A.and Baar,K.(2009).Tissue Engineering Part C:Methods 15(3).
Kudlow,B.A.,et al.(2008).Mol.Biol.Cell 19,5238–5248.
L’honoré,A.,et al.(2014).Dev.Cell 29,392–405.
L’honoré,A.,et al.(2018).Elife 7.
Lau,A.,et al.(2019).J.Clin.Invest.129,4–11.
Le,M.T.N.,et al.(2011).PLoS Genet.7,e1002242.
Lee,S.J.,et al.(2012).Proc.Natl.Acad.Sci.109,E2353–E2360.
Li T.et al.(2018).Nano Research 11(10),5240-5257.
Li,Z.,et al.(2012).Dev.Cell 23,1176–1188.
Liu,N.,et al.(2017).Nat.Cell Biol.19,202–213.
Ma,X.,et al.(2014).Nat.Commun.5,5212.
Majmundar,A.J.,et al.(2010).Mol.Cell 40,294–309.
Malhotra,J.D.,and Kaufman,R.J.(2007).Antioxid.Redox Signal.9,2277–2294.
Mendell,J.R.(1995).Ann.Neurol.37,3–4.
Miwa,S.,and Brand,M.D.(2003).Biochem.Soc.Trans.31,1300–1301.
Mullarky,E.,and Cantley,L.C.(2015).Diverting Glycolysis to CombatOxidative Stress.
Nakada,Y.,et al.(2017).Nature 541,222–227.
O’Driscoll,L.,et al.(2006).J.Endocrinol.191,665–676.
Pajcini,K.V,et al.(2010).Stem Cell 7,198–213.
Park,T.J.,et al.(2017).Science.356,307–311.
Pearson,R.D.(1984).Acta Biotheor.33,51–59.
Poletto,M.,et al.(2017).Nucleic Acids Res.45,10042–10055.
Porrello,E.R.,et al.(2011).Science.331,1078–1080.
Price,F.D.,v et al.(2014).Nat.Med.20,1174–1181.
Pronsato,L.,et al.(2013a).Biocell 37,1–9.
Pronsato,L.,Boland,R.,and Milanesi,L.(2013b).Arch.Biochem.Biophys.530,13–22.
Quintana,E.,et al.(2008).Nature 456,593–598.
Robinton,D.A.,et al.(2019).Dev.Cell 48,396–405.e3.
Rodier,F.,Campisi,J.,and Bhaumik,D.(2007).Nucleic Acids Res.35,7475–7484.
Ron,D.,and Walter,P.(2007).Nat.Rev.Mol.Cell Biol.8,519–529.
Rowe,R.G.,et al.(2016).J.Exp.Med.213,1497–1512.
Ryall,J.G.,et al.(2015).Cell Stem Cell 16,171–183.
Sadek,H.A.,et al.(2014).Stem Cell Reports 3,1.
Schienda,J.,et al.(2006).Proc.Natl.Acad.Sci.103,945–950.
Schwarzkopf,M.,et al.(2006).Genes Dev.20,3440–3452.
Semenza,G.L.,et al.(1994).J.Biol.Chem.269,23757–23763.
Sena,L.A.,and Chandel,N.S.(2012).Mol.Cell 48,158–167.
Shah,M.V.,Namigai,E.K.O.,and Suzuki,Y.(2011).Mech.Dev.128,342–358.
Sharples,A.P.,et al.(2011).J.Cell.Biochem.112,3773–3785.
Shelton,M.,et al.(2016).Methods 101,73-84.
Shinoda,G.,et al.(2013).Stem Cells 31,1563–1573.
Shyh-Chang,N.,and Daley,G.Q.(2013).Cell Stem Cell 12,395–406.
Shyh-Chang,N.,et al.(2013a).Cell 155,778–792.
Shyh-Chang,N.,Daley,G.Q.,and Cantley,L.C.(2013b).Development 140,2535–2547.
Skuk,D.,et al.(2010).Mol.Ther.18,1689–1697.
Smith-Bolton,R.K.,et al.(2009).Dev.Cell 16,797–809.
Sousa-Victor,P.,et al.(2014).Nature 506,316.
Stockley,T.L.,et al.(2000).J.Lab.Clin.Med.135(6):484-92.
Takashima,Y.,et al.(2016).Hepatology 64,245–260.
Testa,S.,et al.(2018).Materialstoday Communications 15:120-123.
Tierney,M.T.,et al.(2014).Nat.Med.20,1182–1186.
Tierney,M.T.,et al.(2016).Cell Rep.14,1940–1952.
Urbach,A.,et al.(2014).Genes Dev.28,971–982.
Van Raamsdonk,J.M.,et al.(2002).J.Lab.Clin.Med.139(1),35-42.
Xipell,E.,et al.(2016).Neuro.Oncol.18,1109–1119.
Xu,M.,et al.(2018).Nat.Med.24,1246–1256.
Yang,M.,et al.(2015).Development 142,1616–1627.
Yao,K.,et al.(2016).Cell Rep.17,165–178.
Yermalovich,A.V.,et al.(2019).Nat.Commun.10,168.
Yin,H.,Price,F.,and Rudnicki,M.A.(2013).Physiol.Rev.93,23–67.
Yuan,J.,et al.(2012).Science.335,1195–1200.
Yun,J.,and Finkel,T.(2014).Cell Metab.19,757–766.
Zhang,J.,et al.(2016).Cell Stem Cell 19,66–80.
Zhu,H.,et al.(2011).Cell 147,81–94.

Claims (40)

1.一种向需要药剂的个体递送所述药剂的方法，包括向所述个体局部给药包括工程化肌原细胞的组合物，其中所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞、成肌细胞和/或其分化细胞，其中，所述工程化肌原细胞在所述个体的给药部位植入，并且其中所述工程化肌原细胞经基因修饰以允许将所述药剂递送至所述个体。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物经肌内或皮下给药。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞，任选地，其中所述肌肉干细胞为Pax7+Pax3+MyoD-肌生成素-、Pax7+Pax3-MyoD-肌生成素-和/或Pax7-Pax3+MyoD-肌生成素-细胞。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述工程化肌原细胞包括成肌细胞，任选地，其中：
(i)所述成肌细胞由胚胎干细胞(ESC)或诱导多能干细胞(iPSC)产生；和/或(ii)所述成肌细胞为Pax7-Pax3+MyoD+肌生成素-和/或Pax7+Pax3-MyoD+肌生成素-细胞。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述工程化肌原细胞包括由肌肉干细胞或成肌细胞产生的肌细胞；任选地，其中：
(i)所述肌细胞由成肌细胞分化来，其中所述成肌细胞由胚胎干细胞(ESC)或诱导多能干细胞(iPSC)产生；和/或
(ii)所述肌细胞为Pax3-Pax7-MyoD+肌生成素+细胞。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述工程化肌原细胞为重编程的肌原细胞，任选地，其中：
(i)所述工程化肌原细胞是由成体肌原细胞产生的更生和/或去分化的肌原细胞；或
(ii)所述工程化肌原细胞是由成体体细胞产生的转分化肌原细胞。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述组合物是包括工程化肌原细胞的悬浮液，任选地，其中所述组合物通过注射给药。
8.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述组合物是包括工程化肌原细胞的肌肉构建物，任选地，其中所述组合物作为局部植入物给药。
9.如权利要求8所述的方法，其中：
(i)所述肌肉构建物包括肌管；
(ii)所述肌肉构建物包括肌纤维；和/或
(iii)所述肌肉构建物包括PAX7+肌原细胞。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述组合物进一步包括载体，任选地，其中：
(i)将工程化肌原细胞与所述载体混合；
(ii)所述载体包括细胞外基质(ECM)分子，任选地，其中所述载体包括
Figure FDA0003380468020000021
(iii)所述载体包括细胞粘附分子，任选地，其中所述细胞粘附分子为纤维蛋白；和/或
(iv)所述组合物中所述载体的量不超过约95％(重量/重量)。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述工程化肌原细胞不是由永生化细胞系产生的。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述植入的工程化肌原细胞在所述个体中形成肌肉组织，其中所述肌肉组织允许向所述个体递送所述药剂。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述肌肉组织产生所述药剂，任选地，其中所述药剂的产生是可诱导的或组成性的。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中所述肌肉组织允许将所述药剂递送至所述个体局部。
15.如权利要求12或13所述的方法，其中所述肌肉组织允许将所述药剂递送至所述个体全身。
16.如权利要求12-15中任一项所述的方法，其中所述肌肉组织从个体的周围组织招募血管。
17.如权利要求12-15中任一项所述的方法，其中所述肌肉组织与所述个体的周围组织融合。
18.如权利要求12-17中任一项所述的方法，其中在将所述药剂递送至所述个体至少约2个月后从所述个体移除所述肌肉组织。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中：
(i)对所述个体给药一次所述组合物；和/或
(ii)通过给药所述工程化肌原细胞，向所述个体递送所述药剂至少约2个月。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述工程化肌原细胞包括编码所述药剂的异源核酸序列。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述药剂选自由代谢物、营养素、小分子药物、生物药剂、病毒、细胞外囊泡、疫苗和报告分子组成的组。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中：
(i)所述药剂由所述工程化肌原细胞分泌；或
(ii)所述药剂在所述工程化肌原细胞的细胞表面上表达。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述工程化肌原细胞允许递送多种药剂。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述组合物包括至少约105个所述工程化肌原细胞。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述工程化肌原细胞是自体的或同种异体的。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述工程化肌原细胞对所述个体无免疫原性。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述工程化肌原细胞是非致瘤性的。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述个体是人类个体，任选地，其中：
(i)所述个体年龄不超过约3岁；或
(ii)所述个体年龄约为18岁或更大。
29.一种治疗或诊断个体疾病或病况的方法，包括使用权利要求1-28中任一项所述的方法向所述个体递送所述药剂，其中所述药剂治疗或诊断所述疾病或病况，任选地，其中所述疾病或病况为慢性疾病或病况。
30.一种制备疾病或病况的非人动物模型的方法，包括使用权利要求1-28中任一权利要求的方法向非人动物递送所述药剂，其中所述药剂与所述疾病或病况相关。
31.一种包括工程化肌原细胞、包括细胞外基质分子和纤维蛋白的水凝胶载体的组合物，其中所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞、成肌细胞和/或其分化细胞，并且其中所述工程化肌原细胞与所述载体混合。
32.如权利要求31所述组合物，其中所述组合物是肌肉构建物，任选地，其中所述组合物是供食用的非人类肉制品。
33.一种用于向所述个体递送所述药剂的试剂盒，其包括包含工程化肌原细胞的组合物，其中所述工程化肌原细胞包括肌肉干细胞、成肌细胞和/或其分化细胞，并且其中所述工程化肌原细胞经基因修饰以允许递送所述药剂；以及用于向所述个体局部给药所述组合物的装置。
34.一种从成体肌原细胞产生重编程的肌原细胞的方法，包括：
(a)将胚胎调节因子、端粒相关调节因子和细胞周期调节因子引入所述成体肌原细胞以提供转导的肌原细胞；和
(b)在特定条件下培养转导的肌原细胞，以获得重编程的肌原细胞。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述重编程的肌原细胞是肌肉干细胞、成肌细胞或肌细胞。
36.如权利要求34或35所述的方法，其中：
(i)所述胚胎调节因子为LIN28A；
(ii)所述端粒相关调节因子为TERT；和/或
(iii)所述细胞周期调节因子是p53抑制剂，任选地，其中所述p53抑制剂是靶向p53的短发夹RNA(shRNA)。
37.用如权利要求34-36中任一项所述的方法制备的重编程的肌原细胞。
38.一种向需要药剂的个体递送所述药剂的方法，包括向所述个体局部给药所述组合物，所述组合物包括有效量的如权利要求37所述的重编程的肌原细胞或其分化细胞，其中，所述重编程的肌原细胞或其分化细胞经基因修饰以允许将所述药剂递送至所述个体。
39.一种治疗有治疗需要的个体的肌肉疾病或病况的方法，包括向所述个体给药有效量的如权利要求37所述的重编程的肌原细胞或其分化细胞。
40.一种用于产生重编程的肌原细胞的试剂盒，包括：(A)编码LIN28A蛋白的第一核酸，(b)编码TERT蛋白的第二核酸，和(c)p53抑制剂。
CN202080040018.8A 2019-05-29 2020-05-27 工程化肌原细胞组合物及其用途 Pending CN114286859A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2019088977 2019-05-29
CNPCT/CN2019/088977 2019-05-29
PCT/CN2020/092615 WO2020238961A1 (en) 2019-05-29 2020-05-27 Compositions and use of engineered myogenic cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114286859A true CN114286859A (zh) 2022-04-05

Family

ID=73552480

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080040018.8A Pending CN114286859A (zh) 2019-05-29 2020-05-27 工程化肌原细胞组合物及其用途

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20220257793A1 (zh)
EP (1) EP3976761A4 (zh)
JP (1) JP2022534927A (zh)
CN (1) CN114286859A (zh)
WO (1) WO2020238961A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023061485A1 (zh) * 2021-10-14 2023-04-20 北京干细胞与再生医学研究院 年轻化骨骼肌肉细胞及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2287291A1 (en) * 2009-08-07 2011-02-23 Kyoto University Canine iPS cells and method of producing same

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5538722A (en) * 1989-06-13 1996-07-23 Stanford University Isolation, growth, differentiation and genetic engineering of human muscle cells
EP1113807B1 (en) * 1998-05-01 2007-08-08 University of Pittsburgh Cell mediated gene delivery using muscle derived cells for treating muscle- and bone-related injury or dysfunction
US7029838B2 (en) * 2001-03-30 2006-04-18 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Prevascularized contructs for implantation to provide blood perfusion
JP2009506805A (ja) * 2005-09-02 2009-02-19 コンティネンス コントロール システムズ インターナショナル プロプライエタリー リミテッド 病状を管理するための平滑筋インプラント
JP5340265B2 (ja) * 2008-06-27 2013-11-13 国立大学法人京都大学 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2287291A1 (en) * 2009-08-07 2011-02-23 Kyoto University Canine iPS cells and method of producing same

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
OZAWA. CLARE R.等: "A NOVEL MEANS OF DRUG DELIVERY: Myoblast-Mediated Gene Therapy and Regulatable Retroviral Vectors", ANU. REV. PHARMACOL. TOXICOL., pages 295 - 317 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20220257793A1 (en) 2022-08-18
WO2020238961A1 (en) 2020-12-03
EP3976761A4 (en) 2023-10-25
EP3976761A1 (en) 2022-04-06
JP2022534927A (ja) 2022-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2712496C (en) Stem cell aggregates and methods for making and using
CA3109078A1 (en) Cells differentiated from immunoengineered pluripotent cells
US20100209404A1 (en) Enhanced method for producing stem-like cells from somatic cells
JP2018518943A (ja) 幹細胞からの筋肉系列細胞の生成
US20230042917A1 (en) Direct reprogramming of somatic cells into myogenic cells
JP2024519218A (ja) 成熟角膜内皮細胞を作製する方法
JP2016516394A (ja) ヒト線維芽細胞において特徴的な幹細胞であるＭｕｓｅ細胞から容易に分化した機能性メラノサイトの使用
US20190352601A1 (en) Engineering blood vessel cells for transplantation
WO2020238961A1 (en) Compositions and use of engineered myogenic cells
WO2014141392A1 (ja) 平行線維性結合組織の製造方法
US20230392124A1 (en) Methods and compositions for improving sc-beta cells or enhancing their utility
WO2005045012A1 (en) Endodermal stem cells in liver and methods for isolation thereof
US20230128770A1 (en) Compositions and methods for enhancing differentiation of stem cell-derived beta cells
US20220275329A1 (en) Compositions and methods for maturing stem cell-derived beta cells
AU2022270117A1 (en) Methods of generating mature hepatocytes
WO2023086599A1 (en) Cardiomyocytes and compositions and methods for producing the same
Spinale et al. We thank Reiko Kobayashi, Emi Fujita, Megumi Ikeda, Akane Furuyama, and Yuko Ohtsuki for their technical assistance.

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination