CN114262704A - 一种固定化载体、d-乙酰亮氨酸脱乙酰固定化酶及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固定化载体、D‑乙酰亮氨酸脱乙酰固定化酶及制备方法。本发明所述的固定化载体包括质量比为1～3:2～4:4～6的甘草酸二钾、脱乙酰壳多糖以及硅藻土制备的载体；所述载体置于质量浓度为4.5～5.5％的戊二醛溶液中固定8～12h得到固定化载体。本发明以甘草酸二钾与脱乙酰壳多糖、硅藻土共絮凝吸附，形成的复合壳聚糖载体，具有较好的机械强度，固定化载体过滤可操作性好。本发明制备的D‑乙酰亮氨酸脱乙酰酶具有较好的稳定性，可反复使用20次以上。
Description
技术领域
本发明属于涉及生化工程技术领域，具体涉及一种固定化载体、D-乙酰亮氨酸脱乙酰固定化酶及制备方法。
背景技术
D-亮氨酸的制备采用发酵-消旋-酰化酶法拆分法，该路线需要使用发酵生产的L-亮氨酸作为原料，经消旋，然后再乙酰化工序，得到N-乙酰-DL-亮氨酸，后经过D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶选择性水解后可以得到D-亮氨酸。D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶固定化后可以提高酶的稳定性，使得催化过程容易控制，且极易与反应体系分离，产品的收率高、质量好；同时，固定化酶可以重复使用使得使用效率提高而成本降低。固定化酶所用的材料，多为卡拉胶、聚乙烯亚胺、聚丙烯酰胺等材料，而对于采用壳聚糖交联戊二醛固定化酶多有使用，但脱乙酰程度不完全，交联酶的载量和强度不够。
发明内容
发明目的：针对上述现有技术存在的不足，本发明提供了固定化载体、D-乙酰亮氨酸脱乙酰固定化酶及制备方法。本发明采用甘草酸二钾与脱乙酰壳多糖、硅藻土共絮凝吸附，形成的复合壳聚糖载体，具有较好的机械强度和比表面积，再经戊二醛交联后形成固定化目标酶的固定载体。本发明的固定化酶载体用于固定D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶，使得D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶具有较好的稳定性，并促进甘草提取物的应用。
技术方案：本发明所述的一种固定化载体，包括质量比为1～3:2～4:4～6的甘草酸二钾、脱乙酰壳多糖以及硅藻土制备的载体；所述载体置于质量浓度为4.5～5.5％的戊二醛溶液中固定8～12h得到固定化载体。
作为本发明的一种优选实施方式，所述载体通过以下方法制备：配置1～3％甘草酸二钾溶液，室温条件下将1～3％甘草酸二钾溶液滴入2～4％脱乙酰壳多糖和4～6％硅藻土的混合液中，搅拌2～4小时，过滤，清洗后得到载体。
本发明所述的固定化载体的制备方法，包括以下步骤：
(S1)：配置1～3％甘草酸二钾溶液，室温条件下将1～3％甘草酸二钾溶液滴入2～4％脱乙酰壳多糖和4～6％硅藻土的混合液中，搅拌2～4小时，过滤，清洗后得到载体；
(S2)：取步骤(S1)制备的载体，加入到4～8倍质量比的4.5～5.5％的戊二醛溶液中，室温条件下150～200r/min搅拌反应8～12h，以蒸馏水充分清洗，过滤得到固定化载体。
本发明所述的D-乙酰亮氨酸脱乙酰固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
(SS1)：配置1～3％甘草酸二钾溶液，室温条件下将1～3％甘草酸二钾溶液滴入2～4％脱乙酰壳多糖和4～6％硅藻土的混合液中，搅拌2～4小时，过滤，清洗后得到载体；
(SS2)：取步骤(S1)制备的载体，加入到4～8倍质量比的4.5～5.5％的戊二醛溶液中，室温条件下150～200r/min搅拌反应8～12h，以蒸馏水充分清洗，过滤得到固定化载体；
(SS3)：取步骤(SS2)制备的固定化载体，加入D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶溶液，4～10℃条件下150～200r/min搅拌8～12h，过滤，并用蒸馏水充分清洗后得到固定化酶。
作为本发明的一种优选实施方式，所述D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶溶液通过以下方法制备：将重组表达D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶的工程菌发酵液离心，收集得到菌泥，将菌泥混悬于6～10倍质量比的磷酸盐缓冲液溶液中，进行高压均质，制备得到破壁粗酶溶液。
作为本发明的一种优选实施方式，步骤(SS1)中，所述脱乙酰甲壳素的分子量为50w～100W。
作为本发明的一种优选实施方式，所述高压均质的条件为：压力500～600Mpa，时间3～5分钟。
作为本发明的一种优选实施方式，固定化载体通过以下方法制备：配置2％甘草酸二钾溶液，通过匀速多管路滴加设备，室温条件滴入3％脱乙酰壳多糖和5％硅藻土的混合液中，搅拌2小时，过滤，以蒸馏水充分清洗后得到到固定化载体。
作为本发明的一种优选实施方式，戊二醛活化的固定化载体通过以下方法制备：取上述载体，加入到4～8倍质量比的5％的戊二醛溶液中，室温条件下150r/min搅拌反应8～12h，以蒸馏水充分清洗，过滤得到活化固定化载体。
本发明中选择戊二醛为活化剂，发现温度对固定化酶活性的影响很大。室温条件下固定化固定化酶活和回收率最高，当温度再升高时，游离酶在较高的温度下失活严重,引起固定化酶活和回收率的降低。活化剂戊二醛的质量分数也决定着脱乙酰壳多糖上氨基的活化程度,即决定着酶与载体结合的活性中心的多少，从而影响固定化酶活的高低。因此，活化剂的质量分数是影响酶活的关键因素。戊二醛溶液质量分数为5％时的酶活和回收率最好。固定化时间以8～12h时效果为宜。固定化时间太短时，酶结合量小,酶活性不高，而且稳定性差；但若固定化时间太长，酶长期暴露在戊二醛溶液里，容易造成酶的失活，影响回收率。
(4)作为本发明的一种优选实施方式，本发明的固定载体与酶通过以下方法交联固定：取上述预处理的固定化载体，加入5～10倍质量比的破壁粗酶溶液，4～10℃条件下150r/min搅拌12h，过滤，并用蒸馏水充分清洗后得到固定化酶，测固定化酶酶活和残余酶液的酶活。
作为本发明的一种优选实施方式，所述的D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶溶液通过以下方法制备：制备菌泥：将重组表达D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶的工程菌发酵液离心，收集得到菌泥；破壁：将菌泥混悬于6～10倍质量比的30mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶液中，进行高压均质，均质机条件为压力600Mpa，时间5分钟，循环均质，制备得到破壁粗酶溶液。
活化载体和破壁粗酶溶液的质量比也影响固定化酶的酶活和回收率。固定化酶的酶活性随着酶用量的增加而升高，但回收率随着酶用量的增加反而下降。综合了酶活、回收率两个因素，载体和酶液5～10倍质量比为最佳。
有益效果：(1)本发明以甘草酸二钾与脱乙酰壳多糖、硅藻土共絮凝吸附，形成的复合壳聚糖载体，具有较好的机械强度，固定化载体过滤可操作性好。(2)本发明固定载体具有较大的比表面积，经戊二醛交联后形成固定化目标酶，酶的活力和回收率高。酶活力达到80U/g以上，酶回收率达到80％以上。(3)本发明将D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶固定化，具有较好的固定化强度，具有较好的稳定性和酶催化活性，使得其在D-亮氨酸生过程中能够重复利用，本发明制备的D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶具有较好的稳定性，可反复使用20次以上。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明的保护范围不仅限于此。
实施例1：酶活测定：
(1)HPLC条件:Cosmosil 5C18-AR(150mm×4.6mm)柱温40℃；流动相A：乙腈流动相B：TFA(0.01M)水溶液；梯度洗脱：15％流动相A——45％流动相A流速1mL/min，340nm。
(2)标准品溶液的配置：精确称取0.1g N-乙酰-DL-亮氨酸标准品(99％含量)，用蒸馏水溶解，容量瓶定容到25mL，计算ρ标(单位g/L)。取10uL标准品溶液进样，采集色谱数据，峰面积记为S标。
(3)配制质量分数11％左右的底物N-乙酰-DL-亮氨酸水溶液，用单点外标法标定底物含量。
称11g N-乙酰-DL-亮氨酸，加89g蒸馏水溶解，得到质量分数11％N-乙酰-DL-亮氨酸水溶液100g。称取1g配制的N-乙酰-DL-亮氨酸水溶液(精确记录重量m1，单位g)于25mL容量瓶中，用蒸馏水定容至25mL。取10uL稀释后的N-乙酰-DL-亮氨酸水溶液进样，采集色谱数据，峰面积记为S1，则标定后的底物水溶液质量分数：
(4)菌泥或固定化酶比活力检测
1)酶活定义：在最适条件下，每分钟内催化1微摩尔(μmol)底物N-乙酰-DL-亮氨酸转化为D-亮氨酸所需的酶量定为一个活力单位，即1IU＝1μmol/min。
2)配制0.2mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.3)，备用。
3)配制0.2mol/L磷酸二氢钾缓冲液(磷酸调pH 3.0)，备用。
4)称取1g菌泥或固定化酶平摊于玻璃皿中，于105℃烘箱中烘至恒重，测算菌泥或固定化酶含水量。
5)称取5g质量分数为ω1的N-乙酰-DL-亮氨酸水溶液(精确记录重量m2，单位g)于100mL锥形瓶中，加0.2mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.3)至锥形瓶内溶液总重50g左右(精确记录重量m3，单位g)，加入湿重0.1g菌泥或湿重0.5g固定化酶(精确记录重量m4，单位g)，加搅拌子，瓶口密封，30℃水浴搅拌60min。立即取5g上述反应液(精确记录重量m5，单位g)于10mL容量瓶中，用磷酸二氢钾缓冲液(pH＝3.0)定容至10mL。取少量稀释液用0.22um滤膜过滤，取10uL进样，采集色谱数据，峰面积记为S2，则稀释后的反应液质量分数：
酶回收率(％)＝100*固定化酶比活力*固定化酶重量/菌泥酶活力*菌泥重量
实施例2：D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶固定化酶的制备
(1)本发明所用的D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶是采用构建的D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶的工程菌发酵制备，具体制备方法为，将重组大肠杆菌pET28a-D-aceDElase/E.coli BL21接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaC1 10g/L，pH7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量转接到装有600mL LB培养基的2L三角烧瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到1.2时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG作为诱导剂，16℃诱导24h后得到发酵液，按以下步骤进行固定化：
(2)将重组表达D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶的工程菌发酵液离心，收集得到菌泥；测定菌泥酶活力为1021U/g。将菌泥混悬于6倍质量比的30mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶液中，进行高压均质，均质机条件为压力600Mpa，时间5分钟，循环均质，制备得到破壁粗酶溶液。
(3)配置2％甘草酸二钾溶液，通过匀速多管路滴加设备，室温条件滴入3％脱乙酰壳多糖和5％硅藻土的混合液中，(三者质量比为2：3：5)搅拌2小时，过滤，以蒸馏水充分清洗后得到到固定化载体。取上述固定化载体，加入到5倍质量比的5％的戊二醛溶液中(以固定化载体的质量为标准，下同)，室温条件下150r/min搅拌反应8～12h，以蒸馏水充分清洗，过滤得到活化固定化载体。
(4)取上述预处理的活化载体，加入5倍质量比的破壁粗酶溶液，4℃条件下150r/min搅拌12h，过滤，并用蒸馏水充分清洗后得到固定化酶，测固定化酶酶活为106U/g和酶回收率为88.2％。
实施例3：D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶固定化酶的制备
(1)将重组表达D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶的工程菌发酵液离心，收集得到菌泥；测定菌泥酶活力为920U/g。将菌泥混悬于8倍质量比的30mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶液中，进行高压均质，均质机条件为压力600Mpa，时间5分钟，循环均质，制备得到破壁粗酶溶液。
(2)配置1％甘草酸二钾溶液，通过匀速多管路滴加设备，室温条件滴入4％脱乙酰壳多糖和5％硅藻土的混合液中，(三者质量比为1：4：5)搅拌2小时，过滤，以蒸馏水充分清洗后得到到固定化载体。取上述固定化载体，加入到8倍质量比的5％的戊二醛溶液中，室温条件下150r/min搅拌反应8h，以蒸馏水充分清洗，过滤得到活化固定化载体。
(3)取上述预处理的活化载体，加入8倍质量比的破壁粗酶溶液，4℃条件下150r/min搅拌12h，过滤，并用蒸馏水充分清洗后得到固定化酶，测固定化酶酶活为115U/g和酶回收率为86.2％。
实施例4：D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶固定化酶的制备
(1)将重组表达D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶的工程菌发酵液离心，收集得到菌泥；测定菌泥酶活力为920U/g。将菌泥混悬于10倍质量比的30mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)溶液中，进行高压均质，均质机条件为压力600Mpa，时间5分钟，循环均质，制备得到破壁粗酶溶液。
(2)配置3％甘草酸二钾溶液，通过匀速多管路滴加设备，室温条件滴入2％脱乙酰壳多糖和4％硅藻土的混合液中，(三者质量比为3：2：4)搅拌2小时，过滤，以蒸馏水充分清洗后得到到固定化载体。取上述固定化载体，加入到4倍质量比的5％的戊二醛溶液中，室温条件下150r/min搅拌反应8h，以蒸馏水充分清洗，过滤得到活化固定化载体。
(3)取上述预处理的活化载体，加入8倍质量比的破壁粗酶溶液，4℃条件下150r/min搅拌12h，过滤，并用蒸馏水充分清洗后得到固定化酶，测固定化酶酶活为122U/g和酶回收率为90.2％。
实施例5：固定化D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶使用稳定性测试：称取50g质量分数为10％的N-乙酰-DL-亮氨酸水溶液于1000mL锥形瓶中，加0.2mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.3)至锥形瓶内溶液总重500g左右，加入实施例2制备得到的5g固定化酶，加搅拌子，瓶口密封，30℃水浴搅拌60min。过滤回收固定化酶，反复上述步骤20次后，测定固定化酶活力为82.5U/g，损失率为22％。
此外，应当理解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
Claims (7)
1.一种固定化载体，其特征在于，包括质量比为1～3:2～4:4～6的甘草酸二钾、脱乙酰壳多糖以及硅藻土制备的载体；所述载体置于质量浓度为4.5～5.5％的戊二醛溶液中固定8～12h得到固定化载体。
2.根据权利要求1所述的固定化载体，其特征在于，所述载体通过以下方法制备：配置1～3％甘草酸二钾溶液，室温条件下将1～3％甘草酸二钾溶液滴入2～4％脱乙酰壳多糖和4～6％硅藻土的混合液中，搅拌2～4小时，过滤，清洗后得到载体。
3.一种如权利要求1所述的固定化载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(S1)：配置1～3％甘草酸二钾溶液，室温条件下将1～3％甘草酸二钾溶液滴入2～4％脱乙酰壳多糖和4～6％硅藻土的混合液中，搅拌2～4小时，过滤，清洗后得到载体；
(S2)：取步骤(S1)制备的载体，加入到4～8倍质量比的4.5～5.5％的戊二醛溶液中，室温条件下150～200r/min搅拌反应8～12h，以蒸馏水充分清洗，过滤得到固定化载体。
4.一种D-乙酰亮氨酸脱乙酰固定化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(SS1)：配置1～3％甘草酸二钾溶液，室温条件下将1～3％甘草酸二钾溶液滴入2～4％脱乙酰壳多糖和4～6％硅藻土的混合液中，搅拌2～4小时，过滤，清洗后得到载体；
(SS2)：取步骤(S1)制备的载体，加入到4～8倍质量比的4.5～5.5％的戊二醛溶液中，室温条件下150～200r/min搅拌反应8～12h，以蒸馏水充分清洗，过滤得到固定化载体；
(SS3)：：取步骤(SS2)制备的固定化载体，加入D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶溶液，4～10℃条件下150～200r/min搅拌8～12h，过滤，并用蒸馏水充分清洗后得到固定化酶。
5.根据权利要求4所述的D-乙酰亮氨酸脱乙酰固定化酶的制备方法，其特征在于，所述D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶溶液通过以下方法制备：将重组表达D-乙酰亮氨酸脱乙酰酶的工程菌发酵液离心，收集得到菌泥，将菌泥混悬于6～10倍质量比的磷酸盐缓冲液溶液中，进行高压均质，制备得到破壁粗酶溶液。
6.根据权利要求4所述的D-乙酰亮氨酸脱乙酰固定化酶的制备方法，其特征在于，步骤(SS1)中，所述脱乙酰壳多糖的分子量为50w～100w。
7.根据权利要求所述的D-乙酰亮氨酸脱乙酰固定化酶的制备方法，其特征在于，所述高压均质的条件为：压力500～600Mpa，时间3～5分钟。
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| CN105820564A (zh) * | 2016-04-29 | 2016-08-03 | 安徽安缆模具有限公司 | 一种硅烷改性尼龙模具材料及其制备方法 |
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