CN114276329B - 喹啉化合物的盐的晶型及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，提供了一种喹啉化合物的盐的晶型及制备方法和应用。所提供的化合物为2,4‑二氨基‑6‑[1‑(7‑氟‑2‑吡啶‑2‑基‑喹啉‑3‑基)‑乙氨基]‑嘧啶‑5‑甲腈，其结构如下所示：

该化合物的对甲苯磺酸盐的晶型I可以用作磷酸肌醇3‑激酶的抑制剂，治疗磷酸肌醇3‑激酶相关的疾病。该晶型I具有2θ为4.9°±0.2°、7.6°±0.2°、12.2°±0.2°、14.8°±0.2°和15.4°±0.2°的XRPD特征峰。

Description

喹啉化合物的盐的晶型及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种喹啉化合物的盐的晶型以及制备方法和应用。

背景技术

磷酸肌醇3-激酶(PI3K)属于脂质信号传导激酶大家族。其中I类PI3K(包括PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kγ和PI3Kδ)属于双特异性脂质和蛋白激酶，PI3K本身具有丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶的活性，可以磷酸化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP₂)，从而产生磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP₃)。PIP₃在细胞存活、信号转导、跨膜运输的控制和其他功能中起关键作用，参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节(Di Paolo,G.et al.Nature,2006,443,651；Parker,P.J.et al.Biochem.Soc.Trans.2004,32,893；Hawkins,P.T.etal.Biochem.Soc.Trans.2006,34,647；Schaeffer,E.M.et al.Curr.Opin.Immnunol.2000,12,2822)，如果该调节机制发生异常，会导致诸如癌症、炎症和自身免疫性疾病等多种疾病。

PI3K可分为3类，其结构与功能各异。其中研究最广泛的为I类PI3K。I类PI3Ks由四种激酶组成，这四种激酶可进一步划分为2个亚类。其中1A亚类PI3Ks由三种密切相关的激酶PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kδ组成，它们均以异二聚体的形式存在，由催化亚基(p110α、p110β或p110δ)和不同种类的调节亚基构成。1A亚类PI3Ks通常响应经由受体酪氨酸激酶(RTKs)的信号传导通路。1B亚型由PI3Kγ单类构成，它主要响应G蛋白偶联受体(GPCRs)信号通路。与1A亚类PI3Ks结构类似，PI3Kγ由p110γ催化亚基和两种不同的调节亚基中的一种构成。PI3Kα和PI3Kβ在各种组织和器官类型中广泛表达。PI3Kγ主要存在于白细胞中，但也存在于骨骼肌、肝脏、胰腺和心脏中(Cantly,C.Science 2002,1655)。PI3Kδ的表达模式受限于脾脏、胸腺和外周血白细胞(Knight,Z.et al.Cell 2006,125,733)。

PI3Kδ是I类PI3K四个激酶之一，也是PI3K-AKT-mTOR信号通路中的重要一员，同时也被认为是体内适应性免疫系统功能发挥的主要参与者。该通路对于肿瘤的生长至关重要，肿瘤细胞依靠这一通路维持着生长、转移和扩散。研究表明，PI3Kδ在调节适应性免疫系统细胞(B细胞和较小程度的T细胞)以及先天免疫系统(中性粒细胞、肥大细胞和巨噬细胞)中具有重要的作用，是多种免疫疾病潜在有效的治疗靶点。

最新的研究成果指出，如果小鼠的p110δ失活，可以预防多种癌症的发生，包括非血液学实体瘤，同时调节性T细胞(Treg)的p110δ失活会释放CD8+细胞毒性T细胞并诱导肿瘤消退。因此，p110δ抑制剂可以破坏肿瘤诱导的免疫耐受性，在肿瘤的临床治疗方面具有潜在的广泛应用(Ali,et al.,Nature:2014,510,407–411)。

2014年7月，第一款PI3Kδ抑制剂Idelalisib在FDA和EMA获批，用于以治疗不同类型的白血病。截止目前，已有Idelalisib、Copanlisib和Duvelisib三款对PI3Kδ有抑制作用的新药相继在美国获批，PI3Kδ逐渐进入人们的视野，并且备受新药开发者关注，全球针对这一靶点的新药研发正处于活跃期，Parsaclisib、HMPL-689、Copanlisib、CDZ173等PI3Kδ抑制剂也正处在临床前或临床试验中。

尽管有多款针对PI3Kδ的抑制剂已经上市或者在研，但是对于临床疗效更佳、毒副作用更小的PI3Kδ抑制剂仍然存在巨大的需求空间。通过提高PI3Kδ抑制剂的体内稳定性、克服CYP酶抑制或诱导倾向并联合其他抗癌干预(如新兴免疫疗法)治疗方法，可以进一步释放PI3Kδ抑制剂在恶性肿瘤治疗领域的临床潜力。随着更多公司将研发投入到这一靶点的临床开发中，未来将会有更多安全、有效的PI3Kδ抑制剂被开发出来并应用于临床患者治疗中。

发明内容

本发明提供了新型的喹啉化合物的盐的晶型，即特性显著改善的PI3K亚型抑制剂。

本发明的第一方面提供了一种化合物A的对甲苯磺酸盐的晶型，其为晶型I，

所述晶型I具有2θ为4.9°±0.2°、7.6°±0.2°、12.2°±0.2°、14.8°±0.2°和15.4°±0.2°的XRPD特征峰。

本发明的第二方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述晶型，以及药学上可接受的载体。

本发明的第三方面提供了上述晶型或者上述药物组合物在制备预防或治疗磷酸肌醇3-激酶相关疾病的药物中的用途。

本发明的第四方面提供了一种在体外选择性地抑制包含磷酸肌醇3-激酶的细胞的生长或者增殖的方法，包括：

使细胞与有效量的上述晶型或者上述药物组合物接触。

本发明的第五方面提供了一种预防或者治疗磷酸肌醇3-激酶相关疾病的方法，包括给予受试者有效量的上述晶型或者上述药物组合物。

附图说明

图1是根据本发明的实施例提供的96孔板中部分样品的¹H NMR图谱结果。

图2是根据本发明的实施例提供的96孔板中部分样品的¹H NMR图谱结果

图3是根据本发明的实施例提供的96孔板中第4行部分样品的XRPD图谱结果。

图4是根据本发明的实施例提供的96孔板中第E列部分样品的XRPD图谱结果。

图5是根据本发明的实施例提供的样品5和样品3的XRPD图谱结果。

图6是根据本发明的实施例提供的样品3的动态水分脱吸附分析(DVS)图谱结果。

图7是根据本发明的实施例提供的化合物A及化合物A的对甲苯磺酸盐晶型I的溶解度测试结果柱状图。

图8是根据本发明的实施例提供的样品8的XRPD图谱结果。

图9是根据本发明的实施例提供的样品8的TGA-DSC图谱结果。

图10是根据本发明的实施例提供的样品8的¹H NMR图谱结果。

图11是根据本发明的实施例提供的样品8经高湿稳定测定后的XRPD图谱结果。

图12是根据本发明的实施例提供的样品6的¹H NMR图谱结果。

图13是根据本发明的实施例提供的样品6的XRPD图谱结果。

图14是根据本发明的实施例提供的不同化合物对于人源淋巴癌DoHH-2细胞株皮下移植CB17/SCID雌性免疫缺陷鼠模型的抗肿瘤作用结果图。

具体实施方式

下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

化合物A的对甲苯磺酸盐的晶型

本发明提供了一种化合物A的对甲苯磺酸盐的晶型，为晶型I，

所述晶型I具有2θ为约4.9°、约7.6°、约12.2°、约14.8°、约15.4°的XRPD特征峰。

本发明通过化合物A的对甲苯磺酸盐结晶，获得晶型I。而且以化合物A的对甲苯磺酸盐为起始原料采用多种方法进行晶型筛选，例如挥发结晶、混悬打浆、反溶剂沉淀、降温结晶以及研磨等方法对化合物A的对甲苯磺酸盐进行多晶型筛选，发现除了晶型I之外，并没有出现新的晶型。而且所制备的对甲苯磺酸晶型I在高湿条件下表现出高的稳定性，该晶型I在0-90％RH的条件下是基本上不吸湿的，表现出极低的吸湿性。

在一些实施方式中，所述晶型I具有2θ为4.9°±0.2°、7.6°±0.2°、12.2°±0.2°、14.8°±0.2°、15.4°±0.2°的XRPD特征峰。

在一些实施方式中，所述晶型I具有2θ为4.9°±0.1°、7.6°±0.1°、12.2°±0.1°、14.8°±0.1°、15.4°±0.1°的XRPD特征峰。

在一些实施方式中，所述晶型I进一步具有至少一个选自2θ为约9.8°、约10.3°、约14.3°、约14.5°、约16.3°、约18.3°和约19.8°的XRPD特征峰。例如，可以含有一个、两个、三个、四个、五个、六个或者七个选自2θ为约9.8°、约10.3°、约14.3°、约14.5°、约16.3°、约18.3°和约19.8°的XRPD特征峰。

在一些实施方式中，所述晶型I进一步具有至少一个选自2θ为9.8°±0.2°、10.3°±0.2°、14.3°±0.2°、14.5°±0.2°、16.3°±0.2°、18.3°±0.2°和19.8°±0.2°的XRPD特征峰。例如，可以含有一个、两个、三个、四个、五个、六个或者七个选自2θ为9.8°±0.2°、10.3°±0.2°、14.3°±0.2°、14.5°±0.2°、16.3°±0.2°、18.3°±0.2°和19.8°±0.2°的XRPD特征峰。

在一些实施方式中，所述晶型I进一步具有至少一个选自2θ为9.8°±0.1°、10.3°±0.1°、14.3°±0.1°、14.5°±0.1°、16.3°±0.1°、18.3°±0.1°和19.8°±0.1°的XRPD特征峰。例如，可以含有一个、两个、三个、四个、五个、六个或者七个选自2θ为9.8°±0.1°、10.3°±0.1°、14.3°±0.1°、14.5°±0.1°、16.3°±0.1°、18.3°±0.1°和19.8°±0.1°的XRPD特征峰。

在一些实施方式中，所述晶型I具有基本上如图8所示的X射线粉末衍射图案。

在一些实施方式中，所述晶型I在277～283℃具有熔融峰。

在一些实施方式中，所述晶型I具有基本上如图9所示的DSC和TGA热谱图。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述晶型，以及药学上可接受的载体。

药学上可接受的载体包括但不限于乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄芪胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆以及甲基纤维素。而且还可以，根据不同制剂的需求，所提供的药物组合物中还可以包含润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸镁或者矿物油，润湿剂，乳化剂，悬浮剂，防腐剂如苯甲酸甲酯和丙基羟基苯甲酸酯，甜味剂等等。

制备方法

本发明还提供了一种制备上述化合物A的对甲苯磺酸盐的方法，包括：使得化合物A和对甲苯磺酸反应，以形成化合物A的对甲苯磺酸盐。

在一些实施方式中，所述方法进一步包括：制备化合物A和对甲苯磺酸在有机溶剂中的反应产物；通过过滤回收反应产物中的固体。

在一些实施方式中，在20～50摄氏度条件下进行所述反应。在一些优选实施方式中，在25～40摄氏度条件下进行所述反应。

在一些实施方式中，所述有机溶剂包括选自甲醇、异丙醇、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、乙腈、乙醇、甲基叔丁基醚、丙酮、乙酸乙酯中的至少一种。在一些优选实施方式中，所述有机溶剂包括选自丙酮和乙酸乙酯中的至少一种。

在一些实施方式中，化合物A可以通过下述方法制备获得：

使得化合物B和化合物C反应，以形成化合物D；

使得化合物D和酸反应，以形成化合物E；

使得化合物E和2,4–二氨基-6-氯嘧啶-5-甲腈反应，以形成化合物A；

未在文中专门列出的化合物的合成路线，可以使用已知的有机合成技术来制备，并可以根据众多可能的合成途径中的任一种来合成；也可以直接购买获得。对于生成的物质可以根据本领域中已知的任何合适的方法来监测。例如可以通过光谱手段如核磁共振光谱法(例如¹H或者¹³C)、红外光谱法或者分光光度测定法；或者通过色谱法如高效液相色谱法(HPLC)或薄层色谱(TLC)或其他技术来监测产物的形成。

其中根据上述方法制备的化合物A可以和对甲苯磺酸反应，形成化合物A的对甲苯磺酸盐。

文中所提到的化合物A或者化合物A的对甲苯磺酸盐基本上是分离的。术语“基本上分离的”是指化合物A或者化合物A的对甲苯磺酸盐至少部分地或者基本上能够从它所形成的或者被检测到的环境中分离出来。基本上分离可以包含至少约60重量％、至少约70重量％、至少约70重量％、至少约80重量％、至少约90重量％、至少约95重量％、至少约97重量％、或者至少约99重量％的本发明的化合物A或者化合物A的对甲苯磺酸盐的晶型I。用于分离化合物或者化合物A的对甲苯磺酸盐或其晶型的方法是本领域常规的。

治疗方法及用途

本发明还提供了上述晶型或者上述药物组合物在制备治疗磷酸肌醇3-激酶相关疾病的药物中的用途。本发明还提供了一种在体外选择性地抑制包含磷酸肌醇3-激酶的细胞的生长或者增殖的方法，包括：使细胞与有效量的上述晶型或者上述药物组合物接触。

本发明还提供了一种预防或者治疗磷酸肌醇3-激酶相关疾病的方法，包括给予受试者有效量的上述晶型或者上述药物组合物。

本文中所提到的磷酸肌醇3-激酶的活性，主要是指磷酸肌醇3-激酶δ(PI3Kδ)的活性。对于PI3Kδ活性的抑制或其变体是指PI3Kδ活性的降低，该PI3Kδ活性的降低为相对于不存在化合物A的对甲苯磺酸盐的晶型I的情况下的PI3Kδ的活性，并作为晶型I存在的情况下的直接或者间接应答。本文所提到的晶型I还可以用于PI3Kγ活性的抑制，所表现出来的抑制活性弱于对于PI3Kδ活性的抑制。

在一些实施方式中，所提到的磷酸肌醇3-肌酶相关疾病为PI3Kδ活性相关疾病。

本文所用的关于疾病的“治疗”或“预防”意指减轻或预防疾病的一种或多种生物学表现，以干预导致该疾病或作为该疾病的原因的生物学级联中的一个或多个点，从而减轻与该疾病相关的一种或多种症状或影响。如上所述，疾病的“治疗”包括疾病的预防，并且“预防”应理解为指药物的预防性给药以显著降低疾病或其生物学表现的可能性或严重性，或延迟此类疾病或其生物学表现的发作。

本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

首先利用已知化合物1和化合物4制备化合物A。其中化合物1和化合物4可以通过商购获得，也可以参考已知的路线合成，例如可以参考申请号为201780004233.0的中国专利中记载的内容获得化合物1和化合物4。

步骤1：在N₂气氛下将i-PrMgCl(13L)和四氢呋喃(THF，4.0L)加入反应容器中。然后在30±5℃下加入含2-溴吡啶(4.12kg)的THF(4.0L)溶液。将混合物在30±5℃下搅拌至少2小时。然后加入ZnBr₂(7.05kg)的THF(10L)溶液，并将反应体系在30±10℃下搅拌至少1小时。将化合物1(4.3kg)，XPhos(748g)，NaI(198g)和Pd(AcO)₂(89g)加入反应容器中，所获得的混合物加热至65±5℃，并将反应体系在65±5℃下搅拌至少24小时。然后冷却至25±5℃。加入二氯甲烷(DCM，20L)，并搅拌至少20分钟。对所得到的混合物进行过滤，并将滤饼用DCM(6.0L)洗涤两次。浓缩有机相，并用DCM交换至10L。然后加入EDTA钠溶液(20L)和DCM(30L)，并将反应体系在25±5℃下搅拌至少0.5小时。对所得到的混合物进行过滤，并将滤饼用DCM(6.0L)洗涤两次。分离滤液，收集有机相。并用EDTA钠溶液(20L)洗涤有机相3次。收集有机相，浓缩并与乙酸乙酯交换至4.0-6.0L。将混合物冷却至-15±5℃。然后加入正庚烷(40L)。将混合物在-15±5℃下搅拌至少12小时。过滤固体，并将滤饼用正庚烷(6.0L)洗涤两次。如果去氯副产物>1.0％，则继续进行以下操作：用EA/正庚烷(4.0L/40L)使滤饼成浆。将混合物在-15±5℃下搅拌至少8小时。将产物过滤并将滤饼用正庚烷(4.0L)洗涤两次。收集滤饼，并在45±5℃下干燥至少16小时。获得4.6Kg浅黄色固体，纯度为97.78％。产率为95％。

步骤2：在N₂气氛下将EA(22.5L)和化合物2(4.5kg)装入反应容器中。然后在20±5℃下加入4M HCl的乙酸乙酯溶液(22.5L)。将混合物在20±5℃下搅拌至少2小时。过滤并收集滤饼。然后将滤饼和水(45L)混合。用DCM(45L)洗涤一次水相，并用MTBE(45L)洗涤一次。用NH₃·H₂O(约4.5L)调节水相的pH＝9。将水相用DCM(27L)萃取两次。然后加入3-巯基丙基乙基硫醚二氧化硅(10％，w/w)。将混合物在40±5℃下搅拌至少2小时。过滤固体，并将滤饼用DCM(9L)洗涤两次。收集有机相，将有机相浓缩，得到油状物。残余物不经纯化直接用于下一步。产率为93％。

步骤3：在N₂气氛下将DMSO(10L)，化合物3(2.76kg)，化合物4(1.85kg)，KF(0.61kg)和N,N-二异丙基乙胺(DIEA，2.68kg)加入反应容器中。将该混合物加热至100±5℃。将反应体系在100±5℃下搅拌至少24小时。然后将混合物冷却至25±5℃，并加入水(83L)中。将混合物搅拌至少0.5小时并过滤。收集固体，并将固体溶解在DCM(33L)中。然后加入1.2N HCl(40L)，并搅拌至少0.5小时。分离，收集水相，并用DCM(33L)洗涤水相3次。将水相加至Na₂CO₃水溶液(1.2N，33L)，将混合物搅拌至少30分钟过滤固体，并用水(7L)洗涤滤饼两次。收集滤饼，并在45±5℃下干燥至少16小时，得到化合物A，产率83％。质谱(ESI)m/e：401(M+1)。¹H NMR(300MHz，DMSO-d6)ppm 8.72(s,1H),8.56(m,1H),7.54-8.12(m,6H),6.50(s,2H),6.08(s,br,2H),5.65-5.75(m,1H),1.35(d,J＝6.9Hz,3H)。

实施例2

实施例2采用12种酸对实施例1中制备的化合物A进行96-孔板成盐筛选，成盐筛选中制备所得的固体样品通过核磁(¹H NMR)、X射线粉末衍射(XRPD)手段进行分析确认。

其中¹H NMR分析采用的仪器是配备有B-ACS 120自动进样系统的BrukerAdvance300。

本实施例及本说明书其它各处所涉及的XRPD用到的X射线衍射分析仪为BrukerD8advance，该仪器配备了LynxEye检测器，样品的2θ扫描角度从3°到40°，扫描步长为0.02°。测试样品时光管电压和电流分别为40KV和40mA。

其中，适量的化合物A用甲醇溶解配制得到浓度为30mg/mL的药物溶液。

实验所用到的酸如下表1所示，将一定量的酸用甲醇溶解并稀释分别制备得到浓度为0.1M的酸溶液。

表1实验用酸

盐酸(HCl)	磷酸(H<sub>3</sub>PO<sub>4</sub>)	对甲苯磺酸(p-TsOH)	甲磺酸
				氢溴酸(HBr)	马来酸	富马酸	柠檬酸
硫酸(H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)	L-酒石酸	苯甲酸	丁二酸

所用到的溶剂如表2所示。

表2实验用溶剂

甲醇(MeOH)	乙腈(ACN)	丙酮
			异丙醇(IPA)	乙醇(EtOH)	水(H<sub>2</sub>O)
四氢呋喃(THF)	甲基叔丁基醚(MTBE)	乙酸乙酯(EA)

将上述制备得到的药物溶液分布于96-孔板中，随后加入酸。每孔中含有100μL药液和上述制备得到的一种酸溶液，除硫酸为0.55当量外，其余各酸均为1.05当量。

待96-孔板中液体挥干后，再向每孔中加入200μL筛选所需溶剂。随后，将96-孔板用扎孔的封口膜密封，置于室温条件下的通风橱内。缓慢挥干溶剂后，选择质量较好的固体样品进行XRPD、¹H NMR表征，以确定成盐与否及所成盐是否为晶体。

酸液及溶剂的分配方法如表3所示，96孔板中液体挥干后，样品的状态如表3所示，选取部分样品进行¹H NMR和XRPD表征。

表3 96孔板中样品的状态

A

B

C

D

E

F

G

H

EtOH

IPA

THF

ACN

MTBE

丙酮

水

EA

1

氢溴酸

A

A

A

A

2

盐酸

A

A

A

A

A

3

硫酸

A

A

A

A

A

A

A

4

对甲苯磺酸

C

C

*C

C

*C

C

*C

C

5

甲磺酸

A

A

A

6

马来酸

A

A

A

A

A

A

A

7

磷酸

A

A

A

A

A

A

A

8

L-酒石酸

A

A

A

A

A

A

A

9

富马酸

A

A

A

A

A

A

*A

10

柠檬酸

A

A

A

A

A

A

11

苯甲酸

*C

A

12

丁二酸

*C

A

备注：表3中A＝无定型；C＝晶体；其余均为玻璃态；

*为XRPD测量结果。

实验结果表明，化合物A能与盐酸、氢溴酸、硫酸、对甲苯磺酸、甲磺酸和马来酸形成盐。其中部分XRPD分析结果如图1-图4所示。结合图1和图2所示出的结果，化合物A与盐酸、氢溴酸、硫酸、对甲苯磺酸、甲磺酸和马来酸反应，均在¹H NMR中表现出相应的化学位移。同时在96-孔板中得到了一种晶体盐，即对甲苯磺酸盐，且在不同溶剂中所得对甲苯磺酸盐样品的XRPD基本相同，其都为晶型I，如图3所示。此外，虽然在E11(苯甲酸-MTBE)和E12(丁二酸-MTBE)孔两个孔中也分别得到了晶体样品，经判断，它们均为化合物A的MTBE溶剂化合物。例如在图4示出了它们的XRPD图谱检测结果。

实施例3

实施例3制备了化合物A的对甲苯磺酸盐，并对对甲苯磺酸盐所制备得到的晶型I与化合物A的溶解度和稳定性进行了比较。

其中所用的HPLC方法如下表4所示：

表4 HPLC检测条件

其中对甲苯磺酸盐(晶型I，样品5)制备方法如下：

519mg化合物A中加入3.6mL(7V)丙酮，溶清后向其中加入1.36mL(1.05当量，约2V)1.0M对甲苯磺酸的水溶液。室温搅拌2h后仍无沉淀析出，向其中加入0.1mg晶种(样品3)后逐渐析出固体，将该悬浊液室温搅拌0.5h过滤，所得固体在室温环境中干燥过夜，得到样品5。经表征样品5即为对甲苯磺酸盐晶型I，该样品5的熔点约为280℃。

其中，样品3的制备方法如下：

室温下约30mg化合物A的MTBE溶剂化合物溶于7V丙酮，随后加入90μL(1.05当量)0.75M对甲苯磺酸水溶液，室温搅拌1h以上有沉淀析出；继续搅拌3h后过滤，所得样品在室温环境下干燥过夜。

其中所制备得到的样品3和样品5的XRPD图谱结果如图5所示，其都为晶型I。

以样品3为例进行动态水分脱吸附分析(DVS)表征，DVS分析采用的仪器型号为IGASorp(Hidentity Isochema)。样品测量采用梯度模式，测试的湿度范围为0％至90％，每个梯度的湿度增量为10％。保持在每个湿度梯度的时间为30分钟～2小时。其结果如图6所示，试验结果表明样品3即使在90％RH下，也仅仅吸湿0.92％，表现出极低的吸湿性。

其中溶解度测试条件如下：

测试了化合物A和对甲苯磺酸盐(样品5，晶型I)在37℃条件下模拟肠胃液(SGF、FeSSIF和FaSSIF)中的溶解度。

约7.5mg化合物A和对甲苯磺酸盐分别加入1.5mL三种生物溶媒中配制得混悬液。所有混悬液均置于37℃摇床中200rpm振荡至24小时，在0.5、2和24h时分别取样约0.5mL进行过滤，所得滤液进行HPLC分析和pH测量，并分别将滤饼进行XRPD测定。

其结果如下：

表5.溶解度结果

如表5和图7所示，化合物A和对甲苯磺酸盐(样品5，晶型I)的溶解度具有pH依赖性，随着pH的减小而增大。化合物A和化合物A的对甲苯磺酸盐在SGF和FeSSIF中具有较高的溶解度，且化合物A对甲苯磺酸盐晶型I的溶解度总体高于化合物A。

稳定性测试条件如下：

适量的化合物A和对甲苯磺酸盐(样品5，晶型I)分别置于40℃/75％RH和60℃环境下一周，进行固体稳定性测定。在0和7天时，进行HPLC纯度分析和固体XRPD测定，其结果如表6所示。

表6.固体稳定性结果

化合物A的对甲苯磺酸盐晶型I在40℃/75％RH和60℃条件下放置7天表现出优异的物理和化学稳定性，无纯度和晶型变化。而化合物本身在60℃条件下放置7天化学纯度降低了约0.16％。

本发明所提供的化合物A的对甲苯磺酸盐晶型I容易结晶，具有可接受的理化性质，而且相较于化合物本身来说，具有更高的化学稳定性。

实施例4

本实施例中的TGA分析所用到的仪器型号为TA TGA Q500或Discovery TGA 55(TAInstruments,US)。将样品置于已平衡的开口铝制样品盘中，质量在TGA加热炉内自动称量。样品以10℃/min加热至最终温度。

DSC分析所用到的仪器型号为TA DSC Q200或Discovery DSC 250(TAInstruments,US)。样品经精确称重后置于扎孔DSC样品盘中，并记录下样品的准确质量。样品以10℃/min加热至最终浓度。

实施例4参考成盐筛选实验，按照下述方法制备了化合物A的对甲苯磺酸盐：

室温下约1.40g化合物A的MTBE溶剂化合物溶于9.8mL(7V)丙酮中，随后加入3.05mL(1.05当量，约2V)1M对甲苯磺酸/(丙酮/水＝3/1)溶液，立即有沉淀析出；继续搅拌0.5h后过滤其中固体，所得样品在室温环境下干燥过夜。得到1.24g对甲苯磺酸固体(即为样品7)。室温下向约1.10g对甲苯磺酸盐(样品7)中加入约10V水，室温搅拌2小时后过滤其中固体，50℃干燥过夜。得到约1g对甲苯磺酸盐(即为样品8)。

通过XRPD结果表征，样品8的晶型为晶型I，如图8所示。样品8的TGA-DSC图谱结果如图9所示。经TGA确定样品在分解前基本无失重，¹H NMR结果显示无有机溶剂残留(如图10所示)；DSC图谱在283℃有一个吸热峰应为熔融峰，且熔融后即刻分解。

表7 XRPD表征结果

然后利用所制备的样品8作为起始原料进行晶型筛选，实验采用混悬打浆、反溶剂沉淀、降温结晶、挥发结晶等多种方法对样品8进行晶型筛选，实验发现在筛选的过程中除了晶型I之外，并没有出现新的晶型。

1、混悬打浆实验

室温或50℃条件下，尝试在多种溶剂中进行混悬打浆实验。

(1)单一溶剂中混悬打浆实验

室温下，称取约25mg对甲苯磺酸晶型I，分别在10种溶剂(20V)中混悬搅拌2天，并将晶型未变样品升温至50℃继续混悬搅拌1天。所得样品进行XRPD测定，结果如表8所示。

表8单一溶剂中混悬打浆实验结果

ID	溶剂	室温-2天	50℃-1天
				1	甲苯	晶型I	晶型I
2	正庚烷	晶型I	晶型I
				3	环己烷	晶型I	晶型I
4	甲基叔丁基醚	晶型I	晶型I
				5	乙酸异丙酯	晶型I	晶型I
6	异丙醇	晶型I	晶型I
				7	乙酸乙酯	晶型I	晶型I
8	乙醇	晶型I	晶型I
				9	乙腈	晶型I	晶型I
10	丁酮	晶型I	晶型I

实验结果表明，在单一溶剂中对样品8进行混悬打浆实验，所获得的样品的晶型均为对甲苯磺酸盐晶型I。

(2)混合溶剂中混悬打浆实验

约15mg对甲苯磺酸盐晶型I(样品8)样品中分别加入0.3或0.5mL的16种混合溶剂，制备得到混悬液。分别将所得混悬液置于室温下搅拌4天，或置于50℃环境中震荡1天，并将所得固体样品进行XRPD测定。

表9混合溶剂混悬打浆实验结果

实验结果如表9所示，经过在混合溶剂中混悬打浆实验，得到的固体样品均为晶型I，未发现新的晶型。

2、降温结晶

实验以乙醇、丁酮和丙酮为例，对对甲苯磺酸盐晶型I进行了降温结晶实验。具体实验及结果如表10所示。在60℃下，取10mg样品8溶解在不同溶剂中，仅在乙醇中得到了澄清溶液。将溶液/混悬液过滤，所得滤液缓慢降至室温。

表10降温结晶实验

编号	溶剂	溶剂体积(mL)	结果
				1	乙醇	1	晶型I
2	丁酮	2	晶型I
				3	四氢呋喃	0.7	溶液

实验结果表明，在乙醇、丁酮和丙酮三种溶剂中得到了固体样品，均为对甲苯磺酸盐晶型I。

3、反溶剂沉淀法

实验测得对甲苯磺酸盐在甲醇中的溶解度>24mg/mL，在四氢呋喃中的溶解度>11.6mg/mL，因此以这两种溶剂为例，作为良溶剂进行反溶剂沉淀实验。

室温下，取约10mg样品8溶于0.4mL甲醇或0.8mL四氢呋喃中，搅拌下逐渐加入反溶剂，对析出的固体样品进行XRPD表征。

表11反溶剂沉淀实验

结果如表11所示：所得固体样品均为晶型I，未发现新晶型。

同时继续考察了对甲苯磺酸盐晶型I(样品8)在研磨和高湿条件下的稳定性。

将一定的对甲苯磺酸盐晶型I分别在研钵中研磨2min，随后进行XRPD测定。研磨后样品仍为对甲苯磺酸盐晶型I。

对甲苯磺酸盐晶型I样品在高湿条件下基本上是不吸湿的，且晶型表现出很高的稳定性。例如，将对甲苯磺酸盐晶型I样品在室温/92.5％RH条件下放置11天后，进行XRPD测定。如图11所示出的XRPD图谱显示，结果发现样品的晶型未发生改变，其仍然为晶型I。由此可知，对甲苯磺酸盐晶型I在高湿条件下具有一定的稳定性。

综上，采用多种方法对化合物A的对甲苯磺酸盐样品进行多晶型筛选，实验结果发现：通过各种条件或者溶剂所得的多个样品中，除晶型I以外，未发现其他新的晶型。而且该晶型在室温/92.5％RH 11天并未发生晶型改变。

对甲苯磺酸盐晶型I具有较高的结晶度、较高的熔点以及极低的吸湿性，且很易在丙酮/水中反应结晶得到。综上，对甲苯磺酸盐晶型I具有适于后续开发的相关性质。

实施例5

实施例5制备了化合物A的对甲苯磺酸盐晶型I。实验步骤如下：

(1)在27±5℃下将对甲苯磺酸水溶液(10L)加入反应容器中，然后加入化合物A(3.37kg)的乙酸乙酯(27L)溶液。将混合物在27±5℃下搅拌至少12小时。过滤固体并收集滤饼。对滤液进行分离并收集有机相。用饱和Na₂CO₃水溶液调节有机相的pH为9-10，分离并收集有机相。用乙酸乙酯(17L)萃取水相一次。将有机相合并，并浓缩，得到化合物A。

(2)在27±5℃下将对甲苯磺酸水溶液(10L)加入反应容器中，然后加入上述步骤(1)最后制备得到的化合物A的乙酸乙酯(27L)溶液。将混合物在27±5℃下搅拌至少12小时。过滤并收集滤饼。将(1)中得到的滤饼和此处收集的滤饼合并，并在45±5℃下干燥至少6小时，直到LOD<5％。所获得的固体用纯净水(14L)、乙酸乙酯(20L)和丙酮(20L)溶解。然后浓缩至30-36L。用乙酸乙酯(34L)交换丙酮3次。将反应体系浓缩至30-33L。加入少量化合物A对甲苯磺酸盐的晶种(2％，w/w)。冷却至25±5℃并搅拌至少12小时。然后离心并用水(6.7L)洗涤滤饼两次。收集滤饼，并在40±5℃下干燥至少16小时，获得样品6，即化合物A的对甲苯磺酸盐晶型I。产率为64％。

其中样品6的¹H NMR和XRPD表征结果分别如图12和图13所示。

实施例6

实施例6测试了上述实施例5所制备的样品6对于激酶PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kγ和PI3Kδ的抑制效果。

实验所用到的激酶分别购自于：

PI3Kα(p110α/p85α)，购自于Invitrogen，目录号PV4788；

PI3Kβ(p110β)，购自于eurofins，目录号14-603M；

PI3Kδ(p110δ/p85a)，购自于Invitrogen，目录号PV6452；

PI3Kγ(p110γ)，购自于Invitrogen，目录号PR8641C。

首先，配制1x激酶缓冲液，包括：

配制样品6溶液：

在激酶PI3Kα,PI3Kβ,PI3Kγ上，化合物的检测终浓度为10μM，配置成100x浓度，即1000μM。在96孔板上A行第二个孔中加入90μL的100％DMSO，再加入10μL 10mM化合物溶液，依次往下做3x稀释，共稀释10个浓度。

在激酶PI3Kδ上，化合物的检测终浓度为1μM，配置成100倍浓度，即100μM。在96孔板上B行第二个孔中加入90μL的100％DMSO，再从A行第二个孔中取10μL 1000μM化合物溶液，依次往下做3倍稀释，共稀释10个浓度。

转移50μL 100％DMSO分别到两个空的孔中作为Max孔和Min孔。

使用ECHO550转移50nL化合物到384孔板中。

反应过程如下：

配制2x激酶溶液：将激酶加入1x激酶缓冲液，配置成2x酶溶液。

向384孔板中加入酶溶液：在384孔反应板中加入2.5μL的2x酶溶液，阴性对照孔加入2.5μL激酶缓冲液，室温下孵育10分钟。

配制2x的底物溶液：将激酶加入1x激酶缓冲液，配置成2x底物溶液。

向384孔板中加入底物溶液：在384孔反应板中加入2.5μL的2x底物溶液。

激酶反应：室温下反应60分钟。

激酶反应的检测：将ADP-Glo试剂平衡到室温，转移5μL ADP-Glo试剂1到384孔板反应孔中终止反应，450rpm振荡180分钟后转移10μL ADP-Glo试剂2(检测试剂)到每个反应孔中，450rpm振荡1分钟，室温静置30分钟。其中ADP-Glo试剂购自于Promege，目录号为v9102。

最后，从Envision 2104 Multi-label Reader上读取化学发光数值，并进行曲线拟合，计算IC50，实验结果如表12所示。

同时，以样品6为例，测定了其在相应细胞中对PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kγ和PI3Kδ的抑制效果。PI3Kα的活性是通过IGF-1刺激的C2C12细胞中Akt的磷酸化水平来检测，PI3Kβ的活性是通过LPA刺激的PC-3细胞中Akt的磷酸化水平来检测，PI3Kγ的活性是通过c5α刺激的Raw264.7细胞中Akt的磷酸化水平来检测，PI3Kδ的活性是通过IgM刺激的Raji细胞中Akt的磷酸化水平来检测。利用PerkinElemer的AlphaLISA技术测定细胞中Akt的磷酸化水平。

其中C2C12细胞、PC-3细胞、Raw264.7细胞、Raji细胞均购自于ATCC。结果如表12所示。

表12生物活性和选择性结果

上述结果表明，所提供的化合物A的对甲苯磺酸盐晶型I对于PI3Kδ表现出抑制活性，且对于PI3Kγ也表现出抑制活性。化合物A的对甲苯磺酸盐晶型I对于磷酸肌醇3-激酶的活性抑制呈现出选择性。

以化合物A的对甲苯磺酸盐晶型I为例，实验研究发现化合物的对甲苯磺酸盐晶型I对于多种肿瘤细胞均表现出抑制作用，例如对于淋巴瘤细胞株(如DoHH-2、SU-DHL-4、SU-DHL-4、SU-DHL-6和WSU-DLCL-2等)的体外增殖均表现出抑制作用，绝对IC50(AbsIC50)值小于0.1微摩。而且，化合物的对甲苯磺酸盐晶型I对于多种动物模型，例如小鼠乳腺癌4T1皮下移植瘤模型、小鼠结直肠癌CT26.WT细胞皮下移植瘤模型等的肿瘤体积增长表现出显著的抑制作用。

实施例7

实施例7评价了化合物A的对甲苯磺酸盐在不同剂量下灌胃给药对人源淋巴癌DoHH-2细胞株皮下移植CB17/SCID雌性免疫缺陷鼠模型中的抗肿瘤作用。

7-9周龄CB17/SCID雌性免疫缺陷鼠皮下接种5*10⁶DoHH-2细胞，建立皮下人淋巴癌异种移植肿瘤模型，待小鼠平均肿瘤体积到达68mm³时，对小鼠随机分组，并于分组当天给药。各治疗组和溶媒对照组的处理方式分别如下：

化合物A对甲苯磺酸盐(样品6)100mg/kg(p.o.QD)组，每天给药一次，给药25天(0～24天)；

化合物A对甲苯磺酸盐(样品6)30mg/kg(p.o.QD)组，每天给药一次，给药25天(0～24天)；

阳性治疗组(Duvelisib，购自于上海楼岚生物科技有限公司)50mg/kg(p.o.BID)组，每天给药2次，间隔12h，给药24天；及

溶媒对照组(5％DMSO/40％PEG400/55％水，体积比)(p.o.QD)，每天给药一次，给药25天(0～24天)。

每组小鼠10只，所有小鼠均在分组当天开始给药(0天)，在分组后第24天(24天)，统一安乐。根据实验终点肿瘤体积进行疗效评价。

其中缩写p.o.代表口服灌胃，QD代表一天一次，BID代表一天两次。

实验结果如图14所示。溶媒对照组小鼠在给药后第24天平均肿瘤体积为2163.13mm³。化合物A对甲苯磺酸盐在剂量为100mg/kg(QD)和30mg/kg(QD)时在给药后第24天平均肿瘤体积为549.05mm³和984.45mm³，相较溶媒对照组统计学上有显著性差异(p＜0.001)，相对肿瘤抑制率TGI(％)为75％和54％。Duvelisib(50mg/kg BID)组在给药后第24天平均肿瘤体积为1496.12mm³，相较溶媒对照组统计学上有显著性差异(p＝0.01)，TGI(％)为30％。结果表明：化合物A对甲苯磺酸盐在100mg/kg和30mg/kg剂量下均表现出对皮下人淋巴癌DoHH-2异种移植CB17/SCID雌性免疫缺陷鼠模型的显著性的肿瘤生长抑制作用，而且抑制肿瘤生长作用呈剂量依赖性。

其中相对肿瘤抑制率(TGI)通过下述公式计算获得：

TGI％＝(1-T/C)*100％

其中，T和C分别为各实验组和溶媒对照组在某一特定时间点的平均肿瘤体积。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (13)

1.一种化合物A的对甲苯磺酸盐的晶型，其特征在于，为晶型I，

所述晶型I具有2θ为4.9°±0.2°、7.6°±0.2°、12.2°±0.2°、14.8°±0.2°和15.4°±0.2°的XRPD特征峰。

2.根据权利要求1所述的晶型，其特征在于，所述晶型I进一步具有至少一个选自2θ为9.8°±0.2°、10.3°±0.2°、14.3°±0.2°、14.5°±0.2°、16.3°±0.2°、18.3°±0.2°和19.8°±0.2°的XRPD特征峰。

3.根据权利要求1所述的晶型，其特征在于，所述晶型I进一步具有至少两个选自2θ为9.8°±0.2°、10.3°±0.2°、14.3°±0.2°、14.5°±0.2°、16.3°±0.2°、18.3°±0.2°和19.8°±0.2°的XRPD特征峰。

4.根据权利要求1所述的晶型，其特征在于，所述晶型I进一步具有至少三个选自2θ为9.8°±0.2°、10.3°±0.2°、14.3°±0.2°、14.5°±0.2°、16.3°±0.2°、18.3°±0.2°和19.8°±0.2°的XRPD特征峰。

5.根据权利要求1所述的晶型，其特征在于，所述晶型I进一步具有至少四个选自2θ为9.8°±0.2°、10.3°±0.2°、14.3°±0.2°、14.5°±0.2°、16.3°±0.2°、18.3°±0.2°和19.8°±0.2°的XRPD特征峰。

6.根据权利要求1所述的晶型，其特征在于，所述晶型I进一步具有至少五个选自2θ为9.8°±0.2°、10.3°±0.2°、14.3°±0.2°、14.5°±0.2°、16.3°±0.2°、18.3°±0.2°和19.8°±0.2°的XRPD特征峰。

7.根据权利要求1所述的晶型，其特征在于，所述晶型I进一步具有2θ为9.8°±0.2°、10.3°±0.2°、14.3°±0.2°、14.5°±0.2°、16.3°±0.2°、18.3°±0.2°和19.8°±0.2°的XRPD特征峰。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的晶型，其特征在于，所述晶型I具有基本上如图8所示的X射线粉末衍射图案。

9.根据权利要求1-7中任一项所述的晶型，其特征在于，所述晶型I在277～283℃具有熔融峰。

10.根据权利要求1-7中任一项所述的晶型，其特征在于，所述晶型I具有基本上如图9所示的DSC和TGA热谱图。

11.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1～10中任一项所述的晶型，以及药学上可接受的载体。

12.权利要求1～10中任一项所述的晶型或者权利要求11所述的药物组合物在制备预防或治疗磷酸肌醇3-激酶相关疾病的药物中的用途。

13.一种在体外选择性地抑制包含磷酸肌醇3-激酶的细胞的生长或者增殖的方法，其特征在于，包括：

使细胞与有效量的权利要求1～10任一项所述的晶型或者权利要求11所述的药物组合物接触。

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