CN114269740A - 用于预防和治疗肾损伤的膜铁转运蛋白抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通式(I)的膜铁转运蛋白抑制剂化合物的用途，

用于预防和治疗肾损伤，特别是急性肾损伤，以及与之相关的症状和病理状况。

Description

用于预防和治疗肾损伤的膜铁转运蛋白抑制剂

技术领域

本发明涉及作为膜铁转运蛋白抑制剂的通式(I)的化合物用于预防和治疗肾损伤，如特别是急性肾损伤，以及与其相关的症状和病理状况的用途。

背景技术

铁是几乎所有生物体的必需微量元素，并且尤其与生长和血液形成相关。在这种情况下，铁代谢的平衡主要是从老化红细胞的血红蛋白、从肝中的铁储存和十二指肠对膳食铁的吸收中铁的回收水平进行调节。释放的铁通过肠吸收，特别是通过特定的转运系统(DMT-1、膜铁转运蛋白(ferroportin))，转移到血液循环中，从而输送到适当的组织和器官(转铁蛋白(运铁蛋白，transferrin)、转铁蛋白受体(transferrin receptors))。在人体中，元素铁是非常重要的，尤其是对于氧运输、氧摄取、细胞功能如线粒体电子运输、认知功能等，并且最终对于整个能量代谢。哺乳动物生物体不能主动排出铁。铁代谢基本上由铁调素(hepcidin)通过巨噬细胞、肝细胞和肠细胞中铁的细胞释放来控制。铁调素作用于通过肠和通过胎盘的铁吸收，并且作用于从网状内皮系统释放铁。铁调素的形成与生物体铁水平直接相关地调节，即如果向生物体供应足够的铁和氧，则形成更多的铁调素，如果铁和氧水平低，或在红细胞生成增加的情况下，则形成更少的铁调素。在小肠粘膜细胞和巨噬细胞中，铁调素结合转运蛋白(transport protein)膜铁转运蛋白(ferroportin)，该转运蛋白膜铁转运蛋白通常将铁从细胞内部转运到血液中。转运蛋白膜铁转运蛋白是由571个氨基酸组成的跨膜蛋白，其在肝、脾、肾、心脏、肠和胎盘中表达。特别是，膜铁转运蛋白位于肠上皮细胞的基底外侧膜中。因此，以这种方式定位的膜铁转运蛋白起到将膳食铁输出到血液中的作用。如果铁调素与膜铁转运蛋白结合，则膜铁转运蛋白被转运到细胞内部，在细胞内部发生膜铁转运蛋白的分解，使得几乎完全阻断了铁从细胞中的释放。如果膜铁转运蛋白被铁调素灭活或抑制，使得其不能输出储存在粘膜细胞中的铁，则肠中铁的吸收被阻断。铁调素的减少导致活性膜铁转运蛋白增加，从而允许储存的铁的释放增加以及膳食铁的吸收增加，从而增加血清铁水平。在病理情况下，增加的铁水平导致慢性铁过载。

除了慢性铁过载以外，紊乱的铁代谢也会引起其他严重的病理状况。铁的主要部分与血红蛋白和蛋白质如转铁蛋白、铁蛋白、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)结合或以三价铁(Fe³⁺)状态存在。在病理状况下，可形成高反应性和毒性的亚铁(Fe²⁺)。未与转铁蛋白(或与其他传统铁结合分子如铁蛋白、血红素、去铁蛋白、血铁黄素等)结合的铁部分统称为游离铁或非转铁蛋白结合铁(NTBI)。此外，“催化铁”或“不稳定铁”被广泛称为细胞外和细胞内铁的过渡池，其通常松散地结合血清白蛋白或内源性螯合剂，如柠檬酸盐、乙酸盐、苹果酸盐、磷酸盐和腺嘌呤核苷。不稳定铁主要以亚铁(Fe²⁺)形式存在。据描述，此类过量游离铁和催化铁或不稳定铁的一个特别有害的方面是，导致不期望的自由基形成。特别是铁(II)离子催化活性氧(ROS)的形成(尤其通过Fenton反应)。这些ROS导致DNA、脂质、蛋白质和碳水化合物的损害，包括脂质过氧化、内皮损伤、蛋白质氧化、线粒体损伤和红细胞损害，这在细胞、组织和器官中具有深远的影响。ROS的形成是众所周知的，并且在文献中被描述为引起所谓的氧化应激。NTBI和催化铁被广泛描述为表现出诱导此类具有细胞损害毒性潜能的ROS的高倾向的铁，其中主要器官受铁毒性的影响，包括心脏、胰腺、肾和参与造血的器官。进一步认为血浆中的NTBI积累导致衰老红细胞的血管内损害，并因此导致铁介导的血管内溶血。铁介导的血管内溶血被认为诱导了肾损伤。

因此，已知铁过载引起组织和器官损害，例如心脏、肝和内分泌损害(Patel M.等人，“Non Transferrin Bound Iron:Nature,Manifestations and AnalyticalApproaches for Estimation”，Ind.J.Clin.Biochem.，2012年，第27卷第4期，第322-332页，以及Brissot P.等人，综述“Non-transferrin bound iron:A key role in ironoverload and iron toxicity”，Biochimica et Biophysica Acta，2012年，第1820卷，第403-410页)。

特别是，催化铁或不稳定铁已被描述为与肾损伤的发病机理有关，例如通过ROS的形成及其对肾组织的损伤潜力。进一步描述了催化铁或不稳定铁以及NTBI在肾缺血-再灌注损伤(IRI)或缺血性损伤(导致急性肾损伤(AKI))期间充当细胞死亡和随后的炎性应答的介质。由催化游离铁形成ROS会引起更多的组织损伤，从而导致释放无细胞血红素和其他含铁产物，并因此导致催化游离铁的自持续释放，因此涉及许多急性疾病中的关键损伤途径，如心肌梗死、败血症、中风、再灌注损伤和急性肾损伤等。缺血性损伤是AKI的主要原因，并且与没有此类病症的患者相比，AKI与发病率、死亡率和住院时间延长相关。急性缺血导致ATP耗竭、肾小管上皮损伤和缺氧细胞死亡。进一步的急性外科情况如手术可通过外科压力诱导催化游离铁。例如，在需要心肺旁路的手术期间，暴露于非生理表面和/或剪切力的体外循环血液可能损伤红细胞，从而释放游离血红蛋白和游离铁。因此，急性手术可能导致催化游离铁增加，这反过来又促进AKI的发展。迄今为止，铁调素已被描述为通过调节全身铁稳态来减轻缺血性损伤和AKI的潜在治疗机会(S.Swaminathan，“Iron HomeostasisPathways as Therapeutic Targets in Acute Kidney Injury”，Nephron ClinicalPractice，2018年；Scindia等人，“Iron Homeostasis in Healthy Kidney and its Rolein Acute Kidney Injury”，Seminars in Nephrology，第39卷第1期，第76-84页，2019年；Scindia等人，“Hepcidin Mitigates Renal Ischemia-Reperfusion Injury byModulating Systemic Iron Homeostasis”，J.Am.Soc.Nephrol.，第26卷，第2008-2814页，2015年；Chawla等人，“Therapeutic Opportunities for Hepcidin in Acute CareMedicine”，Crit Care Clin，第35卷，第357-374页，2019年)。

关于Ueda和Takasawa(“Role of Hepcidin-25in Chronic Kidney Disease:Anemia and Beyond”，Current Medicinal Chemistry，2017年，第24卷，第1417-1452页)的综述文章描述了铁调素-25通过调节铁介导的氧化剂损伤在肾损伤的发病机制和进展中的作用。

进一步描述了NTBI和游离血红蛋白在红细胞(RBC)输血中积累，特别是在储存的RBC输血中积累。已经讨论了RBC输血可能与导致NTBI积累的血管外溶血相关。基于此，通过增加输血患者的NTBI和催化铁水平，RBC输血可被认为是AKI的潜在贡献者[Baek JH等人，“Iron accelerates hemoglobin oxidation increasing mortality in vasculardiseased guinea pigs following transfusion of stored blood”，JCI Insights，第2卷第9期，2017年]。

WO2015/042515描述了铁调素和铁调素衍生物用于保护肾免受IRI的用途。

还讨论了铁螯合作为治疗AKI的治疗方法(Leaf等人，“Catalytic iron andacute kidney injury”，Am J Physiol Renal Physiol.，第311卷第5期，第F871–F876页，2016年)。

WO2018/067857描述了用作过氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPARδ)的调节剂的特定化合物通过调节线粒体生物合成用于治疗急性肾损伤的用途。

J.H.Baek等人的“Ferroportin inhibition attenuates,oxidant stress,andrenal injury following red blood cell transfusion in guinea pigs”(Transfusion，2020年3月，第60卷第3期，第513-523页)报告称，通过在豚鼠模型中急性红细胞输血后立即静脉内注射Vifor(国际)公司提供的小分子膜铁转运蛋白抑制剂VIT-2653导致细胞损伤的减弱。

此外，具有作为膜铁转运蛋白抑制剂的活性的低分子量化合物及其通过口服施用治疗慢性铁过载的用途描述于国际申请WO2017/068089和WO2017/068090中。此外，国际申请WO2018/192973涉及在WO2017/068089和WO2017/068090中描述的选择的膜铁转运蛋白抑制剂的特定盐。在所述三个国际申请中描述的膜铁转运蛋白抑制剂与用于本发明的新医学适应症中使用的根据式(I)化合物重叠。其中，新膜铁转运蛋白抑制剂化合物在用于预防和/或治疗由过量铁或铁过载引起的自由基、活性氧(ROS)和氧化应激的形成中的用途，以及在用于预防和/或治疗由过量铁或铁过载引起的心脏、肝和内分泌损害中的用途的适用性已有一般性描述。然而，其中没有描述急性缺血性情况，并且特别是缺血性肾损伤和/或AKI的预防和治疗。

发明目的

本发明的目的是提供用于预防和治疗肾损伤的新方法和新型药，此类肾损伤如特别是肾缺血-再灌注损伤(本文也缩写为“IRI”)和急性肾损伤，特别是包括急性肾损伤(本文也缩写为“AKI”)、肾缺血-再灌注损伤和由缺血性损伤引起的AKI、手术或外科干预后(如特别是常涉及心肺旁路(cardiopulmonary bypass，体外循环)、其他大型胸部或腹部手术操作的心脏手术后)的AKI，以及与RBC输血相关的肾损伤。在进一步方面，本发明的目的在于提供用新型药物预防和治疗本文所述肾损伤的化合物，这些化合物比基于重组工程蛋白或基因工程药物化合物的药物更容易且更便宜地制备。

具体实施方式

本发明的发明人惊奇地发现，作为膜铁转运蛋白抑制剂(FpnI)的如本文所定义的通式(I)化合物可用于预防和治疗本文所述的肾损伤。

因此，本发明的第一方面涉及用于治疗肾损伤，优选的用于治疗由催化游离铁和/或ROS引起的肾损伤的式(I)化合物以及它们的药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和多晶型物：

其中

X¹是N或O；并且

X²是N、S或O；

条件是X¹和X²不同；

R¹选自

-氢，和

-任选取代的烷基；

n是1至3的整数；

A¹和A²独立地选自烷二基基团

R²是

-氢，或

-任选取代的烷基；

或

A¹和R²与它们所键合的氮原子一起形成任选取代的4元至6元环；

R³表示1个、2个或3个任选的取代基，所述取代基可以独立地选自

-卤素、

-氰基、

-任选取代的烷基、

-任选取代的烷氧基，和

-羧基基团；

R⁴选自

-氢、

-卤素、

-C₁-C₃烷基，和

-卤素取代的烷基。

适应症

本发明涉及如本文所述的式(I)化合物及其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物用于预防和治疗肾损伤的新医学用途，这些肾损伤选自由催化游离铁诱导的肾损伤。

在本发明的优选方面，肾损伤选自肾缺血-再灌注损伤(IRI)、缺血性损伤和急性肾损伤。

在本发明的进一步优选方面，肾损伤选自急性肾损伤(AKI)、肾缺血-再灌注损伤(IRI)、缺血性损伤和由缺血性损伤引起的AKI、手术或外科干预后(如特别是常涉及心肺旁路、其他大型胸部或腹部手术操作的心脏手术后)的AKI，以及与RBC输血相关的肾损伤。

因此，本发明还涉及通过向有此需要的患者施用一种或多种如本文所定义的式(I)化合物，包括其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和多晶型物来预防和治疗本文所述的肾损伤的新方法。

根据本发明的新用途和治疗方法包括向患者施用如本文所定义的式(I)化合物，包括其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和多晶型物。

在本发明的新用途的上下文中，术语“治疗”(“treat”、“treatment”或“treating”)包括改善(缓解)本文所述的肾损伤的至少一种症状或与其相关的病理状况。

在本发明的上下文中，术语“预防”(“prophylaxis”、“prevent”、“prevention”或“preventing”)包括保护免于缺血性肾损伤、避免AKI的发生或至少降低在缺血性损伤、RBC输血或外科干预后AKI的严重程度，例如通过在缺血性事件、RBC输血或外科干预前或同时或之后不久施用本发明的化合物，以预防或至少减轻由催化游离铁诱导的肾损伤的发生。

如上所述，认为游离催化铁或不稳定铁或NTBI是肾损伤，如特别是由缺血引发的AKI的主要原因。根据本发明的式(I)膜铁转运蛋白抑制剂化合物的施用有助于保护免受催化游离铁的破坏作用。假定本发明的膜铁转运蛋白抑制剂通过在肝和脾的巨噬细胞中螯合铁来防止催化游离铁或NTBI的形成，这将在下文更详细地解释，由此降低其在血浆中的水平并降低ROS形成的风险。作为膜铁转运蛋白抑制剂的本发明的式(I)化合物由此具有通过在巨噬细胞中螯合铁并因此中断催化游离铁的自持续释放的恶性循环来防止有害作用的潜力。

本发明的发明人发现，本发明的式(I)化合物通过限制铁用于形成NTBI的可用性而特别适合于预防和治疗本文所述的肾损伤。进一步发现本发明的式(I)化合物通过限制活性氧(ROS)以避免肾组织损伤而特别适合于预防和治疗本文所述的肾损伤。

除了催化游离铁之外，还必须考虑NTBI和LPI会引起肾损伤。NTBI包含与转铁蛋白不紧密相关的所有形式的血清铁并且在化学和功能上是异质的。LPI(不稳定血浆铁)代表NTBI的组分，其具有氧化还原活性和可螯合性两者，能够渗透到器官中并诱导组织铁过载。

可确定以下参数以评价本发明的化合物在新医学用途中的疗效：血浆肌酐、肾小球滤过率(包括估计的肾小球滤过率eGFR)、尿白蛋白排泄、尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、NTBI、LPI、RBC溶血、血尿素氮(BUN)、血浆血红蛋白(Hb)、总血浆铁、血浆铁调素、肾中性粒细胞浸润、血清IL-6、脾、肾和/或肝的铁含量、肾膜铁转运蛋白、作为血液和尿中肾损伤急性标志物的KIM-1(肾损伤分子-1)和H-铁蛋白。

另外地或另选地，本发明的化合物的疗效可通过肾小管损伤评分来测定，例如如下更详细描述的用于检测急性肾小管损害的CSA-NGAL评分(心脏手术相关NGAL评分)、如下更详细描述的KDIGO评分或包含内皮、肾小球、肾小管和间质(EGTI)成分的EGTI评分来评价组织学[例如通过以下描述：Khalid等人，“Kidney ischaemia reperfusion injury inthe rat:the EGTI scoring system as a valid and reliable tool for histologicalassessment”，Journal of Histology&Histopatholoy，第3卷，2016年]。

可使用本领域的常规方法，特别是通过以下更详细描述的那些方法进行上述参数的测定。本发明的化合物(I)适于校正或改善这些参数中的至少一者。

在预防或治疗AKI中，特别是通过施用式(I)化合物改善以下参数：

新治疗可导致患者的血清肌酐(sCr)降低至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％和/或sCr值加速降低和/或降低幅度增加，这是在首次施用后和/或缺血事件后的至多一周、至多6天、至多5天、至多4天、至多84小时、至多72小时、至多60小时、至多48小时、至多36小时、至多24小时或至多12小时的时间段内的任何时间点测定的，并且是与本发明治疗开始前12小时、24小时、36小时、48小时、1周、2周、3周或4周内的任何时间点测定的患者的sCr水平相比的。sCr浓度可通过常规方法，如根据以下实施例中所述的测定法来测定。

在进一步方面，新治疗可导致患者的尿白蛋白排泄校正(降低)至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，这是在首次施用后和/或缺血事件后至多一周、至多6天、至多5天、至多4天、至多84小时、至多72小时、至多60小时、至多48小时、至多36小时、至多24小时或至多12小时的时间段内的任何时间点测定的，并且是与在本发明治疗开始前12小时、24小时、36小时、48小时、1周、2周、3周或4周内的任何时间点测定的患者的尿白蛋白排泄相比。尿白蛋白排泄可通过常规方法测定。

新治疗可导致患者的血尿素氮(BUN)降低至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，这是在首次施用后和/或缺血事件后至多一周、至多6天、至多5天、至多4天、至多84小时、至多72小时、至多60小时、至多48小时、至多36小时、至多24小时或至多12小时的时间段内的任何时间点测定的，并且是与在本发明治疗开始前12小时、24小时、36小时、48小时、1周、2周、3周或4周内的任何时间点测定的患者的BUN水平相比。BUN浓度可通过常规方法，如根据以下实施例中所述的测定法来测定。

在另一方面，新治疗可导致患者的总血浆铁降低至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，这是在首次施用后和/或缺血事件后至多一周、至多6天、至多5天、至多4天、至多84小时、至多72小时、至多60小时、至多48小时、至多36小时、至多24小时或至多12小时的时间段内的任何时间点测定的，并且是与在本发明治疗开始前12小时、24小时、36小时、48小时、1周、2周、3周或4周内的任何时间点测定的患者的总血浆铁水平相比。总血浆铁浓度可通过常规方法，如根据以下实施例中所述的测定法来测定。

新治疗可导致患者的白细胞介素-6(IL-6)水平降低至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，这是在首次施用后和/或缺血事件后至多一周、至多6天、至多5天、至多4天、至多84小时、至多72小时、至多60小时、至多48小时、至多36小时、至多24小时或至多12小时的时间段内的任何时间点测定的，并且是与在本发明治疗开始前12小时、24小时、36小时、48小时、1周、2周、3周或4周内的任何时间点测定的患者的总IL-6水平相比。IL-6浓度可通过常规方法，如根据以下实施例中所述的测定法来测定。

新治疗导致患者的KIM-1水平降低至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，这是在首次施用后和/或缺血事件后至多72小时、至多60小时、至多48小时、至多36小时、至多24小时或至多12小时、8小时、6小时、5小时、4小时、3小时、2小时、1小时和0.5小时的时间段内的任何时间点测定的，并且是与本发明治疗开始前0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时、24小时、36小时或48小时内或至多＜1周的任何时间点测定的患者的总KIM-1水平相比。KIM-1浓度可通过常规方法，如根据以下实施例中所述的测定法来测定。

在另一方面，新治疗可导致患者的脾和/或肝铁浓度增加至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，这是在首次施用后和/或缺血事件后至多一周、至多6天、至多5天、至多4天、至多84小时、至多72小时、至多60小时、至多48小时、至多36小时、至多24小时或至多12小时的时间段内的任何时间点测定的，并且是与在本发明治疗开始前12小时、24小时、36小时、48小时、1周、2周、3周或4周内的任何时间点测定的患者的脾和肝铁浓度水平相比。脾和肝铁浓度可通过常规方法，如在以下实施例中所述的方法来测定。

在另一方面，新治疗可导致患者的肾铁浓度降低至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，这是在首次施用后和/或缺血事件后至多一周、至多6天、至多5天、至多4天、至多84小时、至多72小时、至多60小时、至多48小时、至多36小时、至多24小时或至多12小时的时间段内的任何时间点测定的，并且是与在本发明治疗开始前12小时、24小时、36小时、48小时、1周、2周、3周或4周内的任何时间点测定的患者的肾铁浓度水平相比。肾铁浓度可通过常规方法，如在以下实施例中所述的方法来测定。

如Patel等人(2012年；如上所引用)所解释的，在正常生理条件下，转铁蛋白水平足以完全清除游离铁，从而确保不存在NTBI，并且因此正常健康个体中的NTBI水平不超过1μmol/L，并且大多数通过最常用的方法检测不到。据报道，在不存在转铁蛋白时，NTBI水平高达20μmol/L，并且在转铁蛋白不足时，发现NTBI水平高达10μmol/L。然而，如Patel等人(2012年)和Brissot等人(2012年)所述，测定在很大程度上取决于所用的应用方法和测定法，并且必须考虑到测定循环NTBI的异质化学形式所产生的技术困难。例如，Brissot等人(2012年)引用的Hider等人(2010年)已描述了具有低至0.1μM/L的可重复精度的荧光测量。根据Patel等人(2012年；表1)，临床铁过载条件中的NTBI水平升高的范围在0.25μmol/L至4.0μmol/L之间(具有不同的精度和不同的测定方法)。考虑到这一点，在本发明的意义上，如果用已知方法(例如Patel等人(2012年)或Brissot等人(2012年)中描述的方法)可检测到，则NTBI水平被认为是升高的，优选地超过0.1μm/L。

在一个具体方面，本发明的新治疗导致患者的NTBI水平降低至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，这是在首次施用后和/或缺血事件后至多72小时、至多60小时、至多48小时、至多36小时、至多24小时或至多12小时、8小时、6小时、5小时、4小时、3小时、2小时、1小时和0.5小时的时间段内的任何时间点测定的，并且是与本发明治疗开始前0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时、24小时、36小时或48小时内或至多＜1周的任何时间点测定的患者的总NTBI水平相比。NTBI可通过常规方法，如根据下述的测定法来测定。

在一个具体方面，本发明的新治疗导致患者的LPI水平降低至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，这是在首次施用后和/或缺血事件后至多72小时、至多60小时、至多48小时、至多36小时、至多24小时或至多12小时、8小时、6小时、5小时、4小时、3小时、2小时、1小时和0.5小时的时间段内的任何时间点测定的，并且是与本发明治疗开始前0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时、24小时、36小时或48小时内或至多＜1周的任何时间点测定的患者的总LPI水平相比。LPI可通过常规方法，如根据以下实施例中所述的测定法来测定。

新治疗可导致对肾小管损伤如肾小管坏死的抑制。

新治疗可导致对细胞凋亡的抑制。

新治疗可导致IRI诱导的肾中性粒细胞浸润减少。

在进一步方面，本发明的新治疗导致患者肾组织中的ROS水平降低至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，这是在首次施用后和/或缺血事件后至多5天、至多6天、至多7天、至多8天、至多9天、至多10天、至多11天、至多12天、至多13天、至多14天、至多15天、至多16天、至多17天、至多18天、至多19天、至多20天、至多21天和至多1个月的时间段内的任何时间点测定的，并且是与本发明治疗开始前12小时、24小时、36小时、48小时、1周、2周、3周或4周内的任何时间点测定的患者肾组织中的ROS水平相比。ROS水平可通过常规方法，如根据以下实施例中所述的测定法，如特别是如Scindia等人2015年(上文引用)所述的测定法来测定。

在进一步方面，新治疗可导致患者的肾H-铁蛋白水平校正(增加)至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少100％，这是在首次施用后和/或缺血事件后至多一周、至多6天、至多5天、至多4天、至多84小时、至多72小时、至多60小时、至多48小时、至多36小时、至多24小时或至多12小时的时间段内的任何时间点测定的，并且是与在本发明治疗开始前12小时、24小时、36小时、48小时、1周、2周、3周或4周内的任何时间点测定的患者的肾H-铁蛋白水平相比。肾H-铁蛋白水平可通过常规方法，如根据以下实施例中所述的测定法来测定。

用根据本发明的新治疗方法，可实现上述改善中的一种或多种。

特别是，用新治疗方法可减少AKI、肾缺血-再灌注损伤和由缺血性损伤引起的AKI、手术或外科干预后(如特别是常涉及心肺旁路、其他大型胸部或腹部手术操作的心脏手术后)的AKI，以及与RBC输血相关的肾损伤的发生。

根据本发明的新治疗的一个具体方面，通过施用式(I)化合物抑制缺血性损伤和(急性)肾损伤的上述参数或指标中的一种或多种的异常变化。

因此，在进一步方面，本发明涉及式(I)化合物或其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物用于预防或治疗如本文所述的肾损伤的用途，其中预防和/或治疗包括：

a)血清肌酐的降低、加速降低或预防升高，和/或

b)估计的肾小球滤过率(eGFR)的增加或预防降低，和/或

c)肾膜铁转运蛋白的降低或预防增加，和/或

d)H-铁蛋白水平的增加或预防降低，和/或

e)肾中性粒细胞浸润的降低或预防增加，和/或

f)血清IL-6水平的降低或预防增加。

患者组

根据本发明的新用途中待治疗的受试者可以是任何哺乳动物，如啮齿类和灵长类，并且在优选的方面，新医学用途涉及人的治疗。待用根据本发明的新方法治疗的受试者也称为“患者”。

待治疗的受试者可以是任何年龄。本发明的一个方面涉及儿童和青少年的治疗。因此，在本发明的优选方面，待用本文所述的新方法治疗的受试者小于18岁。更特别地，待用本文所述的新方法治疗的受试者小于16岁、小于15岁、小于14岁、小于13岁、小于12岁、小于11岁、小于10岁、小于9岁、小于8岁、小于7岁、小于6岁或小于5岁。在本发明的进一步方面，待用本文所述的新方法治疗的受试者是1岁至3岁、3岁至5岁、5岁至7岁、7岁至9岁、9岁至11岁、11岁至13岁、13岁至15岁、15岁至20岁、20岁至25岁、25岁至30岁或大于30岁。在治疗成人的情况下，待用本文所述的新方法治疗的受试者是18岁至25岁、20岁至25岁、25岁至30岁、30岁至35岁、35岁至40岁、40岁至45岁、45岁至50岁、50岁至55岁、55岁至60岁或大于60岁。在治疗老年患者的情况下，待用本文所述的新方法治疗的受试者是60岁至65岁、65岁至70岁、70岁至75岁、75岁至80岁或大于80岁。

在本发明的进一步方面，待治疗的受试者的特征在于与正常生理水平相比具有增加的血浆肌酐水平和/或降低的估计的肾小球滤过率(eGFR)。血肌酐的正常范围是0.84mg/dL至1.21mg/dL(74.3μM/L至107μM/L)。

此外，可使用以下参数中的一种或多种来表征待治疗的受试者：

a)尿白蛋白排泄，和/或

b)中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)，和/或

c)可检测到的NTBI水平，和/或

d)RBC溶血水平，和/或

e)血尿素氮(BUN)水平，和/或

f)血浆血红蛋白(Hb)水平，和/或

g)总血浆铁水平，和/或

h)血浆铁调素水平，和/或

i)肾中性粒细胞浸润水平，和/或

j)血清IL-6水平，和/或

k)脾、肾和/或肝铁水平

在根据本发明待治疗的受试者中，所述参数中的一种或多种偏离用常规诊断方法测定的正常生理水平。

所述参数可用于确定患有AKI或处于发生AKI风险中的患者组。

在本发明的进一步方面，患有缺血性损伤或AKI或处于发生AKI危险并待用根据本发明的新方法治疗的患者组或群体选自NTBI水平升高的受试者(患者)。如果用上述已知方法可检测到，则NTBI水平被认为是升高的。优选地，认为NTBI水平≥0.1μM/L在患者中是升高的。可能的测定方法描述于例如de Swart等人，“Second international round robinfor the quantification of serum non-transferrin-bound iron and labile plasmairon in patients with iron-overload disorders”，Haematologica，2016年，第101卷第1期，第38–45页。

类似地，如果用上述已知方法可检测到并且可使用de Swart等人(“Secondinternational round robin for the quantification of serum non-transferrin-bound iron and labile plasma iron in patients with iron-overload disorders”，Haematologica，2016年，第101卷第1期，第38–45页)所述的测定方法进行测定，则认为LPI水平升高。

通常，血清肌酐水平(sCr)用于对AKI的严重程度和形式进行分类。

根据KDIGO(2012年)的分类，已经建立了以下AKI的具体诊断标准，其中如果存在以下任一种，则可诊断出AKI：

48小时内SCr增加≥0.3mg/dl(≥26.5μmol/l)；或

SCr增加至≥1.5倍基线，这发生在之前的7天内；或

尿量＜0.5ml/kg/h，持续6小时

此外，由急性透析质量倡议(ADQI)小组提出的根据RIFLE/AKIN标准的分类系统有助于评估一个人的急性肾损伤的严重程度。首字母缩写词RIFLE用于定义AKI中所见的进行性肾损伤的范围：

急性肾损伤的进一步重要标志物是估计的肾小球滤过率(eGFR)，这是测量肾功能水平的测试。考虑到患者的年龄、身体大小和性别，根据血肌酐值计算eGFR。与正常水平相比GFR降低表明肾脏不能如其应该的那样工作。在成年人中，正常的eGFR＞90。eGFR随年龄下降，甚至在没有肾病的人中。基于年龄的平均估计的eGFR可被认为如下：

年龄(岁)	平均估计的eGFR
		20-29	116
30-39	107
		40-49	99
50-59	93
		60-69	85
70+	75

此外，通过使用CSA-NGAL评分，急性肾小管损害可用作AKI的早期诊断标志物。该评分基于NGAL作为定义急性肾小管损害的生物标志物，最初与心脏手术相关的急性肾损伤(CSA-AKI)有关，然而，该评分通常可用于确定AKI中的肾小管损害：

作为另一可能性，但很少用于临床实践，可进行活组织检查，特别是如果需要诊断潜在原因时。然后，可使用基于内皮、肾小球、肾小管和间质成分的上述EGTI评分来根据Khalid等人2016年(如上所述)的表1评价组织学：

表1.EGTI组织学评分系统。

考虑到这一点，在本发明的进一步方面，待用本发明的新方法治疗的患者组或群体在由KDIGO或RIFLE/AKIN分类定义的分期中的任一个或通过eGFR水平降低或具有CSA-NGAL评分＞0或具有EGTI组织学评分＞0时患有AKI或者处于患有AKI的风险中。

在本发明的具体方面，待治疗的患者的特征在于：

i)具有增加的血浆肌酐水平，和/或

ii)增加的尿白蛋白排泄，和/或

iii)降低的估计的肾小球滤过率(eGFR)，

每种都与正常生理水平相比，和/或

iv)通过KDIGO或RIFLE/AKIN分类定义的分期中的任一个或通过CSA-NGAL评分＞0或通过EGTI组织学评分＞0，将患者分类为患有AKI或处于患有AKI的风险中。

施用形式

在本发明的进一步方面，预防或治疗如本文所定义的肾病，如特别是IRI或缺血性损伤和AKI，可包括向有需要的患者口服和/或静脉内施用一种或多种式(I)化合物、其盐、溶剂合物、水合物或多晶型物，它们各自如本文任何地方所述。

在预防性治疗的情况下，例如在计划的外科干预前，可优选选择口服施用。在缺血事件急性发生的情况下或在医院中，可优选选择静脉内施用。

对于口服施用，根据本发明的式(I)化合物优选以口服施用形式的药物或药物组合物提供，包括例如丸剂、片剂(如肠溶片剂、膜片剂和层片剂)、口服施用的缓释制剂、贮库制剂(depot formulation)、糖衣丸(dragees)、颗粒剂、乳剂、分散体、微囊剂、微米制剂、纳米制剂、脂质体制剂、胶囊(如肠溶胶囊)、粉剂、微晶制剂、撒布粉、滴剂、安瓿剂、溶液剂和口服施用的混悬剂。

在其优选实施方案中，根据本发明的式(I)化合物以如上所定义的片剂或胶囊形式施用。这些可以例如作为耐酸形式或与pH依赖型涂层一起存在。

因此，本发明的进一步方面涉及根据本发明的式(I)化合物，包括其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，以及包含它们的药物、组合物和联合制剂，以口服施用形式在用于预防和治疗如本文所定义的肾损伤的药物中的用途。

肠胃外施用包括例如皮下或静脉内施用，优选静脉内施用，并且因此根据本发明的式(I)化合物优选以可注射施用形式的药物或药物组合物提供，这些可注射给药形式包括例如安瓿剂、溶液剂、混悬剂、输液剂或注射剂等。

因此，本发明的进一步方面涉及根据本发明的式(I)化合物，包括其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，以及包含它们的药物、组合物和联合制剂，以可注射、优选静脉内施用形式在用于预防和治疗如本文所定义的肾损伤的药物中的用途。

给药方案

本发明的进一步方面涉及用于根据本发明的用途的根据本发明的式(I)化合物，其中治疗的特征在于以下给药方案之一：

在一方面，根据本发明的式(I)化合物可以0.001mg至500mg的剂量施用给有此需要的患者，例如每天1次至4次。然而，剂量可根据患者的年龄、体重、病症、疾病的严重程度或施用的类型而增加或减少。在本发明的进一步方面，式(I)化合物可以0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg、4mg、4.5mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg、160mg、165mg、170mg、175mg、180mg、185mg、190mg、195mg、200mg、205mg、210mg、215mg、220mg、225mg、230mg、235mg、240mg、245mg、250mg、255mg、260mg、265mg、270mg、275mg、280mg、285mg、290mg、295mg、300mg、325mg、350mg、375mg、400mg、425mg、450mg、475mg、500mg的剂量施用。

优选的剂量介于0.5mg至500mg之间，更优选地介于1mg至300mg之间，更优选地介于1mg至250mg之间。最优选的剂量为5mg、15mg、60mg、120mg或240mg。

进一步优选的剂量介于0.001mg/kg体重至35mg/kg体重之间、介于0.01mg/kg体重至35mg/kg体重之间、介于0.1mg/kg体重至25mg/kg体重之间或介于0.5mg/kg体重、1mg/kg体重、2mg/kg体重、3mg/kg体重、4mg/kg体重、5mg/kg体重、6mg/kg体重、7mg/kg体重、8mg/kg体重、9mg/kg体重、10mg/kg体重至最多20mg/kg体重之间。

可以每日单剂量或分成每日两次或更多次施用的亚剂量的总日剂量形式施用上述剂量。

甚至更优选的剂量是120mg(对于体重＞50kg的患者)和60mg(对于体重＜50kg的患者)，在每种情况下每天一次或两次。

在进一步方面，可选择上述所定义的剂量之一作为初始剂量，并且后续以1天至7天、1天至5天、优选1天至3天或每两天的重复间隔施用1次或更多次相同或不同的上述所定义的剂量。

初始剂量和后续剂量可选自以上所定义的剂量，并且根据患者的需要在所提供的范围内进行调节/改变。

特别是，后续剂量的量可根据个体患者、疾病的过程和治疗应答适当地选择。可施用1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次和更多次后续剂量。

可能的是，初始剂量等于或不同于该一个或多个后续剂量。进一步可能的是，后续剂量是相等的或不同的。

重复间隔可以是相同长度，或者可根据个体患者、疾病的过程和治疗应答而变化。

优选地，后续剂量的量随着后续给药次数的增加而减少。

在口服施用的情况下，在至少3天、至少5天、至少7天的治疗期内，每天一次施用介于3mg和300mg之间、更优选地介于5mg和250mg之间、最优选地5mg、15mg、60mg、120mg或240mg的合适剂量。在进一步优选方面，每天一次口服施用60mg或120mg的剂量。在进一步优选方面，120mg的总日剂量通过每日两次口服施用60mg剂量来施用。

在进一步优选方面，240mg的总日剂量通过每日两次口服施用120mg剂量来施用。所述剂量证明是安全的和良好耐受的。

在静脉内施用的情况下，施用的合适剂量介于5mg至300mg之间，例如5mg至50mg、5mg至40mg、5mg至30mg、5mg至20mg、5mg至10mg、或50mg至300mg、50mg至250mg、50mg至200mg、50mg至150mg、50mg至100mg、或100mg至300mg。所述静脉内剂量可例如每天施用一次、两次或更多次，并且可根据患者总体病征的严重程度和治疗成功来选择至少1天、至少2天、至少3天、至少5天、至少7天的治疗期。

在进一步方面，式(I)化合物在用于本文所述的新方法的预防和/或治疗的药物中的用途包括在IRI或缺血性损伤前、在RBC输血前、在手术或外科干预(例如心脏手术，包括涉及心肺旁路、其他大型胸部或腹部手术的操作)前，在＞0小时至48小时、＞0小时至36小时、＞0小时至24小时、＞0小时至20小时、＞0小时至18小时、＞0小时至16小时、＞0小时至12小时、＞0小时至10小时、＞0小时至8小时、＞0小时至6小时、＞0小时至5小时、＞0小时至4小时、＞0小时至3小时、＞0小时至2小时、＞0小时至1小时、＞0小时至0.5小时的时间段内向有此需要的患者施用一种或多种式(I)化合物、其盐、溶剂合物、水合物或多晶型物一次或多次。

在进一步方面，式(I)化合物在用于本文所述的新方法的预防和/或治疗的药物中的用途包括在缺血性再灌注事件、RBC输血或外科干预后立即至最多48小时之间，优选地在缺血性再灌注事件、RBC输血或外科干预后立即至最多12小时之间的时间段内，向有此需要的患者施用一种或多种式(I)化合物、其盐、溶剂合物、水合物或多晶型物一次或多次。

在口服给药中，早在给药后15分钟至30分钟就已观察到具有可检测到的水平的快速口服吸收。即使在重复给药时，吸收水平也可维持稳定，并且没有观察到严重的积累。

优选的给药方案进一步证明有效降低平均血清铁水平和平均计算的转铁蛋白饱和度，并偏移平均血清铁调素峰，从而表明其治疗AKI的效率。

在本发明的进一步方面，根据所治疗患者的sCr浓度调节初始和一个或多个后续给药。sCr浓度用常规方法测定。

膜铁转运蛋白(Fpn)抑制剂化合物

本发明涉及如本文所定义的式(I)化合物的新医学用途：

其中和在整个发明中，取代基基团具有如本文任何地方详细定义的含义：

任选取代的烷基优选地包括：优选地含有1个至8个，更优选地1个至6个，特别优选地1个至4个，甚至更优选地1个、2个或3个碳原子的直链或支链烷基，也表示为C₁-C₄烷基或C₁-C₃烷基。

任选取代的烷基还包括优选地含有3个至8个、更优选地5个或6个碳原子的环烷基。

含有1个至8个碳原子的烷基残基的示例包括：甲基基团、乙基基团、正丙基基团、异丙基基团、正丁基基团、异丁基基团、仲丁基基团、叔丁基基团、正戊基基团、异戊基基团、仲戊基基团、叔戊基基团、2-甲基丁基基团、正己基基团、1-甲基戊基基团、2-甲基戊基基团、3-甲基戊基基团、4-甲基戊基基团、1-乙基丁基基团、2-乙基丁基基团、3-乙基丁基基团、1,1-二甲基丁基基团、2,2-二甲基丁基基团、3,3-二甲基丁基基团、1-乙基-1-甲基丙基基团、正庚基基团、1-甲基己基基团、2-甲基己基基团、3-甲基己基基团、4-甲基己基基团、5-甲基己基基团、1-乙基戊基基团、2-乙基戊基基团、3-乙基戊基基团、4-乙基戊基基团、1,1-二甲基戊基基团、2,2-二甲基戊基基团、3,3-二甲基戊基基团、4,4-二甲基戊基基团、1-丙基丁基基团、正辛基基团、1-甲基庚基基团、2-甲基庚基基团、3-甲基庚基基团、4-甲基庚基基团、5-甲基庚基基团、6-甲基庚基基团、1-乙基己基基团、2-乙基己基基团、3-乙基己基基团、4-乙基己基基团、5-乙基己基基团、1,1-二甲基己基基团、2,2-二甲基己基基团、3,3-二甲基己基基团、4,4-二甲基己基基团、5,5-二甲基己基基团、1-丙基戊基基团、2-丙基戊基基团等。含有1个至4个碳原子的那些(C₁-C₄烷基)，例如特别是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基是优选。C₁-C₃烷基，特别是甲基、乙基、丙基和异丙基是更优选的。最优选的是C₁和C₂烷基，如甲基和乙基。

含有3个至8个碳原子的环烷基残基优选地包括：环丙基基团、环丁基基团、环戊基基团、环己基基团、环庚基基团和环辛基基团。环丙基基团、环丁基基团、环戊基基团和环己基基团是优选的。环丙基基团是特别优选的。

上述定义的任选取代的烷基的取代基优选地包括1个、2个或3个相同或不同的取代基，选自例如：以下所定义的卤素，例如优选的F，如上所定义的环烷基，例如优选环丙基，以下所定义的任选取代的杂芳基，例如优选苯并咪唑基基团，以下所定义的任选取代的氨基，例如优选氨基基团或苄氧基羰基氨基、羧基基团，以下所定义的氨基羰基基团，以及亚烷基基团例如特别是亚甲基基团，形成例如亚甲基取代的乙基基团(CH₃-(C＝CH₂)-或

其中*表示连接位点)。

在本发明的含义内，卤素包括氟、氯、溴和碘，优选氟或氯，最优选的氟。

被卤素取代并含有1个至8个碳原子的直链或支链烷基残基的示例包括：

氟甲基基团、二氟甲基基团、三氟甲基基团、氯甲基基团、二氯甲基基团、三氯甲基基团、溴甲基基团、二溴甲基基团、三溴甲基基团、1-氟乙基基团、1-氯乙基基团、1-溴乙基基团、2-氟乙基基团、2-氯乙基基团、2-溴乙基基团、二氟乙基基团如1,2-二氟乙基基团、1,2-二氯乙基基团、1,2-二溴乙基基团、2,2-二氟乙基基团、2,2-二氯乙基基团、2,2-二溴乙基基团、2,2,2-三氟乙基基团、七氟乙基基团、1-氟丙基基团、1-氯丙基基团、1-溴丙基基团、2-氟丙基基团、2-氯丙基基团、2-溴丙基基团、3-氟丙基基团、3-氯丙基基团、3-溴丙基基团、1,2-二氟丙基基团、1,2-二氯丙基基团、1,2-二溴丙基基团、2,3-二氟丙基基团、2,3-二氯丙基基团、2,3-二溴丙基基团、3,3,3-三氟丙基基团、2,2,3,3,3-五氟丙基基团、2-氟丁基基团、2-氯丁基基团、2-溴丁基基团、4-氟丁基基团、4-氯丁基基团、4-溴丁基基团、4,4,4-三氟丁基基团、2,2,3,3,4,4,4-七氟丁基基团、全氟丁基基团、2-氟戊基基团、2-氯戊基基团、2-溴戊基基团、5-氟戊基基团、5-氯戊基基团、5-溴戊基基团、全氟戊基基团、2-氟己基基团、2-氯己基基团、2-溴己基基团、6-氟己基基团、6-氯己基基团、6-溴己基基团、全氟己基基团、2-氟庚基基团、2-氯庚基基团、2-溴庚基基团、7-氟庚基基团、7-氯庚基基团、7-溴庚基基团、全氟庚基基团等。特别是氟烷基、二氟烷基和三氟烷基，优选三氟甲基以及单氟乙基和二氟乙基。特别优选的是三氟甲基。

环烷基取代的烷基基团的示例包括上述含有1个至3个、优选1个环烷基基团的烷基残基，例如：环丙基甲基、环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲基、2-环丙基乙基、2-环丁基乙基、2-环戊基乙基、2-环己基乙基、2-环丙基丙基或3-环丙基丙基、2-环丁基丙基或3-环丁基丙基、2-环戊基丙基或3-环己基丙基、2-环己基丙基或3-环己基丙基等。优选环丙基甲基。

杂芳基取代的烷基基团的示例包括上述烷基残基，其含有1个至3个，优选1个(任选取代的)杂芳基基团，例如吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吡唑基、咪唑基、苯并咪唑基、噻吩基或噁唑基基团，例如吡啶-2-基-甲基、吡啶-3-基-甲基、吡啶-4-基-甲基、2-吡啶-2-基-乙基、2-吡啶-1-基-乙基、2-吡啶-3-基-乙基、哒嗪-3-基-甲基、嘧啶-2-基-甲基、嘧啶-4-基-甲基、吡嗪-2-基-甲基、吡唑-3-基-甲基、吡唑-4-基-甲基、吡唑-5-基-甲基、咪唑-2-基-甲基、咪唑-5-基-甲基、苯并咪唑-2-基-甲基、噻吩-2-基-甲基、噻吩-3-基-甲基、1,3-噁唑-2-基-甲基。

优选被苯并咪唑基取代的烷基基团，如苯并咪唑-2-基-甲基和苯并咪唑-2-基-乙基。

氨基取代的烷基残基的示例包括上述含有1个至3个、优选1个(任选取代的)以下所定义的氨基基团的烷基残基，例如氨基烷基(NH₂-烷基)或单或二烷基氨基-烷基，例如氨基甲基、2-氨基乙基、2-氨基丙基或3-氨基丙基、甲基氨基甲基、甲基氨基乙基、甲基氨基丙基、2-乙基氨基甲基、3-乙基氨基甲基、2-乙基氨基乙基、3-乙基氨基乙基等。优选3-氨基丙基，或可被任选取代的烷氧基羰基氨基基团取代的烷基基团，如根据下式的基团

其中R为苯基基团，形成苄氧羰基氨基丙基基团。

根据本发明的任选取代的氨基优选地包括：氨基(-NH₂)、任选取代的单或二烷基氨基(烷基-NH-、(烷基)₂N-)，其中关于“烷基”可参考上述任选取代的烷基的定义。优选单或二甲基氨基、单或二乙基氨基以及单丙基氨基。最优选氨基基团(-NH₂)和单丙基氨基。

此外，在本发明的意义上，羧基基团表示基团[-(C＝O)-OH]，并且氨基羰基基团表示基团[NH₂-(C＝O)-]。

任选取代的烷氧基包括任选取代的烷基-O-基团，其中可参考烷基基团的前述定义。优选的烷氧基基团是含有至多6个碳原子的直链或支链烷氧基基团，如甲氧基基团、乙氧基基团、正丙氧基基团、异丙氧基基团、正丁氧基基团、异丁氧基基团、仲丁氧基基团、叔丁氧基基团、正戊氧基基团、异戊氧基基团、仲戊氧基基团、叔戊氧基基团、2-甲基丁氧基基团、正己氧基基团、异己氧基基团、叔己氧基基团、仲己氧基基团、2-甲基戊氧基基团、3-甲基戊氧基基团、1-乙基丁氧基基团、2-乙基丁氧基基团、1,1-二甲基丁氧基基团、2,2-二甲基丁氧基基团、3,3-二甲基丁氧基基团、1-乙基-1-甲基丙氧基基团，以及环烷氧基基团如环戊氧基基团或环己氧基基团。优选甲氧基基团、乙氧基基团、正丙氧基基团和异丙氧基基团。更优选甲氧基和乙氧基基团。特别优选甲氧基基团。

在本发明中，任选取代的烷二基优选地是具有1个至6个、优选1个至4个、更优选1个、2个或3个碳原子的二价直链或支链的烷二基，其可任选地带有1个至3个、优选1个或2个选自卤素、羟基(-OH)、氧代(C＝O；形成羰基或酰基基团[-(C＝O)-])和如上定义的烷基例如优选甲基的取代基。以下可作为优选示例提及：亚甲基、乙烷-1,2-二基、乙烷-1,1-二基、丙烷-1,3-二基、丙烷-1,1-二基、丙烷-1,2-二基、丙烷-2,2-二基、丁烷-1,4-二基、丁烷-1,2-二基、丁烷-1,3-二基、丁烷-2,3-二基、丁烷-1,1-二基、丁烷-2,2-二基、丁烷-3,3-二基、戊烷-1,5-二基等。特别优选亚甲基、乙烷-1,2-二基、乙烷-1,1-二基、丙烷-1,3-二基、丙烷-2,2-二基和丁烷-2,2-二基。最优选亚甲基、乙烷-1,2-二基和丙烷-1,3-二基。

优选的取代的烷二基是羟基取代的烷二基如羟基取代的乙烷二基，氧代取代的烷二基如氧代取代的亚甲基或乙烷二基，形成羰基或酰基(乙酰基)基团，卤素取代的烷二基基团如被一个或两个选自F和Cl的卤素原子取代的烷二基基团，优选2,2-二氟乙烷二基，或被甲基基团取代的烷二基基团。

根据本发明，进一步可能的是，具有如上所定义的直链或支链烷二基基团含义的A¹和具有如上所定义的任选取代的烷基基团含义的R²与它们所连接的氮原子一起形成任选取代的4元至6元环，该环可被1个至3个如上所定义的取代基取代。因此，A¹和R²可一起来自根据下式之一的基团：

其中优选(取代或未取代的)4元环，例如非常特别地为基团

其中左侧结合位点表示与本发明的式(I)中X¹和X²之间的杂环5元环的直接结合位点。右侧结合位点表示与具有本文所定义的烷二基基团含义的基团A²的结合位点。

在本文任何地方所定义的式(I)中，n具有整数1至3的含义，包括1、2或3，因此表示亚甲基基团、乙烷-1,2-二基基团或丙烷-1,3-二基基团。更优选n是1或2，并且甚至更优选地n是1，表示亚甲基基团。

在本发明中，上述式(I)的各个取代基可具有以下含义：

A)X¹是N或O；并且

X²是N、S或O；

条件是X¹和X²不同；

从而形成根据下式的5元杂环

其中*表示与氨基羰基基团的连接位点，**表示与A¹基团的连接位点。

B)n是整数1、2或3；优选地n是1或2，更优选地n是1。

C)R¹选自

-氢，和

-任选取代的烷基(如上所定义)；

优选地R¹是氢或甲基，更优选地R¹是氢。

D)R²选自

-氢，和

-任选取代的烷基(如上所定义)；

优选地R²是氢或C₁-C₄烷基，更优选地R²是氢或甲基，甚至更优选地R²是氢。E)R³表示1个、2个或3个任选的取代基，这些取代基能够独立地选自

-卤素(如上所定义)、

-氰基、

-任选取代的烷基(如上所定义)、

-任选取代的烷氧基(如上所定义)，和

-羧基(如上所定义)；

优选地R³表示1个或2个任选的取代基，这些取代基能够独立地选自

-卤素、

-氰基、

-烷基(如上所定义)(其可被1个、2个或3个卤素原子(如上所定义)取代)、

任选取代的烷氧基(如上所定义)，和

羧基(如上所定义)；

更优选地R³表示1个或2个任选的取代基，这些取代基能够独立地选自

-F和Cl、

-氰基、

-三氟甲基、

-甲氧基，和

-羧基基团；

甚至更优选地R³为氢，表示式(I)中未取代的末端苯并咪唑基环。

F)R⁴选自

-氢、

-卤素(如上所定义)、

-C₁-C₃烷基，和

-卤素取代的烷基(如上所定义)；

优选地R⁴选自

-氢、

-Cl、

-甲基、乙基、异丙基，和

-三氟甲基；

更优选R⁴选自

-氢、

-Cl、

-甲基，和

-三氟甲基；

更优选R⁴选自

-氢、

-Cl，和

-甲基；

甚至更优选地R⁴是氢。

G)A¹是烷二基；

优选地A¹是亚甲基或乙烷-1,2-二基，更优选地A¹是乙烷-1,2-二基。

H)A²是烷二基；

优选地A²是亚甲基、乙烷-1,2-二基或丙烷-1,3-二基；

更优选地A²是亚甲基或乙烷-1,2-二基；

甚至更优选地A²是乙烷-1,2-二基。

I)或A¹和R²与它们所连接的氮原子一起形成如上所定义的任选取代的4元至6元环；

其中A¹和R²与它们所连接的氮原子一起优选地形成如上所定义的任选取代的4元环；

其中A¹和R²与它们所连接的氮原子一起更优选形成未取代的4元环(氮杂环丁基环)。

下列(I)的化合物的取代基可特别具有以下含义：

n具有根据上述B)的含义中的任一种，并且其余取代基可具有A)和C)至I)中定义的含义中的任一种。

R¹具有根据上述C)的含义中的任一种，并且其余取代基可具有A)和B)和D)至I)中定义的含义中的任一种。

R²具有根据上述D)的含义中的任一种，并且其余取代基可具有A)至C)和E)至H)或I)中定义的含义中的任一种。

R³具有根据上述E)的含义中的任一种，并且其余取代基可具有A)至C)和F)至I)中定义的含义中的任一种。

R⁴具有根据上述F)的含义中的任一种，并且其余取代基可具有A)至E)和G)至I)中定义的含义中的任一种。

A¹具有根据上述G)的含义中的任一种，并且其余取代基可具有A)至F)和H)或I)中定义的含义中的任一种。

A²具有根据上述H)的含义中的任一种，并且其余取代基可具有A)至G)和I)中定义的含义中的任一种。

R²和A¹具有如I)中定义的含义中的任一种，并且其余取代基可具有如A)至C)、E)、F)和H)中定义的含义中的任一种。

在本发明的优选实施方案中，通式(I)化合物被定义为

X¹是N或O；并且

X²是N、S或O；

条件是X¹和X²不同；

R¹是氢；

n是1、2或3；

A¹是亚甲基或乙烷-1,2-二基；

A²是亚甲基、乙烷-1,2-二基或丙烷-1,3-二基；

R²是氢或C₁-C₄烷基；

或

A¹和R²与它们所连接的氮原子一起形成任选取代的4元环；

R³表示1个或2个任选的取代基，这些取代基能够独立地选自

-卤素、

-氰基、

-烷基，其可被1个、2个或3个卤素原子取代、

-任选取代的烷氧基，和

-羧基基团；

R⁴选自

-氢、

-Cl、

-甲基、乙基、异丙基，和

-三氟甲基。

在本发明的进一步优选实施方案中，通式(I)化合物被定义为

X¹是N或O；并且

X²是N、S或O；

条件是X¹和X²不同；

R¹是氢；

n是1或2；

A¹是亚甲基或乙烷-1,2-二基；

A²是亚甲基、乙烷-1,2-二基或丙烷-1,3-二基；

R²是氢或甲基；

或

A¹和R²与它们所连接的氮原子一起形成未取代的4元环；

R³表示1个或2个任选的取代基，这些取代基能够独立地选自

-F和Cl、

-氰基、

-三氟甲基、

-甲氧基，和

-羧基；

R⁴选自

-氢、

-Cl、

-甲基，和

-三氟甲基。

在本发明的进一步优选实施方案中，通式(I)化合物被定义为

X¹是N或O；并且

X²是N、S或O；

条件是X¹和X²不同；

R¹是氢；

n是1；

A¹是亚甲基或乙烷-1,2-二基；

A²是亚甲基、乙烷-1,2-二基或丙烷-1,3-二基；

R²是氢；

或

A¹和R²与它们所连接的氮原子一起形成未取代的4元环；

R³表示氢，由此形成未取代的末端苯并咪唑基环；

R⁴选自

-氢、

-Cl，和

-甲基。

在本发明的进一步优选实施方案中，通式(I)化合物被定义为

X¹是N或O；并且

X²是N、S或O；

条件是X¹和X²不同；

R¹是氢；

n是1；

A¹是亚甲基或乙烷-1,2-二基；

A²是亚甲基、乙烷-1,2-二基或丙烷-1,3-二基；

R²是氢；

或

A¹和R²与它们所连接的氮原子一起形成未取代的4元环；

R³表示氢，由此形成未取代的末端苯并咪唑基环；并且

R⁴是氢。

在进一步方面，本发明涉及如本文所定义的新用途和治疗方法，其中根据式(I)化合物或其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物选自如上所示的式(I)化合物，其中

n＝1；

R³＝氢；

R⁴＝氢；

A¹＝亚甲基或乙烷-1,2-二基；

A²＝亚甲基、乙烷-1,2-二基或丙烷-1,3-二基；

或A¹和R²与它们所连接的氮原子一起形成任选取代的4元环，

从而形成根据式(II)或(III)的化合物：

其中在式(II)和/或(III)中

l是0或1；

m是整数1、2或3，并且

X¹、X²、R¹和R²具有本文任何地方对式(I)化合物所定义的含义。

优选地，在式(II)和(III)中，X¹和X²具有如A)中所定义的含义。

在式(II)中，R¹和R²优选为氢。

在式(III)中，R¹优选为氢，并且m优选为2。

在本发明的进一步优选实施方案中，通式(II)化合物被定义为

X¹和X²选自N和O并且是不同的；

R¹＝氢；

R²＝氢；

l＝1；和

m＝2。

如本文所定义的充当膜铁转运蛋白抑制剂并且适合治疗严重形式的β-地中海贫血的其他化合物是WO2020/123850A1中描述的那些，其以引用方式整体并入本文。WO2020/123850A1中所述的适用于治疗本文所定义的严重形式的β-地中海贫血的那些具体化合物可选自：

在进一步优选方面本发明涉及如本文所定义的新用途和治疗方法，其中根据式(I)化合物或根据WO2020/123850A1的化合物以其药学上可接受的盐或溶剂合物、水合物和多晶型物的形式使用。

关于本文任何地方所定义的式(I)、(II)和(III)化合物的合适的药学上可接受的盐参考国际申请WO2017/068089、WO2017/068090，并且特别是WO2018/192973。其中公开的药学上可接受的盐的定义在本文引入作为参考。

在进一步优选方面，本发明涉及如本文所定义的新用途和治疗方法，其中式(I)、(II)或(III)化合物的药学上可接受的盐选自与酸形成的盐，这些酸选自苯甲酸、柠檬酸、富马酸、盐酸、乳酸、苹果酸、马来酸、甲磺酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸和甲苯磺酸。优选地，酸选自柠檬酸、盐酸、马来酸、磷酸和硫酸。

在进一步优选方面，本发明涉及如本文所定义的新用途和治疗方法，其中式(I)、(II)或(III)化合物的药学上可接受的盐选自单盐(1:1盐)、三盐(1:3盐)和特征在于化合物(I)、(II)或(III)与酸的比率为1-2:1-3的盐；包括其溶剂合物、水合物和多晶型物。

其中，化合物(I)、(II)或(III)的盐的特征在于选择的碱:酸的比例，即化合物(I)、(II)或(III):如上所定义的酸在1.0至2.0(摩尔碱):1.0至3.0(摩尔酸)范围。在一个具体的实施方案中，所选择的碱:酸是1.0至2.0(摩尔碱):1.0至2.0(摩尔酸)。

具体的示例包括以下碱:酸的比率，即化合物(I)、(II)或(III):如上所定义的酸：

1.0(摩尔碱)：1.0(摩尔酸)；

1.0(摩尔碱)：1.25(摩尔酸)；

1.0(摩尔碱)：1.35(摩尔酸)；

1.0(摩尔碱)：1.5(摩尔酸)；

1.0(摩尔碱)：1.75(摩尔酸)；

1.0(摩尔碱)：2.0(摩尔酸)；

1.0(摩尔碱)：3.0(摩尔酸)；以及

2.0(摩尔碱)：1.0(摩尔酸)。

其中，具有碱:酸为1:1的比率的盐也称为“单盐”或“1:1盐”。例如，单HCl盐也称为1HCl或1HCl盐。

其中，具有碱:酸为1:2的比率的盐也称为“二盐”或“1:2盐”。例如，二HCl盐也称为2HCl或2HCl盐。

其中，具有碱:酸为1:3的比率的盐也称为“三盐”、“三合盐”或“1:3盐”。例如，三HCl盐也称为3HCl或3HCl盐。

具有碱:酸为1:1.25的比率的盐也称为“1:1.25盐”。

具有碱:酸为1:1.35的比率的盐也称为“1:1.35盐”。

具有碱:酸为1:1.5的比率的盐也称为“1:1.5盐”。

具有碱:酸为1:1.75的比率的盐也称为“1:1.75盐”。

具有碱:酸为2:1的比率的盐也称为“半盐”或“2:1盐”。

根据本发明的式(I)、(II)或(III)化合物的盐可以无定形、多晶型、结晶和/或半结晶(部分结晶)形式以及以该盐的溶剂合物形式存在。优选地，根据本发明的式(I)、(II)或(III)化合物的盐以结晶和/或半结晶(部分结晶)形式和/或其溶剂合物形式存在。

优选的盐或盐溶剂合物的结晶度可通过使用常规分析方法例如特别是通过使用各种X-射线方法来测定，这使得对盐化合物进行清楚和简单地分析。特别是，结晶度的等级可通过使用粉末X射线衍射(反射)方法或通过使用粉末X射线衍射(透射)方法(PXRD)来测定或确认。对于具有相同化学组成的结晶固体，不同的所得晶体点阵由术语“多晶型现象”概括。关于具有特定结晶度的溶剂合物、水合物和多晶型物和盐参考国际申请WO2018/192973，其以引用方式包括在本文中。

在进一步优选方面，本发明涉及如本文所定义的新用途和治疗方法，其中式(I)、(II)或(III)化合物选自：

及其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和多晶型物。

在进一步优选方面，本发明涉及如本文所定义的新用途和治疗方法，其中式(I)、(II)或(III)的化合物选自：

及其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和多晶型物。

在进一步优选方面，本发明涉及如本文所定义的新用途和治疗方法，其中式(I)、(II)或(III)化合物选自：

在进一步优选方面，本发明涉及如本文所定义的新用途和治疗方法，其中式(I)、(II)或(III)的化合物选自：

及其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和多晶型物。

在本发明的甚至更优选的方面，式(I)、(II)或(III)化合物选自：

及其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和多晶型物。

在本发明的进一步优选方面，式(I)、(II)或(III)化合物选自以下盐：

具有下式的1:1硫酸盐

具有下式的1:1磷酸盐

2:1磷酸盐(半磷酸盐)

具有下式的1:3HCl盐

以及它们的多晶型物。

如WO2017/068089、WO2017/068090和WO2018/192973中所述，式(I)化合物用作膜铁转运蛋白抑制剂。因此，关于化合物的膜铁转运蛋白抑制剂活性参考所述国际申请。

含有膜铁转运蛋白抑制剂化合物的药物

本发明的进一步方面涉及含有一种或多种如本文任何地方所定义的式(I)、(II)或(III)化合物的药物或药物组合物，用于如本文任何地方所定义的肾损伤特别是IRI和AKI的新用途和治疗方法。

此类药物可进一步包含一种或多种药物载体和/或一种或多种助剂和/或一种或多种溶剂。

优选地，该药物是口服剂型的形式，例如如上所定义。

优选地，药物载体和/或助剂和/或溶剂选自用于制备口服和/或静脉内剂型的合适化合物。

所述药物组合物包含例如高达99重量％或高达90重量％或高达80重量％或高达70重量％的本发明的膜铁转运蛋白抑制剂化合物，其余的均由药学可接受的载体和/或助剂和/或溶剂和/或任选的其他药学活性化合物形成。

其中，药学上可接受的载体、辅助物质或溶剂是常见的药物载体、辅助物质或溶剂，包括各种有机或无机载体和/或辅助材料，因为它们通常用于药物目的，特别是用于固体药物制剂。示例包括：赋形剂，例如蔗糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、纤维素、滑石、磷酸钙、碳酸钙；粘合剂，例如纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚丙基吡咯烷酮、明胶、阿拉伯胶、聚乙二醇、蔗糖、淀粉；崩解剂，例如淀粉、水解淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙盐、羟丙基淀粉、乙二醇淀粉钠、碳酸氢钠、磷酸钙、柠檬酸钙；润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石、月桂基硫酸钠；香料，例如柠檬酸、薄荷醇、甘氨酸、橙粉；防腐剂，例如苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、对羟基苯甲酸酯(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯)；稳定剂，例如柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸和来自titriplex系列的多羧酸，例如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)；悬浮剂，例如甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸铝；分散剂；稀释剂，例如水、有机溶剂；蜡、脂肪和油，例如蜂蜡、可可脂；聚乙二醇；白凡士林等。

液体药物制剂，例如溶液、悬浮液和凝胶通常含有液体载体，例如水和/或药学上可接受的有机溶剂。此外，此类液体制剂还可包含pH调节剂、乳化剂或分散剂、缓冲剂、防腐剂、润湿剂、胶凝剂(例如甲基纤维素)、染料和/或调味剂，例如如上所定义的。组合物可以是等渗的，即，它们可具有与血液相同的渗透压。组合物的等渗性可通过使用氯化钠和其他药学上可接受的试剂来调节，这些试剂例如葡萄糖、麦芽糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇和其他无机或有机可溶性物质。液体组合物的粘度可通过药学上可接受的增稠剂例如甲基纤维素来调节。其他合适的增稠剂包括例如黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的优选浓度取决于所选择的试剂。

可使用药学上可接受的防腐剂以增加液体组合物的储存寿命。苯甲醇可以是合适的，尽管也可以使用多种防腐剂，包括例如对羟基苯甲酸酯、硫柳汞、氯丁醇和苯扎氯铵。

联合疗法

本发明的进一步目的涉及药物或联合制剂，其包含一种或多种如本文任何地方所定义的膜铁转运蛋白抑制剂化合物以及至少一种另外的药物活性化合物(“联合疗法化合物”)，优选的另外的活性化合物可用于治疗如本文所定义的肾损伤，特别是用于IRI和AKI。优选的联合疗法化合物特别是用于预防和治疗铁过载和相关症状的化合物。最优选的联合疗法化合物是铁螯合化合物，或用于预防和治疗伴随或由铁过载、IRI和AKI引起的任何状态、障碍或疾病的化合物。优选地，该至少一种另外的药学活性联合疗法化合物选自用于减少铁过载的药物(例如Tmprss6-ASO)和铁螯合剂，特别是姜黄素、SSP-004184、地夫立群、地拉罗司、去铁胺和去铁酮。

进一步优选的联合疗法化合物可选自用于治疗炎症、合成人铁调素(LJPC-401)、铁调素肽模拟物PTG-300和靶向Tmprss6的反义寡核苷酸(IONIS-TMPRSS6-L RX)。

在进一步方面，本发明涉及如本文所定义的新用途和医学治疗，其中将如本文所定义的膜铁转运蛋白抑制剂化合物与一种或多种如上所定义的联合疗法化合物以固定剂量或自由剂量联合在联合疗法中施用给有此需要的患者，以供顺序使用。此类联合疗法包括共同施用本发明所定义的膜铁转运蛋白抑制剂化合物与该至少一种另外的药物活性化合物(药物/联合疗法化合物)。

固定剂量联合疗法中的联合疗法包括将本文所定义的膜铁转运蛋白抑制剂化合物与该至少一种另外的药物活性化合物以固定剂量制剂共同施用。

自由剂量联合疗法中的联合疗法包括通过同时施用单个化合物或通过分布在一段时间段内顺序使用单个化合物以各自化合物的自由剂量共同施用如本文所定义的膜铁转运蛋白抑制剂化合物和该至少一种另外的药学活性化合物。

图1：实施例II中给药方案的说明。

图2：用Fpn127以120mg/kg或300mg/kg治疗4h或8h的初始C57BL/6小鼠的血清铁水平。

溶媒是0.5％甲基纤维素的水溶液

实施例

通过以下实施例更详细地说明了本发明。这些实施例仅是解释性的，并且本领域技术人员可将具体实施例扩展至根据本发明的其他膜铁转运蛋白抑制剂化合物。

I.膜铁转运蛋白抑制剂示例化合物

关于本文所述的具体膜铁转运蛋白抑制剂示例化合物编号1、2、4、40、94、118、126、127、193、206、208和233的制备以及它们的药学上可接受的盐的制备参考国际申请WO2017/068089、WO2017/068090和WO2018/192973。

关于WO2020/123850A1中所述的具体膜铁转运蛋白抑制剂化合物的制备参考所述国际申请WO2020/123850A1中所述的制备方法。

II.药理学测定法

II.1Fpn127在C57BL/6小鼠中降低血清铁

为了确定导致持续血清铁减少的Fpn127的剂量，C57BL/6小鼠接受120mg/kg或300mg/kg Fpn127 po 4h或8h。在给药后4h，两种剂量的血清铁都显著降低。然而，仅300mg/kg的剂量维持低铁血症8小时(图2)。在初始C57BL/6小鼠中的这些数据表明在AKI的双侧输尿管梗阻模型中使用300mg/kg po的剂量。

II.2膜铁转运蛋白抑制剂Fpn127在双侧缺血性急性肾损伤小鼠模型中的体内疗效

肾缺血-再灌注损伤(IRI)是急性肾损伤(AKI)的主要原因，并且非转铁蛋白结合铁(NTBI)引起的铁介导的氧化应激与IRI发病机理有关(Baliga R、Ueda N、Shah SV，Biochem J，第291卷，第901–905页，1993年)。铁调素是防止铁通过膜铁转运蛋白从细胞输出的关键调节剂或铁稳态，已显示其介导肾IRI中的保护(ScindiaY等人，JASN，2015年)。

本发明的膜铁转运蛋白抑制剂化合物在治疗肾损伤如IRI和AKI中的疗效可在双侧缺血性肾损伤模型中确定。作为示例性的根据式(I)的膜铁转运蛋白抑制剂化合物，可使用实施例化合物编号127(Fpn127)。

为了确定该模型中肾损伤的最佳水平，进行了比较25分钟和30分钟的双侧肾缺血的初步研究，如以下所述：Wei Q和Dong Z，“Mouse model of ischemic acute kidneyinjury:technical notes and tricks”，Am J Physiol Renal Physiol，第303卷，第F1487–F1494页，2012年。通过腹腔注射用50mg/kg至60mg/kg戊巴比妥钠麻醉小鼠。用无菌生理盐水稀释戊巴比妥溶液至注射用浓度5mg/ml。在戊巴比妥注射后不久，皮下施用50μg/kg丁丙诺啡以缓解疼痛和痛苦。在注射戊巴比妥和丁丙诺啡后，用理发推子将小鼠两侧的毛发除去。然后用70％酒精棉签将手术区域的皮肤擦干净。在皮肤准备好后立即将小鼠置于恒温监测系统的恒温毯上，并用无菌纱布覆盖。通过直肠探针监测体温，并控制在36.5℃至37℃的范围内(我们的常规设定点是36.7℃，并且温度在0.1℃范围内变化)。直到1)体温稳定在设定点，以及2)小鼠处于深度麻醉中并因此对由脚趾捏引起的疼痛不产生反应，才开始手术。注射戊巴比妥后通常需要30min才达到深度麻醉。将小鼠放置在位于右侧的恒温站上。沿背部切开左侧的皮肤和肌肉以暴露左肾。切口位于距小鼠背部身体的1/3处，并且切口大小沿背部为1cm至1.5cm。然后用无菌棉签将肾从切口中推出以暴露肾蒂。用超细尖镊子进行蒂组织的解剖以除去肾蒂周围的组织，从而暴露血管以供肾蒂夹持。准备好后，将左肾放回腹腔。通过类似的外科规程准备右肾蒂，但由于右肾的不同位置，切口更靠近肋骨。在蒂准备好后，将两个肾放回到它们在腹腔中的原始位置。然后在恒温台上用无菌纱布覆盖小鼠，使其体温再次稳定，这通常需要5min至10min。用棉签将右肾轻轻推出体腔以暴露蒂。使用微动脉瘤夹持蒂以阻断流向肾的血流从而诱导肾缺血。右肾缺血的持续时间从夹持时间开始。通过在几秒内肾从红色到深紫色的颜色变化来指示完全缺血。经检验肾颜色变化后，将肾放回腹腔。然后将小鼠放在其右侧以进行左肾蒂的夹持和缺血。在右肾夹持和左肾夹持之间存在约1min至1.5min的时间延迟。然而，分别记录每一侧的缺血时间以确保两个肾接受相同持续时间的缺血。在缺血后，在期望的时间释放微动脉瘤夹以使每个肾脏开始再灌注，这通过肾颜色变为红色来指示。Vicryl缝合线用于闭合切口的肌肉层，然后用Michel伤口夹闭合皮肤伤口。伤口闭合后立即给每只小鼠腹腔给予0.5ml温的无菌生理盐水。然后将动物保持在加热垫上，直到它获得完全的意识，然后再将其放回其圈养笼。将肾暴露于再灌注24小时。假手术小鼠在不夹持肾蒂的情况下进行双侧胁切口。缺血后24小时将小鼠安乐死，并收集肾和血液。测量血清肌酐水平并将其用作损伤严重程度的标志物。以下组为8周龄至10周龄的C57BL/6J雄性小鼠；在初步研究中使用n＝4/组：

1.假手术

2.IRI—25min

3.IRI-30min

主要研究：

基于来自初步研究的结果，选择血浆肌酐水平介于2.5mg/dL至3mg/dL之间的缺血持续时间用于主要研究。在IRI前，用Fpn127(300mg/kg，经口(p.o.))，Fpn127(100mg/kg，静脉内(i.v.))，铁调素(50μg/小鼠，腹腔(i.p.))或溶媒(0.5％甲基纤维素，p.o.)预治疗小鼠24小时。然后，在麻醉的小鼠中暴露两个肾蒂并交叉夹持25分钟或30分钟。除去夹子，并使肾再灌注24小时。假手术小鼠在不夹持肾蒂的情况下进行双侧胁切口。缺血后24小时将小鼠安乐死，并收集肾和血液。

包括以下小鼠组：8周龄至10周龄C57BL/6J雄性小鼠，n＝8/组。

4.假手术—溶媒(0.5％甲基纤维素，10ml/kg，p.o.)

5.IRI—溶媒(0.5％甲基纤维素，10ml/kg，p.o.)

6.IRI—Fpn127(300mg/kg、10ml/kg，在IRI前24h，p.o.)

7.IRI—Fpn127(100mg/kg、5ml/kg，在IRI前24h，i.v.)

8.IRI—铁调素(50μg/小鼠，5ml/kg，IRI前24h)，i.p.

图1中示出了给药时间间隔。

在研究结束时测量以下标志物：血浆肌酐、血尿素氮(BUN)、总血浆铁、NTBI、血浆铁调素、脾、肾和肝铁。

进行肾切片的苏木精/曙红(HE)染色以评估肾组织损伤的程度，其中以肾小管损伤评分作为读数。使用caspase-3染色对肾切片进行免疫组织化学以评估肾损害的水平。

通过检测肾切片中的4-HNE来评估肾中ROS介导的氧化应激。通过qPCR测量肝、脾和肾中膜铁转运蛋白的基因表达。

通过蛋白质印迹和qPCR测量器官中的H-铁蛋白表达。

通过使用流式细胞术用抗CD45抗体染色来检测肾中白细胞浸润。

通过CD11b+细胞的抗Ly6G和Ly6C标记以及流式细胞术分析鉴定中性粒细胞。

在患者中，急性肾损伤的发作是不可预见的，并且理想地，接近缺血事件的药物剂量是优选的。为了优化膜铁转运蛋白抑制剂的给药方案，在IRI前用Fpn127治疗小鼠1h、3h、6h、9h、12h和15h。包括以下小鼠组：8周龄至10周龄C57BL/6J雄性小鼠，n＝8/组。

1.假手术—溶媒(0.5％甲基纤维素，10ml/kg，p.o.)

2.IRI—溶媒(0.5％甲基纤维素，10ml/kg，p.o.)

3.IRI—Fpn127(300mg/kg、10ml/kg，在IRI前2h，p.o.)

4.IRI—Fpn127(300mg/kg、10ml/kg，在IRI前4h，p.o.)

5.IRI—Fpn127(300mg/kg、10ml/kg，在IRI前6h，p.o.)

6.IRI—Fpn127(300mg/kg、10ml/kg，在IRI前8h，p.o.)

7.IRI—Fpn127(300mg/kg、10ml/kg，在IRI前12h，p.o.)

8.IRI—Fpn127(300mg/kg、10ml/kg，在IRI前16h，p.o.)

在主要研究中测量的肾功能参数用作疗效读数。

为了进一步优化给药方案，在IRI前0.5h、1h和3h或IRI后1h，通过i.v.途径给小鼠施用Fpn127。包括以下小鼠组：8周龄至10周龄C57BL/6J雄性小鼠，n＝8/组。

假手术—溶媒(生理盐水，5ml/kg，i.v.)

1.IRI—溶媒(生理盐水，5ml/kg，i.v.)

2.IRI—Fpn127(100mg/kg、5ml/kg，在IRI前0.5h，i.v.)

3.IRI—Fpn127(100mg/kg、5ml/kg，在IRI前1h，i.v.)

4.IRI—Fpn127(100mg/kg、5ml/kg，在IRI前3h，i.v.)

5.IRI—Fpn127(100mg/kg、5ml/kg，在IRI后1h，i.v.)

在主要研究中测量的肾功能参数用作疗效读数。

II.3降低肾组织中ROS的比例

膜铁转运蛋白抑制剂例如Fpn127对肾组织中ROS水平的影响可通过可商购的发射远红外的ROS-敏感性传感器来监测。

特别是，ROS测定可用作效率标志物，类似于Scindia等人2015年(上文引用)中所述。

III.Fpn127对上述IRI/AKI小鼠模型中NTBI和LPI水平的影响

如上所述，在AKI期间，认为由于膜铁转运蛋白介导的铁从回收损害细胞如RBC和其他类型受损细胞的巨噬细胞中输出而导致的血浆NTBI水平升高会诱导组织损伤。本发明的膜铁转运蛋白抑制剂如Fpn127具有降低血浆NTBI(和LPI)水平和相关副作用的潜力。

在用本发明的溶媒或膜铁转运蛋白抑制剂如Fpn127治疗的小鼠中研究了上述IRI/AKI小鼠模型中NTBI的水平，如上所述。使用先前描述的次氮基三乙酸酯-NTBI方法(NTA-NTBI)(Singh S、Hider RC、Porter JB，“A direct method for quantification ofnon-transferrin-bound iron”，Anal Biochem.，1990年5月1日，第186卷第2期，第320-323页)并稍作修改。

简言之，将0.02mL 800mM NTA(pH 5.7)加入到0.18mL小鼠血清池中，并允许在22℃下静置30分钟。使用Whatman Vectaspin超速离心装置(30kDa)在12320g下对溶液进行超滤，并将超滤液(0.02mL)直接注射到用5％乙腈和3mM去铁酮(DFP)的5mM MOPS(pH 7.8)溶液平衡的高效液相色谱柱(ChromSpher-ODS，5μM，100×3mM，装有适当保护柱的玻璃柱)上。然后NTA-铁复合物交换形成DFP-铁复合物，由Waters996光电二极管阵列在460nm处检测到。使用在80mM NTA中制备的标准铁浓度进样来生成标准曲线。用于处理样本和制备标准品的800mM NTA溶液用2μM铁处理，以将污染试剂的背景铁归一化。这意味着零标准给出正信号，因为它包含作为NTA-复合物添加的背景铁。当血清中存在不饱和转铁蛋白时，这种另外的背景铁可被提供给空转铁蛋白位点，从而导致背景信号的损失并产生负的NTBI值。

NTBI也使用另选的方法(CP851 bead-NTBI)测定，如Garbowski MW、Ma Y、Fucharoen、Srichairatanakool S、Hider R、Porter JB，“Clinical and methodologicalfactors affecting non-transferrin-bound iron values using a novel fluorescentbead assay”，Transl Res.，2016年中所述的测定法。该测定法的标准如下制备：用MilliQ水将由100mM NTA和18mM原子吸收标准铁溶液制备的1mM铁-NTA复合物(1:2.5摩尔比)稀释至介于0μM至100μM之间的最终浓度。对于标准曲线，将120μL探针标记的珠悬浮液与20μL已知浓度的缓冲NTA-铁溶液在室温下温育20分钟，随后加入20μL来自野生型小鼠的对照血清(不含游离铁)和40μL最终浓度为2％的多聚甲醛(MOPS中10％)。将密封的96孔板中的悬浮液在37℃下振荡温育16小时，然后通过流式细胞术进行荧光测量。对于未知铁浓度的血清样本，将140μL量的珠与20μL血清样本温育20分钟，随后加入最终浓度为2％的40μL多聚甲醛。将可螯合荧光珠与作为对照的野生型小鼠血清混合，以建立100％的荧光，并相应计算可螯合荧光珠与上述IRI/AKI模型中测试的小鼠血清的相对荧光。在Beckman CoulterFC500流式细胞仪上进行测量，并在FlowJo软件上进行分析。门控基于未处理的珠群体的点图。记录10,000个事件的中值荧光，并针对珠自身荧光进行校正。用可变斜率S形剂量响应函数拟合标准曲线。

包含与转铁蛋白不紧密相关的所有形式的血清铁的NTBI在化学和功能上是异质的。LPI代表NTBI的组分，其具有氧化还原活性和可螯合性两者，能够渗透到器官中并诱导组织铁过载。LPI(Esposito BP1、Breuer W、Sirankapracha P、Pootrakul P、Hershko C、Cabantchik ZI，“Labile plasma iron in iron overload:redox activity andsusceptibility to chelation”，Blood，2003年)测定法测量给定样本产生ROS的铁比容量，并且被认为是参与组织损伤如AKI的最相关的活性铁物质之一。

FeROS^TM LPI试剂盒(Aferrix有限公司)用于测定用本发明的溶媒或膜铁转运蛋白抑制剂如Fpn127治疗的小鼠的血清中的LPI。

已经发现在IRI/AKI模型中测试的小鼠的NTBI和LPI水平作为翻译标志物，从而允许评价膜铁转运蛋白抑制剂治疗的效率。

该模型也可用于优化设计用于治疗IRI和AKI的膜铁转运蛋白抑制剂(例如Fpn127)的给药方案。于是，使用本发明的膜铁转运蛋白抑制剂可建立用于AKI的最佳联合疗法。

用上述模型和实施例，可证明本发明的膜铁转运蛋白抑制剂预防和改善IRI和AKI的能力。

IV.血清肌酐、尿白蛋白排泄、BUN、NGAL、血红蛋白(Hb)、肾H-铁蛋白、总血浆铁、 RBC溶血、肾膜铁转运蛋白和KIM-1

这些参数可使用常规方法测定。

例如，血浆中的铁水平可通过MULTIGENT铁测定法(Abbott Diagnostics)测定。总器官铁通过在啮齿动物模型中的电感耦合等离子体-光发射光谱(ICP-OES)或通过患者的磁共振成像来测定。

V.血清铁调素、IL-6、非血红素铁、肾中性粒细胞浸润

这些参数可如Scindia等人2015年(上文引用)所述测定。

VI.组织/器官铁水平

铁水平，例如肝、脾或肾铁水平可使用常规测定法来测定。例如，铁水平可通过磁共振成像来测定。

VII.组织形态学和组织学/肾小管坏死和细胞凋亡

组织形态学和组织病理学，例如肾小管坏死和细胞凋亡，可如Scindia等人2015年(上文引用)所述进行。

VIII.膜铁转运蛋白抑制剂VIT-2653(实施例化合物编号40)减轻豚鼠红细胞输血 后肾损伤的疗效

本发明的膜铁转运蛋白抑制剂化合物在预防和治疗根据本发明的肾损伤中的疗效已经进一步通过J.H.Baek等人(“Ferroportin inhibition attenuates plasma iron,oxidant stress,and renal injury following red blood cell transfusion inguinea pigs”，Transfusion，2020年3月，第60卷第3期，第513-523页)的结果证实。

所述实验是通过静脉内施用对应于本发明的实施例化合物编号40的小分子膜铁转运蛋白抑制剂VIT-2653进行的，并且进一步证实了本发明的发现。

通过给予膜铁转运蛋白抑制剂，显著改善了换血后的NTBI和Hb水平。

通过给予膜铁转运蛋白抑制剂可降低输血后肾中的总铁。评估了循环Hb对肾铁负载的贡献以及随后对氧化应激和细胞损伤的影响，表明向输血小鼠给予膜铁转运蛋白抑制剂，显著降低了血浆肌酐＞0.3mg/dL的变化的发生，该变化用作早期急性肾损伤(AKI)的指标。

实验细节和研究条件以及具体研究结果可以从上述论文得出。

Claims (16)

1.用于预防和治疗肾损伤的式(I)化合物及其药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，

其中

X¹是N或O；并且

X²是N、S或O；

条件是X¹和X²不同；

R¹选自

-氢，和

-任选取代的烷基；

n是1至3的整数；

A¹和A²独立地选自烷二基基团

R²是

-氢，或

-任选取代的烷基；

或

A¹和R²与它们所键合的氮原子一起形成任选取代的4元至6元环；

R³表示1个、2个或3个任选的取代基，所述取代基可以独立地选自

-卤素、

-氰基、

-任选取代的烷基、

-任选取代的烷氧基，和

-羧基基团；

R⁴选自

-氢、

-卤素、

-C₁-C₃烷基，和

-卤素取代的烷基。

2.根据前述权利要求中任一项所述的用于用途的式(I)化合物或其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，其中所述肾损伤选自由催化游离铁诱导的肾损伤。

3.根据前述权利要求中任一项所述的用于用途的式(I)化合物或其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，其中所述肾损伤选自肾缺血-再灌注损伤(IRI)、缺血性损伤和急性肾损伤。

4.根据前述权利要求中任一项所述的用于用途的式(I)化合物或其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，其中所述肾损伤选自急性肾损伤(AKI)、肾缺血-再灌注损伤(IRI)和由缺血性损伤引起的AKI、手术或外科干预后的AKI，以及与红细胞(RBC)输血相关的肾损伤。

5.根据前述权利要求中任一项所述的用于用途的式(I)化合物或其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，其中所述预防和/或治疗包括向患者施用一种或多种式(I)化合物、其盐、溶剂合物、水合物或多晶型物，所述患者具有以下特征：

i)血浆肌酐水平升高，和/或

ii)尿白蛋白排泄增加，和/或

iii)估计的肾小球滤过率(eGFR)降低，

每个都与正常生理水平相比，和/或

iv)通过KDIGO或RIFLE/AKIN分类定义的分期中的任一个或通过CSA-NGAL评分＞0或通过EGTI组织学评分＞0，将患者分类为患有AKI或处于患有AKI的风险中。

6.根据前述权利要求中任一项所述的用于用途的式(I)化合物或其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，其中所述预防和/或治疗包括：

a)血清肌酐的降低、加速降低或预防升高，和/或

b)eGFR的增加或预防降低，和/或

c)肾膜铁转运蛋白的降低或预防增加，和/或

d)H-铁蛋白水平的增加或预防降低，和/或

e)肾中性粒细胞浸润的降低或预防增加，和/或

f)血清IL-6水平的降低或预防增加。

7.根据前述权利要求中任一项所述的用于用途的式(I)化合物或其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，其中所述预防和/或治疗包括在IRI前、在红细胞输血前、在手术或外科干预前，在＞0小时至48小时、＞0小时至36小时、＞0小时至24小时、＞0小时至20小时、＞0小时至18小时、＞0小时至16小时、＞0小时至12小时、＞0小时至10小时、＞0小时至8小时、＞0小时至6小时、＞0小时至5小时、＞0小时至4小时、＞0小时至3小时、＞0小时至2小时、＞0小时至1小时或＞0小时至0.5小时的时间段内，将一种或多种所述式(I)化合物、其盐、溶剂合物、水合物或多晶型物施用给处于IRI和/或AKI风险的患者一次或多次。

8.根据前述权利要求中任一项所述的用于用途的式(I)化合物或其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，其中所述预防和/或治疗包括在外科干预、RBC输血或缺血性再灌注事件后立即至最多48小时之间，优选地在外科干预或缺血性再灌注事件后立即至最多12小时之间的时间段内，向有此需要的患者施用一种或多种式(I)化合物、其盐、溶剂合物、水合物或多晶型物一次或多次。

9.根据前述权利要求中任一项所述的用于用途的式(I)化合物或其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，其中所述式(I)化合物以介于0.5mg至500mg之间或介于1mg至300mg之间或介于1mg至250mg之间、优选地介于0.001mg/kg体重至35mg/kg体重之间的剂量施用。

10.根据前述权利要求中任一项所述的用于用途的式(I)化合物或其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，用于口服和/或静脉内施用，优选地用于静脉内施用。

11.根据前述权利要求中任一项所述的用于用途的式(I)化合物或其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，其中在式(I)中，

n＝1；

R³＝氢；

R⁴＝氢；

A¹＝亚甲基或乙烷-1,2-二基；

A²＝亚甲基、乙烷-1,2-二基或丙烷-1,3-二基；

或A¹和R²与它们所连接的氮原子一起形成任选取代的4元环，从而形成式(II)或(III)的化合物：

其中在式(II)和(III)中，

l是0或1；

m是整数1、2或3，并且

X¹、X²和R¹具有根据权利要求1所定义的含义。

12.根据前述权利要求中任一项所述的用于用途的化合物，所述化合物是与选自苯甲酸、柠檬酸、富马酸、盐酸、乳酸、苹果酸、马来酸、甲磺酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸和甲苯磺酸的酸形成的药学上可接受的盐的形式，

优选地与来自柠檬酸、盐酸、马来酸、磷酸和硫酸的酸形成的盐；

以及它们的溶剂合物、水合物和多晶型物。

13.根据前述权利要求中任一项所述的用于用途的化合物，其中所述式(I)化合物选自：

优选地，所述式(I)化合物选自：

以及它们的药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和多晶型物。

14.根据前述权利要求中任一项所述的用于用途的化合物以及它们的药学上可接受的盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，其中所述式(I)化合物选自：

或选自以下的盐以及它们的多晶型物：

具有下式的1:1硫酸盐

具有下式的1:1磷酸盐

具有下式的1:3HCl盐

15.一种药物，所述药物包含一种或多种根据前述权利要求1和10至13中任一项所定义的化合物，其中所述药物进一步包含一种或多种药物载体和/或助剂和/或溶剂，和/或一种或多种另外的药物活性化合物。

16.根据前述权利要求中任一项所定义的用于预防和/或治疗肾损伤的联合疗法中的式(I)化合物或其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，其中所述联合疗法包括将根据前述权利要求中任一项所定义的化合物，包括其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，与一种或多种其他另外的药物活性化合物共同施用，

其中所述联合疗法的共同施用可以固定剂量联合疗法进行，通过将根据前述权利要求中任一项所定义的化合物，包括其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，与一种或多种其他另外的药物活性化合物以固定剂量制剂共同施用，或

其中所述联合疗法的共同施用可以自由剂量联合疗法进行，通过将根据前述权利要求中任一项所定义的化合物，包括其盐、溶剂合物、水合物和多晶型物，以及所述一种或多种其他另外的药物活性化合物以相应化合物的自由剂量通过同时施用单个化合物或通过在一段时间内顺序使用给药的单个化合物共同施用。

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