CN114252971A - 一种用于骨髓涂片的自动对焦方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于骨髓涂片的自动对焦方法，包括以下步骤：（1）上下移动机械臂带动骨髓涂片在暗场光路下对目标细胞进行拍摄，其机械臂所在拍摄位置为Pos1，其对应的逻辑值为X1，再上下分别移动9次，共得到19个逻辑值，以此19个逻辑值与X1的差值坐标作为X；（2）每个X值对应在暗场光路（数字全息显微镜）下相机拍下骨髓涂片的细胞全息图和空白背景的全息图，利用opencv（Matlab）对全息图做快速傅里叶变换，将拍得的全息图从空域转为频域，得到频谱图；（3）在频谱图中截取﹢1级或‑1级频谱，并在未被截取的频谱区域补零，分别进行逆傅里叶操作，取相位，用细胞全息图的相位减去空白背景全息图的相位；该发明利用自动聚焦算法，缩短了骨髓涂片拍摄所用的对焦时间，大大提高了骨髓涂片的拍摄效率。
Description
技术领域
本发明属于人工智能医疗诊断领域，尤其涉及一种用于骨髓涂片的自动对焦方法。
背景技术
现阶段针对骨髓涂片的扫描设备一般是将骨髓涂片放置在载物台上，显微镜镜头安装机架上，载物台上下移动，实现对骨髓涂片的对焦，主要存在以下技术难点：显微镜的百倍镜的景深范围较小，而在制作骨髓涂片时，涂片制作的薄厚不均，细胞大小的差异，以及涂片上杂质的存在，往往对硬件设备及算法的精细程度要求很高。
目前涂片的对焦方法主要以下几种：1、通过先粗调，再微调，完成对焦，处理效率低。2、借助测量工具，如激光测距仪等，先测量目标相对高度，然后载物台根据测量数据移动到焦点，该方式对测量工具精度和涂片平整度以及洁净度要求较高，不能保证实际焦点拍摄图像中主要观察对象一定清晰，存在随机性。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，而提供一种用于骨髓涂片的自动对焦方法，该发明利用自动对焦算法，可随机对模糊的骨髓涂片图像进行分析，得出确定的明场光路焦点，实现骨髓涂片的对焦及拍摄。
本发明解决上述问题所采用的技术方案是：提供一种用于骨髓涂片的自动对焦方法，包括以下步骤：
（1）上下移动机械臂带动骨髓涂片在暗场光路下对目标细胞进行拍摄，其机械臂所在拍摄位置为Pos1，其对应的逻辑值为X1，再上下分别移动9次，共得到19个逻辑值，以此19个逻辑值与X1的差值坐标作为X；
（2）每个X值对应在暗场光路（数字全息显微镜）下相机拍下骨髓涂片的细胞全息图和空白背景的全息图，利用opencv（Matlab）对全息图做快速傅里叶变换，将拍得的全息图从空域转为频域，得到频谱图；
（3）在频谱图中截取﹢1级或-1级频谱，并在未被截取的频谱区域补零，分别进行逆傅里叶操作，取相位，用细胞全息图的相位减去空白背景全息图的相位；
（4）相位解包裹，将相减的相位限制在-π到π的范围内，得到骨髓涂片的表面细胞形态图，同时得到细胞的复振幅分布A1；
（5）对每个X值对应算出的细胞的复振幅分布A1做菲涅尔正衍射传播模拟，得到细胞在相机CMOS平面上的复振幅分布A2；
（6）再从细胞在相机CMOS平面上的复振幅分布A2做逆向菲涅尔衍射传播模拟，得到细胞平面附近的复振幅分布A3；
（7）在显微物镜的正负焦深范围内取20个平均分布的点，通过复振幅分布，分别算出相机平面的振幅和相位分布，运用清晰度评价函数计算每个细胞位置振幅的清晰度值，取自聚焦清晰度值最高的位置Pos2，其对应逻辑坐标为Y；
（8）用最小二乘法拟合这19个点作为X值和每个X值点对应自聚焦最清晰位置Pos2处的的Y值的关系；
（9）在明场显微光路下找到和上述暗场光路下拍摄骨髓涂片全息图相同的的视野，手动调焦，找到细胞清晰的位置Pos3，其逻辑坐标为Z；
（10）计算明场光路下细胞清晰位置Pos3处的Z值和暗场光路下目标细胞逻辑位置X值的对应关系；
（11）通过暗场光路下目标细胞逻辑位置X值作为中间量转换得到Pos2处的Y值和Pos3处的Z值的对应关系；
（12）通过Y值和Z值的关系，即模糊的骨髓涂片图像在算法中算出一个距离值Y后，可得到对应Z的值，即为对应的明场光路下的细胞清晰位置。
进一步地，所述暗场光路，为数字全息显微镜光路，用于建立X和Y关系式，包括物光和参考光两个光路，物光光路为依次设置的激光光源、准直镜、分光棱镜一、骨髓涂片、物镜一、平凸透镜、分光棱镜二和相机，参考光路为依次设置的激光光源、准直镜、分光棱镜一、反射镜一、物镜二、消色差双胶合透镜二、反射镜二、分光棱镜二和相机二。
进一步地，所述分光棱镜一与分光棱镜二的分光比均为50%∶50%。
进一步地，所述细胞的复振幅分布计算公式为：
其中，U(x,y)为观察平面光场复振幅分布，x0y0为衍射孔径平面，xy为观察平面，U0(x0,y0)为衍射孔径平面上光场复振幅分布，k=2π/λ是波数，z为衍射孔径平面和观察平面的垂直距离。
进一步地，所述明场光路，用于建立X和Z的关系式，包括依次设置的LED光源、聚光镜、骨髓涂片、物镜、消色差双胶合透镜一和相机一。
进一步地，所述自聚焦清晰位置Pos2处的Y值与暗场光路下目标细胞逻辑位置X值的对应关系为：
Y=4.845X+0.0285
其中，X、Y的单位为μm。
进一步地，所述明场光路下细胞清晰位置Pos3处的Z值和暗场光路下目标细胞逻辑位置X值的对应关系为：
Z=X1-1.126X
其中，X、Z的单位为μm。
进一步地，所述Pos2处的Y值和Pos3处的Z值的对应关系为：
Z=X1+0.0066-0.2324Y
其中，Y、Z的单位为μm。
进一步地，所述机械臂中对应的逻辑值X1的取值范围为0~1000μm。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：利用自动聚焦算法，缩短了骨髓涂片拍摄所用的对焦时间，大大提高了骨髓涂片的拍摄效率；只需首次确定暗场光路焦点时使用全息显微镜拍摄，后续利用算法直接计算明场光路焦点；拍摄骨髓涂片时不用预对焦，只需随机拍摄一张图像，利用算法可算出对焦所需焦距，机械臂直接将骨髓涂片移动到焦点距离，即可得到清晰的骨髓细胞图像。
附图说明
图1是本发明的明场光路布设图。
图2是本发明的暗场光路（即数字全息显微镜）的布设图。
图3是本发明的机械臂在X1=581.8μm处拍摄的测试玻片图像。
图4是本发明的运用自动对焦算法后机械臂在583.81μm处直接拍摄的测试玻片图像。
附图标记说明：1、LED光源；2、聚光镜；3、骨髓涂片；4、物镜；5、消色差双胶合透镜一；6、相机一；7、激光光源；8、准直镜；9、分光棱镜一；10、骨髓涂片；11、物镜一；12、平凸透镜；13、分光棱镜二；14、相机二；15、反射镜一；16、物镜二；17、消色差双胶合透镜二；18、反射镜二。
具体实施方式
下面结合附图并通过实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
实施例1。
本发明的一种用于骨髓涂片的自动对焦方法，包括以下步骤：
（1）上下移动机械臂带动骨髓涂片在暗场光路下对目标细胞进行拍摄，其机械臂所在拍摄位置为Pos1，其对应的逻辑值为X1，X1的取值范围为0~1000μm，再上下分别移动9次，共得到19个逻辑值，以此19个逻辑值与X1的差值坐标作为X，单位μm；
（2）每个X值对应在暗场光路（数字全息显微镜）下相机拍下骨髓涂片的细胞全息图和空白背景的全息图，利用opencv（Matlab）对全息图做快速傅里叶变换，将拍得的全息图从空域转为频域，得到频谱图；
（3）在频谱图中截取﹢1级或-1级频谱，并在未被截取的频谱区域补零，分别进行逆傅里叶操作，取相位，用细胞全息图的相位减去空白背景全息图的相位；
（4）相位解包裹，将相减的相位限制在-π到π的范围内，得到骨髓涂片的表面细胞形态图，同时得到细胞的复振幅分布A1；
（5）对每个X值对应算出的细胞的复振幅分布A1做菲涅尔正衍射传播模拟，得到细胞在相机CMOS平面上的复振幅分布A2；
（6）再从细胞在相机CMOS平面上的复振幅分布A2做逆向菲涅尔衍射传播模拟，得到细胞平面附近的复振幅分布A3；
（7）在显微物镜的正负焦深范围内取20个平均分布的点，通过复振幅分布，分别算出相机平面的振幅和相位分布，运用清晰度评价函数计算每个细胞位置振幅的清晰度值，取自聚焦清晰度值最高的位置Pos2，其对应逻辑坐标为Y，单位μm；
（8）用最小二乘法拟合这19个点作为X值和每个X值点对应自聚焦最清晰位置Pos2处的的Y值的关系，得到X与Y的关系式：Y=4.845X+0.0285；
（9）在显微明场光路下找到和上述暗场光路下拍摄骨髓涂片全息图相同的的视野，手动调焦，找到细胞清晰的位置Pos3，其逻辑坐标为Z，单位μm；
（10）计算明场光路下细胞清晰位置Pos3处的Z值和暗场光路下目标细胞清晰位置Pos1处的X值的对应关系，得出其关系式为：Z=X1-1.126X；
（11）通过Pos1处的X值作为中间量转换得到Pos2处的Y值和Pos3处的Z值的对应关系，其关系式为Z=X1+0.0066-0.2324Y；
（12）通过Y值和Z值的关系，即模糊的骨髓涂片图像在算法中算出一个距离值Y后，可得到对应Z的值，即为对应的明场光路下的细胞清晰位置。
在上述步骤中，明场光路用于建立X和Z的关系式，其布设结构如图1所示，包括依次设置的LED光源1、聚光镜2、骨髓涂片3、物镜4、消色差双胶合透镜一5和相机一6。
暗场光路即为数字全息显微镜，用于建立X和Y关系式，其布设结构如图2所示，包括物光和参考光两个光路，物光光路为依次设置的激光光源7、准直镜8、分光棱镜一9、骨髓涂片10、物镜一11、平凸透镜12、分光棱镜二13和相机二14，参考光路为依次设置的激光光源7、准直镜8、分光棱镜一9、反射镜一15、物镜二16、消色差双胶合透镜二17、反射镜二18、分光棱镜二13和相机二14。分光棱镜一与分光棱镜二的分光比均为50%∶50%。
本发明在计算细胞的复振幅分布时采用的公式为：
其中，U(x,y)为观察平面光场复振幅分布，x0y0为衍射孔径平面，xy为观察平面，U0(x0,y0)为衍射孔径平面上光场复振幅分布，k=2π/λ是波数，z为衍射孔径平面和观察平面的垂直距离。
如图3-4所示，当X1=581.8μm，机械臂拍出的照片比较模糊，对其图像进行算法分析，得出Y=-8.6，则Z=583.81，然后将机械臂直接移动至坐标583.81μm处，即可拍得一张清晰的测试玻片的图像。
此外，需要说明的是，本说明书中所描述的以上内容仅仅是对本发明所作的举例说明。凡依据本发明专利构思所述的特征及原理所做的等效变化或者简单变化，均包括于本发明专利的保护范围内。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的技术方案或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种用于骨髓涂片的自动对焦方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）上下移动机械臂带动骨髓涂片在暗场光路下对目标细胞进行拍摄，其机械臂所在拍摄位置为Pos1，其对应的逻辑值为X1，再上下分别移动9次，共得到19个逻辑值，以此19个逻辑值与X1的差值坐标作为X；
（2）每个X值对应在暗场光路（数字全息显微镜）下相机拍下骨髓涂片的细胞全息图和空白背景的全息图，利用opencv（Matlab）对全息图做快速傅里叶变换，将拍得的全息图从空域转为频域，得到频谱图；
（3）在频谱图中截取﹢1级或-1级频谱，并在未被截取的频谱区域补零，分别进行逆傅里叶操作，取相位，用细胞全息图的相位减去空白背景全息图的相位；
（4）相位解包裹，将相减的相位限制在-π到π的范围内，得到骨髓涂片的表面细胞形态图，同时得到细胞的复振幅分布A1；
（5）对每个X值对应算出的细胞的复振幅分布A1做菲涅尔正衍射传播模拟，得到细胞在相机CMOS平面上的复振幅分布A2；
（6）再从细胞在相机CMOS平面上的复振幅分布A2做逆向菲涅尔衍射传播模拟，得到细胞平面附近的复振幅分布A3；
（7）在显微物镜的正负焦深范围内取20个平均分布的点，通过复振幅分布，分别算出相机平面的振幅和相位分布，运用清晰度评价函数计算每个细胞位置振幅的清晰度值，取自聚焦清晰度值最高的位置Pos2，其对应逻辑坐标为Y；
（8）用最小二乘法拟合这19个点作为X值和每个X值点对应自聚焦最清晰位置Pos2处的的Y值的关系；
（9）在明场显微光路下找到和上述暗场光路下拍摄骨髓涂片全息图相同的的视野，手动调焦，找到细胞清晰的位置Pos3，其逻辑坐标为Z；
（10）计算明场光路下细胞清晰位置Pos3处的Z值和暗场光路下目标细胞逻辑位置X值的对应关系；
（11）通过暗场光路下目标细胞逻辑位置X值作为中间量转换得到Pos2处的Y值和Pos3处的Z值的对应关系；
（12）通过Y值和Z值的关系，即模糊的骨髓涂片图像在算法中算出一个距离值Y后，可得到对应Z的值，即为对应的明场光路下的细胞清晰位置。
2.根据权利要求1所述的一种用于骨髓涂片的表面形态测量系统，其特征在于，所述暗场光路，为数字全息显微镜光路，用于建立X和Y关系式，包括物光和参考光两个光路，物光光路为依次设置的激光光源、准直镜、分光棱镜一、骨髓涂片、物镜一、平凸透镜、分光棱镜二和相机，参考光路为依次设置的激光光源、准直镜、分光棱镜一、反射镜一、物镜二、消色差双胶合透镜二、反射镜二、分光棱镜二和相机二。
3.根据权利要求2所述的一种用于骨髓涂片的表面形态测量系统，其特征在于，所述分光棱镜一与分光棱镜二的分光比均为50%∶50%。
4.根据权利要求1所述的一种用于骨髓涂片的表面形态测量系统，其特征在于，所述细胞的复振幅分布计算公式为：
其中，U(x,y)为观察平面光场复振幅分布，x0y0为衍射孔径平面，xy为观察平面，U0(x0,y0)为衍射孔径平面上光场复振幅分布，k=2π/λ是波数，z为衍射孔径平面和观察平面的垂直距离。
5.根据权利要求1所述的一种用于骨髓涂片的表面形态测量系统，其特征在于，所述明场光路，用于建立X和Z的关系式，包括依次设置的LED光源、聚光镜、骨髓涂片、物镜、消色差双胶合透镜一和相机一。
6.根据权利要求1所述的一种用于骨髓涂片的表面形态测量系统，其特征在于，所述自聚焦清晰位置Pos2处的Y值与暗场光路下目标细胞逻辑位置X值的对应关系为：
Y=4.845X+0.0285
其中，X、Y的单位为μm。
7.根据权利要求1所述的一种用于骨髓涂片的表面形态测量系统，其特征在于，所述明场光路下细胞清晰位置Pos3处的Z值和暗场光路下目标细胞逻辑位置X值的对应关系为：
Z=X1-1.126X
其中，Z、X的单位为μm。
8.根据权利要求1所述的一种用于骨髓涂片的表面形态测量系统，其特征在于，所述Pos2处的Y值和Pos3处的Z值的对应关系为：
Z=X1+0.0066-0.2324Y
其中，Y、Z的单位为μm。
9.根据权利要求1所述的一种用于骨髓涂片的表面形态测量系统，其特征在于，所述机械臂中对应的逻辑值X1的取值范围为0~1000μm。
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