CN114262304A - 响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素的合成方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素的合成方法及其应用，将对二甲氨基肉桂酸、1,2‑双‑(乙氧基羰基)亚乙基三苯基膦烷反应合成第一化合物，之后溶于异丙醇和NaOH混合溶液并反应、调节PH值之后得第二化合物，之后溶于PBS溶液滴加间氯过氧苯甲酸乙酸乙酯溶液，反应后得第三化合物，之后溶于N,N‑二甲基甲酰胺DMF，加入K2CO3和三乙胺搅拌溶解后滴加叔丁基保护的S‑三苯甲基‑D‑半胱氨酸，室温反应、萃取洗涤、过色谱柱分离后得第四化合物，之后脱去三苯基保护基团所得混合物溶于水，加入酯酶室温水解过夜、分离纯化后得生物发光荧光素O‑Akalumine。本发明的生物发光荧光素可特异性响应Fe(Ⅱ)并生成活性Akalumine荧光素，与荧光素酶反应后生物发光，体外Fe(Ⅱ)响应浓度低至0.1μM，可用于细胞Fe(Ⅱ)成像检测。
Description
技术领域
本发明涉及分子影像技术领域，特别涉及响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素的合成方法及其应用。
背景技术
脑出血(Intracerebral Hemorrhage，ICH)通常指非外伤性脑实质出血，约占所有脑卒中的24％，具有较高的死亡率和发病率，脑出血发生后，血红蛋白(Hb)降解所释放的大量Fe(Ⅱ)在血肿周围水肿区域逐渐聚积，过量的Fe(Ⅱ)通过过氧化作用破坏血脑屏障，引起铁依赖的细胞死亡和神经损伤。
Fe(Ⅱ)在脑出血的继发性损伤中的作用已得到广泛的证实，有研究者试图通过铁螯合剂甲磺去铁胺或米诺环素干预铁代谢以缓解Fe(Ⅱ)导致的神经毒性，II期临床试验发现甲磺去铁胺治疗组在180d的神经恢复情况优于对照组。因此，通过MRI等非侵入影像方法量化血肿周围水肿中的Fe(Ⅱ)的浓度，不仅有助于指导治疗和评估预后，更有助于了解ICH中Fe(Ⅱ)介导的水肿及神经损伤机制。
为获取脑部铁离子浓度，目前已有可用于总铁成像的序列包括T2*WI，SWI，R2*，QSM等技术；其中T2*WI和QSM可将顺磁性物质(如铁、铁蛋白和铁血黄素)与抗磁性物质(如钙、水或髓磷脂)区分开来，实现总铁定量。然而，目前的成像方法只能总铁成像，仍无法区分Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)，导致准确定量血肿周围水肿中Fe(Ⅱ)浓度依然是面临巨大的挑战。因此，开发响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素的合成方法并应用于细胞Fe(Ⅱ)定量MRI成像成像检测中，显得尤为迫切和重要。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提供一种响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素的合成方法及其应用，该生物发光荧光素可特异性响应Fe(Ⅱ)并生成活性Akalumine荧光素，与荧光素酶反应后生物发光，体外Fe(Ⅱ)响应浓度低至0.1μM，可用于细胞Fe(Ⅱ)成像检测。
本发明为达到上述目的所采用的技术方案是：
一种响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素的合成方法，包括以下步骤：
S1：用对二甲氨基肉桂酸、1,2-双-(乙氧基羰基)亚乙基三苯基膦烷反应合成得到第一化合物；
S2：将所得第一化合物溶于异丙醇和NaOH混合溶液中并室温搅拌24小时后，调节PH值析出沉淀，有机相经低压移除溶剂，合并固体经干燥即得第二化合物；
S3：将所得第二化合物溶于PBS溶液后滴加间氯过氧苯甲酸乙酸乙酯溶液，搅拌反应后，收集水相，干燥即得淡黄色固体第三化合物；
S4：将所得第三化合物溶于N,N-二甲基甲酰胺DMF中，加入K2CO3和三乙胺搅拌溶解后，滴加叔丁基保护的S-三苯甲基-D-半胱氨酸，室温搅拌反应，反应产物溶解于超纯水中，经萃取洗涤、过色谱柱分离后，得到第四化合物。
S5：将所得第四化合物在三苯基氧磷和三氟甲磺酸酐条件下脱去三苯基保护基团，得到第五化合物的混合物，所得混合物溶解于水中，加入酯酶室温水解过夜，色谱柱分离纯化后得到生物发光荧光素O-Akalumine。
优选地，所述步骤S1的第一化合物采用的原料用量比为30-50mmol对二甲氨基肉桂酸：45-75mmol 1,2-双-(乙氧基羰基)亚乙基三苯基膦烷。
进一步地，所述步骤S1还包括以下步骤：以20-40mL甲苯为溶剂，加入30-50mmol对二甲氨基肉桂酸和45-75mmol1,2-双-(乙氧基羰基)亚乙基三苯基膦烷，搅拌升温至100-120℃，反应3-5小时后低压旋蒸移除溶剂，过色谱柱分离后得到第一化合物。
优选地，所述步骤S2还包括以下步骤：将25-35mmol第一化合物溶于体积比1:2的异丙醇和NaOH混合溶液中，室温搅拌20-26小时，加HCl调节pH值为6，过滤沉淀，用乙酸乙酯洗涤水相，合并有机相后低压移除溶剂，合并固体经干燥即得第二化合物。
优选地，所述步骤S3包括以下步骤：将10-20mmol第二化合物溶于20-40mL的PBS溶液后滴加溶于20-40mL乙酸乙酯中的15-30mmol间氯过氧苯甲酸溶液，室温下混合搅拌2-4小时，收集水相，冻干除去水，干燥后得到淡黄色固体第三化合物。
优选地，所述步骤S4采用的原料用量比为5-20mmol第三化合物：10-40mLN,N-二甲基甲酰胺DMF：6-24mmolK2CO3：1-4mmol三乙胺：6-24mmol叔丁基保护的S-三苯甲基-D-半胱氨酸；所述步骤S4中室温搅拌反应2-8小时；用乙酸乙酯萃取洗涤三次。
优选地，所述步骤S5采用的原料用量比为10mmol第四化合物：12mmol酯酶。
本发明还公开了一种前述的响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素的合成方法制备得到的生物发光荧光素的应用，该响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素利用Fe(Ⅱ)荧光棒成像建立去铁治疗的动态影像评估方法，可特异性响应Fe(Ⅱ)并生成活性Akalumine荧光素，并与荧光素酶反应后生物发光，体外Fe(Ⅱ)响应浓度低至0.1μM，可用于细胞Fe(Ⅱ)成像及Fe(Ⅱ)活体成像。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素O-Akalumine的合成方法得到的O-Akalumine荧光素的发光波长在630nm，属于红光区，可穿透颅骨，适用于大小鼠脑部等成像研究，基于luciferin衍生物Akalumine研发设计的荧光素O-Akalumine可特异性响应Fe(Ⅱ)并生成活性Akalumine荧光素，并与荧光素酶反应后生物发光。由于灵敏度高于Firefly luciferin，体外Fe(Ⅱ)响应浓度低至0.1μM，O-Akalumine荧光素不仅可作为MRI探针的对照和补充，还能为微观层面研究相关脑出血水肿形成及继发性损伤、神经损伤机制提供光学成像工具。
本发明以对二甲氨基肉桂酸为原料合成的生物发光荧光素O-Akalumine，该亚铁响应生物荧光素对Fe(Ⅱ)的荧光检测，特异性荧光探针可用于Fe(Ⅱ)响应MRI成像检测，可用于细胞Fe(Ⅱ)成像和小鼠的Fe(Ⅱ)活体成像及进一步研究Fe(Ⅱ)参与的氧化损伤机制等，市场经济价值重大。
上述是发明技术方案的概述，以下结合附图与具体实施方式，对本发明做进一步说明。
附图说明
图1为本发明的生物发光荧光素的合成过程示意图；
图2为本发明的体内Fe(Ⅱ)选择性MRI/活体荧光成像的荧光示意图；
图3为本发明的体内Fe(Ⅱ)选择性MRI/活体荧光成像不同波长的荧光强度示意图。
具体实施方式：
为了使本发明的目的和技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例作详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：本实施例提供的响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素的合成方法及其应用，参见图1，具体地包括如下步骤：
(1)第一化合物的合成：室温下，以30mL甲苯为溶剂，加入40mmol的对二甲氨基肉桂酸，加入60mmol的1,2-双-(乙氧基羰基)亚乙基三苯基膦烷，搅拌升温至110℃，反应4小时后低压旋蒸移除溶剂，过色谱柱分离得到第一化合物。
(2)第二化合物的合成：将30mmol第一化合物溶于体积比1:2的异丙醇和NaOH(1M)混合溶液中，室温搅拌24小时，加HCl调节pH至6，溶液中出现大量黄色沉淀，过滤沉淀，并用乙酸乙酯洗涤水相，合并有机相并低压移除溶剂，合并固体，干燥即为第二化合物。
(3)第三化合物的合成：10mmol第二化合物溶于20mL的PBS溶液，滴加15mmol间氯过氧苯甲酸溶解于20mL乙酸乙酯中，混合后室温搅拌2小时，收集水相，冻干除去水，干燥后得到淡黄色固体即为第三化合物。
(4)第四化合物的合成：10mmol第三化合物溶于20mL的N,N-二甲基甲酰胺DMF中，加入12mmolK2CO3和2mmol三乙胺，搅拌溶解后，滴加12mmol叔丁基保护的S-三苯甲基-D-半胱氨酸，室温搅拌反应4小时后，反应液溶解于超纯水中，并用乙酸乙酯萃取洗涤三次，过色谱柱分离得到第四化合物。
(5)化合物O-Akalumine的合成：10mmol第四化合物在三苯基氧磷和三氟甲磺酸酐条件下脱去三苯基保护基团，得到第五化合物的混合物，直接将混合物溶解于水溶液中，加入12mmol酯酶室温水解过夜，色谱柱分离纯化得到生物发光荧光素O-Akalumine。
实施例2：本实施例提供的响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素的合成方法及其应用，其与实施例1基本相同，不同之处在于：
(1)第一化合物的合成过程中：20mL甲苯为溶剂，加入30mmol的对二甲氨基肉桂酸，加入45mmol的1,2-双-(乙氧基羰基)亚乙基三苯基膦烷，搅拌升温至100℃，反应3小时。
(2)第二化合物的合成过程中：25mmol第一化合物溶于体积比1:2的异丙醇和NaOH(1M)混合溶液中，室温搅拌20小时，加HCl调节pH至6。
(3)第三化合物的合成过程中：20mmol第二化合物溶于40mL的PBS溶液，滴加30mmol间氯过氧苯甲酸溶解于40mL乙酸乙酯中，混合后室温搅拌4小时。
(4)第四化合物的合成过程中：20mmol第三化合物溶于40mL的N,N-二甲基甲酰胺DMF中，加入24mmolK2CO3和4mmol三乙胺，搅拌溶解后，滴加24mmol叔丁基保护的S-三苯甲基-D-半胱氨酸，室温搅拌反应8小时。
(5)化合物O-Akalumine的合成过程中：5mmol第四化合物在三苯基氧磷和三氟甲磺酸酐条件下脱去三苯基保护基团，得到第五化合物的混合物，直接将混合物溶解于水溶液中，加入6mmol酯酶室温水解过夜。
实施例3：本实施例提供的响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素的合成方法及其应用，其与实施例1基本相同，不同之处在于：
(1)第一化合物的合成过程中：40mL甲苯为溶剂，加入50mmol的对二甲氨基肉桂酸，加入75mmol的1,2-双-(乙氧基羰基)亚乙基三苯基膦烷，搅拌升温至110℃，反应5小时。
(2)第二化合物的合成过程中：35mmol第一化合物溶于体积比1:2的异丙醇和NaOH(1M)混合溶液中，室温搅拌26小时，加HCl调节pH至6。
(3)第三化合物的合成过程中：15mmol第二化合物溶于35mL的PBS溶液，滴加22.5mmol间氯过氧苯甲酸溶解于35mL乙酸乙酯中，混合后室温搅拌3小时。
(4)第四化合物的合成过程中：5mmol第三化合物溶于10mL的N,N-二甲基甲酰胺DMF中，加入6mmolK2CO3和1mmol三乙胺，搅拌溶解后，滴加6mmol叔丁基保护的S-三苯甲基-D-半胱氨酸，室温搅拌反应4小时。
(5)化合物O-Akalumine的合成过程中：20mmol第四化合物在三苯基氧磷和三氟甲磺酸酐条件下脱去三苯基保护基团，得到第五化合物的混合物，直接将混合物溶解于水溶液中，加入24mmol酯酶室温水解过夜。
实施例4：本实施例提供的响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素的合成方法及其应用，其与实施例1基本相同，不同之处在于：
(1)第一化合物的合成过程中：35mL甲苯为溶剂，加入55mmol的对二甲氨基肉桂酸，加入70mmol的1,2-双-(乙氧基羰基)亚乙基三苯基膦烷，搅拌升温至120℃，反应4小时。
(2)第二化合物的合成过程中：28mmol第一化合物溶于体积比1:2的异丙醇和NaOH(1M)混合溶液中，室温搅拌22小时，加HCl调节pH至6。
(3)第三化合物的合成过程中：10mmol第二化合物溶于30mL的PBS溶液，滴加20mmol间氯过氧苯甲酸溶解于30mL乙酸乙酯中，混合后室温搅拌2小时。
(4)第四化合物的合成过程中：15mmol第三化合物溶于35mL的N,N-二甲基甲酰胺DMF中，加入20mmolK2CO3和3mmol三乙胺，搅拌溶解后，滴加18mmol叔丁基保护的S-三苯甲基-D-半胱氨酸，室温搅拌反应3小时。
(5)化合物O-Akalumine的合成过程中：15mmol第四化合物在三苯基氧磷和三氟甲磺酸酐条件下脱去三苯基保护基团，得到第五化合物的混合物，直接将混合物溶解于水溶液中，加入18mmol酯酶室温水解过夜。
实施例5：本实施例提供的响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素的合成方法及其应用，其与实施例1基本相同，不同之处在于：
(1)第一化合物的合成过程中：32mL甲苯为溶剂，加入35mmol的对二甲氨基肉桂酸，加入55mmol的1,2-双-(乙氧基羰基)亚乙基三苯基膦烷，搅拌升温至120℃，反应4小时。
(2)第二化合物的合成过程中：28mmol第一化合物溶于体积比1:2的异丙醇和NaOH(1M)混合溶液中，室温搅拌28小时，加HCl调节pH至6。
(3)第三化合物的合成过程中：12mmol第二化合物溶于28mL的PBS溶液，滴加20mmol间氯过氧苯甲酸溶解于32mL乙酸乙酯中，混合后室温搅拌2小时。
(4)第四化合物的合成过程中：18mmol第三化合物溶于35mL的N,N-二甲基甲酰胺DMF中，加入20mmolK2CO3和3mmol三乙胺，搅拌溶解后，滴加18mmol叔丁基保护的S-三苯甲基-D-半胱氨酸，室温搅拌反应2小时。
(5)化合物O-Akalumine的合成过程中：16mmol第四化合物在三苯基氧磷和三氟甲磺酸酐条件下脱去三苯基保护基团，得到第五化合物的混合物，直接将混合物溶解于水溶液中，加入22mmol酯酶室温水解过夜。
实施例6：本实施例对响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素体外响应发光成像性能评价：
1.以紫外吸收光谱的变化及发光强度的变化，检测O-Akalumine的Fe(Ⅱ)选择性成像能力，紫外可见光谱分析：配置至少四个浓度的Fe(Ⅱ)离子PBS溶液，通过紫外可见分光光度计测定Fe(Ⅱ)/Fer-Gd-DOTA的吸光度及变化，并通过斜率确定消光系数及选择性性反应情况。
2.体内Fe(Ⅱ)选择性MRI/活体荧光成像性能评价，
(1)脑出血模型：雄性SD大鼠(12W，300-400g)。用戊巴比妥(45mg/kg，腹膜内)麻醉大鼠，保持体温在37℃。右股动脉插管以连续监测血压并采集血液100μL。将大鼠置于立体定位仪上，根据大鼠解剖图谱，以前囟与矢状缝交点定位原点，在原点前1mm,右3.5mm处钻孔，用微量注射器抽吸100μL自体全血，26号针头沿骨孔缓慢垂直插至硬脑膜下5.5mm，退针0.2mm，使用微量输液泵以10μL/分钟的速度注射自体全血(100μL)。对照组大鼠注入100μL盐水。注射后，拔下针头，用骨蜡填充毛刺孔，并用缝合线缝合皮肤切口。
(2)活体Fe(Ⅱ)选择性生物发光成像：使用小动物活体荧光成像系统进行大鼠的生物发光成像。脑出血模型大鼠或对照组在输自体血(生理盐水)后的第1、2、3、5、7、14和21天进行活体成像。成像前，颅内注射荧光素酶，或者以图像在Luminescence模式下采集，开放光栅，通过系统自带分析软件绘制感兴趣区域(ROI)并测量相关组织的发光强度。
(3)去铁治疗疗效及Fe(Ⅱ)含量动态评估：ICH模型鼠或对照组大鼠，将大鼠分为三组。治疗组分为三种铁螯合剂：甲磺酸去甲氧胺、2,2'-联吡啶或VK-28DFX(100mg/kg肌肉注射，建模后2小时，然后每间隔12小时，共计7天，n＝3)，对照组输注相同量的生理盐水治疗。对照组接受等量的生理盐水治疗。在第1、3、7、14和21天后处死ICH大鼠，在第7天处死盐水对照大鼠，以进行组织学检查。治疗组大鼠在预设时间点进行Fe(Ⅱ)含量染色和ICP-MS定量分析Fe(Ⅱ)元素含量，并进行相关蛋白印迹分析。所有动物都经过在第1、2、3、5、7、14和21天完成MRI及活体荧光成像。
本发明AD模型5xFAD小鼠荧光探针响应性活体成像的荧光图如图2所示，以及不同波长的荧光强度图，如图3所示。
可见，响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素应用荧光探针在不同模型鼠的头部成像结果，可特异性响应AD头部的氧化环境，并显示更高的荧光信号。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。
Claims (8)
1.一种响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：用对二甲氨基肉桂酸、1,2-双-(乙氧基羰基)亚乙基三苯基膦烷反应合成得到第一化合物；
S2：将所得第一化合物溶于异丙醇和NaOH混合溶液中并室温搅拌24小时后，调节PH值析出沉淀，有机相经低压移除溶剂，合并固体经干燥即得第二化合物；
S3：将所得第二化合物溶于PBS溶液后滴加间氯过氧苯甲酸乙酸乙酯溶液，搅拌反应后，收集水相，干燥即得淡黄色固体第三化合物；
S4：将所得第三化合物溶于N,N-二甲基甲酰胺DMF中，加入K2CO3和三乙胺搅拌溶解后，滴加叔丁基保护的S-三苯甲基-D-半胱氨酸，室温搅拌反应，反应产物溶解于超纯水中，经萃取洗涤、过色谱柱分离后，得到第四化合物。
S5：将所得第四化合物在三苯基氧磷和三氟甲磺酸酐条件下脱去三苯基保护基团，得到第五化合物的混合物，所得混合物溶解于水中，加入酯酶室温水解过夜，色谱柱分离纯化后得到生物发光荧光素O-Akalumine。
2.根据权利要求1所述的响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素的合成方法，其特征在于，所述步骤S1的第一化合物采用的原料用量比为30-50mmol对二甲氨基肉桂酸：45-75mmol1,2-双-(乙氧基羰基)亚乙基三苯基膦烷。
3.根据权利要求1或2所述的响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素的合成方法，其特征在于，所述步骤S1还包括以下步骤：以20-40mL甲苯为溶剂，加入30-50mmol对二甲氨基肉桂酸和45-75mmol1,2-双-(乙氧基羰基)亚乙基三苯基膦烷，搅拌升温至100-120℃，反应3-5小时后低压旋蒸移除溶剂，过色谱柱分离后得到第一化合物。
4.根据权利要求1所述的响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素的合成方法，其特征在于，所述步骤S2还包括以下步骤：将25-35mmol第一化合物溶于体积比1:2的异丙醇和NaOH混合溶液中，室温搅拌20-26小时，加HCl调节pH值为6，过滤沉淀，用乙酸乙酯洗涤水相，合并有机相后低压移除溶剂，合并固体经干燥即得第二化合物。
5.根据权利要求1所述的响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素的合成方法，其特征在于，所述步骤S3包括以下步骤：将10-20mmol第二化合物溶于20-40mL的PBS溶液后滴加溶于20-40mL乙酸乙酯中的15-30mmol间氯过氧苯甲酸溶液，室温下混合搅拌2-4小时，收集水相，冻干除去水，干燥后得到淡黄色固体第三化合物。
6.根据权利要求1所述的响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素的合成方法，其特征在于，所述步骤S4采用的原料用量比为5-20mmol第三化合物：10-40mLN,N-二甲基甲酰胺DMF：6-24mmolK2CO3：1-4mmol三乙胺：6-24mmol叔丁基保护的S-三苯甲基-D-半胱氨酸；所述步骤S4中室温搅拌反应2-8小时；用乙酸乙酯萃取洗涤三次。
7.根据权利要求1所述的响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素的合成方法，其特征在于，所述步骤S5采用的原料用量比为10mmol第四化合物：12mmol酯酶。
8.一种权利要求1-7任一所述的响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素的合成方法制备得到的生物发光荧光素的应用，其特征在于，该响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素利用Fe(Ⅱ)荧光棒成像建立去铁治疗的动态影像评估方法，可特异性响应Fe(Ⅱ)并生成活性Akalumine荧光素，并与荧光素酶反应后生物发光，对Fe(Ⅱ)进行荧光检测，体外Fe(Ⅱ)响应浓度低至0.1μM，可用于细胞Fe(Ⅱ)成像及Fe(Ⅱ)活体成像。
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| SATOSHI IWANO ET AL.: "Development of simple firefly luciferin analogs emitting blue, green, red, and near-infrared biological window light" * |
| TAKAHIRO KUCHIMARU ET AL.: "A luciferin analogue generating near-infraredbioluminescence achieves highly sensitivedeep-tissue imaging" * |
| 李俊彬: "近红外激发/生物发光分子探针的设计、合成与应用研究" * |
| 马素芳等: "亚铁离子荧光探针的研究进展" * |
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