CN114277098A

CN114277098A - 基于dna折纸结构的条形码系统

Info

Publication number: CN114277098A
Application number: CN202111136400.1A
Authority: CN
Inventors: 魏迪明; 维克多·潘; 王雯; 白坦蹊; 柯永刚
Original assignee: Tsinghua University; Emory University
Current assignee: Tsinghua University; Emory University
Priority date: 2021-09-27
Filing date: 2021-09-27
Publication date: 2022-04-05

Abstract

本发明涉及基于DNA折纸结构的条形码探针和条形码探针集合。还提供制备该条形码探针和条形码探针集合的方法，使用该条形码探针和条形码探针集合对靶标分子进行检测的用途。

Description

基于DNA折纸结构的条形码系统

技术领域

本发明涉及检测领域，具体而言涉及基于DNA折纸结构制备的条形码，以及包含该条形码的检测系统和使用该条形码对靶标分子进行检测的方法。

背景技术

随着荧光显微镜技术和可编程探针标记技术的发展，可以一次筛选单个样品中的多种生物分子，因此平行检测多种生物分子的多重技术大幅提高了样品的处理和分析效率。不同的多重检测策略包括荧光探针、金属和碳纳米粒子以及核酸构建体技术。

Nanostring nCounter的工作尤其突出，因为其在多重检测能力方面取得了前所未有的进步(Geiss,G.K.等，Direct Multiplexed Measurement of Gene Expressionwith Color-Coded Probe Pairs.Nature biotechnology 2008,26(3),317-325)。荧光标记的RNA片段与单链DNA骨架杂交，创建了一个多色报告探针。数百种独特的报告探针可用于同时检测目标mRNA链。然而，该技术仅限于体外检测，需要专门的设备来促进样品制备(例如，对齐排列)。

随后，利用核酸纳米技术开发了基于刚性DNA纳米结构的条形码系统。在这样的系统中，展示了一个模块化平台，其中包含多个在光谱上可区分的荧光团，从而以几何的方式将216种不同的组合编码到亚微米大小的条形码上。除了拥有庞大的组合数外，条形码的刚性也使其适用于进行原位成像。虽然该技术成功地提高了为下游探测应用创建更多独特条形码的能力，但它们都在很大程度上依赖于使用多个在光谱上可区分的荧光团来生成不同的组合。需要多重荧光团构建条形码较为昂贵且复杂。该技术也体现在PCT专利公开WO2012058638A2中。

WO2012058638A2公开了一种由核酸纳米结构形成的条形码探针，其带有至少两个荧光标记的区域。当探针与样品结合时，可以通过荧光标记的区域的颜色和各个区域之间的距离来鉴别样品。该申请的条形码能够编码有荧光的区域的荧光颜色和荧光之间的距离，但是不能编码荧光本身的长度。尽管该申请中也提到了两个荧光标记区域之间的间隔可以小于衍射限，但其必需与直接随机光学重建显微镜(direct stochastic opticalreconstruction microscopy；dSTORM)的超分辨率成像技术一起应用。换言之，借助于dSTORM技术将距离小于衍射限的两个位点鉴别开，仍然作为两个荧光位点读取，还是没有实现对于荧光位点本身长度的编辑。与真实世界的条形码相比，相当于黑白条之中，只有一种的长度可变。这在某种程度上限制了条形码能够编码的信息总量。

本领域对于高效、简便的样品鉴定和分析方法存在尚未满足的需求。

发明内容

本发明的发明人开发了一种简单而可靠的多重分子检测方法，其中包含通过分步组装DNA折纸(origami)超结构生成的微米级荧光DNA条形码的组合。与之前的条形码系统相比，除了光学可分辨的点之外，还通过设置彼此距离在衍射限之下的荧光位点，使它们形成长度可以被测量和鉴别的短条。如此一来，条形码中明条部分的长度也能得到编辑，使得同等条件下(如条形码的长度和不同的荧光颜色数等条件)相同时，能够获得多样性更丰富的条形码组合，从而完成了本发明。

因此，第一方面，本发明涉及包含至少两种条形码探针的条形码探针集合，其中所述条形码探针是核酸形成的棒状结构，每种条形码探针包含至少一个带有荧光修饰的区域，并且每种条形码探针中带有荧光修饰的区域的分布不同，从而使得在成像设备中观察时，每种条形码探针呈现出明条和暗条交替出现的独特图案，其中在所述集合的条形码探针中，存在至少两种在成像结果中具有不同尺寸的明条。

第二方面，本发明提供一种检测样品中靶标的存在的方法，包括：

(a)提供第一方面的条形码探针集合，所述条形码探针集合包含与所述靶标特异性结合的条形码探针；

(b)使所述条形码探针集合与所述样品在所述靶标与所述条形码探针能够结合的条件下接触；

(c)通过鉴定所述条形码探针的独特图案来检测所述样品中是否存在与所述条形码探针结合的靶标。

在优选的实施方案中，所述方法用于检测样品中存在的多种靶标，并且每种靶标与所述探针集合中的一种条形码探针结合。

第三方面，本发明提供一种检测多个靶标核酸和探测核酸对之间的相互作用的方法，包括：

(a)将每一种探测核酸构建到第一方面的条形码探针集合中的一种独特的条形码探针上，并将所述条形码探针固定在固相支撑物上；

(b)使所述靶标核酸与固相支撑物上的包含所述探测核酸的条形码探针集合接触；

(c)通过测定条形码探针的荧光信号检测所述靶标核酸与探测核酸对之间的相互作用。

第四方面，本发明提供一种试剂盒，其包含第一方面的条形码探针集合。

第五方面，本发明提供一种制备条形码探针的方法，所述条形码探针由n个按照预定顺序排列的单体组成，每个单体由一个核酸支架链和多个核酸辅助链组成，并且每个单体为包含带有荧光修饰的区域的单体或不包含带有荧光修饰的区域的单体，所述方法包括：

(a)分别构建包含带有荧光修饰的区域的单体和不包含带有荧光修饰的区域的单体；

(b)按照预定顺序选择(a)中构建的单体类型并为其添加一对独特的粘末端；

(c)通过粘末端之间的互补关系使多个单体按照预定顺序组装，由此获得所述条形码探针。

第六方面，本发明提供通过第五方面的方法制备的条形码探针。

第七方面，本发明提供制备条形码探针集合的方法，包括通过第五方面的方法制备多种条形码探针，其中每种条形码探针通过以不同的预定顺序排列不同的单体来制备，并且其中至少一种条形码探针包含至少两个符合如下关系的具有荧光修饰的区域，其中相邻的两个具有荧光修饰的区域中心之间的距离小于成像设备的可分辨极限，由此所述成像设备无法将所述两个具有荧光修饰的区域分辨为两个彼此独立的点。

第八发明，本发明提供第七方面制备的条形码探针集合。

第九方面，本发明提供包含成像设备和第一方面的条形码探针集合的系统。例如，所述成像设备为普通光学成像设备，分辨率不超过可见光衍射限。例如，所述成像设备为超分辨率成像设备，分辨率超过可见光衍射限。

本发明的探针至少具有如下优点：

1.由于不仅可以编辑“OFF”条的长度(即相邻亮点之间的距离)，还可以编辑“ON”条的长度(即不可分辨的亮条或亮点本身的长度)，丰富了条形码系统的丰度；

2.类似地，由于可以编辑“ON”条长度，即使在仅使用单色荧光修饰的情况下，可以获得丰富的条形码组合；

3.可以通过增加荧光的颜色、调整一个模块内的荧光修饰数量(从而调整荧光强度)、使用超分辨成像系统等来进一步丰富在同样条形码长度内的组合可能性；

4.可以通过缓冲液系统介导的“梳理”过程使玻璃上的条形码同向排列之后的成像，继而可以通过机器学习方法实现高精度且高效率的识别和分类；

5.首次实现了互补核酸结合动力学的多重研究和表征；

6.可以通过模块化的方式分步组装来对生成的条形码进行编码，方便且低成本。

总之，本发明提供了一种简单且强大的条形码系统，可以实现准确、高效的多重分子检测。

附图说明

图1A-C是从DNA折纸纳米棒模块分步组装单色荧光条形码的设计示意图。(A)具有17个可定制模块的10HB DNA折纸纳米棒的设计，这些模块中的每一个是10个辅助链组成的带，每条带都可以替换为带有“抓手(handle)”的辅助链以供捕获各种功能配体，例如荧光团缀合的DNA。(B)由五个折纸单体组成的条形码，其中三个单体含有荧光带。“ON”单体被“OFF”单体间隔开，产生了光学上可分辨的荧光强度峰。(C)5聚体条形码包含2个连续的“ON”单体，它们在光学上无法分开，因此产生了一个破折号一样的短横，带有多个荧光插入物的单体则产生增强的荧光强度。可以使用具有光开关特性(photoswitching)的荧光团来实现超分辨率成像，以解析两个相邻的“ON”单体中的多个荧光插入物或同一单体内的多个荧光插入物的位置，从而允许每个条形码具有更高密度的可编码位(如三角形所示，其指向虚线中离散峰的高斯中心)。

图2A-E示例了条形码的设计，按层次显示了条形码的组装方式。(A)10HB纳米棒的caDNAno设计；(B)10HB纳米棒的三维示意图；(C)17个重复的辅助链带，其中一个带有荧光DNA修饰；(D)带有一个荧光带的单体；(E)5个单体，每一个带有一组独特的粘性末端，用于5聚体条形码的分步组装。

图3显示了实施例1中组装的5聚体条形码的组装结果。上方小图是5聚体条形码组合和单体对照的琼脂糖凝胶电泳结果，1代表“ON”单体，0代表“OFF”单体。下方小图是凝胶纯化后的5聚体条形码的TEM图像，该5聚体的计算长度为1.25μm。比例尺为1μm。

图4是对实施例1中的5聚体条形码的产率进行定量的凝胶电泳结果。显示了5聚体条形码和对应的五个单体的琼脂糖凝胶电泳图。泳道L：1-kb plus DNA ladder；泳道M1-M5：用于形成5聚体的五个单体；泳道“5聚体”：5聚体条形码。

图5显示了12种单色条形码的结构特征。图中以示意图和TIRF图像展示12种不同的条形码，在示意图下方是各种条形码的3个代表图像。比例尺：2μm。

图6显示了不同“ON”条的长度分布。图中显示长度逐渐增加的“ON”条可以通过测量进行区分。

图7A-C显示了通过缓冲液介导的“梳理”过程使玻璃上的条形码同向排列之后的成像结果。(A)PBS中的10101和01010条形码，均不带合成靶标；(B)PBS中的10101和01010条形码，带有01010的合成靶标；(C)在用缓冲液B(pH 9.1)置换PBS之后的10101和01010条形码，带有01010的合成靶标。比例尺：10μm。

图8显示了对5种单色条形码的计算机读取。左上角的图像数据集由数百张图像组成，包含五种条形码中的每一种。显示了图像处理和模型训练的工作流程。使用eXtreme梯度增强(eXtreme Gradient Boosting；XGB)机器学习的条形码鉴定混淆矩阵表明了每种条形码中得到正确鉴定的分数。

图9显示了实施例2的10聚体条形码方案。左侧是10聚体的设计示意图，右侧为对应的TIRF图像。比例尺：2μm。

图10显示了包含带有不同荧光强度的单体的条形码，第1、第3和第5单体包含分别带有三个、一个和两个荧光带(具有荧光修饰的区域)。在左侧的dSTORM成像图中，可以看到每个折纸单体上的各个带。在TIRF成像中，两条带或三条带产生了无法解析的融合点，这些点具有更强的荧光。比例尺：1μm。

图11显示了包含带有不同荧光强度(一个或三个荧光带，即“ON”一级和“ON”三级，分别表示为“1”和“3”，不带荧光带的单元为“0”)的单体的5聚体条形码。每个小图的上部显示的是5聚体条形码的设计示意图，下部为两个代表性成像结果。右下角显示了条形码11103的荧光强度曲线。比例尺：2μm。

图12显示了四种多色5聚体条形码的设计示意图和照片，显示了在不同波长的激发光下的不同组合。比例尺：2μm。

图13显示了以摩尔斯电码编码字母D、N和A的5聚体条形码的dSTORM超分辨成像。比例尺：1μm。

图14显示了携带摩尔斯电码“DNA”信息的条形码的完整dSTORM成像。比例尺：10μm。

图15显示了本发明的单色条形码作为检测探针的应用。使用条形码系统检测合成靶标DNA链。上部：工作方法的示意图：在合成靶标存在下，经过表面洗脱，条形码集合中只有与合成靶标对应的条形码探针保留在抗地高辛抗体涂覆的表面上；底部左侧：条形码探针靶标检测前后的代表性TIRF图像；底部右侧：收集的图像的机器学习分析。比例尺：2μm。

图16显示了四种同时包含“I级ON”、“III级ON”的5聚体条形码的TIRF图像。左上：10300；右上：10030；左下：10003；右下：33001。比例尺：10μm。

图17显示了多重靶向的机器学习分析结果。比例尺：10μm。

图18显示了条形码系统的检测限测试的示意图。将不同浓度的合成目标DNA链和条形码加入微流通道中，然后用缓冲液洗涤以去除未结合的条形码。

图19示意了靶标分子和探针分子之间瞬时结合的特征性弛豫时间的多重测量。上部：DNA条形码示意图，在未被占用的支架上带有延伸，用于结合瞬时自由扩散的靶标链(感兴趣的分子)。中间：由靶标和9或10nt探针之间的瞬时结合引起的荧光轨迹的实例。底部：共定位在表面结合条形码上的特征性弛豫时间分布。

图20显示了实施例3中的多重荧光相关光谱(FCS)条形码的TIRF图像。上部：每个FCS条形码的设计方案。下部：相应的FCS条形码的TIRF图像。比例尺：10μm。

图21显示了实施例3中各个条形码的代表性荧光自相关曲线。

发明详述

基于DNA折纸的条形码结构

“条形码”在本文指由核苷酸序列和可检测的修饰基团如荧光团组成的可在纳米级进行编码的结构。在成像设备下，每种条形码因包含不同数量、强度、颜色和/或距离的荧光团而呈现出一种明暗相间的“荧光代码”，其中不同长度的明条(即“ON”条)和暗条(即“OFF”条)交替出现。通过这种荧光代码可以识别每种条形码的独特身份，实现与现实世界中的条形码类似的功能，例如将其作为标签附于靶标之上，从而允许对所述靶标的检测、鉴别甚至是分离。

就分子结构而言，条形码由多个“DNA折纸(DNA origami)”单体构成。例如，本发明的条形码包含选自3-1000中的任意整数的数量的单体。

在优选的实施方案中，单体和条形码都呈现一种细长的棒状结构，即在其三维结构的一个维度(轴向)上的尺寸显著大于另外两个维度。将尺寸最大的维度的大小称为“长度”。每个单体可以具有相同或不同的长度。优选每个单体的长度相同，因为这样更适合模块化的制备和组装。进一步而言，每个单体是由一条长单链和多个短单链遵循预先确定的设计方案组合而成的结构。具体来说，通过指定长单链的排列方式来形成特定的骨架，同时通过指定每一条短单链与长单链中的特定区域能够互补结合，从而通过DNA自组装使长单链以特定排列方式形成的骨架被固定下来。一般用“核酸骨架(scaffold)”代指长单链，用“核酸辅助链(staple)”代指短单链，来描述其在DNA折纸设计方案中的功能。一个单体可以含有多个辅助链，例如几条至几百条，优选几十条至几百条，例如50-500条辅助链，例如50条至250条辅助链。

在一些实施方案中，每个单体由多个模块组成，以便于设计和编辑。每个模块可以含有多个辅助链。每个模块含有的辅助链的数目可以相同或不同，优选相同以便于编辑。例如，通过在预先确定的模块的辅助链中附接荧光修饰，可以在单体的不同位置包含一个或多个具有荧光修饰的区域。例如，每个模块中可以在一个或多个辅助链上附接荧光修饰，由此使得每个模块的荧光强度有所不同。

可以通过辅助链来承载多种修饰，例如条形码探针的荧光修饰。一个带有荧光修饰的区域可以包含一个或多个带有荧光修饰的辅助链，例如，1-50个或更多个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个。在本发明的上下文中，有时也将带有荧光修饰的区域称为“带”。

除了本发明的条形码中含有的荧光修饰，辅助链也可以附接其他功能性模块，如功能性的蛋白、抗体、多肽等，从而使得条形码能够具有更多扩展的功能，包括与特定物质结合，如固定到固相支撑物上或与待测样品结合。

在用于靶标检测时，条形码包括能够与靶标结合的区域。所述靶标结合区可以位于任意位置，优选位于不影响条形码荧光信号读取的位置。例如，所述靶标结合区可以位于条形码的任一末端。所述靶标结合区可以是单链核酸，其与靶标反向互补。所述靶标结合区也可以包含蛋白或多肽，例如特异性结合靶标的抗体。

在靶标是核酸分子的情况下，条形码可以包括和靶标核酸互补的单链区域。在靶标是蛋白质的情况下，条形码可以包括与所述蛋白质能够发生相互作用或结合的模块，如该蛋白质的配体或抗体。在靶标是细胞的情况下，条形码可以包括与所述细胞能够发生相互作用或结合的模块，如特异性识别所述细胞表面蛋白的抗体或配体。

从成像结果来看，条形码由交替出现的“明条”和“暗条”构成。“明条”来自于带有荧光修饰的区域。“暗条”来自于没有荧光修饰的区域。在一些情况下，将每个明或暗的信号称为“位点”，因为其可能不是一个细长的条。例如，在一些情况下，“明条”也可以是一个亮点。

可以从长度、强度、颜色、数量等多个参数上调整明条和暗条的性质。可供调整的参数种类越多，则在可比的条件下，例如条形码长度相当的条件下，就能够通过组合不同的参数变化使条形码的总类型数量呈级数增长，从而获得包含更多种类的条形码的条形码集合。

编辑明条、暗条的长度

本发明的明条和暗条在棒状条形码探针轴向的长度取决于两个带有荧光修饰的区域之间的距离。所述“轴向”指棒状结构旋转中心轴的方向。

在之前的条形码技术中，从未将“明位点”的长度作为可编码的性质。之前技术中的“明位点”通常通过单个荧光修饰区域实现，在成像中呈现为一个亮点。甚至之前认为带有荧光修饰的区域的距离需要大于衍射限，以保证能够不同的两点之间能够被分辨。在荧光修饰的区域的距离小于衍射限时，则需要配合高分辨率的成像设备来将这些点区分开。

本发明人创造性地利用了两个或更多个荧光区域无法被成像设备区分的情况，实现了对明条的编辑，丰富了条形码的类别。通过调整带有荧光修饰的区域之间的距离，使两个带有荧光修饰的区域足够靠近到距离小于成像设备的分辨极限，从而形成一个比单一荧光区域所形成的点更长的短条。以此类推，当连续几个带有荧光修饰的区域两两之间的距离都小于成像设备的分辨极限时，可以形成更长的“明条”。不同长度的“明条”在成像设备中是可以被区分的。换言之，本发明的条形码中可以出现亮点和不同长度的亮短条，并将它们统称为“明条”。

这样做的一个好处在于，可以容许两个带有荧光修饰的区域更加靠近。那么在同样长度的条形码(例如1000nm)中，就可以存在更多可以被编辑的方式。另一方面，可编辑的明条长度为条形码集合引入了一个新的可编辑特性，使得条形码探针的种类进一步得以丰富。

可以理解的是，成像设备的可分辨极限在某种程度上决定了检测结果中是否能够存在长度不同的“明条”，还是只能存在大小相同的“亮点”。因为只有在两个光点无法被成像设备识别成两个独立的点时，才能被呈现为一个加长的短条。对于常规成像设备而言，可分辨的极限距离基本上与可见光衍射限相同，即200nm至250nm。那么在使用常规成像设备时，两个带有荧光修饰的区域的中心点之间的距离小于250nm，优选小于200nm时会形成短条。在使用高分辨率成像设备如dSTORM设备时，这个上限距离会进一步缩小。例如，在使用dSTORM设备时，两个带有荧光修饰的区域的中心距离小于30nm才能形成短条，而不是离散的点，甚至需要小于20nm。

在一个实施方案中，可以将DNA折纸单体的长度设计为小于等于可见光衍射限，即小于等于250nm左右，例如约150nm至约250nm。如此一来，在相邻两个单体均仅含一个带有荧光修饰的区域且这个区域在各个单体中位于同样位置，例如位于各个单体的中央时，就能出现比单个两点具有更长的长度“明条”。但是需要注意，决定是否形成有一定长度的明条的关键在于带有荧光修饰的区域之间的距离，而非DNA折纸单体的长度。

在使用分辨率更高的成像设备时，带有荧光修饰的区域之间的距离需要相距更近才能出现融合形成的“明条”。例如，使用dSTORM设备时，在这种情况下，可以通过在一个单体中包含多个带有荧光修饰的区域来实现，和/或通过调整单体的长度来实现。总的来说，使用分辨率更高的设备进行成像和解析时，由于能够区分距离更近的荧光团，这使得在同样长度上可以放置更多的荧光修饰，等同于增加了同样长度内的可编码的位置，继而能够使条形码的种类总数得到级数增长。

“暗条”长度的编辑更容易理解。“暗条”的长度取决于两个带有荧光修饰的区域之间的距离。所述距离应当大于设备的可分辨极限。在采用普通光学成像设备时，当两个带有荧光修饰的区域之间的距离大于可见光衍射限时，在观测结果中在它们之间的位置即为暗条。

在本文的上下文中，“普通光学成像设备”、“普通分辨率成像设备”或简称“普通成像设备”，是相对于超分辨率设备如dSTORM而言。

编辑明条的强度

本发明的条形码的另一个可编辑特性是明条即ON条的强度。

在本发明的上下文中，“强度”指条形码的每个明条的荧光强度。

如前文所述，一个条形码可以含有多个单体，一个单体进一步可以含有多个模块，每个模块可以含有多个辅助链，其中的每一个辅助链可以带有或不带有荧光修饰。基于这样的结构，每个ON条的强度可以通过多种方式来编辑。

例如，可以通过使用具有不同强度的荧光团来改变荧光强度。

例如，可以通过调整每个模块中带有荧光团的辅助链的数量来改变荧光强度。例如，可以设计使得每个模块中所含辅助链中不同比例的辅助链带有荧光团。所述比例例如1％-100％中的任意比例。

例如，可以通过调整每个单体中带有荧光修饰的模块的数量来改变荧光强度。在多个带有荧光修饰的模块足够靠近的情况下，它们会形成一个强度比单个模块更高的带有荧光修饰的区域。在这种情况下，每个带有荧光修饰的模块的距离不仅低于衍射限，还会在荧光强度曲线中融合成一个峰值更高的峰(例如图1C右侧的大峰所示)，并在观测设备中呈现为一个更亮的点，因此可以将这些能够在强度曲线中融合成一个大峰的多个模块视为一个带有荧光修饰的区域，以方便表述。在一些实施方案中，当使用普通光学成像设备时，可以通过使两个带有荧光修饰的模块的中心距离小于等于120nm，优选小于等于100nm，更优选小于等于80nm，特别优选小于等于60nm来形成一个强度大于单个模块的带有荧光修饰的区域。

需要理解的是，这不同于同样可以由多个靠近的带有荧光修饰的模块形成的短条，因为在短条的情况下，多个带有荧光修饰的模块在强度曲线中不会融合成一个大峰，而是形成一个“平台”，即最大值不是一个点(图1C左侧)。

强度增强的带有荧光修饰的区域也可以进一步与其他带有荧光修饰的区域形成短条，只要他们的发光中心低于衍射限，但不会在强度曲线中融合成一个大峰即可。

如此，无论明条是由一个带有荧光修饰的区域组成的亮点，还是由两个或更多个带有荧光修饰的区域组成的短条，都可以通过编辑每个带有荧光修饰的区域的强度来进一步改变条形码的类型。在各个区域融合成一个短条的情况下，每个带有荧光修饰的区域的强度可以相同也可以不同，只要它们在光学检测设备中能够被区分即可。参考图11可以更好地理解明条的强度与长度这两个可编辑特性。例如，图11中第一行第2个(33001)和第3个条形码(33010)中连成短条的两个带有荧光修饰的区域具有相同的III级ON信号；图11第三行最后一个条形码和最后一行的两个条形码连成短条的五个带有荧光修饰的区域具有不同强度的ON信号。从图11中可以清楚地看到，可以通过强度和长度两个特性将图11中的各种条形码进行区分。例如，最后一行的两个条形码(11331和13331)的区别仅在于第二个带有荧光修饰的区域的强度的不同，但仍然可以在成像设备中得到区分，并且可以被自动读取并识别为两种不同的条形码。

其他可以编辑的特性

上述从长度和强度这两方面对条形码进行编码的方式是本发明开创性的设计。它们可以与现有技术中已知的其他方式组合，为条形码集合提供更多的可能性。所述其他方式包括：引入更多种颜色的荧光，如绿色荧光、红色荧光、蓝色荧光；改变条形码中单体(从结构上看)或明/暗条(从观测结果上看)的数量等。

在引入带有不同颜色的荧光团的情况下，一个具有荧光修饰的区域可以只包含一种颜色的荧光团，也可以包含多种荧光团，例如该区域包含具有不同荧光团的辅助链。如此一来，可以通过不同颜色荧光团的叠加形成新的颜色。

另一方面，在包含带有不同颜色荧光修饰的区域时，还可以通过切换成像设备的颜色通道来辅助对不同种类条形码的识别(参见图12)。

条形码的制备

本发明提供了一种分步组装的方法以模块化的方式来制备条形码探针。

具体来说，所述条形码探针由n个按照预定顺序排列的单体组成，每个单体由一个核酸支架链和多个核酸辅助链组成，并且每个单体为包含带有荧光修饰的区域的单体或不包含带有荧光修饰的区域的单体，所述方法包括：

(a)构建包含带有荧光修饰的区域的单体和不包含带有荧光修饰的区域的单体；

(c)通过粘末端之间的互补关系按预定顺序组装多个单体，由此获得所述条形码探针。

每个单体都是一个单独的DNA折纸单元，可以通过支架链和辅助链之间的自组装形成预先设计的结构。需要理解的是，DNA折纸结构虽然由核苷酸构成，但形成同样的结构可以使用不同的核苷酸序列，因为在DNA折纸结构中，核苷酸通常并不承担诸如编码蛋白质这样的生物学功能，而是利用了它们之间的互补配对特性。可以使用本领域已知的设计工具来设计想要的DNA折纸结构。所述工具例如cadnano(http://cadnano.org/)。

为了方便实现本发明所特有的长度可编辑的明条，也为了合成的便利性，优选将每个单体的长度设计为接近光学观测和成像设备的可分辨极限，例如可见光的衍射限。例如，可以将每个单体的长度设计在200nm至250nm。在这种情况下，即使只合成两种单体，即不含带有荧光修饰的区域的单体(OFF单体)，和带有荧光修饰的区域的单体(ON单体)，都可以通过单体的不同排列顺序，合成在普通观测设备的观测结果中可以具有不同长度明条和暗条的条形码。当两个ON单体连续排列时，由于其在同样位置带有荧光修饰，因此这两个荧光修饰的区域中心的距离等于单体的长度，该长度接近可见光衍射限，因而这两个具有荧光修饰的区域会在观测结果中融合成一个短条。

然而，本领域技术人员应该理解，单体可以更长或更短。随着技术的发展，合成更长的单体可能会更加便利。可以根据单体的长度、希望编辑的性质(如明暗条长度、明条强度、颜色等)来设计单体的种类。在引入更多可编辑特性的情况下，同一个条形码探针集合中的单体种类数也会增加。

在具体的实施方案中，具有棒状结构的本发明的条形码探针单体由10个螺旋束组成。应该理解的是，本发明不限于具体的螺旋束数量，还可以使用更多或更少的螺旋束，如3-20个中任意整数的螺旋束。或者使用其他搭建方式来形成“棒状”条形码探针结构。

在本发明的一个实施方案中，合成了包含强度不同的具有荧光修饰的区域的单体。这些强度不同的具有荧光修饰的区域可以通过如上所述的多种方式实现。

在本发明的另一个实施方案中，合成了包含具有不同颜色荧光修饰的区域。

制备的探针中可能包含结构不完整的“缺陷”探针。其中的多数为单体的缺失，或者也可能是荧光修饰的辅助链没有有效结合在最终的结构上。导致缺陷的原因是由于在分离、纯化或者进行成像准备的过程中，部分单体从五聚体上掉落。

缺陷会导致识别和/或分类的错误。这在一些具体的条形码图案上更加明显。比如，就10100五聚体而言，第四位或第五位单体的缺陷都会显示为1010，使得其表现型还是被分类为10100五聚体，不会影响识别结果。而11011五聚体的任意缺陷都会影响其识别结果。

条形码的缺陷可以通过改进纯化方法或者利用标记噪音的机器学习方法来改善。

条形码的读取

与传统条形码一样，发明人通过机器学习开发了一种自动读取、识别本发明的核酸条形码的方法。

用途

本发明的条形码探针可以用于多种检测用途，包括但不限于检测样品中靶标的存在、估算样品中靶标的浓度、监测两种可相互作用的分子之间的相互作用等。由于本发明的条形码探针能够产生丰富的组合，同时还能够实现准确、高效的机器识别，本领域技术人员能够理解其可以用于多种需要同时检测多种分子的应用。

在优选的实施方案中，在用于检测分析物时，以至少10pM的浓度使用本发明的条形码探针，更优选至少20pM，至少30pM，至少40pM，至少50pM，至少0.1nM。

本发明还涉及如下实施方案：

1.包含至少两种条形码探针的条形码探针集合，其中所述条形码探针是由核酸形成的棒状结构，每种条形码探针包含一个或多个带有荧光修饰的区域，并且每种条形码探针中带有荧光修饰的区域的数量和/或分布不同，从而使得在成像设备中观察时，每种条形码探针呈现出明条和暗条交替出现的独特图案，

其中在所述集合的条形码探针中，存在至少两种在成像结果中具有不同长度的明条。

2.实施方案1的条形码探针集合，所述不同长度是在所述棒状结构的轴向方向上的长度。

3.实施方案1的条形码探针集合，其中所述荧光修饰均为同一种颜色的荧光修饰。

4.实施方案1的条形码探针集合，包含不同颜色的荧光修饰。

5.实施方案4的条形码探针集合，在至少一种条形码探针中包含不同颜色的荧光修饰。

6.实施方案1-5任一项的条形码探针集合，其中至少一种条形码探针包含至少两个符合如下关系的具有荧光修饰的区域，其中相邻的两个具有荧光修饰的区域中心之间的距离小于所述成像设备的可分辨极限，由此所述成像设备无法将所述两个具有荧光修饰的区域分辨为两个彼此独立的点。

7.实施方案6任一项的条形码探针集合，所述成像设备将符合所述关系的至少两个具有荧光修饰的区域识别为具有长度的明条。

8.实施方案6或7的条形码探针集合，其中所述成像设备是普通成像设备，如荧光显微镜，如全内反射荧光显微镜(TIRFM)，并且其中所述相邻的两个具有荧光修饰的区域中心之间的距离小于约250nm。

9.实施方案8的条形码探针集合，其中所述相邻的两个具有荧光修饰的区域中心之间的距离在约150nm至250nm之间。

10.实施方案6或7的条形码探针集合，其中所述成像设备为超分辨率成像设备，如dSTORM，并且其中所述相邻的两个具有荧光修饰的区域中心之间的距离小于约30nm。

11.实施方案8的条形码探针集合，其中所述相邻的两个具有荧光修饰的区域中心之间的距离在约20nm至30nm之间。

12.实施方案1-11任一项的条形码探针集合，其中至少两个具有荧光修饰的区域具有不同的荧光强度。

13.实施方案1-12任一项的条形码探针集合，其中所述核酸形成的棒状结构由多个单体组成，每个单体包含一个核酸支架链和多个核酸辅助链。

14.实施方案13的条形码探针集合，其中所述核酸形成的棒状结构由3-1000个单体组成。

15.实施方案13的条形码探针集合，其中所述核酸形成的棒状结构由3-500个单体组成。

16.实施方案13的条形码探针集合，其中所述核酸形成的棒状结构由3-100个单体组成。

17.实施方案13的条形码探针集合，其中所述核酸形成的棒状结构由3-50个单体组成。

18.实施方案13的条形码探针集合，其中所述核酸形成的棒状结构由3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个单体组成。

19.实施方案13-18任一项的条形码探针集合，其中每个单体长度相同或不同。

20.实施方案13-19任一项的条形码探针集合，其中每个单体长度为200-250nm。

21.实施方案13-20任一项的条形码探针集合，其中每个单体不包含带有荧光修饰的区域，或者包含一个或多个带有荧光修饰的区域。

22.实施方案1-21任一项的条形码探针集合，其中所述带有荧光修饰的区域包含与荧光团缀合的核酸辅助链。

23.实施方案22的条形码探针集合，所述至少两个具有荧光修饰的区域包含数量不同的与荧光团缀合的核酸辅助链。

24.实施方案1-23任一项的条形码探针集合，其中所述条形码探针包含靶标结合区域。

25.实施方案24的条形码探针集合，其中所述靶标结合区域是单链核酸。

26.实施方案24的条形码探针集合，其中所述靶标结合区域包含用于结合靶标的抗体。

27.实施方案24的条形码探针集合，其中所述靶标结合区域包含用于结合靶标的多肽。

28.一种检测样品中靶标的存在的方法，包括：

(a)提供实施方案1-27中任一项的条形码探针集合，所述条形码探针集合包含与所述靶标特异性结合的条形码探针；

29.实施方案28的方法，其用于检测样品中存在的多种靶标，并且每种靶标与所述探针集合中的一种条形码探针结合。

30.实施方案28或29的方法，进一步包括将未结合的靶标和/或条形码探针与结合的靶标-条形码探针复合物分离的步骤。

31.实施方案28至30任一项的方法，其中所述靶标或条形码探针固定在固相支撑物上。

32.实施方案31的方法，其中所述固相支撑物为玻璃或树脂。

33.实施方案31的方法，其中所述固定通过非共价相互作用、抗体-抗原相互作用或静电相互作用实现。

34.实施方案33的方法，其中所述固定通过链霉亲和素/生物素相互作用或地高辛/抗地高辛抗体相互作用实现。

35.实施方案31至34中任一项的方法，进一步包括将未结合的靶标和/或条形码探针洗脱的步骤。

36.实施方案35的方法，进一步包括根据洗脱后剩余的条形码探针的数量估算所述样品中的靶标浓度。

37.实施方案28-36任一项的方法，所述靶标是核酸分子、蛋白质或细胞。

38.一种检测多个靶标核酸和探测核酸对之间的相互作用的方法，包括：

(a)将每一种探测核酸构建到实施方案1-27中任一项的条形码探针集合中的一种独特的条形码探针上，并将所述条形码探针固定在固相支撑物上；

39.一种试剂盒，其包含实施方案1-27中任一项的条形码探针集合。

40.一种制备条形码探针的方法，所述条形码探针由n个按照预定顺序排列的单体组成，每个单体由一个核酸支架链和多个核酸辅助链组成，并且每个单体为包含带有荧光修饰的区域的单体或不包含带有荧光修饰的区域的单体，所述方法包括：

41.实施方案40的方法，其中所述n为3至1000的整数。

42.实施方案40的方法，其中所述带有荧光修饰的区域包括带有荧光团的辅助链。

43.实施方案40-42任一项的方法，其中所述带有荧光修饰的区域的单体包括带有不同荧光强度的荧光修饰的区域的单体。

44.实施方案43的方法，所述不同荧光强度通过在所述带有荧光修饰的区域中包含数量不同的带有荧光团的辅助链来实现。

45.实施方案40-44任一项的方法，其中所述带有荧光修饰的区域的单体包括带有不同颜色的荧光修饰的区域的单体。

46.实施方案40-45任一项的方法，所述单体长度为200-250nm。

47.实施方案40-46任一项的方法，其中所述条形码探针包含至少两个符合如下关系的具有荧光修饰的区域，其中相邻的两个具有荧光修饰的区域中心之间的距离小于成像设备的可分辨极限，由此所述成像设备无法将所述两个具有荧光修饰的区域分辨为两个彼此独立的点。

48.实施方案47的方法，所述成像设备将符合所述关系的至少两个具有荧光修饰的区域识别为具有长度的明条。

49.实施方案47或48的方法，其中所述成像设备是普通成像设备，并且其中所述相邻的两个具有荧光修饰的区域中心之间的距离小于约250nm。

50.实施方案49的方法，其中所述相邻的两个具有荧光修饰的区域中心之间的距离在约150nm至250nm之间。

51.实施方案47或48的方法，其中所述成像设备为超分辨率成像设备，如dSTORM，并且其中所述相邻的两个具有荧光修饰的区域中心之间的距离小于约30nm。

52.实施方案51的方法，其中所述相邻的两个具有荧光修饰的区域中心之间的距离在约20nm至30nm之间。

53.通过实施方案40至52中任一项的方法制备的条形码探针。

54.一种制备条形码探针集合的方法，包括通过实施方案40-52中任一项的方法制备多种条形码探针，其中每种条形码探针通过以不同的预定顺序排列不同的单体来制备，并且其中至少一种条形码探针包含至少两个符合如下关系的具有荧光修饰的区域，其中相邻的两个具有荧光修饰的区域中心之间的距离小于成像设备的可分辨极限，由此所述成像设备无法将所述两个具有荧光修饰的区域分辨为两个彼此独立的点。

55.通过实施方案54制备的条形码探针集合。

实施例

为了更全面地理解和应用本发明，下文将参考实施例和附图详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

方法

材料

所有DNA寡核苷酸均购自Integrated DNA Technologies(Coralville,IA)。链霉亲和素购自Invitrogen(Carlsbad,CA)，抗地高辛抗体购自Millipore Sigma(St.Louis,MO)。载玻片和盖玻片购自Fisher Scientific(挪威奥斯陆)。p8064支架由发明人制造，如SEQ ID NO:1中所示。其他合成DNA折纸条形码所需的DNA片段，包括辅助链等的序列如表3-7和SEQ ID Nos:2-558所示。

DNA折纸条形码组装

首先，分别组装具有特定粘性末端组的五聚体条形码单体。该反应通过“一锅法(one-pot process)”进行，其中将20nM的p8064支架与100nM的每种辅助链(staple)和2.5μM荧光标记的DNA在补充有12.5mM MgCl₂的1×TE缓冲液(10mM Tris，2mM EDTA，pH 8.0)中混合。将得到的混合物在热循环仪中以每分钟0.5℃的恒定速度从85℃退火至25℃，然后以每分钟3℃的恒定速度从25℃退火至4℃。接下来，构成五聚体的五个单体将被等量混合，并在42℃下恒温孵育12小时以连接成为五聚体结构。将恒温孵育后的产物使用1％非变性琼脂糖凝胶进行分离纯化。电泳缓冲液为补充有10mM MgCl₂的0.5×TBE(44.5mM Tris、44.5mM硼酸和1mM EDTA)溶液。电泳将在冰水浴中进行。然后将产物条带切下、压碎并在Freeze‘n’Squeeze柱(Bio-Rad)中离心回收。

对于较长的10聚体条形码，琼脂糖凝胶电泳无法分离完整的产物。因此将每个10聚体对半分成两个5聚体。首先将两个5聚体用前述流程组装并进行凝胶纯化。接下来，再将经纯化的两个5聚体混合后在真空浓缩器中浓缩三倍，并在42℃下温育过夜。

研究中使用的另一种方法是对每种单体进行完全退火，将所有组分合并到100kMWCO

超离心过滤器(Millipore)中，在其中去除多余的辅助链。然后在融合步骤中将所得浓缩产物在42℃下温育12小时。

透射电子显微镜

首先将碳formvar 400目网格以低设置等离子清洁30秒(Harrick Plasma)。将3μL凝胶纯化的DNA折纸产物滴加到网格上并使其吸附30秒，然后用Whatman滤纸吸干。使用5μL1％pH经调节的甲酸双氧铀溶液对吸附的折纸样品进行30秒染色。在用滤纸(Whatman)吸掉染色液后，让染色的网格在室温下在空气中干燥，然后进行成像。图像用Hitachi HT-7700120kV W(钨)TEM和AMT CCD相机在80kV下拍摄。

成像–pH固定

本方法用于促进条形码对玻璃的稳健吸附，以在没有半抗原-抗半抗原化学作用的情况下实现清晰成像。首先在空气等离子清洁器中清洁显微镜载玻片和玻璃盖玻片(#1.5 22x22mm²，VWR)30秒。接下来，将细长的双面胶带(Scotch^TMPermanent)平行贴在显微镜载玻片上，以形成直径约2mm的通道。将盖玻片放在双面胶带的顶部，并通过施加温和的压力牢固地粘附。为了促进条形码对等离子体清洁过的玻璃的电荷介导吸附，首先将凝胶纯化的条形码用缓冲液B(5mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、1mM EDTA、0.05％Tween-20)(用NaOH将pH值调至9.1)稀释到工作浓度50pM。将稀释后的样品加入到胶带微流通道中，然后用指甲油密封。图像在Nikon Eclipse Ti显微镜上拍摄，通过Nikon Elements软件操作，使用1.49数值孔径CFI Apo X 100物镜、完美对焦系统和以75mW和488/640nm启动的TIRF激光。Chroma四边形立方体激光器(ET-405/488/561/640nm激光四波段)用于成像。Andor iXonUltra 897电子倍增电荷耦合设备用于图像采集。

成像–半抗原固定

对于需要将条形码通过生物素-链霉亲和素固定在玻璃上的实验，制备了带有用生物素修饰的延伸片段的条形码。制备与pH固定所用的相同的胶带微流通道。首先，用40μL缓冲液A(10mM Tris-HCl、100mM NaCl、0.05％Tween 20、pH 7.5)洗涤通道。然后使20μL生物素化牛血清白蛋白(1mg/mL，溶于缓冲液A中)流入腔室并孵育4分钟。将腔室再次用40μL缓冲液A洗涤，然后将20μL链霉亲和素(0.5mg/mL，溶于缓冲液A中)流入腔室并使其结合4分钟。再用40μL缓冲液A和40μL缓冲液B先后洗涤后，使20μL生物素标记的DNA条形码结构流入腔室并孵育5分钟。最后用60μL缓冲液B冲洗通道，然后用指甲油密封。

直接随机光学重建显微镜(dSTORM)超分辨率图像采集

在半抗原固定流程中使用相同的方法进行显微镜载玻片制备和条形码固定，但使用Alexa 647荧光团，因为它们具有出色的光开关能力。在用60μL缓冲液B进行最终洗涤后，使成像缓冲液(10％葡萄糖、160mM Tris-HCl(pH8.0)、40mM NaCl、2mM环辛四烯(COT)、143mMβME、0.56mg/mL葡萄糖氧化酶、40μg/mL过氧化氢酶、10mM MgCl₂、1mM EDTA和0.05％Tween 20)流入腔室，并在成像前用环氧树脂密封腔室。图像用EMCCD相机获取。读取模式设置为14位EM增益10MHz、EM增益倍数30和4.9X转换增益。使用640nm激光(300mW，MPBC647nm)和405nm激光(100mW，CUBE 405-100C)。所有图像均以60ms曝光时间和20000帧获取。

合成核酸靶标的检测

制备了具有不同荧光代码的条形码，其中每种条形码中的第一个单体携带与某种合成靶标的一半互补的独特延伸片段。每种合成靶标的另一半与地高辛修饰的DNA链互补。使用PBS将纯化的条形码稀释至50pM，并与不同浓度的合成靶标和过量的地高辛修饰的DNA链(1nM)在室温下在摇床上温育过夜。将条形码在PBS中稀释，因为钠离子会抑制折纸结构和等离子清洁的玻璃表面之间基于电荷的相互作用。这导致地高辛-抗地高辛化学成为将条形码固定到玻璃上的唯一途径。制备胶带微流通道并与溶解于PBS中的50μg/mL抗地高辛一起温育三分钟。用20μL的PBS洗涤后，加入样品并温育半个小时。接下来，用20μL的纯PBS洗去任何未粘附的条形码和游离寡核苷酸。最后，使用20μL缓冲液B(pH 9.1)来置换PBS，并使条形码通过电荷相互作用吸附到玻璃上。使用该方法可检测到低至1pM的合成靶标浓度。

多重荧光相关光谱(FCS)测定

对六种凝胶纯化的条形码结构进行单独成像，然后根据图像上显示的密度混合成大致相等的最终摩尔浓度(图20)。将0.05mg/mL链霉亲和素加入经PEG-生物素处理的载玻片的微流通道中并温育3分钟，然后用缓冲液A(10mM Tris-HCl、100mM NaCl、0.05％Tween20，pH 7.5)洗涤。然后将条形码混合物添加到通道中，并在温育3分钟后用提升缓冲液(1XPBS和10mM MgCl₂，pH 7.4)洗涤。将TMR标记的靶标链(每条靶标链10nM)与氧清除系统(3mg/mL葡萄糖、100μg/mL葡萄糖氧化酶、40μg/mL过氧化氢酶、1mM环辛四烯、1mM 4-硝基苯甲醇和1.5mM 6-羟基-2,5,7,8-四甲基-色烷-2-羧酸)添加到微流体中。通过配备T635lpxr干涉二向色性(Chroma)、ET585/65m(Chroma，用于TMR)和ET700/75m(Chroma，用于Alexa647)带通滤波器的TIRF显微镜获取图像。对于Alexa 647检测通道(100ms/帧，1帧)使用激光功率为5mW的640nm激光，而对于TMR检测通道(100ms/帧，3000帧)使用激光功率20mW的532nm激光。

实施例1.单色几何荧光条形码

本实施例展示了本发明的一组5聚体条形码，包括该条形码系统的制备和表征。

5聚体条形码设计

每个5聚体使用了五个10螺旋束(10helix bundle；10HB)DNA折纸纳米棒，每个纳米棒或者为“开/ON”(1)，或者为“关/OFF”(0)(图1A和图2)。

10HB DNA折纸纳米棒具有理想的刚性和较为便利的长度，长约250nm，这种长度接近衍射限(200-250nm)。将10HB纳米棒分为17个带(band)，每条带由10个辅助链组成，每个条带长度约为14nm。在包含10辅助链的每条带中，有8个辅助链可以进行5'和3'延伸，以对接具有功能性修饰的互补DNA链。在每个10HB单体上，选择位于中心的带(如图1A中所示的9号带)来携带总共对接八个荧光团的延伸片段。将五个这样的单体通过端对端的组装生成了一个长度为1.25μm的DNA条形码。获得的条形码共有五个可编码的“ON”或“OFF”单体。

当两个或多个“ON”单体在条形码内连续排列时(即中间没有“OFF”单体)，它们会因无法分辨而在成像中显示为一个细长的“ON”条，而当它们中间有至少一个“OFF”单体时，它们呈现为清晰可辨的两个或多个点状的“ON”。这样的核酸条形码模仿了宏观世界的条形码系统，其中黑色和白色区域的宽度都是可编码的。

相较于仅可编码“OFF”条的长度的现有技术，可以创建更多条形码组合。例如，WO2012058638A2中的三位点系统采用了不等距的设计，即条形码包含三个荧光标记区域且荧光标记区域两两之间的距离不等，分别为270nm和450nm。在这样的系统中，只有“OFF”条的长度可以编码，也就是说只能改变荧光标记区域之间的距离。在仅使用单色荧光的情况下，如果只能编辑“OFF”条长度，那么只存在四种不同的组合。与之不同，本发明还可以编辑条形码中的“ON”条长度。因此，在同样含有1至3个“ON”的情况下，由于“ON”条长度可变，使得组合的数量成倍增加到12种。

构建和鉴定

为了构建这一系列的条形码，制备了两个核心辅助链组，“ON”(1)和“OFF”(0)，以及五组独特的粘末端(dT//A、A*//B、B*//C、C*//D、D*//dT)。通过设计粘性末端，使各个10HB单体能够按照从1到5的顺序组装。为五个“ON”或“OFF”纳米棒单体中每一个的核心辅助链组配备一组独特的粘性末端，使用标准流程组装每个单体(图2)。然后在等温温育中混合五个独特的单体，使单个纳米棒连接成一个长的条形码，然后用琼脂糖凝胶电泳纯化。条形码的形态通过透射电子显微镜进行验证(图3)。

通过全内反射荧光(TIRF)显微镜来鉴定荧光条形码，纯化后的荧光条形码，通过缓冲液介导的静电相互作用被固定在载玻片表面，载玻片预先经过等离子清洗处理，使用全内反射荧光显微镜收集图像，代表性图像如图2A和图5所示。经过纯化的12种条形码均以高产率(～80％)生成(如图4)，即其中的80％保持了期望的完整结构。

鉴于条形码以随机方向沉积在玻璃上，因此在成像过程中无法区分11010和10110这样的组合。此外，诸如10100、01010和00101这样的移位图案也只能通过鉴定条形码末端的方法来区分。因此，尽管理论上存在32(2^5)种5聚体的组合，但最终只制备了12种无需极性和末端信息即可区分的5聚体。

通过测量10000、11000、11100、11110和11111这五种带有不同长度“ON”条的条形码，验证了“ON”条的可编码性和可读性。对于每种条形码人工测量了图像中随机选择的50个条形码，并记录它们的长度。如图6所示，包含长度从1到5不等的“ON”条的五种条形码能够被成功地区分，仅有极小的测量值上的重叠。

条形码的读取

另外值得注意的是，极性问题可以通过缓冲液介导的梳理过程来解决。通过来自条形码一端的生物素/链霉亲和素或地高辛/抗地高辛抗体相互作用将各个条形码锚定到玻璃表面，使缓冲液组合流入微流通道，从而让条形码均朝同一方向排列(图7)。这样会使半抗原修饰的末端朝向上游，而未经修饰末端朝向下游。使用此策略不仅可以更轻松、更清晰地读取条形码，而且还是一种无需任何额外化学修饰或荧光颜色即可建立极性的可靠方法。

为了自动读取该条形码系统，发明人训练了一种机器学习算法来识别和分类五种选定的条形码(图8)。相应的图像是在显微镜粘附后的清洗过程之后拍摄的，该清洗过程旨在去除破损或不完整的条形码以获得更清晰的图像并模拟探测条件。将每种条形码单独制备并成像。

使用Python程序包scikit-image(van der Walt,S.等，Scikit-Image:ImageProcessing in Python.PeerJ 2014,2,e453)将显微镜图像分割成包含单个条形码的较小图像。将显微镜图像转换为位图(bitmap)，并使用拉普拉斯高斯(Laplacian of Gaussian；LoG)斑点检测提取15×15像素子图像，其中固定内核大小对应于最长条形码的长度。分割的图像被归一化和下采样以确保数据集平衡。然后将分割的图像以80/20的比例分成训练集和测试集。使用Python程序包xgboost(Chen,T.and Guestrin,C.,XGBoost:A ScalableTree Boosting System.In Proceedings of the 22nd ACM SIGKDD InternationalConference on Knowledge Discovery and Data Mining,Association for ComputingMachinery:San Francisco,California,USA,2016；pp 785–794)执行用于分类分割的图像的eXtreme梯度增强(eXtreme Gradient Boosting；XGB)。在训练集上使用五倍交叉验证调整超参数。使用来自交叉验证的最佳超参数，在训练集上训练XGB模型。然后根据测试集评估模型的性能。我们的数据集由来自每个类别的3012个分割图像组成。平均而言，经过训练的算法能够在92.3％的时间内正确识别分割的条形码。

我们还进行了阳性对照，其中将数百个完整且准确的条形码输入到训练算法中。在这组手工选择的图像中，条形码在100％的时间内被正确识别。这表明92.3％的成功率接近经洗涤的条形码的真实产率，任何错误识别的条形码均为本身具有缺陷，为含有半抗原修饰的单体。

值得注意的是，上述条形码评估研究是在没有丢弃任何一类的情况下进行的，这意味着明显的缺陷被强行归类为五种条形码种类之一。此外，一些条形码更容易误分类。例如，10100条形码的单体4和5中的缺陷仍会导致条形码看起来像10100，而11011中的任何缺陷都会产生看起来与11011完全不同的条形码，后者可能导致误分类的机会更大。

实施例2.生成扩展条形码集

本实施例涉及增加条形码的编码空间的策略。

增加位数(number of bits)

第一个是通过增加每个条形码的位数，这允许以指数方式增加组合总数。使用了一系列具有任意选择的样式的10聚体条形码来展示这种策略(图9)。

10聚体条形码通过分步组合两个特定的预制的5聚体制备。为了确保完整的10聚体条形码可以得到可靠的识别，将每个10聚体条形码的第一位和最后一位都设计为“ON”单元。对于剩余的8位，最多可能有256(2^8)种组合。随后每增加一位，组合总数就会增加一倍，因此需要具有更多位的更长纳米棒来获得更多条形码种类。

虽然可以使用更多的折纸单元来构建更长的纳米棒(结果未显示)，但为了获得所需的条形码来作为工作探针而进行的制备过程，尤其是纯化过程将变得具有挑战性。

引入不同的荧光强度

第二种策略是改变每个折纸纳米棒单元的荧光强度。这通过将辅助链与一个、两个或三个用于荧光团链对接的辅助链带结合来完成，其分别对应于每个单体8、16或24个荧光团(图10)。

如图10所示，带有两条荧光带的“ON”折纸纳米棒的带间距离为120nm，而带有三条荧光带的“ON”折纸纳米棒的带间距离为60nm。在TIRF成像中，单个折纸纳米棒上的多条荧光带无法被识别为离散的点，只会增加测量的荧光强度(因衍射极限而不可分辨的图案可以通过图10中的直接随机光学重建显微镜(dSTORM)超分辨率成像显示)。

一个5聚体多强度条形码被用来演示这个概念。如图11中所示，成像的图像和荧光强度曲线均与设计的条形码结构相匹配。

为了解决潜在的可区分性问题，可以使用更大的荧光强度增量，例如8个荧光团(一条带)、24个荧光团(三条带)和40个荧光团(五条带)。例如，通过采用三级荧光强度系统，每个单体将具有四种可编码状态：OFF(0)、ON(I级)、ON(II级)或ON(III级)。如此一来，5聚体条形码的总组合数理论上可增加到1023(4^5-1)个——尽管唯一可识别的非对称条形码的总数较少。

引入多色荧光

虽然本发明主要作为单色系统呈现，但也可以通过增加荧光颜色的类别来扩展组合总数。

在图12中示例了两个5聚体，其中使用了红和绿两种不同颜色的荧光。在使用两种颜色时，每个单体有四种可编码状态：无荧光、颜色一(例如Alexa 647)、颜色二(例如Alexa488)、两种颜色叠加(例如，Alexa 647和Alexa 488)。这将可能的组合总数从31(2^5-1)增加到1023(4^5-1)。此外，只需要准备四种辅助链混合物，每种对应一种前述可编码状态。

缩短位点之间的间隔和超分辨率成像

最后一个策略是使位点之间的间隔缩短，使位点更加密集。

在这种策略中，可以使用dSTORM超分辨率成像。使用三条带的“ON”折纸单体制作5聚体条形码，其在超分辨率成像下能够呈现15个可能的位点，或32767(2^15-1)个组合。

更进一步，可以使位点靠得更近，使其即使使用dSTORM也无法分辨相邻的“ON”位点。这允许在超分辨率成像的框架下创建可编码长度的“ON”条。

Alexa 647具有出色的光开关特性，并因此广泛用于dSTORM应用。在本方案中选用Alexa 647。通过使用莫尔斯电码执行的信息编码来编写三个字母D、N和A(图13)来展示本平台的多功能性。三条带的“ON”折纸单元代表一个破折号，而单条带的“ON”折纸单元代表一个点。单独制备三种条形码，然后混合并成像。

将每个5聚体条形码中的三个DNA折纸单元作为字母编码区域，之后是一个间隔区，并以最后一位描述字母顺序。如此一来，将涉及字母和字母顺序的所有信息都包含在样品中，从而允许在单次成像中解码所有信息(所有三个莫尔斯电码都可以在40μm×40μm图像中得到识别，图14)。

实施例3.用于生物分子检测的单色分步组装DNA条形码

本实施展示本发明的单色荧光条形码系统用于捕获和鉴定生物分子的应用。

本发明的条形码被用来检测合成靶标DNA链的存在。实施了一种三明治杂交法，其中使用靶标寡核苷酸将条形码的鉴定探针连接到地高辛修饰的锚定探针，锚定探针可以将整个复合物连接到玻璃表面，从而使得清洗步骤期间条形码能够保留在表面上，同时去除任何未粘附的条形码(图15)。

将实施例1中用于训练机器学习算法的五种单独的5聚体条形码构建成在第一个单体上带有独特的靶标杂交粘性末端。纯化后，将五个条形码混合，然后在三个独立的检测中分别添加两个、三个和四个靶标以分离样品。然后将条形码和靶标混合物添加到涂有抗地高辛抗体的玻璃中，并洗掉游离的条形码(图16)。使用先前训练的算法来表征图像，并且可以在对应的核酸靶标(例如合成靶标2和4)存在的情况下观察到靶标条形码(例如，条形码2和4)，这清楚地证明了本发明的方法的特异性(图17和表1)。

如表1所示，未将缺陷结构强制归类到某种条形码，而是添加了丢弃类别，允许算法在低于某个确定性阈值时丢弃条形码。此外，可以根据表面上存在的条形码数量推断溶液中存在的靶标的相对浓度(图18)。如表2所示，本发明可以检测到低至1pM的浓度。本发明的检测和分析流程表明，可以以高灵敏度(1pM)和低误报率自动处理数百甚至数千张图像。在检测高浓度的分析物时，将条形码浓度固定在50pM左右可以有效避免产生条形码之间信号重叠干扰。

表1.多重靶向的机器学习分析

表2.条形码系统更多检测限测试

接下来进一步证明了将本发明的条形码系统用于多重单分子荧光测量的可行性。在典型的体外单分子荧光测量中，可以同时记录数百甚至数千个单分子事件。然而，这些事件包含高度冗余的信息。由于缺乏将单个单分子点分配给不同物种的合适技术，因此必须将整个微流体室仅用于一种探针。

建立了一种多重荧光相关光谱(FCS)测定法来量化自由扩散的目标分子和固定探针分子之间的瞬态结合动力学(图19)。FCS是一种常用单分子荧光方法，提供高时间分辨率以捕获扩散运动以及分子内和分子间相互作用。在本实施例的FCS测定中将这种瞬时结合用于量化分子间相互作用的动力学。

设计了六个正交靶标-探针对并分为三组。每组包含一个四甲基罗丹明(TMR)标记的ssDNA作为靶标链和两个互补的ssDNA探针。TMR标记的靶标可以通过9或10个碱基对与任何探针瞬时结合。然后设计六种5聚体条形码(Alexa 647标记)，每种携带一种探针链(图20)。将这六种条形码的混合物固定在PEG-生物素处理的载玻片上，并将该载玻片与三种自由扩散的TMR标记的靶标链(靶标1、2和3)的混合物一起温育。靶标链和固定的条形码上的探针之间的瞬时特异性相互作用导致记录的荧光信号的波动。计算荧光相关曲线及其特征性弛豫时间(图19和图21)。

在本实施例中，通过使用条形码系统建立的多重单分子测定法，第一次能够在一次测量中同时区分、检查并量化六种靶标-探针对的相互作用动力学(图19)，其弛豫时间与从一次仅包含一种固定化探针链的单分子荧光测量法获得的高度相符。

序列信息

表3.核心辅助链的序列如下表所示

表4.功能性链的序列

表5.粘末端链序列

表6.合成靶标链序列

表7.探针抓手和TMR标记的靶标链序列

序列表

<110> 清华大学

埃默里大学

<120> 基于DNA折纸结构的条形码系统

<130> PS12963SLS33CN

<160> 558

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8064

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Scaffold

<400> 1

aatgctacta ctattagtag aattgatgcc accttttcag ctcgcgcccc aaatgaaaat 60

atagctaaac aggttattga ccatttgcga aatgtatcta atggtcaaac taaatctact 120

cgttcgcaga attgggaatc aactgttata tggaatgaaa cttccagaca ccgtacttta 180

gttgcatatt taaaacatgt tgagctacag cattatattc agcaattaag ctctaagcca 240

tccgcaaaaa tgacctctta tcaaaaggag caattaaagg tactctctaa tcctgacctg 300

ttggagtttg cttccggtct ggttcgcttt gaagctcgaa ttaaaacgcg atatttgaag 360

tctttcgggc ttcctcttaa tctttttgat gcaatccgct ttgcttctga ctataatagt 420

cagggtaaag acctgatttt tgatttatgg tcattctcgt tttctgaact gtttaaagca 480

tttgaggggg attcaatgaa tatttatgac gattccgcag tattggacgc tatccagtct 540

aaacatttta ctattacccc ctctggcaaa acttcttttg caaaagcctc tcgctatttt 600

ggtttttatc gtcgtctggt aaacgagggt tatgatagtg ttgctcttac tatgcctcgt 660

aattcctttt ggcgttatgt atctgcatta gttgaatgtg gtattcctaa atctcaactg 720

atgaatcttt ctacctgtaa taatgttgtt ccgttagttc gttttattaa cgtagatttt 780

tcttcccaac gtcctgactg gtataatgag ccagttctta aaatcgcata aggtaattca 840

caatgattaa agttgaaatt aaaccatctc aagcccaatt tactactcgt tctggtgttt 900

ctcgtcaggg caagccttat tcactgaatg agcagctttg ttacgttgat ttgggtaatg 960

aatatccggt tcttgtcaag attactcttg atgaaggtca gccagcctat gcgcctggtc 1020

tgtacaccgt tcatctgtcc tctttcaaag ttggtcagtt cggttccctt atgattgacc 1080

gtctgcgcct cgttccggct aagtaacatg gagcaggtcg cggatttcga cacaatttat 1140

caggcgatga tacaaatctc cgttgtactt tgtttcgcgc ttggtataat cgctgggggt 1200

caaagatgag tgttttagtg tattcttttg cctctttcgt tttaggttgg tgccttcgta 1260

gtggcattac gtattttacc cgtttaatgg aaacttcctc atgaaaaagt ctttagtcct 1320

caaagcctct gtagccgttg ctaccctcgt tccgatgctg tctttcgctg ctgagggtga 1380

cgatcccgca aaagcggcct ttaactccct gcaagcctca gcgaccgaat atatcggtta 1440

tgcgtgggcg atggttgttg tcattgtcgg cgcaactatc ggtatcaagc tgtttaagaa 1500

attcacctcg aaagcaagct gataaaccga tacaattaaa ggctcctttt ggagcctttt 1560

ttttggagat tttcaacgtg aaaaaattat tattcgcaat tcctttagtt gttcctttct 1620

attctcactc cgctgaaact gttgaaagtt gtttagcaaa atcccataca gaaaattcat 1680

ttactaacgt ctggaaagac gacaaaactt tagatcgtta cgctaactat gagggctgtc 1740

tgtggaatgc tacaggcgtt gtagtttgta ctggtgacga aactcagtgt tacggtacat 1800

gggttcctat tgggcttgct atccctgaaa atgagggtgg tggctctgag ggtggcggtt 1860

ctgagggtgg cggttctgag ggtggcggta ctaaacctcc tgagtacggt gatacaccta 1920

ttccgggcta tacttatatc aaccctctcg acggcactta tccgcctggt actgagcaaa 1980

accccgctaa tcctaatcct tctcttgagg agtctcagcc tcttaatact ttcatgtttc 2040

agaataatag gttccgaaat aggcaggggg cattaactgt ttatacgggc actgttactc 2100

aaggcactga ccccgttaaa acttattacc agtacactcc tgtatcatca aaagccatgt 2160

atgacgctta ctggaacggt aaattcagag actgcgcttt ccattctggc tttaatgagg 2220

atttatttgt ttgtgaatat caaggccaat cgtctgacct gcctcaacct cctgtcaatg 2280

ctggcggcgg ctctggtggt ggttctggtg gcggctctga gggtggtggc tctgagggtg 2340

gcggttctga gggtggcggc tctgagggag gcggttccgg tggtggctct ggttccggtg 2400

attttgatta tgaaaagatg gcaaacgcta ataagggggc tatgaccgaa aatgccgatg 2460

aaaacgcgct acagtctgac gctaaaggca aacttgattc tgtcgctact gattacggtg 2520

ctgctatcga tggtttcatt ggtgacgttt ccggccttgc taatggtaat ggtgctactg 2580

gtgattttgc tggctctaat tcccaaatgg ctcaagtcgg tgacggtgat aattcacctt 2640

taatgaataa tttccgtcaa tatttacctt ccctccctca atcggttgaa tgtcgccctt 2700

ttgtctttgg cgctggtaaa ccatatgaat tttctattga ttgtgacaaa ataaacttat 2760

tccgtggtgt ctttgcgttt cttttatatg ttgccacctt tatgtatgta ttttctacgt 2820

ttgctaacat actgcgtaat aaggagtctt aatcatgcca gttcttttgg gtattccgtt 2880

attattgcgt ttcctcggtt tccttctggt aactttgttc ggctatctgc ttacttttct 2940

taaaaagggc ttcggtaaga tagctattgc tatttcattg tttcttgctc ttattattgg 3000

gcttaactca attcttgtgg gttatctctc tgatattagc gctcaattac cctctgactt 3060

tgttcagggt gttcagttaa ttctcccgtc taatgcgctt ccctgttttt atgttattct 3120

ctctgtaaag gctgctattt tcatttttga cgttaaacaa aaaatcgttt cttatttgga 3180

ttgggataaa taatatggct gtttattttg taactggcaa attaggctct ggaaagacgc 3240

tcgttagcgt tggtaagatt caggataaaa ttgtagctgg gtgcaaaata gcaactaatc 3300

ttgatttaag gcttcaaaac ctcccgcaag tcgggaggtt cgctaaaacg cctcgcgttc 3360

ttagaatacc ggataagcct tctatatctg atttgcttgc tattgggcgc ggtaatgatt 3420

cctacgatga aaataaaaac ggcttgcttg ttctcgatga gtgcggtact tggtttaata 3480

cccgttcttg gaatgataag gaaagacagc cgattattga ttggtttcta catgctcgta 3540

aattaggatg ggatattatt tttcttgttc aggacttatc tattgttgat aaacaggcgc 3600

gttctgcatt agctgaacat gttgtttatt gtcgtcgtct ggacagaatt actttacctt 3660

ttgtcggtac tttatattct cttattactg gctcgaaaat gcctctgcct aaattacatg 3720

ttggcgttgt taaatatggc gattctcaat taagccctac tgttgagcgt tggctttata 3780

ctggtaagaa tttgtataac gcatatgata ctaaacaggc tttttctagt aattatgatt 3840

ccggtgttta ttcttattta acgccttatt tatcacacgg tcggtatttc aaaccattaa 3900

atttaggtca gaagatgaaa ttaactaaaa tatatttgaa aaagttttct cgcgttcttt 3960

gtcttgcgat tggatttgca tcagcattta catatagtta tataacccaa cctaagccgg 4020

aggttaaaaa ggtagtctct cagacctatg attttgataa attcactatt gactcttctc 4080

agcgtcttaa tctaagctat cgctatgttt tcaaggattc taagggaaaa ttaattaata 4140

gcgacgattt acagaagcaa ggttattcac tcacatatat tgatttatgt actgtttcca 4200

ttaaaaaagg taattcaaat gaaattgtta aatgtaatta attttgtttt cttgatgttt 4260

gtttcatcat cttcttttgc tcaggtaatt gaaatgaata attcgcctct gcgcgatttt 4320

gtaacttggt attcaaagca atcaggcgaa tccgttattg tttctcccga tgtaaaaggt 4380

actgttactg tatattcatc tgacgttaaa cctgaaaatc tacgcaattt ctttatttct 4440

gttttacgtg caaataattt tgatatggta ggttctaacc cttccattat tcagaagtat 4500

aatccaaaca atcaggatta tattgatgaa ttgccatcat ctgataatca ggaatatgat 4560

gataattccg ctccttctgg tggtttcttt gttccgcaaa atgataatgt tactcaaact 4620

tttaaaatta ataacgttcg ggcaaaggat ttaatacgag ttgtcgaatt gtttgtaaag 4680

tctaatactt ctaaatcctc aaatgtatta tctattgacg gctctaatct attagttgtt 4740

agtgctccta aagatatttt agataacctt cctcaattcc tttcaactgt tgatttgcca 4800

actgaccaga tattgattga gggtttgata tttgaggttc agcaaggtga tgctttagat 4860

ttttcatttg ctgctggctc tcagcgtggc actgttgcag gcggtgttaa tactgaccgc 4920

ctcacctctg ttttatcttc tgctggtggt tcgttcggta tttttaatgg cgatgtttta 4980

gggctatcag ttcgcgcatt aaagactaat agccattcaa aaatattgtc tgtgccacgt 5040

attcttacgc tttcaggtca gaagggttct atctctgttg gccagaatgt cccttttatt 5100

actggtcgtg tgactggtga atctgccaat gtaaataatc catttcagac gattgagcgt 5160

caaaatgtag gtatttccat gagcgttttt cctgttgcaa tggctggcgg taatattgtt 5220

ctggatatta ccagcaaggc cgatagtttg agttcttcta ctcaggcaag tgatgttatt 5280

actaatcaaa gaagtattgc tacaacggtt aatttgcgtg atggacagac tcttttactc 5340

ggtggcctca ctgattataa aaacacttct caggattctg gcgtaccgtt cctgtctaaa 5400

atccctttaa tcggcctcct gtttagctcc cgctctgatt ctaacgagga aagcacgtta 5460

tacgtgctcg tcaaagcaac catagtacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg 5520

tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt 5580

cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg 5640

ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga 5700

tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac 5760

gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc 5820

tatctcgggc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggaac caccatcaaa 5880

caggattttc gcctgctggg gcaaaccagc gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc 5940

caggcggtga agggcaatca gctgttgccc gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg 6000

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 6060

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 6120

cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 6180

tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg aattcgagct 6240

cggtacccgg ggatcctcaa ctgtgaggag gctcacggac gcgaagaaca ggcacgcgtg 6300

ctggcagaaa cccccggtat gaccgtgaaa acggcccgcc gcattctggc cgcagcacca 6360

cagagtgcac aggcgcgcag tgacactgcg ctggatcgtc tgatgcaggg ggcaccggca 6420

ccgctggctg caggtaaccc ggcatctgat gccgttaacg atttgctgaa cacaccagtg 6480

taagggatgt ttatgacgag caaagaaacc tttacccatt accagccgca gggcaacagt 6540

gacccggctc ataccgcaac cgcgcccggc ggattgagtg cgaaagcgcc tgcaatgacc 6600

ccgctgatgc tggacacctc cagccgtaag ctggttgcgt gggatggcac caccgacggt 6660

gctgccgttg gcattcttgc ggttgctgct gaccagacca gcaccacgct gacgttctac 6720

aagtccggca cgttccgtta tgaggatgtg ctctggccgg aggctgccag cgacgagacg 6780

aaaaaacgga ccgcgtttgc cggaacggca atcagcatcg tttaacttta cccttcatca 6840

ctaaaggccg cctgtgcggc tttttttacg ggattttttt atgtcgatgt acacaaccgc 6900

ccaactgctg gcggcaaatg agcagaaatt taagtttgat ccgctgtttc tgcgtctctt 6960

tttccgtgag agctatccct tcaccacgga gaaagtctat ctctcacaaa ttccgggact 7020

ggtaaacatg gcgctgtacg tttcgccgat tgtttccggt gaggttatcc gttcccgtgg 7080

cggctccacc tctgaaagct tggcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa 7140

ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa 7200

tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg 7260

gcgctttgcc tggtttccgg caccagaagc ggtgccggaa agctggctgg agtgcgatct 7320

tcctgaggcc gatactgtcg tcgtcccctc aaactggcag atgcacggtt acgatgcgcc 7380

catctacacc aacgtgacct atcccattac ggtcaatccg ccgtttgttc ccacggagaa 7440

tccgacgggt tgttactcgc tcacatttaa tgttgatgaa agctggctac aggaaggcca 7500

gacgcgaatt atttttgatg gcgttcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa 7560

tttaatgcga attttaacaa aatattaacg tttacaattt aaatatttgc ttatacaatc 7620

ttcctgtttt tggggctttt ctgattatca accggggtac atatgattga catgctagtt 7680

ttacgattac cgttcatcga ttctcttgtt tgctccagac tctcaggcaa tgacctgata 7740

gcctttgtag atctctcaaa aatagctacc ctctccggca ttaatttatc agctagaacg 7800

gttgaatatc atattgatgg tgatttgact gtctccggcc tttctcaccc ttttgaatct 7860

ttacctacac attactcagg cattgcattt aaaatatatg agggttctaa aaatttttat 7920

ccttgcgttg aaataaaggc ttctcccgca aaagtattac agggtcataa tgtttttggt 7980

acaaccgatt tagctttatg ctctgaggct ttattgctta attttgctaa ttctttgcct 8040

tgcctgtatg atttattgga tgtt 8064

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 2

gttggtgtcc tcatgcagca ccgtcggtag tttgaggcat ca 42

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 3

gagcacatag atggataaat taatgccgga gagggaggtc ac 42

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 4

caagaatgcc aacgaacgga acgtgccgat gggattagct at 42

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 5

tcgcaaatgg ggcgctcatc tttgacccaa cggagtaaac ag 42

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 6

attctaccta gctggcgcat cgtaaccggc agccttccca cg 42

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 7

aatacacctg ataattgaat ccccctcaag aagcaataca tt 42

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 8

tcatcgctaa aacacgagct gaaaaggtcc attagaagcg ga 42

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 9

ttcagaattt accctgacta ttatagtcaa tgcttatttg ta 42

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 10

ttgcatcata ttcaattgtg tcgaaatcga aagaggcaaa ag 42

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 11

aaccgtttaa tagtgaacga gtagatttgg tgccaccggc ca 42

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 12

tgaggggcgt ttttctggag gtgtccagcc atataatcat ac 42

<210> 13

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 13

cgcggtcacg acgacagtca aatcaccatc aatatgccag tt 42

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 14

caaccagctt acggtcgtct cgtcgctgtg catctgatat tc 42

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 15

attctgcagt agcacaccaa cctaaaaccg cgacccggaa tc 42

<210> 16

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 16

aggcaagccg gagacagtat cggcctcagc cgttcggggt ca 42

<210> 17

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 17

tgccacttag ccggactgga tagcgtccga aagacattcc ca 42

<210> 18

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 18

tgttactacg aaggttaaca tccaataaac agttgttcaa at 42

<210> 19

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 19

gtcataaaaa aagattaaga ggaagcccaa tactgtgctc ca 42

<210> 20

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 20

atcgcgttgt ttagaacgag gcgcagacgg taaaatacgt aa 42

<210> 21

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 21

agaaagggca aagactggaa gtttcattca tcagccggca aa 42

<210> 22

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 22

cagccagtaa agttgcactc aatccgcctt ttaaaagcct ca 42

<210> 23

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 23

tgaagggctt tccgaatgtg taggtaaaga ttcaacgcac tc 42

<210> 24

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 24

ttgcaggcgc tttcaaacga tgctgattgg aagataaggg tg 42

<210> 25

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 25

acggtgtatt agcagtttcc attaaacggg tcaatgggta at 42

<210> 26

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 26

gagcatacct gagtgcaccg cttctggtgc ggcctgttgc gg 42

<210> 27

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 27

tttttcaact gacccaaaag aagttttgaa ccagactaaa gt 42

<210> 28

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 28

gaaccgatga ggaaaaatta agcaataata tgcaaccgga ag 42

<210> 29

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 29

agtaaaattt aattcgagct tcaaagcgcc agaggcataa gg 42

<210> 30

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 30

caaactcgct tttgaacttt gaaagaggtg aggactaaag ac 42

<210> 31

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 31

tgcaatgaag ctaatgtagc tcaacatggg gcgcgttagt ga 42

<210> 32

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 32

aaagcgcccc gtaactgttg ccctgcggct tagagatgac cc 42

<210> 33

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 33

aaaaaatcat tcgcaatttt tagaaccctc atataaccag gc 42

<210> 34

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 34

tatgagccgg gtcaaaaaag ccgcacaggc cggaatttta aa 42

<210> 35

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 35

ataatgcatc ggttggctac agaggcttac agatgcaaaa ta 42

<210> 36

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 36

tgtaatagga taaacattca ggctgcgctg tacattgggt aa 42

<210> 37

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 37

acgagggcag gcgcttacca gacgacgata cctttgctga at 42

<210> 38

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 38

tacagactag caacgtacca aaaacattct taattaattg ct 42

<210> 39

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 39

gcgagagcaa caggtcagga ttagagagta aaaacaacgg tg 42

<210> 40

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 40

ccttttgccc tcgtataggc tggctgacaa gacagcatcg ga 42

<210> 41

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 41

aacgcaactt ttgctatttt gcggatggct ggtaacgaca ta 42

<210> 42

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 42

gcgatcgccg ccaggtcata aacatcccaa gcatatcata gt 42

<210> 43

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 43

tcatttggtg cgggtacaac gcctgtagca ttcctgggaa gg 42

<210> 44

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 44

aggtttcttt gctccagttg ggcggttgaa ctgttttatt tc 42

<210> 45

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 45

gggtgccggg agaaaccctc agcagcgact tcatccaaca ct 42

<210> 46

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 46

tagcgtatac aaaccctctt cgctattaac ttaaaggtgt gt 42

<210> 47

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 47

tttgcggcaa gaacaattac gaggcatact aactcaagcc tg 42

<210> 48

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 48

atcttgagat cgtcgccaca gacagcccaa gtgtaacatt aa 42

<210> 49

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 49

atcataaata agaggtcata tgagtgaggt aagagaagag ta 42

<210> 50

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 50

ttgcgttcaa aaggcggata ttcattacag ttaaaggccg ct 42

<210> 51

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 51

tcaccagacg atctaacata cgagccggtt acacttttct gc 42

<210> 52

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 52

agggggagac gcagacggca tcagatgcaa attgtacgtt ag 42

<210> 53

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 53

aaaaagatgt gctgaaccca tgtaccgtaa cactgtggcg aa 42

<210> 54

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 54

tcagcaaatc gttaaaacag cggatcaacg ccagcagttt cg 42

<210> 55

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 55

tccacacaaa gttttgaggc ttgcagggcc aaatccagat ac 42

<210> 56

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 56

taaatgacaa taggcaaggc gattaagtga tagctcctgc ag 42

<210> 57

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 57

atatattgct cattgaatac cacattcagt cgggatcaca at 42

<210> 58

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 58

caaagctcgg tcgctgtcgt ctttccagta tccgcaacct gt 42

<210> 59

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 59

ataacgcgcg ctcactgccc gctttccaac taatgaacgt aa 42

<210> 60

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 60

cgtgccagat ttagcagtga ataaggctcc cacgcataac cg 42

<210> 61

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 61

gcaagccatt ttctctgttt cctgtgtgcg ggttactcac gg 42

<210> 62

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 62

gttttccaga ctttgccccc tgcatcagga gctcgctttc aa 42

<210> 63

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 63

gagagatcag tcacagagcc accaccctca ttttccgcca gg 42

<210> 64

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 64

ccagcggtgc cggtctccgt ggtgaaggtg ggtaaaggga ta 42

<210> 65

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 65

gtcataggta tggggacaac aaccatcgtg ccctggattc at 42

<210> 66

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 66

cagtttccac cctcgacgtt gtaaaacggt cccggagcgc ag 42

<210> 67

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 67

gttgcgcaac gagtcaacat tattacagac gcgcgaatca tg 42

<210> 68

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 68

acaccagcga caatattttg ctaaacaaaa ttcgtgggag ag 42

<210> 69

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 69

cagttgagct gcattaatga atcggccagt agaaaacgag aa 42

<210> 70

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 70

gcggtttaac ggaaagtaaa ttgggcttgc ttgataccga ta 42

<210> 71

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 71

gaaccgcagc ggaggatccc cgggtaccac gatccaattt gt 42

<210> 72

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 72

gctttcacgt acagtgtgca ctctgtggcg cgtccaaagg aa 42

<210> 73

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 73

ggcgaaagag gtggaccgcc accctcagaa ccgccgtgcc aa 42

<210> 74

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 74

tgtcactgcg cgcccgccat gtttaccaac ggccaaccct ca 42

<210> 75

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 75

agttgagtga gaatgaattt cttaaacaga gatggtaata aa 42

<210> 76

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 76

ttgcgaagtt tagtagccgc cacgggaaca ccggagccag aa 42

<210> 77

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 77

cttgctttaa tcatgttggg aagaaaaatt tttcttcctc ac 42

<210> 78

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 78

tcaactttcg aggtagaaag gaacaactgt gagcctttca cc 42

<210> 79

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 79

acgaactgcg tattgggcgc cagggtggtc tacgttttaa tt 42

<210> 80

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 80

agtgagatca ggactgtgaa ttaccttata tcggtttatc ag 42

<210> 81

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 81

tcaggagtaa taatgcgtgc ctgttctttg ctgcgaacaa tc 42

<210> 82

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 82

atatcaaaaa gcatttcacg gtcggagcta aagataaaca aa 42

<210> 83

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 83

aaaatctacc ctcaatagcc cggaataggt gtatcacctc aa 42

<210> 84

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 84

tgcggcgggc cgttcacctt gctaacctcg gatgaaccgt ac 42

<210> 85

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 85

ccagcacttt ttcaggagcc tttaattgtg cgattgctca tt 42

<210> 86

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 86

caaataatat aagtatcaat atctggtccc agcagttaga gc 42

<210> 87

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 87

aaaaggctca gagagtcaga gggtaatttc accgcgtttc tg 42

<210> 88

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 88

gctaatatcc aaaacgttga aaatctccac cggggctggc cc 42

<210> 89

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 89

ataccagcgg gcaacagctg attgccctga aactgttaag gc 42

<210> 90

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 90

tgagagagaa caaagataac ccacaagagc cttgatattc aa 42

<210> 91

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 91

gggttgaatc ctcactaaat cggaaccccc ccgatcaaat ga 42

<210> 92

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 92

cagttgagca acagcggcga acgtggcgtt ttttgcagtc tc 42

<210> 93

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 93

accgcctaag gaatagtacc aggcggataa gtgccaaatc aa 42

<210> 94

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 94

ttgacgggga aagctgccac gctgagagag ttggcgtcga ga 42

<210> 95

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 95

taaagcatta aagcaggtca gacgattgat tgagttaact ga 42

<210> 96

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 96

tgaatttttt gctctgagga aggttatccg gtcagaaggg aa 42

<210> 97

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 97

caggaggaga gcaaaagcgc attagacgtg gtttgggtgc cg 42

<210> 98

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 98

aataatattg aggccagaat ggaaagcggg gtcgacccca gc 42

<210> 99

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 99

acaccctgtt gcagcaagcg gtccacgcgg agaattaagc cc 42

<210> 100

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 100

aggcgaaaac aggggaaaca atgaaatagc cgccagcatt ga 42

<210> 101

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 101

gcggggtacc gttctcaccc aaatcaagag aaaggtatta ac 42

<210> 102

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 102

gagcactgaa gatacgggcg ctagggcgtc agggctttga tg 42

<210> 103

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 103

accagcaaac aactagactc ctcaagagaa ggatttcttt ag 42

<210> 104

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 104

gaaagcgaaa ggagaaacag aggtgaggta aaataaggat ta 42

<210> 105

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 105

tgaaccacag taagccacca ccagagccgc aataggagaa ta 42

<210> 106

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 106

atacagggag gctgaataga ttagagccat accgagtgta gc 42

<210> 107

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 107

agccgccccc ttttgaaaat agcagcctcg aaatccacta cg 42

<210> 108

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 108

accgaagacc agaacgtcat acatggctga tggccggcaa aa 42

<210> 109

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 109

acataaaaat cctgtttgat ggtggttctt acagactatc tt 42

<210> 110

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 110

tcccttacaa aaattaagaa aagtaagcgc caccaccctc ag 42

<210> 111

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 111

gtattaaagt gtaccgaaaa accgtctact ggcaaacgaa cc 42

<210> 112

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 112

catttgacct aaaataacca ccacacccaa agaactcagt gc 42

<210> 113

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 113

tgatagcgga tttatcggaa cctattattc tgaaagataa ta 42

<210> 114

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 114

ggtcacgctg cgcgcatcgc cattaaaagt caatacatga aa 42

<210> 115

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 115

caaagggtgg taatccgcca ccctcagaag atagcttttt gt 42

<210> 116

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 116

cttgagtgcc tattgaagta ttagactttt taatgttaat gc 42

<210> 117

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 117

cgccaccaga aggaccaatc caaataagga tagggccaac gt 42

<210> 118

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 118

agttaccctc agaaaagttt taacgggggt ggactttgag tg 42

<210> 119

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 119

ttaacgttaa atcaaaagaa tagcccgaaa acgatcgaac aa 42

<210> 120

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 120

ttgttccatt tatcaaccga ggaaacgcgc ctccctcaga gc 42

<210> 121

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 121

gccccctaac agtgcggagt ccactattgc cgcgccgcga ac 42

<210> 122

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 122

caactcgatt tttgcgtact atggttgcca acatgataaa tc 42

<210> 123

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 123

agacaattat taaatttgaa ttaccttttt taaacaattc ga 42

<210> 124

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 124

gccgctacag ggcgaatggc tattagtcta caaacagtta at 42

<210> 125

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 125

gcattttccc gtatccacca ccggaaccaa taatataaac ag 42

<210> 126

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 126

aatatataat ttcatccttt gcccgaacag aatacagcac gt 42

<210> 127

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 127

caccggaaga actgcctaat ttgccagtta agagaggcag ag 42

<210> 128

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 128

acccaaaacc agagaatgga aacagtacta atttaatata aa 42

<210> 129

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 129

ccatattagt ttggaacaaa gccagtaata caaaaacgga at 42

<210> 130

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 130

gtaccgatcc agaggcatga ttaagacttt cataatcaaa at 42

<210> 131

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 131

atttaacgtg agtgatattt aacaacgctt tgacggtggc ac 42

<210> 132

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 132

aagtttgccc ttcttcgtta gaatcagaca acagtcgtcg ct 42

<210> 133

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 133

gatagaaagt aacacaaaca tcaagaaaac aaaatatttt aa 42

<210> 134

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 134

ataacgtgct ttccgacctg aaagcgtagt tattataatt ac 42

<210> 135

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 135

aatcgccaat aaccgcgttt gccatcttcc ttattctaac ga 42

<210> 136

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 136

attaattgat gaaattatca ttttgcggtt ctggcctaaa ca 42

<210> 137

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 137

tagcccccaa acgtttatcc tgaatcttcc agacgaattg ag 42

<210> 138

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 138

atgttagctt attattgctt ctgtaaatag ggcttacgac aa 42

<210> 139

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 139

gcgtcttcaa aaggtaaagt aattctgtac caacgacgca gt 42

<210> 140

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 140

taaacaatac aattagaaaa tacatacagg cattttcggt ca 42

<210> 141

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 141

agaagataat tttcataaag ccaacgctgc gggagcaaca ga 42

<210> 142

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 142

cagaaggcga ccaggggatt ttagacagca tatgcagcga ta 42

<210> 143

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 143

agtcacaagc ggaaaattat tcatttcaat tacctaaacc ac 42

<210> 144

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 144

ggaggccgat taaataataa aagggacaaa caaaggagca aa 42

<210> 145

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 145

taccagtcct tagaagcgcg ttttcatcta aaggtatttt gc 42

<210> 146

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 146

gcttagaaga ggcgttatca tcatattctt ggcagacgcc ag 42

<210> 147

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 147

tagcgtcgaa acgccttaaa tcaagattgc gcctgaaatt ct 42

<210> 148

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 148

tataaaaaga ctgtatcctt gaaaacatgt tatactttat ca 42

<210> 149

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 149

acccagccat gttcagctaa tgcagaacag ttgctggcaa ca 42

<210> 150

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 150

acaatagttg aagcaaagac accacggaat caagtttgcc tt 42

<210> 151

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 151

atcgcgctta agacagcctg tttagtatga acggtattca cc 42

<210> 152

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 152

atggcaagtc tgaattttta taatcagtaa acaccattta tc 42

<210> 153

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 153

ctcaatcttc atcactgatt gctttgaata ccaagtcaga tg 42

<210> 154

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 154

aatcctgaga agtgatggat tatttacact gattattaca aa 42

<210> 155

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 155

tagaaaagct gagatcagta gcgacagaat aagttacttg cg 42

<210> 156

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 156

aaaatcagat tcgcatataa tcctgattcc tacatccgag ta 42

<210> 157

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 157

tagcagccaa tagaggcgtt ttagcgaata atatctaatt ac 42

<210> 158

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 158

tcacaatacc gtaaagagtc aatagtgagg aatcaccatc ct 42

<210> 159

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 159

ggaggttata agtcctgaac aagaaaaacc tcccgtattt tg 42

<210> 160

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 160

aatttacaac gcgaaaattc atatggttaa tgaaaccatc ga 42

<210> 161

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 161

aataacgtag gtctcgttaa ataagaatga ggccatttga cg 42

<210> 162

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 162

tctgaatgga aaaatcacgc aaattaactg aaataccggc tt 42

<210> 163

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 163

tgcaacaaat ggaataacag taccttttac atcggttata ct 42

<210> 164

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 164

aaagagtctg tccacgctca tggaaatagt ttggagagaa ac 42

<210> 165

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 165

aataagggag agacccggaa acgtcaccta ccagctccgg ta 42

<210> 166

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 166

aggttggtat acaggggtta gaacctactt accgcgcaat ac 42

<210> 167

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 167

taccattggc gacaaaatca gatatagata atcggtgtga ta 42

<210> 168

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 168

acaaaagagc aaggtacctt tttaacctcc gaccgctgtc tt 42

<210> 169

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 169

ttctaaggag catgtagaaa ccaatcaaag gcttagccaa ag 42

<210> 170

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 170

tccttatagc aagcttcaac cgattgagac cagtagcacc at 42

<210> 171

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 171

agatgaagtt atattaaatt tagaacgggt attaaggaat ca 42

<210> 172

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 172

ttttgaggcg agtagcggat tgaccgtaga cttgtgcaac cg 42

<210> 173

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 173

ttctttgtct gaccaactat agagccagca aaatcggagg ga 42

<210> 174

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 174

ttcatctatt agtatatcca gaacaataca tatcataacg tc 42

<210> 175

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 175

aggtaaatat tgacggaatt atgtaaatgc tgatgagtta at 42

<210> 176

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> staple

<400> 176

ttaccgcgcc caatcattcc aaatggttcg ttgtacagcc at 42

<210> 177

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 177

tcctccatcc cttccb 16

<210> 178

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 178

tcctccatcc cttccttdgn 20

<210> 179

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 179

tgcaatgaag ctaatgtagc tcaacatggg gcgcgttagt gattggaagg gatggagga 59

<210> 180

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 180

aaaaaatcat tcgcaatttt tagaaccctc atataaccag gcttggaagg gatggagga 59

<210> 181

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 181

tatgagccgg gtcaaaaaag ccgcacaggc cggaatttta aattggaagg gatggagga 59

<210> 182

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 182

ataatgcatc ggttggctac agaggcttac agatgcaaaa tattggaagg gatggagga 59

<210> 183

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 183

tgtaatagga taaacattca ggctgcgctg tacattgggt aattggaagg gatggagga 59

<210> 184

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 184

tacagactag caacgtacca aaaacattct taattaattg ctttggaagg gatggagga 59

<210> 185

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 185

gcgagagcaa caggtcagga ttagagagta aaaacaacgg tgttggaagg gatggagga 59

<210> 186

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 186

ccttttgccc tcgtataggc tggctgacaa gacagcatcg gattggaagg gatggagga 59

<210> 187

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 187

atttaacgtg agtgatattt aacaacgctt tgacggtggc acttggaagg gatggagga 59

<210> 188

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 188

gatagaaagt aacacaaaca tcaagaaaac aaaatatttt aattggaagg gatggagga 59

<210> 189

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 189

ataacgtgct ttccgacctg aaagcgtagt tattataatt acttggaagg gatggagga 59

<210> 190

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 190

aatcgccaat aaccgcgttt gccatcttcc ttattctaac gattggaagg gatggagga 59

<210> 191

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 191

attaattgat gaaattatca ttttgcggtt ctggcctaaa cattggaagg gatggagga 59

<210> 192

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 192

atgttagctt attattgctt ctgtaaatag ggcttacgac aattggaagg gatggagga 59

<210> 193

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 193

gcgtcttcaa aaggtaaagt aattctgtac caacgacgca gtttggaagg gatggagga 59

<210> 194

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 194

taaacaatac aattagaaaa tacatacagg cattttcggt cattggaagg gatggagga 59

<210> 195

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 195

tagtggagat aatggattgg an 22

<210> 196

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 196

tagtggagat aatggattgg attn 24

<210> 197

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 197

tagtggagat aatggattgg an 22

<210> 198

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 198

agaaagggca aagactggaa gtttcattca tcagccggca aaccaatcca ttatctccac 60

ta 62

<210> 199

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 199

cagccagtaa agttgcactc aatccgcctt ttaaaagcct caccaatcca ttatctccac 60

ta 62

<210> 200

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 200

tgaagggctt tccgaatgtg taggtaaaga ttcaacgcac tcccaatcca ttatctccac 60

ta 62

<210> 201

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 201

ttgcaggcgc tttcaaacga tgctgattgg aagataaggg tgccaatcca ttatctccac 60

ta 62

<210> 202

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 202

tttttcaact gacccaaaag aagttttgaa ccagactaaa gtccaatcca ttatctccac 60

ta 62

<210> 203

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 203

gaaccgatga ggaaaaatta agcaataata tgcaaccgga agccaatcca ttatctccac 60

ta 62

<210> 204

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 204

agtaaaattt aattcgagct tcaaagcgcc agaggcataa ggccaatcca ttatctccac 60

ta 62

<210> 205

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 205

caaactcgct tttgaacttt gaaagaggtg aggactaaag acccaatcca ttatctccac 60

ta 62

<210> 206

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 206

tcaggagtaa taatgcgtgc ctgttctttg ctgcgaacaa tcccaatcca ttatctccac 60

ta 62

<210> 207

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 207

aaaatctacc ctcaatagcc cggaataggt gtatcacctc aaccaatcca ttatctccac 60

ta 62

<210> 208

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 208

tgcggcgggc cgttcacctt gctaacctcg gatgaaccgt acccaatcca ttatctccac 60

ta 62

<210> 209

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 209

ccagcacttt ttcaggagcc tttaattgtg cgattgctca ttccaatcca ttatctccac 60

ta 62

<210> 210

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 210

caaataatat aagtatcaat atctggtccc agcagttaga gcccaatcca ttatctccac 60

ta 62

<210> 211

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 211

gctaatatcc aaaacgttga aaatctccac cggggctggc ccccaatcca ttatctccac 60

ta 62

<210> 212

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 212

ataccagcgg gcaacagctg attgccctga aactgttaag gcccaatcca ttatctccac 60

ta 62

<210> 213

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 213

tgagagagaa caaagataac ccacaagagc cttgatattc aaccaatcca ttatctccac 60

ta 62

<210> 214

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 214

agaagataat tttcataaag ccaacgctgc gggagcaaca gaccaatcca ttatctccac 60

ta 62

<210> 215

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 215

cagaaggcga ccaggggatt ttagacagca tatgcagcga taccaatcca ttatctccac 60

ta 62

<210> 216

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 216

agtcacaagc ggaaaattat tcatttcaat tacctaaacc acccaatcca ttatctccac 60

ta 62

<210> 217

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 217

ggaggccgat taaataataa aagggacaaa caaaggagca aaccaatcca ttatctccac 60

ta 62

<210> 218

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 218

tagcgtcgaa acgccttaaa tcaagattgc gcctgaaatt ctccaatcca ttatctccac 60

ta 62

<210> 219

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 219

tataaaaaga ctgtatcctt gaaaacatgt tatactttat caccaatcca ttatctccac 60

ta 62

<210> 220

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 220

acccagccat gttcagctaa tgcagaacag ttgctggcaa caccaatcca ttatctccac 60

ta 62

<210> 221

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 221

acaatagttg aagcaaagac accacggaat caagtttgcc ttccaatcca ttatctccac 60

ta 62

<210> 222

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 222

agtggtagtg attgagtgag attn 24

<210> 223

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 223

tcaggagtaa taatgcgtgc ctgttctttg ctgcgaacaa tcctcactca atcactacca 60

ct 62

<210> 224

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 224

aaaatctacc ctcaatagcc cggaataggt gtatcacctc aactcactca atcactacca 60

ct 62

<210> 225

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 225

tgcggcgggc cgttcacctt gctaacctcg gatgaaccgt acctcactca atcactacca 60

ct 62

<210> 226

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 226

ccagcacttt ttcaggagcc tttaattgtg cgattgctca ttctcactca atcactacca 60

ct 62

<210> 227

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 227

caaataatat aagtatcaat atctggtccc agcagttaga gcctcactca atcactacca 60

ct 62

<210> 228

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 228

gctaatatcc aaaacgttga aaatctccac cggggctggc ccctcactca atcactacca 60

ct 62

<210> 229

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 229

ataccagcgg gcaacagctg attgccctga aactgttaag gcctcactca atcactacca 60

ct 62

<210> 230

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> functional strand

<400> 230

tgagagagaa caaagataac ccacaagagc cttgatattc aactcactca atcactacca 60

ct 62

<210> 231

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 231

acaacccgtc ggattctttt 20

<210> 232

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 232

agaacgtcag cgtggttttt 20

<210> 233

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 233

tggtcaataa cctgtttttt 20

<210> 234

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 234

ccagcgatta taccaatttt 20

<210> 235

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 235

aacgagaatg accatatttt 20

<210> 236

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 236

tttttccgtg ggaacaaacg 20

<210> 237

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 237

ttttgctggt ctggtcagca 20

<210> 238

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 238

tttttagcta tattttcatt 20

<210> 239

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 239

ttttgcgcga aacaaagtac 20

<210> 240

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 240

ttttaatcaa aaatcaggtc 20

<210> 241

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 241

accaagtacc gcactcatcg agaacatttt 30

<210> 242

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 242

ggaaattatt cattaaaggt gaattatttt 30

<210> 243

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 243

caaatccaat cgcaagacaa agaacgtttt 30

<210> 244

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 244

ataacatcac ttgcctgagt agaagatttt 30

<210> 245

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 245

aaattatttg cacgtaaaac agaaattttt 30

<210> 246

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 246

ttttagcaag ccgtttttat tttcatcgta 30

<210> 247

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 247

tttttcaccg tcaccgactt gagccatttg 30

<210> 248

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 248

ttttcgagaa aactttttca aatatatttt 30

<210> 249

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 249

ttttactcaa actatcggcc ttgctggtaa 30

<210> 250

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 250

ttttaaagaa attgcgtaga ttttcaggtt 30

<210> 251

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 251

accaagtacc gcactcatcg agaacattgt acatagg 37

<210> 252

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 252

ggaaattatt cattaaaggt gaattattag gtcgtac 37

<210> 253

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 253

caaatccaat cgcaagacaa agaacgatgc aataggt 37

<210> 254

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 254

ataacatcac ttgcctgagt agaagaggtg agattga 37

<210> 255

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 255

aaattatttg cacgtaaaac agaaatacaa gaaactt 37

<210> 256

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 256

agattggaat cagcaagccg tttttatttt catcgta 37

<210> 257

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 257

gatggtgtaa ttcaccgtca ccgacttgag ccatttg 37

<210> 258

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 258

tttatgctgc acgagaaaac tttttcaaat atatttt 37

<210> 259

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 259

gctaaccaag gactcaaact atcggccttg ctggtaa 37

<210> 260

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 260

gaagctcata gaaagaaatt gcgtagattt tcaggtt 37

<210> 261

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 261

acaacccgtc ggattcccta tgtacaa 27

<210> 262

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 262

agaacgtcag cgtggtgtac gacctaa 27

<210> 263

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 263

tggtcaataa cctgttacct attgcat 27

<210> 264

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 264

ccagcgatta taccaatcaa tctcacc 27

<210> 265

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 265

aacgagaatg accataaagt ttcttgt 27

<210> 266

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 266

gattccaatc ttccgtggga acaaacg 27

<210> 267

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 267

attacaccat cgctggtctg gtcagca 27

<210> 268

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 268

tgcagcataa atagctatat tttcatt 27

<210> 269

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 269

ccttggttag cgcgcgaaac aaagtac 27

<210> 270

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 270

ctatgagctt caatcaaaaa tcaggtc 27

<210> 271

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 271

accaagtacc gcactcatcg agaacattct tacacta 37

<210> 272

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 272

ggaaattatt cattaaaggt gaattactat caataat 37

<210> 273

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 273

caaatccaat cgcaagacaa agaacgaagt cgtgcta 37

<210> 274

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 274

ataacatcac ttgcctgagt agaagaatcg tagttcg 37

<210> 275

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 275

aaattatttg cacgtaaaac agaaatattg gtggatt 37

<210> 276

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 276

cactgattgg tagcaagccg tttttatttt catcgta 37

<210> 277

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 277

gtctggttac gtcaccgtca ccgacttgag ccatttg 37

<210> 278

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 278

ctgaaggagc tcgagaaaac tttttcaaat atatttt 37

<210> 279

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 279

tgaacgtgga aactcaaact atcggccttg ctggtaa 37

<210> 280

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 280

cgtttaattc taaagaaatt gcgtagattt tcaggtt 37

<210> 281

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 281

acaacccgtc ggattctagt gtaagaa 27

<210> 282

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 282

agaacgtcag cgtggtatta ttgatag 27

<210> 283

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 283

tggtcaataa cctgtttagc acgactt 27

<210> 284

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 284

ccagcgatta taccaacgaa ctacgat 27

<210> 285

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 285

aacgagaatg accataaatc caccaat 27

<210> 286

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 286

accaatcagt gtccgtggga acaaacg 27

<210> 287

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 287

cgtaaccaga cgctggtctg gtcagca 27

<210> 288

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 288

agctccttca gtagctatat tttcatt 27

<210> 289

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 289

ttccacgttc agcgcgaaac aaagtac 27

<210> 290

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 290

agaattaaac gaatcaaaaa tcaggtc 27

<210> 291

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 291

accaagtacc gcactcatcg agaacacgtg tccttat 37

<210> 292

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 292

ggaaattatt cattaaaggt gaattacagc atcttgc 37

<210> 293

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 293

caaatccaat cgcaagacaa agaacgggat aagtcct 37

<210> 294

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 294

ataacatcac ttgcctgagt agaagacacg tgctgct 37

<210> 295

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 295

aaattatttg cacgtaaaac agaaatgtgg tggtcta 37

<210> 296

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 296

gtcctgctac aagcaagccg tttttatttt catcgta 37

<210> 297

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 297

ggaacaggtc ttcaccgtca ccgacttgag ccatttg 37

<210> 298

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 298

gttatctcat tcgagaaaac tttttcaaat atatttt 37

<210> 299

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 299

ctgctcctag aactcaaact atcggccttg ctggtaa 37

<210> 300

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 300

ggtcagctgg aaaagaaatt gcgtagattt tcaggtt 37

<210> 301

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 301

acaacccgtc ggattcataa ggacacg 27

<210> 302

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 302

agaacgtcag cgtggtgcaa gatgctg 27

<210> 303

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 303

tggtcaataa cctgttagga cttatcc 27

<210> 304

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 304

ccagcgatta taccaaagca gcacgtg 27

<210> 305

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 305

aacgagaatg accatataga ccaccac 27

<210> 306

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 306

tgtagcagga ctccgtggga acaaacg 27

<210> 307

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 307

agacctgttc cgctggtctg gtcagca 27

<210> 308

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 308

aatgagataa ctagctatat tttcatt 27

<210> 309

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 309

tctaggagca ggcgcgaaac aaagtac 27

<210> 310

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 310

tccagctgac caatcaaaaa tcaggtc 27

<210> 311

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 311

accaagtacc gcactcatcg agaacacatt ccttcga 37

<210> 312

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 312

ggaaattatt cattaaaggt gaattatgtc gacgaga 37

<210> 313

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 313

caaatccaat cgcaagacaa agaacgctga gctggtt 37

<210> 314

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 314

ataacatcac ttgcctgagt agaagaccta tcgtcgt 37

<210> 315

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 315

aaattatttg cacgtaaaac agaaatctct ggaggac 37

<210> 316

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 316

tccttgtcct gagcaagccg tttttatttt catcgta 37

<210> 317

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 317

acaagcattt atcaccgtca ccgacttgag ccatttg 37

<210> 318

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 318

gatcgaagtg tcgagaaaac tttttcaaat atatttt 37

<210> 319

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 319

cgtcctagca gactcaaact atcggccttg ctggtaa 37

<210> 320

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 320

gtcgtattgg taaagaaatt gcgtagattt tcaggtt 37

<210> 321

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 321

acaacccgtc ggattctcga aggaatg 27

<210> 322

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 322

agaacgtcag cgtggttctc gtcgaca 27

<210> 323

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 323

tggtcaataa cctgttaacc agctcag 27

<210> 324

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 324

ccagcgatta taccaaacga cgatagg 27

<210> 325

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 325

aacgagaatg accatagtcc tccagag 27

<210> 326

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 326

caggacaagg atccgtggga acaaacg 27

<210> 327

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 327

taaatgcttg tgctggtctg gtcagca 27

<210> 328

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 328

acacttcgat ctagctatat tttcatt 27

<210> 329

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 329

ctgctaggac ggcgcgaaac aaagtac 27

<210> 330

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 330

accaatacga caatcaaaaa tcaggtc 27

<210> 331

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 331

accaagtacc gcactcatcg agaacacagc tcttcgt 37

<210> 332

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 332

ggaaattatt cattaaaggt gaattaagac tttacgt 37

<210> 333

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 333

caaatccaat cgcaagacaa agaacggagc tttgcag 37

<210> 334

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 334

ataacatcac ttgcctgagt agaagatcaa gctgatc 37

<210> 335

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 335

aaattatttg cacgtaaaac agaaatgaag gttcaat 37

<210> 336

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 336

tcgtggtcac aagcaagccg tttttatttt catcgta 37

<210> 337

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 337

aatttataag ttcaccgtca ccgacttgag ccatttg 37

<210> 338

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 338

gagcatagag tcgagaaaac tttttcaaat atatttt 37

<210> 339

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 339

gagcacagct gactcaaact atcggccttg ctggtaa 37

<210> 340

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 340

gcacgagatt caaagaaatt gcgtagattt tcaggtt 37

<210> 341

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 341

acaacccgtc ggattcacga agagctg 27

<210> 342

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 342

agaacgtcag cgtggtacgt aaagtct 27

<210> 343

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 343

tggtcaataa cctgttctgc aaagctc 27

<210> 344

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 344

ccagcgatta taccaagatc agcttga 27

<210> 345

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 345

aacgagaatg accataattg aaccttc 27

<210> 346

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 346

tgtgaccacg atccgtggga acaaacg 27

<210> 347

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 347

acttataaat tgctggtctg gtcagca 27

<210> 348

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 348

actctatgct ctagctatat tttcatt 27

<210> 349

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 349

cagctgtgct cgcgcgaaac aaagtac 27

<210> 350

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 350

gaatctcgtg caatcaaaaa tcaggtc 27

<210> 351

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 351

accaagtacc gcactcatcg agaacagcta agaagtc 37

<210> 352

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 352

ggaaattatt cattaaaggt gaattagcag aaagctg 37

<210> 353

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 353

caaatccaat cgcaagacaa agaacgcgta acacaag 37

<210> 354

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 354

ataacatcac ttgcctgagt agaagatttc gtccaat 37

<210> 355

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 355

aaattatttg cacgtaaaac agaaatagtc gtcctgt 37

<210> 356

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 356

tacgtgaatt aagcaagccg tttttatttt catcgta 37

<210> 357

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 357

gattaaagct ttcaccgtca ccgacttgag ccatttg 37

<210> 358

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 358

tataagctag ccgagaaaac tttttcaaat atatttt 37

<210> 359

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 359

tgttctcagg aactcaaact atcggccttg ctggtaa 37

<210> 360

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 360

acctgtaagt aaaagaaatt gcgtagattt tcaggtt 37

<210> 361

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 361

acaacccgtc ggattcgact tcttagc 27

<210> 362

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 362

agaacgtcag cgtggtcagc tttctgc 27

<210> 363

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 363

tggtcaataa cctgttcttg tgttacg 27

<210> 364

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 364

ccagcgatta taccaaattg gacgaaa 27

<210> 365

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 365

aacgagaatg accataacag gacgact 27

<210> 366

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 366

taattcacgt atccgtggga acaaacg 27

<210> 367

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 367

aagctttaat cgctggtctg gtcagca 27

<210> 368

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 368

gctagcttat atagctatat tttcatt 27

<210> 369

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 369

tcctgagaac agcgcgaaac aaagtac 27

<210> 370

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 370

tacttacagg taatcaaaaa tcaggtc 27

<210> 371

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 371

accaagtacc gcactcatcg agaacaggtc ctgacag 37

<210> 372

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 372

ggaaattatt cattaaaggt gaattactca gctacct 37

<210> 373

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 373

caaatccaat cgcaagacaa agaacgggta agactta 37

<210> 374

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 374

ataacatcac ttgcctgagt agaagaaagg tgagtca 37

<210> 375

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 375

aaattatttg cacgtaaaac agaaatcgac gtagcaa 37

<210> 376

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 376

actctgctga cagcaagccg tttttatttt catcgta 37

<210> 377

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 377

ttagaaatgg ttcaccgtca ccgacttgag ccatttg 37

<210> 378

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 378

acgtgagagc tcgagaaaac tttttcaaat atatttt 37

<210> 379

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 379

gcttgctgaa gactcaaact atcggccttg ctggtaa 37

<210> 380

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 380

gaatgaaact caaagaaatt gcgtagattt tcaggtt 37

<210> 381

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 381

acaacccgtc ggattcctgt caggacc 27

<210> 382

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 382

agaacgtcag cgtggtaggt agctgag 27

<210> 383

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 383

tggtcaataa cctgtttaag tcttacc 27

<210> 384

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 384

ccagcgatta taccaatgac tcacctt 27

<210> 385

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 385

aacgagaatg accatattgc tacgtcg 27

<210> 386

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 386

gtcagcagag ttccgtggga acaaacg 27

<210> 387

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 387

accatttcta agctggtctg gtcagca 27

<210> 388

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 388

agctctcacg ttagctatat tttcatt 27

<210> 389

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 389

cttcagcaag cgcgcgaaac aaagtac 27

<210> 390

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 390

gagtttcatt caatcaaaaa tcaggtc 27

<210> 391

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 391

accaagtacc gcactcatcg agaacacctt tacttcc 37

<210> 392

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 392

ggaaattatt cattaaaggt gaattatatt gtactgg 37

<210> 393

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 393

caaatccaat cgcaagacaa agaacgcaag aggtgct 37

<210> 394

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 394

ataacatcac ttgcctgagt agaagacctc ctatatg 37

<210> 395

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 395

aaattatttg cacgtaaaac agaaattctc gttactt 37

<210> 396

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 396

ctctgagtcc tagcaagccg tttttatttt catcgta 37

<210> 397

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 397

agtcacaacg ttcaccgtca ccgacttgag ccatttg 37

<210> 398

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 398

tgctcacgac gcgagaaaac tttttcaaat atatttt 37

<210> 399

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 399

tttaccaatt tactcaaact atcggccttg ctggtaa 37

<210> 400

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 400

aggagaccat caaagaaatt gcgtagattt tcaggtt 37

<210> 401

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 401

acaacccgtc ggattcggaa gtaaagg 27

<210> 402

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 402

agaacgtcag cgtggtccag tacaata 27

<210> 403

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 403

tggtcaataa cctgttagca cctcttg 27

<210> 404

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 404

ccagcgatta taccaacata taggagg 27

<210> 405

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 405

aacgagaatg accataaagt aacgaga 27

<210> 406

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 406

aggactcaga gtccgtggga acaaacg 27

<210> 407

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 407

acgttgtgac tgctggtctg gtcagca 27

<210> 408

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 408

cgtcgtgagc atagctatat tttcatt 27

<210> 409

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 409

aaattggtaa agcgcgaaac aaagtac 27

<210> 410

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 410

gatggtctcc taatcaaaaa tcaggtc 27

<210> 411

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 411

accaagtacc gcactcatcg agaacactct tgataat 37

<210> 412

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 412

ggaaattatt cattaaaggt gaattaagga aatgagt 37

<210> 413

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 413

caaatccaat cgcaagacaa agaacgggtg cagtcac 37

<210> 414

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 414

ataacatcac ttgcctgagt agaagatacc acacgac 37

<210> 415

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 415

aaattatttg cacgtaaaac agaaatgctt acaacga 37

<210> 416

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 416

cctcactaaa gagcaagccg tttttatttt catcgta 37

<210> 417

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 417

caatggtact atcaccgtca ccgacttgag ccatttg 37

<210> 418

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 418

atgcaacgtc gcgagaaaac tttttcaaat atatttt 37

<210> 419

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 419

tagtgaatgt tactcaaact atcggccttg ctggtaa 37

<210> 420

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 420

gctcgtacag aaaagaaatt gcgtagattt tcaggtt 37

<210> 421

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 421

acaacccgtc ggattcatta tcaagag 27

<210> 422

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 422

agaacgtcag cgtggtactc atttcct 27

<210> 423

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 423

tggtcaataa cctgttgtga ctgcacc 27

<210> 424

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 424

ccagcgatta taccaagtcg tgtggta 27

<210> 425

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 425

aacgagaatg accatatcgt tgtaagc 27

<210> 426

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 426

ctttagtgag gtccgtggga acaaacg 27

<210> 427

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 427

tagtaccatt ggctggtctg gtcagca 27

<210> 428

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 428

cgacgttgca ttagctatat tttcatt 27

<210> 429

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 429

aacattcact agcgcgaaac aaagtac 27

<210> 430

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 430

tctgtacgag caatcaaaaa tcaggtc 27

<210> 431

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 431

accaagtacc gcactcatcg agaacatttc gtgacgt 37

<210> 432

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 432

ggaaattatt cattaaaggt gaattatcct aaagcag 37

<210> 433

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 433

caaatccaat cgcaagacaa agaacgtgat ggttatc 37

<210> 434

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 434

ataacatcac ttgcctgagt agaagattgg ttcattg 37

<210> 435

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 435

aaattatttg cacgtaaaac agaaatacgt tgaacag 37

<210> 436

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 436

cgtctccact tagcaagccg tttttatttt catcgta 37

<210> 437

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 437

ctacgtggtt atcaccgtca ccgacttgag ccatttg 37

<210> 438

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 438

gtttatatga gcgagaaaac tttttcaaat atatttt 37

<210> 439

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 439

caggagtata tactcaaact atcggccttg ctggtaa 37

<210> 440

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 440

tacacacctt caaagaaatt gcgtagattt tcaggtt 37

<210> 441

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 441

acaacccgtc ggattcacgt cacgaaa 27

<210> 442

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 442

agaacgtcag cgtggtctgc tttagga 27

<210> 443

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 443

tggtcaataa cctgttgata accatca 27

<210> 444

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 444

ccagcgatta taccaacaat gaaccaa 27

<210> 445

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 445

aacgagaatg accatactgt tcaacgt 27

<210> 446

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 446

aagtggagac gtccgtggga acaaacg 27

<210> 447

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 447

taaccacgta ggctggtctg gtcagca 27

<210> 448

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 448

ctcatataaa ctagctatat tttcatt 27

<210> 449

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 449

atatactcct ggcgcgaaac aaagtac 27

<210> 450

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 450

gaaggtgtgt aaatcaaaaa tcaggtc 27

<210> 451

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 451

ggaagggatg gaggatccgt gggaacaaac g 31

<210> 452

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 452

ggaagggatg gaggatagct atattttcat t 31

<210> 453

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Sticky end strand

<400> 453

ggaagggatg gaggagcgcg aaacaaagta c 31

<210> 454

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 454

ggaagggatg gaggaagtat agacgagcag caaat 35

<210> 455

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 455

acaacccgtc ggattcattt gctgctcgtc tatact 36

<210> 456

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 456

agaacgtcag cgtggtattt gctgctcgtc tatact 36

<210> 457

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 457

tggtcaataa cctgttattt gctgctcgtc tatact 36

<210> 458

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 458

ccagcgatta taccaaattt gctgctcgtc tatact 36

<210> 459

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 459

aacgagaatg accataattt gctgctcgtc tatact 36

<210> 460

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 460

ggaagggatg gaggattggg tttcagcgaa agcagg 36

<210> 461

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 461

acaacccgtc ggattccctg ctttcgctga aacccaa 37

<210> 462

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 462

agaacgtcag cgtggtcctg ctttcgctga aacccaa 37

<210> 463

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 463

tggtcaataa cctgttcctg ctttcgctga aacccaa 37

<210> 464

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 464

ccagcgatta taccaacctg ctttcgctga aacccaa 37

<210> 465

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 465

aacgagaatg accatacctg ctttcgctga aacccaa 37

<210> 466

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 466

ggaagggatg gaggaaggcg gttactgttg cctgtc 36

<210> 467

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 467

acaacccgtc ggattcgaca ggcaacagta accgcct 37

<210> 468

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 468

agaacgtcag cgtggtgaca ggcaacagta accgcct 37

<210> 469

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 469

tggtcaataa cctgttgaca ggcaacagta accgcct 37

<210> 470

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 470

ccagcgatta taccaagaca ggcaacagta accgcct 37

<210> 471

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 471

aacgagaatg accatagaca ggcaacagta accgcct 37

<210> 472

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 472

ggaagggatg gaggaacgct aatggcgtga tatgat 36

<210> 473

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 473

acaacccgtc ggattcatca tatcacgcca ttagcgt 37

<210> 474

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 474

agaacgtcag cgtggtatca tatcacgcca ttagcgt 37

<210> 475

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 475

tggtcaataa cctgttatca tatcacgcca ttagcgt 37

<210> 476

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 476

ccagcgatta taccaaatca tatcacgcca ttagcgt 37

<210> 477

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 477

aacgagaatg accataatca tatcacgcca ttagcgt 37

<210> 478

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 478

ggaagggatg gaggaagtcc tgtaacatgt gcattt 36

<210> 479

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 479

acaacccgtc ggattcaaat gcacatgtta caggact 37

<210> 480

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 480

agaacgtcag cgtggtaaat gcacatgtta caggact 37

<210> 481

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 481

tggtcaataa cctgttaaat gcacatgtta caggact 37

<210> 482

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 482

ccagcgatta taccaaaaat gcacatgtta caggact 37

<210> 483

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Synthetic target strand

<400> 483

aacgagaatg accataaaat gcacatgtta caggact 37

<210> 484

<211> 14

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> TMR labelled target strand

<400> 484

ttttctagat gtat 14

<210> 485

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 485

ggtcattgcc tgagagtctg ttttttatac atcta 35

<210> 486

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 486

gagcaaacaa gagaatcgat ttttttatac atcta 35

<210> 487

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 487

gaacggtaat cgtaaaacta ttttttatac atcta 35

<210> 488

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 488

gcatgtcaat catatgtacc ttttttatac atcta 35

<210> 489

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 489

ccggttgata atcagaaaag ttttttatac atcta 35

<210> 490

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 490

ccccaaaaac aggaagattg ttttttatac atcta 35

<210> 491

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 491

tataagcaaa tatttaaatt ttttttatac atcta 35

<210> 492

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 492

gtaaacgtta atattttgtt ttttttatac atcta 35

<210> 493

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 493

aaaattcgca ttaaattttt ttttttatac atcta 35

<210> 494

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 494

gttaaatcag ctcatttttt ttttttatac atcta 35

<210> 495

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 495

aaccaatagg aacgccatca ttttttatac atcta 35

<210> 496

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 496

aaaataattc gcgtctggcc ttttttatac atcta 35

<210> 497

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 497

ggtcattgcc tgagagtctg ttttttatac atctag 36

<210> 498

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 498

gagcaaacaa gagaatcgat ttttttatac atctag 36

<210> 499

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 499

gaacggtaat cgtaaaacta ttttttatac atctag 36

<210> 500

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 500

gcatgtcaat catatgtacc ttttttatac atctag 36

<210> 501

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 501

ccggttgata atcagaaaag ttttttatac atctag 36

<210> 502

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 502

ccccaaaaac aggaagattg ttttttatac atctag 36

<210> 503

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 503

tataagcaaa tatttaaatt ttttttatac atctag 36

<210> 504

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 504

gtaaacgtta atattttgtt ttttttatac atctag 36

<210> 505

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 505

aaaattcgca ttaaattttt ttttttatac atctag 36

<210> 506

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 506

gttaaatcag ctcatttttt ttttttatac atctag 36

<210> 507

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 507

aaccaatagg aacgccatca ttttttatac atctag 36

<210> 508

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 508

aaaataattc gcgtctggcc ttttttatac atctag 36

<210> 509

<211> 14

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> TMR labelled target strand

<400> 509

ttttatacat ctag 14

<210> 510

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 510

ggtcattgcc tgagagtctg tttttttaga tgtat 35

<210> 511

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 511

gagcaaacaa gagaatcgat tttttttaga tgtat 35

<210> 512

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 512

gaacggtaat cgtaaaacta tttttttaga tgtat 35

<210> 513

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 513

gcatgtcaat catatgtacc tttttttaga tgtat 35

<210> 514

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 514

ccggttgata atcagaaaag tttttttaga tgtat 35

<210> 515

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 515

ccccaaaaac aggaagattg tttttttaga tgtat 35

<210> 516

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 516

tataagcaaa tatttaaatt tttttttaga tgtat 35

<210> 517

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 517

gtaaacgtta atattttgtt tttttttaga tgtat 35

<210> 518

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 518

aaaattcgca ttaaattttt tttttttaga tgtat 35

<210> 519

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 519

gttaaatcag ctcatttttt tttttttaga tgtat 35

<210> 520

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 520

aaccaatagg aacgccatca tttttttaga tgtat 35

<210> 521

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 521

aaaataattc gcgtctggcc tttttttaga tgtat 35

<210> 522

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 522

ggtcattgcc tgagagtctg ttttttctag atgtat 36

<210> 523

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 523

gagcaaacaa gagaatcgat ttttttctag atgtat 36

<210> 524

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 524

gaacggtaat cgtaaaacta ttttttctag atgtat 36

<210> 525

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 525

gcatgtcaat catatgtacc ttttttctag atgtat 36

<210> 526

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 526

ccggttgata atcagaaaag ttttttctag atgtat 36

<210> 527

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 527

ccccaaaaac aggaagattg ttttttctag atgtat 36

<210> 528

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 528

tataagcaaa tatttaaatt ttttttctag atgtat 36

<210> 529

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 529

gtaaacgtta atattttgtt ttttttctag atgtat 36

<210> 530

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 530

aaaattcgca ttaaattttt ttttttctag atgtat 36

<210> 531

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 531

gttaaatcag ctcatttttt ttttttctag atgtat 36

<210> 532

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 532

aaccaatagg aacgccatca ttttttctag atgtat 36

<210> 533

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 533

aaaataattc gcgtctggcc ttttttctag atgtat 36

<210> 534

<211> 14

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> TMR labelled target strand

<400> 534

ttttgtattg aaga 14

<210> 535

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 535

ggtcattgcc tgagagtctg tttaaacttc aatac 35

<210> 536

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 536

gagcaaacaa gagaatcgat tttaaacttc aatac 35

<210> 537

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 537

gaacggtaat cgtaaaacta tttaaacttc aatac 35

<210> 538

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 538

gcatgtcaat catatgtacc tttaaacttc aatac 35

<210> 539

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 539

ccggttgata atcagaaaag tttaaacttc aatac 35

<210> 540

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 540

ccccaaaaac aggaagattg tttaaacttc aatac 35

<210> 541

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 541

tataagcaaa tatttaaatt tttaaacttc aatac 35

<210> 542

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 542

gtaaacgtta atattttgtt tttaaacttc aatac 35

<210> 543

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 543

aaaattcgca ttaaattttt tttaaacttc aatac 35

<210> 544

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 544

gttaaatcag ctcatttttt tttaaacttc aatac 35

<210> 545

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 545

aaccaatagg aacgccatca tttaaacttc aatac 35

<210> 546

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 546

aaaataattc gcgtctggcc tttaaacttc aatac 35

<210> 547

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 547

ggtcattgcc tgagagtctg tttttttctt caatac 36

<210> 548

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 548

gagcaaacaa gagaatcgat tttttttctt caatac 36

<210> 549

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 549

gaacggtaat cgtaaaacta tttttttctt caatac 36

<210> 550

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 550

gcatgtcaat catatgtacc tttttttctt caatac 36

<210> 551

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 551

ccggttgata atcagaaaag tttttttctt caatac 36

<210> 552

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 552

ccccaaaaac aggaagattg tttttttctt caatac 36

<210> 553

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 553

tataagcaaa tatttaaatt tttttttctt caatac 36

<210> 554

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 554

gtaaacgtta atattttgtt tttttttctt caatac 36

<210> 555

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 555

aaaattcgca ttaaattttt tttttttctt caatac 36

<210> 556

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 556

gttaaatcag ctcatttttt tttttttctt caatac 36

<210> 557

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 557

aaccaatagg aacgccatca tttttttctt caatac 36

<210> 558

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<223> Probe handle

<400> 558

aaaataattc gcgtctggcc tttttttctt caatac 36

Claims

2.权利要求1的条形码探针集合，其中所述荧光修饰均为同一种颜色的荧光修饰，或者所述条形码探针集合包含不同颜色的荧光修饰。

3.权利要求1或2的条形码探针集合，其中至少一种条形码探针包含至少两个符合如下关系的具有荧光修饰的区域，其中相邻的两个具有荧光修饰的区域中心之间的距离小于所述成像设备的可分辨极限。

4.权利要求3的条形码探针集合，其中所述成像设备是普通成像设备，并且其中所述相邻的两个具有荧光修饰的区域中心之间的距离小于约250nm，优选在约150nm至250nm之间。

5.权利要求3的条形码探针集合，其中所述成像设备为超分辨率成像设备，如dSTORM，并且其中所述相邻的两个具有荧光修饰的区域中心之间的距离小于约30nm，优选在约20nm至30nm之间。

6.权利要求1-5任一项的条形码探针集合，其中至少两个具有荧光修饰的区域具有不同的荧光强度。

7.权利要求1-6任一项的条形码探针集合，其中所述核酸形成的棒状结构由多个单体组成，每个单体包含一个核酸支架链和多个核酸辅助链。

8.权利要求1-7任一项的条形码探针集合，其中所述条形码探针包含靶标结合区域。

9.一种检测样品中靶标的存在的方法，包括：

(a)提供权利要求1-8中任一项的条形码探针集合，所述条形码探针集合包含与所述靶标特异性结合的条形码探针；

10.一种检测多个靶标核酸和探测核酸对之间的相互作用的方法，包括：

(a)将每一种探测核酸构建到权利要求1-8中任一项的条形码探针集合中的一种独特的条形码探针上，并将所述条形码探针固定在固相支撑物上；

11.一种试剂盒，其包含权利要求1-8中任一项的条形码探针集合。

12.一种制备条形码探针的方法，所述条形码探针由n个按照预定顺序排列的单体组成，每个单体由一个核酸支架链和多个核酸辅助链组成，并且每个单体为包含带有荧光修饰的区域的单体或不包含带有荧光修饰的区域的单体，所述方法包括：

13.权利要求12的方法，所述单体长度为200-250nm。

14.权利要求12或13的方法，其中所述条形码探针包含至少两个符合如下关系的具有荧光修饰的区域，其中相邻的两个具有荧光修饰的区域中心之间的距离小于成像设备的可分辨极限，由此所述成像设备无法将所述两个具有荧光修饰的区域分辨为两个彼此独立的点。

15.通过权利要求12至14中任一项的方法制备的条形码探针。

16.一种制备条形码探针集合的方法，包括通过权利要求12至14中任一项的方法制备多种条形码探针，其中每种条形码探针通过以不同的预定顺序排列不同的单体来制备，并且其中至少一种条形码探针包含至少两个符合如下关系的具有荧光修饰的区域，其中相邻的两个具有荧光修饰的区域中心之间的距离小于成像设备的可分辨极限，由此所述成像设备无法将所述两个具有荧光修饰的区域分辨为两个彼此独立的点。