CN114264751A - 一种高效液相色谱法分离米洛巴林中间体及其对映异构体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高效液相色谱法分离米洛巴林中间体及其对映异构体的方法，该方法色谱柱采用多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱，硅胶表面涂敷有纤维素‑三(3,5‑二甲基苯基氨基甲酸酯)；采用浓度为0.02～0.10%磷酸水溶液‑乙腈为流动相，其比例为55～70∶45～30；检测波长为205 nm～215 nm；柱温为15～30℃；流动相流速为0.3～1.0 mL/min；本发明提供的高效液相色谱法能实现米洛巴林中间体及其对映异构体完全分离，进样重复性良好，方法耐用性好，可用于米洛巴林中间体的质量控制。
Description
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及一种高效液相色谱法分离米洛巴林中间体及其对映异构体的方法。
背景技术
米洛巴林(Mirogabalin、DS-5565)是第一制药三共株式会社研发的一种药物，与加巴喷丁和普瑞巴林(Pregabalin)等药物类似。米洛巴林是一种新型的优先选择性α2δ-1配体，对中枢神经系统(CNS)中电压敏感性钙通道复合物的α2δ-1亚基具有高效性和选择性。米洛巴林结合α2δ钙通道(1和2)，但效能显著高于普加巴林。在治疗糖尿病周围神经性疼痛的II期临床试验中显示了良好的效果。
(1R,5S)-3-乙基二环[3.2.0]庚-3-烯-6-酮为米洛巴林中间体，其对映异构体为(1S,5R)-3-乙基二环[3.2.0]庚-3-烯-6-酮，两者结构式中双键较少，紫外吸收较弱；且化合物无明显的酸性和碱性基团，可能显中性。
原研专利CN104245951B公开了一种气相色谱法分离米洛巴林中间体及其对映异构体的检测方法如下：
色谱柱：Cyclosil-B(0.25mm×30m，DF＝0.25μm)
流速：1.5mL/min(He)分流比：1/10
炉温度：130℃(0-13min)→230℃(18-20min)
注射口温度：230℃探测器温度：230℃
保留时间：
(1R,5S)-3-乙基二环[3.2.0]庚-3-烯-6-酮(8.2min)
(1S,5R)-3-乙基二环[3.2.0]庚-3-烯-6-酮(9.5min)。
申请人尝试了该专利公开的方法分离米洛巴林中间体及其对映异构体，实验结果显示峰型不尖锐，峰响应不高，主峰理论塔板数较低，勉强超过5000，柱效差，灵敏度较低，载气需要使用氦气，成本较高；且该方法对样品反应液中水分含量要求较高，中控检测时样品需先经干燥处理后才能进样，气相操作安全性较差。
发明内容
本发明的要解决的问题是现有技术在分离米洛巴林中间体及其对映异构体时灵敏度低、成本高、中控检测样品处理繁琐和安全性低的问题。
为解决上述问题，本发明提供一种高效液相色谱法分离米洛巴林中间体及其对映异构体的方法：
1)色谱条件：色谱柱采用多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱，硅胶表面涂敷有纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)；采用浓度为0.02～0.10％磷酸水溶液-乙腈为流动相，其比例为55～70∶45～30；检测波长为205nm～215nm；柱温为15～30℃；流动相流速为0.3～1.0mL/min；
2)供试品及系统适应性溶液的配制：将样品用乙腈水溶液溶解；
3)测定：精密量取供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。
所述多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱选自OD-3R 250mm×4.6mm,3μm或OD-RH150mm×4.6mm,5μm。
优选的，所述多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱选自OD-3R 250mm×4.6mm,3μm或两根串联的OD-RH 250mm×4.6mm,5μm。
本发明实施例，所述磷酸水溶液的浓度为0.05～0.10％；所述磷酸水溶液-有机相的比例为60～65∶40～35。
本发明实施例，所述多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱选自OD-3R 250mm×4.6mm,3μm；采用浓度为0.05％磷酸水溶液-乙腈为流动相，其比例为60∶40。所述流动相流速为0.5mL/min。
本发明实施例，所述多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱选自两根串联的OD-RH250mm×4.6mm,5μm；采用浓度为0.05％磷酸水溶液-乙腈为流动相，其比例为65∶35。所述流动相流速为0.8mL/min。
本发明实施例，所述检测波长为210nm。
本发明实施例，所述柱温为20～25℃。
分离度，用于评价待测物质与被分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统分离效能的关键指标，用R表示，R等于相邻色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。R越大，表明相邻两组分分离越好。一般说当R＜1.0时，两峰有部分重叠，当R＝1.0时，分离度可达98％，当R＝1.5时，分离度可达99.7％。
有益效果：本发明的高效液相色谱法分离米洛巴林中间体及其对映异构体的方法可实现米洛巴林中间体及其对映异构体完全分离，进样重复性良好，方法耐用性好，且灵敏度高、成本低、中控检测时样品含水分可直接稀释进样，后处理简单方便和安全性高，可用于米洛巴林中间体的质量控制。
附图说明
图1、实施例1-d液相色谱图。
图2、实施例2-f液相色谱图。
图3、实施例2-i液相色谱图。
图4、实施例2-m液相色谱图。
图5、原研CN104245951B(载气为氮气)方法的气相色谱图。
图6、原研CN104245951B(载气为氦气)方法的气相色谱图。
具体实施方式
实施例1：色谱条件的筛选(正相柱)
通过色谱柱、流动相、波长、流速等进行筛选确定色谱条件。
实施例1-a
色谱柱：AD-H柱250mm×4.6mm,5μm；
检测波长：210nm；柱温：30℃；进样量：10μL；流速：0.5mL/min；
流动相为正己烷∶乙醇＝80∶20，按照0min、40min等度洗脱；
结论：采用AD-H柱，米洛巴林中间体及其对映异构体出峰过早，分离较差。
实施例1-b
尝试在实施例1-a的基础上调整流动相和柱温；
色谱柱：大赛璐AD-H柱250mm×4.6mm,5μm；
检测波长：210nm；柱温：25℃；进样量：10μL；流速：0.5mL/min；
流动相为正己烷∶异丙醇＝98∶2，按照0min、45min等度洗脱；
结论：采用AD-H柱，改变流动相及其比例、调节柱温后，米洛巴林中间体及其对映异构体分离稍有改善，但是还没有达到基线分离要求。
实施例1-c
尝试在实施例1-b的基础上调整流动相；
色谱柱：大赛璐AD-H柱250mm×4.6mm,5μm；
检测波长：210nm；柱温：25℃；进样量：10μL；流速：0.5mL/min；
流动相为100％正己烷，按照0min、60min等度洗脱；
结论：改变流动相为100％正己烷后，米洛巴林中间体及其对映异构体未实现分离。
实施例1-d
尝试在实施例1-c的基础上调整流动相比例和流速；
色谱柱：大赛璐AD-H柱250mm×4.6mm,5μm；
检测波长：210nm；柱温：25℃；进样量：10μL；流速：0.3mL/min；
流动相为正己烷∶异丙醇＝99∶1，按照0min、60min等度洗脱；
结论：采用AD-H柱，调整流动相比例和流速后，米洛巴林中间体及其对映异构体分离稍有改善，分离度1.86，但两峰之间有额外杂质检出，干扰了对映体检出。
实施例1-e
尝试在实施例1-a的基础上更换色谱柱，并调整流动相比例；
色谱柱：大赛璐IC柱250mm×4.6mm,5μm；
检测波长：210nm；柱温：30℃；进样量：10μL；流速：0.5mL/min；
流动相为正己烷∶乙醇＝90∶10，按照0min、40min等度洗脱；
结论：采用IC柱，并调整流动相比例，米洛巴林中间体及其对映异构体未实现分离。
实施例1-f
尝试在实施例1-e的基础上更换色谱柱；
色谱柱：大赛璐IA柱250mm×4.6mm,5μm；
检测波长：210nm；柱温：30℃；进样量：10μL；流速：0.5mL/min；
流动相为正己烷∶乙醇＝90∶10，按照0min、40min等度洗脱；
结论：采用IA柱，米洛巴林中间体及其对映异构体未实现分离。
实施例1-g
尝试在实施例1-e的基础上更换色谱柱；
色谱柱：大赛璐OJ-H柱250mm×4.6mm,5μm；
检测波长：210nm；柱温：30℃；进样量：10μL；流速：0.5mL/min；
流动相为正己烷∶乙醇＝90∶10，按照0min、40min等度洗脱；
结论：采用OJ-H柱，米洛巴林中间体及其对映异构体未实现分离。
实施例1-h
尝试在实施例1-e的基础上更换色谱柱，并调整柱温和流动相；
色谱柱：大赛璐AS-H柱250mm×4.6mm,5μm；
检测波长：210nm；柱温：25℃；进样量：10μL；流速：0.5mL/min；
流动相为正己烷∶异丙醇＝95∶5，按照0min、40min等度洗脱；
结论：采用AS-H柱，米洛巴林中间体及其对映异构体未实现分离。
实施例1-i
尝试在实施例1-h的基础上更换色谱柱；
色谱柱：大赛璐AY-H柱250mm×4.6mm,5μm；
检测波长：210nm；柱温：25℃；进样量：10μL；流速：0.5mL/min；
流动相为正己烷∶异丙醇＝95∶5，按照0min、40min等度洗脱；
结论：采用AYH柱，米洛巴林中间体及其对映异构体分离较差，分离度为1.3。
实施例1-j
尝试在实施例1-b的基础上更换色谱柱；
色谱柱：大赛璐AY柱250mm×4.6mm,5μm；
检测波长：210nm；柱温：25℃；进样量：10μL；流速：0.5mL/min；
流动相为正己烷∶异丙醇＝98∶2，按照0min、45min等度洗脱；
结论：采用AY柱，米洛巴林中间体及其对映异构体分离无明显改善，分离度1.23。
实施例1-k
尝试在实施例1-i的基础上更换色谱柱；
色谱柱：大赛璐IB柱250mm×4.6mm,5μm；
检测波长：210nm；柱温：25℃；进样量：10μL；流速：0.5mL/min；
流动相为正己烷∶异丙醇＝95∶5，按照0min、40min等度洗脱；
结论：采用IB柱，米洛巴林中间体及其对映异构体未实现分离。
实施例1-l
尝试在实施例1-k的基础上更换色谱柱；
色谱柱：大赛璐ODH柱250mm×4.6mm,5μm；
检测波长：210nm；柱温：25℃；进样量：10μL；流速：0.5mL/min；
流动相为正己烷∶异丙醇＝95∶5，按照0min、40min等度洗脱；
结论：采用ODH柱，米洛巴林中间体及其对映异构体未实现分离。
综上可知，正相体系没有合适的分析条件，尝试开发反相体系。
实施例2：色谱条件的筛选(反相柱)
通过色谱柱、流动相、波长、流速等进行筛选确定色谱条件。
实施例2-a
色谱柱：大赛璐OJ-RH柱150mm×4.6mm,5μm；
检测波长：210nm；柱温：25℃；进样量：10μL；流速：0.5mL/min；
流动相为0.05％磷酸水溶液∶乙腈＝40∶60，按照0min、60min等度洗脱；
结论：尝试OJ-RH柱，采用反相模式，米洛巴林中间体及其对映异构体未实现分离。
实施例2-b
尝试在实施例2-a的基础上调整流动相比例；
色谱柱：大赛璐OJ-RH柱150mm×4.6mm,5μm；
检测波长：210nm；柱温：25℃；进样量：10μL；流速：0.5mL/min；
流动相为0.05％磷酸水溶液∶乙腈＝55∶45，按照0min、40min等度洗脱；
结论：采用OJ-RH柱，降低乙腈的比例，米洛巴林中间体及其对映异构体未实现分离。
实施例2-c
尝试在实施例2-b的基础上调整流动相比例；
色谱柱：大赛璐OJ-RH柱150mm×4.6mm,5μm；
检测波长：210nm；柱温：25℃；进样量：10μL；流速：0.5mL/min；
流动相为0.05％磷酸水溶液∶乙腈＝70∶30，按照0min、40min等度洗脱；
结论：采用OJ-RH柱，再次降低乙腈的比例，米洛巴林中间体及其对映异构体分离较差。
实施例2-d
尝试在实施例2-c的基础上更换色谱柱，并调整流动相比例；
色谱柱：大赛璐OX-3R柱150mm×4.6mm,5μm；
检测波长：210nm；柱温：25℃；进样量：10μL；流速：0.5mL/min；
流动相为0.05％磷酸水溶液∶乙腈＝60∶40，按照0min、60min等度洗脱；
结论：采用OX-3R柱，调整流动相比例，米洛巴林中间体及其对映异构体分离较差。
实施例2-e
尝试在实施例2-d的基础上更换色谱柱；
色谱柱：大赛璐ID柱250mm×4.6mm,5μm；
检测波长：210nm；柱温：25℃；进样量：10μL；流速：0.5mL/min；
流动相为0.05％磷酸水溶液∶乙腈＝60∶40，按照0min、60min等度洗脱；
结论：采用ID柱，米洛巴林中间体及其对映异构体未实现分离。
实施例2-f
尝试在实施例2-b的基础上更换色谱柱；
色谱柱：大赛璐OD-RH柱150mm×4.6mm,5μm；
检测波长：210nm；柱温：25℃；进样量：10μL；流速：0.5mL/min；
流动相为0.05％磷酸水溶液∶乙腈＝70∶30，按照0min、60min等度洗脱；
结论：采用OD-RH柱，米洛巴林中间体及其对映异构体实现分离，分离度1.5，且出峰稍晚。
实施例2-g
尝试在实施例2-f的基础上优化色谱条件；
色谱柱：大赛璐OD-RH柱150mm×4.6mm,5μm(两根串联)；
检测波长：210nm；柱温：25℃；进样量：5μL；流速：0.5mL/min；
流动相为0.05％磷酸水溶液∶乙腈＝65∶35，按照0min、60min等度洗脱；
结论：采用OD-RH柱两根串联，调整流动相比例，米洛巴林中间体及其对映异构体实现分离，分离度2.19。
实施例2-h
尝试在实施例2-g的基础上提高流速；
色谱柱：大赛璐OD-RH柱150mm×4.6mm,5μm(两根串联)；
检测波长：210nm；柱温：25℃；进样量：5μL；流速：1.0mL/min；
流动相为0.05％磷酸水溶液∶乙腈＝65∶35，按照0min、60min等度洗脱；
结论：采用OD-RH柱两根串联，提高流速后，米洛巴林中间体及其对映异构体实现分离，分离度1.94。
实施例2-i
尝试在实施例2-h的基础上降低流速；
色谱柱：大赛璐OD-RH柱150mm×4.6mm,5μm(两根串联)；
检测波长：210nm；柱温：25℃；进样量：5μL；流速：0.8mL/min；
流动相为0.05％磷酸水溶液∶乙腈＝65∶35，按照0min、60min等度洗脱；
结论：采用OD-RH柱两根串联，稍降低流速后，米洛巴林中间体及其对映异构体实现分离，分离度2.05，且出峰时间适宜。
实施例2-j
尝试在实施例2-i的基础上提高柱温；
色谱柱：大赛璐OD-RH柱150mm×4.6mm,5μm(两根串联)；
检测波长：210nm；柱温：30℃；进样量：5μL；流速：0.8mL/min；
流动相为0.05％磷酸水溶液∶乙腈＝65∶35，按照0min、60min等度洗脱；
结论：采用OD-RH柱两根串联，提高柱温后，米洛巴林中间体及其对映异构体峰型稍有改善，出峰稍有提前，分离度2.02。
实施例2-k
尝试在实施例2-i的基础上降低柱温；
色谱柱：大赛璐OD-RH柱150mm×4.6mm,5μm(两根串联)；
检测波长：210nm；柱温：20℃；进样量：5μL；流速：0.8mL/min；
流动相为0.05％磷酸水溶液∶乙腈＝65∶35，按照0min、60min等度洗脱；
结论：采用OD-RH柱两根串联，降低柱温后，米洛巴林中间体及其对映异构体出峰稍有延后，分离度2.10。
实施例2-l
尝试在实施例2-k的基础上更换色谱柱并降低流速；
色谱柱：大赛璐OD-3R柱250mm×4.6mm,3μm；
检测波长：210nm；柱温：20℃；进样量：10μL；流速：0.5mL/min；
流动相为0.05％磷酸水溶液∶乙腈＝65∶35，按照0min、60min等度洗脱；
结论：采用OD-3R柱，并降低流速后，米洛巴林中间体及其对映异构体完全分离，分离度2.65，但出峰稍晚。
实施例2-m
尝试在实施例2-l的基础上调整流动相比例；
色谱柱：大赛璐OD-3R柱250mm×4.6mm,3μm；
检测波长：210nm；柱温：20℃；进样量：5μL；流速：0.5mL/min；
流动相为0.05％磷酸水溶液∶乙腈＝60∶40，按照0min、60min等度洗脱；
结论：采用OD-3R柱，调整流动相比例并减小进样量后，米洛巴林中间体及其对映异构体完全分离，分离度2.51，且出峰时间适宜。
由本实验可知，多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱，特别是OD-3R 250mm×4.6mm,3μm或两根串联的OD-RH 150mm×4.6mm,5μm在本发明的方法下，可以实现米洛巴林中间体及其对映异构体的完全分离；并且当使用OD-3R 250mm×4.6mm,3μm时，分离效果更佳。
实施例3：重复性实验
实施例3-a：色谱条件如下：
色谱柱：大赛璐OD-RH柱150mm×4.6mm,5μm(两根串联)；
检测波长：210nm；柱温：25℃；进样量：5μL；流速：0.8mL/min；
流动相为0.05％磷酸水溶液∶乙腈＝65∶35，按照0min、60min等度洗脱。
取6份供试品溶液，连续进样，记录色谱图，结果如下：
3-a-1：米洛巴林中间体保留时间为28.020min，峰面积为401.8671，含量为99.08％；对映异构体保留时间为26.593min，峰面积为3.7193，含量为0.92％；
3-a-2：米洛巴林中间体保留时间为28.197min，峰面积为401.8144，含量为99.07％；对映异构体保留时间为26.589min，峰面积为3.7719，含量为0.93％；
3-a-3：米洛巴林中间体保留时间为28.198min，峰面积为401.9154，含量为99.08％；对映异构体保留时间为26.591min，峰面积为3.7316，含量为0.92％；
3-a-4：米洛巴林中间体保留时间为28.021min，峰面积为402.8545，含量为99.09％；对映异构体保留时间为26.595min，峰面积为3.6996，含量为0.91％；
3-a-5：米洛巴林中间体保留时间为28.020min，峰面积为401.8864，含量为99.08％；对映异构体保留时间为26.592min，峰面积为3.7317，含量为0.92％；
3-a-6：米洛巴林中间体保留时间为28.015min，峰面积为401.8737，含量为99.07％；对映异构体保留时间为26.588min，峰面积为3.7726，含量为0.93％。
实施例3-b：色谱条件如下：
色谱柱：大赛璐OD-3R柱250mm×4.6mm,3μm；
检测波长：210nm；柱温：20℃；进样量：5μL；流速：0.5mL/min；
流动相为0.05％磷酸水溶液∶乙腈＝60∶40，按照0min、60min等度洗脱；
取6份供试品溶液，连续进样，记录色谱图，结果如下：
3-b-1：米洛巴林中间体保留时间为28.743min，峰面积为455.1822，含量为99.15％；对映异构体保留时间为27.287min，峰面积为3.9231，含量为0.85％；
3-b-2：米洛巴林中间体保留时间为28.740min，峰面积为456.0825，含量为99.18％；对映异构体保留时间为27.293min，峰面积为3.7707，含量为0.82％；
3-b-3：米洛巴林中间体保留时间为28.753min，峰面积为454.1926，含量为99.16％；对映异构体保留时间为27.297min，峰面积为3.8475，含量为0.84％；
3-b-4：米洛巴林中间体保留时间为28.698min，峰面积为455.3862，含量为99.17％；对映异构体保留时间为27.237min，峰面积为3.8113，含量为0.83％；
3-b-5：米洛巴林中间体保留时间为28.744min，峰面积为455.8832，含量为99.16％；对映异构体保留时间为27.288min，峰面积为3.8618，含量为0.84％；
3-b-6：米洛巴林中间体保留时间为28.745min，峰面积为456.0312，含量为99.17％；对映异构体保留时间为27.289min，峰面积为3.8167，含量为0.83％。
重复性实验结果显示：色谱柱采用大赛璐OD-RH柱150mm×4.6mm,5μm(两根串联)或者大赛璐OD-3R柱250mm×4.6mm,3μm，在本发明的方法条件下，6份供试品溶液连续进样，实验方法重复性好。
实施例4：耐用性实验
通过将色谱条件的流速、流动相浓度、流动相比例、柱温等进行调整，测定结果不受影响的承受程度。
实施例4-a、不同流速耐用性实验
(1)色谱条件如下：
色谱柱：大赛璐OD-RH柱150mm×4.6mm,5μm(两根串联)；
检测波长：210nm；柱温：20℃；进样量：5μL；流速：0.5～1.0mL/min；
流动相为0.05％磷酸水溶液∶乙腈＝65∶35，按照0min、60min等度洗脱。
结果如下：
当流速为0.5mL/min时，米洛巴林中间体及其对映异构体分离度为2.19；
当流速为0.8mL/min时，米洛巴林中间体及其对映异构体分离度为2.05；
当流速为1.0mL/min时，米洛巴林中间体及其对映异构体分离度为1.94。
(2)色谱条件如下：
色谱柱：大赛璐OD-3R柱250mm×4.6mm,3μm；
检测波长：210nm；柱温：20℃；进样量：5μL；流速：0.3～0.7mL/min；
流动相为0.05％磷酸水溶液∶乙腈＝60∶40，按照0min、60min等度洗脱。
结果如下：
当流速为0.3mL/min时，米洛巴林中间体及其对映异构体分离度为2.30；
当流速为0.5mL/min时，米洛巴林中间体及其对映异构体分离度为2.41；
当流速为0.7mL/min时，米洛巴林中间体及其对映异构体分离度为2.45。
耐用性不同流速的测试结果显示：本测试方法在流速0.3mL/min及1.0mL/min之间变化，对测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。
实施例4-b、不同流动相浓度耐用性实验
(1)色谱条件如下：
色谱柱：大赛璐OD-RH柱150mm×4.6mm,5μm(两根串联)；
检测波长：210nm；柱温：20℃；进样量：5μL；流速：0.8mL/min；
流动相为0.02～0.10％磷酸水溶液∶乙腈＝65∶35，按照0min、60min等度洗脱。
结果如下：
当磷酸水溶液浓度为0.02％时，米洛巴林中间体及其对映异构体分离度为2.08；
当磷酸水溶液浓度为0.05％时，米洛巴林中间体及其对映异构体分离度为2.10；
当磷酸水溶液浓度为0.10％时，米洛巴林中间体及其对映异构体分离度为2.11。
耐用性不同流动相浓度的测试结果显示：本测试方法流动相磷酸水溶液浓度在0.02～0.10％之间变化，对测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。
实施例4-c、不同流动相起始比例耐用性实验
(1)色谱条件如下：
色谱柱：大赛璐OD-RH柱150mm×4.6mm,5μm(两根串联)；
检测波长：210nm；柱温：20℃；进样量：5μL；流速：0.8mL/min；
流动相为0.05％磷酸水溶液∶乙腈，调整乙腈比例，按照0min、60min等度洗脱。
结果如下：
当0.05％磷酸水溶液∶乙腈＝60∶40时，米洛巴林中间体及其对映异构体分离度为1.97；
当0.05％磷酸水溶液∶乙腈＝65∶35时，米洛巴林中间体及其对映异构体分离度为2.10；
当0.05％磷酸水溶液∶乙腈＝70∶30时，米洛巴林中间体及其对映异构体分离度为2.34。
(2)色谱条件如下：
色谱柱：大赛璐OD-3R柱250mm×4.6mm,3μm；
检测波长：210nm；柱温：20℃；进样量：5μL；流速：0.5mL/min；
流动相为0.05％磷酸水溶液∶乙腈，调整乙腈比例，按照0min、60min等度洗脱。
结果如下：
当0.05％磷酸水溶液∶乙腈＝65∶35时，米洛巴林中间体及其对映异构体分离度为2.65；
当0.05％磷酸水溶液∶乙腈＝60∶40时，米洛巴林中间体及其对映异构体分离度为2.51；
当0.05％磷酸水溶液∶乙腈＝55∶45时，米洛巴林中间体及其对映异构体分离度为2.21。
耐用性不同流动相起始比例的测试结果显示：本测试方法的流动相0.05％磷酸水溶液∶乙腈起始比例在55∶45及70∶30之间变化，对测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。
实施例4-d、不同柱温耐用性实验
(1)色谱条件如下：
色谱柱：大赛璐OD-RH柱250mm×4.6mm,5μm(两根串联)；
检测波长：210nm；柱温：15～30℃；进样量：5μL；流速：0.8mL/min；
流动相为0.05％磷酸水溶液∶乙腈＝65∶35，按照0min、60min等度洗脱。
结果如下：
当柱温为15℃时，米洛巴林中间体及其对映异构体分离度为2.21；
当柱温为20℃时，米洛巴林中间体及其对映异构体分离度为2.10；
当柱温为25℃时，米洛巴林中间体及其对映异构体分离度为2.05；
当柱温为30℃时，米洛巴林中间体及其对映异构体分离度为2.02。
(2)色谱条件如下：
色谱柱：大赛璐OD-3R柱250mm×4.6mm,3μm；
检测波长：210nm；柱温：15～25℃；进样量：5μL；流速：0.5mL/min；
流动相为0.05％磷酸水溶液∶乙腈＝60∶40，按照0min、60min等度洗脱。
结果如下：
当柱温为15℃时，米洛巴林中间体及其对映异构体分离度为2.65；
当柱温为20℃时，米洛巴林中间体及其对映异构体分离度为2.51；
当柱温为25℃时，米洛巴林中间体及其对映异构体分离度为2.25；
耐用性不同柱温的测试结果显示：本测试方法在柱温15及30℃之间变化，对测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。
Claims (10)
1.一种高效液相色谱法分离米洛巴林中间体及其对映异构体的方法，其特征在于：
1)色谱条件：色谱柱采用多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱，硅胶表面涂敷有纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)；采用浓度为0.02～0.10％磷酸水溶液-乙腈为流动相，其比例为55～70∶45～30；检测波长为205nm～215nm；柱温为15～30℃；流动相流速为0.3～1.0mL/min；
2)供试品及系统适应性溶液的配制：将样品用乙腈水溶液溶解；
3)测定：精密量取供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱法分离米洛巴林中间体及其对映异构体的方法，其特征在于：所述多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱选自OD-3R 250mm×4.6mm,3μm或OD-RH 150mm×4.6mm,5μm。
3.根据权利要求2所述的高效液相色谱法分离米洛巴林中间体及其对映异构体的方法，其特征在于：所述多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱选自OD-3R 250mm×4.6mm,3μm或两根串联的OD-RH 250mm×4.6mm,5μm。
4.根据权利要求3所述的高效液相色谱法分离米洛巴林中间体及其对映异构体的方法，其特征在于：所述磷酸水溶液的浓度为0.05～0.10％；所述磷酸水溶液-有机相的比例为60～65∶40～35。
5.根据权利要求4所述的高效液相色谱法分离米洛巴林中间体及其对映异构体的方法，其特征在于：所述多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱选自OD-3R 250mm×4.6mm,3μm；采用浓度为0.05％磷酸水溶液-乙腈为流动相，其比例为60∶40。
6.根据权利要求5所述的高效液相色谱法分离米洛巴林中间体及其对映异构体的方法，其特征在于：所述流动相流速为0.5mL/min。
7.根据权利要求4所述的高效液相色谱法分离米洛巴林中间体及其对映异构体的方法，其特征在于：所述多糖衍生物反相涂敷型手性色谱柱选自两根串联的OD-RH 250mm×4.6mm,5μm；采用浓度为0.05％磷酸水溶液-乙腈为流动相，其比例为65∶35。
8.根据权利要求7所述的高效液相色谱法分离米洛巴林中间体及其对映异构体的方法，其特征在于：所述流动相流速为0.8mL/min。
9.根据权利要求5～8任一项所述的高效液相色谱法分离米洛巴林中间体及其对映异构体的方法，其特征在于：所述检测波长为210nm。
10.根据权利要求5～8任一项所述的高效液相色谱法分离米洛巴林中间体及其对映异构体的方法，其特征在于：所述柱温为20～25℃。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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Address after: 210061 No.136, Huakang Road, Jiangbei new district, Nanjing City, Jiangsu Province Patentee after: Jiangsu Weikaier Pharmaceutical Technology Co.,Ltd. Country or region after: China Patentee after: Nanjing weikaier Biomedical Technology Co.,Ltd. Address before: 210061 No.136, Huakang Road, Jiangbei new district, Nanjing City, Jiangsu Province Patentee before: JIANGSU VCARE PHARMATECH Co.,Ltd. Country or region before: China Patentee before: Nanjing weikaier Biomedical Technology Co.,Ltd. |
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