CN114250297A - 基因突变在结肠癌、肺癌易感基因变异检测中的应用 - Google Patents

基因突变在结肠癌、肺癌易感基因变异检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基因突变在结肠癌、肺癌易感基因变异检测中的应用。提供了一种基因突变或核酸在制备试剂盒或设备中的应用，所述试剂盒或者设备用于检测结肠癌或肺癌；所述基因突变为位于BRD2基因上的突变位点rs778675391；所述核酸为与野生型BRD2基因相比，具有c.2455A>T突变。该基因突变是结肠癌或者肺癌相关性强，通过检测该突变在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否患结肠癌或者肺癌或者易患结肠癌或者肺癌。该基因突变进一步扩展和完善了结肠癌或肺癌疾病的检测和研究，为该疾病的诊断和治疗提供了新的检测位点，以及新的检测方法和途径。

Description

基因突变在结肠癌、肺癌易感基因变异检测中的应用
技术领域
本发明涉及生物领域，具体涉及一种基因突变在结肠癌、肺癌易感基因变异检测中的应用。
背景技术
恶性肿瘤具有转移性强、复发率高、死亡率高等特点，是危害我国人民身体健康的重大疾病。研究表明，恶性肿瘤是由环境因素和遗传因素等共同作用引起的。肿瘤发生的家族聚集现象，是提示肿瘤可能具有遗传性的最早线索之一。近年来，随着基于常见变异的遗传关联研究的广泛开展，越来越多的肿瘤遗传易感基因和变异得以发现。最近，高通量基因组测序技术的测序通量和准确性迅速提升，而测序成本大幅下降。因此，高通量基因组测序技术得以在肿瘤易感基因的鉴定中大量应用，发现TP53(J Clin Oncol.2018Feb20；36(6):591-599.)、GPR161(J Clin Oncol.2020Jan 1；38(1):43-50.)CHD1(Nat Genet.2019Jan；51(1):76-87.)、ELP1(Nature.2020Apr；580(7803):396-401.)等一批基因上的罕见变异与多种肿瘤的发病风险增加有关。肿瘤易感基因及变异的发现，有助于深入阐明肿瘤发生发展的分子机理，针对性设计分子靶向干预方法，以及肿瘤的发病风险预测，从而为推动肿瘤的精准防治提供重要依据。
但是，肿瘤的遗传易感性仍然没有得到全部揭示，发现新的肿瘤遗传易感基因和变异是今后需要持续开展的研究方向。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种基因突变在结肠癌、肺癌易感基因变异检测中的应用。
我们采用高通量测序等基因组学技术，对来自中国的约2400名结肠癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等肿瘤患者和1960名非肿瘤对照个体进行目标基因区域的遗传变异研究，发现了一个与结肠癌、肺癌发病风险增加显著相关的易感基因变异(其中，结肠癌fisher’s exacttest p＝0.003537；肺癌fisher’s exact test p＝0.008257)，并发明了用于该变异位点检测的有效方法。所发现的该基因突变位点，补充了现有用于结肠癌、肺癌等肿瘤易感风险预测的基因变异检测位点，利用BRD2基因变异rs778675391(ENST00000395287.5:c.2455A>T；ENSP00000378702.1:p.Glu726Asp)提供一种迅速检测结肠癌、肺癌等肿瘤易感风险的方法。其应用该基因变异位点能够快速、准确、高效、简便、早期诊断率高，检测结果可以为结肠癌、肺癌的早期诊断、鉴别诊断及开发治疗结肠癌、肺癌的治疗药物提供科学依据。
具体而言，本发明提供了如下技术方案：
在本发明的第一方面，本发明提供了一种基因突变或核酸在制备试剂盒或设备中的应用，所述试剂盒或者设备用于检测结肠癌或肺癌；所述基因突变为位于BRD2基因上的突变位点rs778675391；所述核酸为与野生型BRD2基因相比，具有c.2455A>T突变。发明人首次发现BRD2基因上的突变位点rs778675391或者用核酸表示即也野生型BRD2基因相比，具有c.2455A>T突变的核酸，与结肠癌和肺癌的发病发病密切相关，从而可以通过检测上述基因突变或者上述核酸在生物样品中是否发生，可以有效地检测生物样品是否患有结肠癌或者肺癌。
根据本发明的实施例，所述基因突变或者所述核酸表达的蛋白与野生型BRD2基因表达的蛋白相比，具有p.Glu726Asp突变。通过研究发现，BRD2基因上所发生的c.2455A>T突变，使得合成的蛋白质与野生型BRD2基因所表达的蛋白质或者多肽不同，具体表现为在726位由谷氨酸(Glu)突变为天冬氨酸(Asp)。该多肽与结肠癌或者肺癌的发病密切相关，从而可以通过检测该多肽在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易感结肠癌或者肺癌。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种生物模型在筛选药物中的用途，所述药物用于预防或治疗结肠癌或肺癌，所述生物模型携带下列至少之一：(1)基因突变位点rs778675391；(2)与野生型BRD2基因相比，具有c.2455A>T突变；(3)与野生型BRD2基因所表达的蛋白相比，具有p.Glu726Asp突变的多肽。由此所提供的生物模型能有效地用作结肠癌或者肺癌的相关研究的模型。
在本发明的第三方面，本发明提供了特异性改变基因突变或者核酸的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗结肠癌或肺癌，所述基因突变为位于BRD2基因上的突变位点rs778675391；所述核酸为与野生型BRD2基因相比，具有c.2455A>T突变。需要说明的是，这里的特异性改变是指能使得突变的核酸或者基因突变的位点恢复到原来的野生状态或者其他不具有致病性的状态，而对于个体基因组的其他序列不产生实质影响。如前所述，所述核酸或者所述基因突变与结肠癌或者肺癌的发病密切相关，由此，特异性改变前面所述的核酸或者前面所述的基因突变的试剂制备的药物能有效用于治疗结肠癌或者肺癌。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种基因突变或核酸在制备构建体中的用途，所述构建体用于制备治疗结肠癌或肺癌的药物，所述构建体包含所述基因突变或者所述核酸；所述基因突变为位于BRD2基因上的突变位点rs778675391；所述核酸为与野生型BRD2基因相比，具有c.2455A>T突变。需要说明的是，“构建体包含所述基因突变”表示，本发明的构建体与野生型BRD2基因相比具有rs778675391突变；“构建体包含所述的核酸”表示，本发明的构建体与野生型BRD2基因相比，其所包含的核酸具有c.2455A>T突变。由此，根据本发明实施例的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用作结肠癌、肺癌相关研究的模型，或者用作制备治疗结肠癌或者肺癌的药物中。
在本发明的第五方面，本发明提供了一种基因突变或核酸在制备重组细胞中的用途，所述重组细胞用于制备治疗结肠癌或肺癌的药物；所述重组细胞中包含所述基因突变或者所述核酸；所述基因突变为位于BRD2基因上的突变位点rs778675391；所述核酸为与野生型BRD2基因相比，具有c.2455A>T突变。本发明的重组细胞，能够有效地用作结肠癌、肺癌相关研究的模型。
在本发明的第六方面，本发明提供了一种检测结肠癌或肺癌的试剂盒，所述试剂盒中包括检测基因突变或核酸的试剂；所述基因突变为位于BRD2基因上的突变位点rs778675391；所述核酸为与野生型BRD2基因相比，具有c.2455A>T突变。所提到的基因突变或者核酸与结肠癌和肺癌的发病密切相关，进而能用于包含能有效地检测所述核酸或者所述基因突变的试剂盒能有效筛选出易患结肠癌和肺癌的生物样品。
本发明利用BRD2基因变异rs778675391(ENST00000395287.5:c.2455A>T；ENSP00000378702.1:p.Glu726Asp)及所提供的特异引物，通过常规PCR及桑格测序即可对待检样本做出快速检测，为相关人群提供结肠癌、肺癌等肿瘤发病风险预测。本发明操作简单，结果直接、准确，试剂盒所需试剂为市面常见试剂、成本低，适合临床广泛推广。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
本文中所提到的基因突变，为位于BRD2基因上的突变位点rs778675391。如果以核酸表示，则该核酸与野生型BRD2基因相比，具有c.2455A>T突变。发明人发现BRD2基因上的c.2455A>T突变与结肠癌或者肺癌的发病密切相关，从而通过检测上述基因突变在生物样品中是否发生，可以有效地检测生物样品是否患结肠癌或者肺癌或者易患结肠癌或者肺癌。
本文中，所提到的基因突变作本领域通常理解，指基因在结构上发生碱基对组成或者排列顺序的改变。本文中，基因突变是指发生在BRD2基因上的突变。该基因突变是可以被检测的或者说是可以被辨别的，其可以作为BRD2基因上的一个突变位点被检测或者辨别，也可以被作为BRD2基因的部分核酸或者BRD2基因的全部核酸被检测或者辨别。当然也可以称该基因突变是可以被甄选的。可以采用本领域常用的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂等，对上述基因突变进行检测。
在本发明中，当提及核酸时，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本文中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及BRD2基因的序列，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。
需要说明的是，野生型BRD2基因的编码序列可以从如下网址获得：http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Transcript/Sequence_cDNA？db＝core；g＝ENSG00000204256；r＝6:32968594-32981505；t＝ENST00000395287。另外，无论是野生型BRD2基因的DNA序列(例如包括内含子序列、外显子序列等)、RNA序列、所编码的蛋白信息等有关该野生型BRD2基因的信息均在ENSEMBL数据库中有收录。本文中所提到的c.2455A>T突变是以上述网址所对应的编码序列进行定位的。其中BRD2基因的cDNA的ENSEMBL参考序列号为ENST00000395287.5，所对应的蛋白质ENSEMBL参考序列号为ENSP00000378702.1。
本文中，所示出的c.2455A>T突变是指发生在野生型BRD2基因上的，以BRD2 cDNA第一个核苷酸作为1计算，位于BRD2基因上第12号外显子的第2455位腺嘌呤核苷酸突变为胸腺嘧啶核苷酸。
同时为了方便查看，将该野生型BRD2基因的部分核酸序列提供如下：
SEQ ID NO:3(其中用方框框出来的为突变前的碱基A)
Figure BDA0002693323080000041
经过突变后的BRD2基因的部分核酸序列如下所示：
SEQ ID NO:4(其中用方框框出来的为突变后的碱基T)
Figure BDA0002693323080000042
经由上述突变后，所产生的产物在第726位由谷氨酸突变为天冬氨酸，即p.Glu726Asp。
需要说明的是，上述给出的突变位点以及序列等，均是以收录于NCBI数据库中的内容作为参考，本领域技术人员应该理解的是，由于数据库的更新或者数据库的不同，所示出的突变位点以及序列可能会稍有不同或者变化，这些不同或者变化均可以给出的该数据库中的内容为标准找到，这些不同或者变化也均包含在本发明的保护范围之内。
而且，本领域技术人员能够理解的是，本文中所使用的野生型BRD2基因序列位置是以人类基因组中野生型BRD2基因的序列为准，但当该野生型BRD2基因存在于其他物种时，该序列可能会有所差异，可以将该物种的野生型BRD2基因与人类基因组中野生型BRD2基因进行比对，获得该物种的野生型BRD2基因中所对应的位置。
在本发明的又一方面，本发明提出了基因突变或核酸在制备试剂盒或者设备中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒或者设备用于检测结肠癌或者肺癌；所述基因突变为位于BRD2基因上的突变位点rs778675391；所述核酸为与野生型BRD2基因相比，具有c.2455A>T突变。如前所述，本文中所提到的基因突变或者核酸与结肠癌或者肺癌发病密切相关，进而检测所述核酸或所述基因突变，用于制备试剂盒或者设备，所得到的试剂盒或者设备能有效筛选出患结肠癌或者肺癌或者易患结肠癌或者肺癌的生物样品。
根据本发明的实施例，所述试剂盒或者设备包括特异性针对所述核酸、所述基因突变和所述多肽的至少之一的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一。例如，发明人可通过特异性识别所述多肽的抗体与所述多肽的特异性结合来检测待测样品中是否存在上述突变，即通过特异性抗体与抗原的相互作用来检测上述多肽是否存在；发明人还可以通过预先设计特异性识别所述核酸或基因突变的探针，通过探针与上述核酸或基因突变位点所在的核酸片段发生互补配对，来鉴别上述核酸或基因突变的存在；发明人还可以设计用于扩增上述基因突变所在外显子的特异性引物，进而通过基因扩增以及测序，确定上述基因突变是否存在；发明人还可以通过质谱来检测多肽的m/z来判断，上述发生c.2455A>T突变所表达的多肽是否存在。根据本发明的具体实施例的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一能特异性、高灵敏性地筛选出前面所述的核酸或者前面所述的基因突变或者前面所述的多肽，进而特异性、高灵敏性地筛选出患结肠癌或者肺癌的生物样品，进而能有效用于制备筛选患结肠癌或者肺癌的生物样品的试剂盒或者设备。
在本发明的另一方面，本发明提出了生物模型在筛选药物中的用途，所述药物用于预防或治疗结肠癌或肺癌。根据本发明的实施例，所述生物模型携带下列至少之一：(1)基因突变位点rs778675391；(2)与野生型BRD2基因相比，具有c.2455A>T突变；(3)与野生型BRD2基因所表达的蛋白相比，具有p.Glu726Asp突变的多肽。根据本发明的实施例的生物模型能有效地用作结肠癌或者肺癌的相关研究的模型。这些生物模型可以是细胞模型也可以是动物模型。
在本发明的又一方面，本发明提出了特异性改变基因突变或者核酸的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗结肠癌或者肺癌。需要说明的是，这里的特异性改变是指能使得突变的核酸或者基因突变的位点恢复到原来的野生状态或者其他不具有致病性的状态，而对于个体基因组的其他序列不产生实质影响。如前所述，前面所述的核酸或者前面所述的基因突变与结肠癌或者肺癌的发病或者易感密切相关，由此，由这些能够特异性改变前面所述的核酸或者前面所述的基因突变的试剂所制备的药物能有效用于治疗结肠癌或者肺癌。
根据本发明的实施例，所述试剂为基于shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1和锌指核酸酶至少之一的试剂。例如，CRISPRs技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术，CRISPR-Cas9主要通过基因敲除、特种变异的引入和定点转基因三种途径来实现基因组改造，基于CRISPR-Cas9的方法，发明人可以设计出sgRNA并合成该序列的gRNA，然后将gRNA与d Cas9在细胞中共表达，通过gRNA介导d Cas9蛋白与目标DNA区域结合，进而实现特定位点的修复或改变。
在本发明的又一个方面，本发明提出了一种基因突变或核酸在制备构建体中的用途，所述构建体用于制备治疗结肠癌或者肺癌的药物，所述构建体包含所述基因突变或者所述核酸。根据本发明的实施例，所述基因突变为位于BRD2基因上的突变位点rs778675391；所述核酸为与野生型BRD2基因相比，具有c.2455A>T突变。由此，根据本发明实施例的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用作结肠癌或者肺癌的相关研究的模型。其中，所述受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选该受体细胞来源于哺乳动物。
在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。
在本发明的再一个方面，本发明提出了一种基因突变或核酸在制备重组细胞中的用途，所述重组细胞用于表达结肠癌或者肺癌的药物。根据本发明的实施例，所述重组细胞中包含所述基因突变或者所述核酸；所述基因突变为位于BRD2基因上的突变位点rs778675391；所述核酸为与野生型BRD2基因相比，具有c.2455A>T突变。根据本发明的一些实施例，本发明的重组细胞，能够有效地用作结肠癌或者肺癌的相关研究的模型。根据本发明的实施例，受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选所述受体细胞来源于非人哺乳动物。
在本发明的另一个方面，本发明提出了一种检测结肠癌或者肺癌的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒中包括检测基因突变或核酸的试剂；所述基因突变为位于BRD2基因上的突变位点rs778675391；所述核酸为与野生型BRD2基因相比，具有c.2455A>T突变。如前所述，前面所述的核酸、基因突变结肠癌或者肺癌的发病密切相关，进而能用于包含能有效地检测前面所述的核酸或前面所述的基因突变的试剂的试剂盒能有效筛选出患结肠癌或者肺癌的生物样品。
根据本发明的实施例，所述试剂盒包括引物。所述引物包括SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2。除此之外，所述试剂盒还可以根据需要进一步包括dNTPs、PCR缓冲液、DNA聚合酶和ddH2O中的至少一种。根据本发明的具体实施例，所述试剂盒包括25mM dNTPs，10×PCR反应缓冲液，DNA聚合酶和ddH2O。
其中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2序列如下所示：
AGGAGGAGGAAGAGAGCAGG(SEQ ID NO:1)
GAGGAAGAGGAGGAGCTGGA(SEQ ID NO:2)
SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所扩增的序列如下文SEQ ID NO:5下划线所示，其中方框对应碱基为突变位点。
Figure BDA0002693323080000071
根据本发明的实施例，应用该试剂盒对结肠癌或肺癌进行肿瘤易感风险预测，其反应程序为：98℃预变性2分钟，然后进入第一个循环：98℃变性10秒、55℃退火复性15秒、72℃延伸15秒，共进行40个循环，72℃1min，4℃保存。
进一步的，在借助试剂盒利用PCR技术进行结肠癌、肺癌等肿瘤发病风险预测基因BRD2变异rs778675391(c.2455A>T，p.Glu726Asp)的扩增后，扩增后针对PCR产物目的片段进行桑格(Sanger)测序，对测序峰图进行解读即可得出待测样品是否在DNA水平上发生c.2455A>T突变。
除了上述内容之外，本发明还提出了一种筛选易患结肠癌、肺癌的生物样品的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括以下步骤：
从生物样品提取核酸样本；
基于所述核酸样本，确定所述核酸样本的核酸序列；
基于所述核酸样本的核酸序列或其互补序列，与野生型BRD2基因相比是否具有c.2455A>T突变，判断所述生物样品是否易患结肠癌或者肺癌，其中，所述核酸样本的核酸序列或其互补序列，与野生型BRD2基因相比有c.2455A>T突变，是所述生物样品患有结肠癌或者肺癌的指示。通过根据本发明实施例的筛选患结肠癌或者肺癌的生物样品的方法，可以有效地筛选患结肠癌或者肺癌的生物样品。
首先，从生物样品提取核酸样本。根据本发明的实施例，生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品BDR2基因是否存在突变的核酸样本即可。根据本发明的实施例，生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选患结肠癌、肺癌的生物样品的效率。根据本发明的实施例，这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中BRD2基因是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含BRD2基因编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提取的mRNA。根据本发明的一个实施例，所述核酸样本为全基因组DNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选患结肠癌或者肺癌的生物样品的效率。另外，根据本发明的实施例，针对采用RNA作为核酸样本，从生物样品提取核酸样本可以进一步包括：从生物样品提取RNA样本，优选RNA样本为mRNA；以及基于所得到的RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。由此，可以进一步提高利用RNA作为核酸样本筛选患结肠癌或者肺癌的生物样品的效率。
接下来，在得到核酸样本之后，可以对核酸样本进行分析，从而能够确定所得到核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的具体实施例，可以通过测序方法，确定核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，可以用于进行测序的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的实施例，可以采用第二代测序技术，也可以采用第三代以及第四代或者更先进的测序技术。根据本发明的具体实施例，可以利用选BGISEQ-500、BGISEQ-500RS、HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对核酸序列进行测序。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，能够提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。由此，根据本发明的实施例，确定核酸样本的核酸序列可以进一步包括：首先，针对所得到的核酸样本，构建核酸测序文库；以及对所得到的核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。根据本发明的一些实施例，可以采用选自BGISEQ-500、BGISEQ-500RS、HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对所得到的核酸测序文库进行测序。另外，根据本发明的实施例，可以对核酸样本进行筛选，富集BRD2基因外显子，该筛选富集可以在构建测序文库之前，构建测序文库过程中，或者构建测序文库之后进行。可以采用外显子靶向序列富集系统如：外显子捕获芯片，Aglient SureSelect，Nimblegen等其他外显子或目标区域捕获平台，对目标片段进行富集。根据本发明的一个实施例，针对核酸样本，构建核酸测序文库进一步包括：利用选自BRD2基因特异性引物的至少一种，对核酸样本进行PCR扩增；以及针对所得到的扩增产物，构建核酸测序文库。由此，可以通过PCR扩增，富集BRD2基因外显子，从而能够进一步提高筛选患结肠癌、肺癌的生物样品的效率。根据本发明的实施例，BRD2基因特异性引物的序列不受特别限制，例如可以参考人类基因组序列数据库GRCh37.1/hg19，采用Primer3.0在线设计获得，例如可以参考UCSC(http://genome.ucsc.edu/)，应用Primer3(version0.4.0,http://primer3.ut.ee/)设计候选基因的引物并合成(生工生物工程公司合成)，并利用Primer-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)验证引物特异性。
关于针对核酸样本，构建测序文库的方法和流程，本领域技术人员可以根据不同的测序技术进行适当选择，关于流程的细节，可以参见测序仪器的厂商例如Illumina公司所提供的规程，例如参见Illumina公司Multiplexing Sample Preparation Guide(Part#1005361；Feb2010)或Paired-End SamplePrep Guide(Part#1005063；Feb 2010)，通过参照将其并入本文。根据本发明的实施例，从生物样品提取核酸样本的方法和设备，也不受特别限制，可以采用商品化的核酸提取试剂盒进行。
需要说明的是，在这里所使用的术语“核酸序列”应作广义理解，其可以是在对核酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后，得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据(reads)作为核酸序列，只要这些核酸序列中含有对应BRD2基因的编码序列即可。
最后，在确定核酸样本的核酸序列之后，将所得到的核酸样本的核酸序列相应的参考序列进行比对，当所得到的核酸序列中具有前述的突变时，即指示生物样品易患结肠癌或者肺癌。由此，通过根据本发明实施例的筛选患结肠癌或者肺癌的生物样品的方法，可以有效地筛选患结肠癌或者肺癌的生物样品。根据本发明的实施例，对核酸序列与相应野生型基因序列进行比对的方法和设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAPALIGNER/SOAP2进行比对。
需要说明的是，根据本发明实施例的“筛选患结肠癌或者肺癌的生物样品的方法”的用途不受特别限制，例如可以用作非诊断目的的筛选方法，例如用作科研或者其他商业应用。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1确定BRD2基因上的c.2455A>T突变与结肠癌和肺癌的相关性
我们采用高通量测序等基因组学技术，对来自中国的约2400名结肠癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等肿瘤患者和1960名非肿瘤对照个体进行目标基因区域的遗传变异研究，发现了一个与结肠癌、肺癌发病风险增加显著相关的易感基因变异(其中，结肠癌fisher’s exacttest p＝0.003537；肺癌fisher’s exact test p＝0.008257)，其为位于BRD2基因上的c.2455A>T突变，且该突变无论是相较于所研究的受试样本的其他基因，还是相较于BRD2基因上的其他27个突变突变，均表现出与结肠癌和肺癌的显著相关性。
实施例2Sanger法测序验证
选择临床上的一些结肠癌和肺癌的样品，进行Sanger测序。
1、DNA提取
提取受试者外周静脉血中的基因组DNA备用。
2、PCR反应
利用引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，以及25mM dNTPs，10×PCR反应缓冲液，DNA聚合酶和ddH2O，进行PCR反应，反应条件如下：98℃预变性2分钟，然后进入第一个循环：98℃变性10秒、55℃退火复性15秒、72℃延伸15秒，共进行40个循环，72℃1min，4℃保存。
由此，获得各受试者基因组DNA样本的PCR扩增产物。
3、Sanger测序
将步骤2得到的PCR产物经纯化后，直接进行DNA测序，测序使用ABI3730XL型测序仪进行。
基于测序结果表明，通过所设计试剂盒检测到的该位点突变，在结肠癌患者、肺癌患者与正常对照人群相比显著富集，表明试剂盒效果良好，可用于结肠癌、肺癌发病风险的预测。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
天津科技大学
<120> 基因突变在结肠癌、肺癌易感基因变异检测中的应用
<130> PIDC3205610
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物1
<400> 1
aggaggagga agagagcagg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物2
<400> 2
gaggaagagg aggagctgga 20
<210> 3
<211> 123
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRD2基因部分序列
<400> 3
ccattaagaa gcctgtggga aagacaaagg aggaactggc tttggagaaa aagcgggaat 60
tagaaaagcg gttacaagat gtcagcggac agctcaattc tactaaaaag ccccccaaga 120
aag 123
<210> 4
<211> 123
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRD2基因突变后的部分序列
<400> 4
ccattaagaa gcctgtggga aagacaaagg aggatctggc tttggagaaa aagcgggaat 60
tagaaaagcg gttacaagat gtcagcggac agctcaattc tactaaaaag ccccccaaga 120
aag 123
<210> 5
<211> 466
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 扩增序列
<400> 5
aggaggagga agagagcagg cccatgagtt acgatgagaa gcggcagctg agcctggaca 60
tcaacaaatt acctggggag aagctgggcc gagttgtgca tataatccaa gccagggagc 120
cctctttacg tgattcaaac ccagaagaga ttgagattga ttttgaaaca ctcaagccat 180
ccacacttag agagcttgag cgctatgtcc tttcctgcct acgtaagaaa ccccggaagc 240
cctacaccat taagaagcct gtgggaaaga caaaggagga actggctttg gagaaaaagc 300
gggaattaga aaagcggtta caagatgtca gcggacagct caattctact aaaaagcccc 360
ccaagaaagc gaatgagaaa acagagtcat cctctgcaca gcaagtagca gtgtcacgcc 420
ttagcgcttc cagctccagc tcagattcca gctcctcctc ttcctc 466

Claims (10)

1.基因突变或核酸在制备试剂盒或设备中的应用，其特征在于，
所述试剂盒或者设备用于检测结肠癌或肺癌；
所述基因突变为位于BRD2基因上的突变位点rs778675391；
所述核酸为与野生型BRD2基因相比，具有c.2455A>T突变。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因突变或所述核酸表达的蛋白与野生型BRD2基因表达的蛋白相比，具有p.Glu726Asp突变。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒或者设备包括特异性针对所述基因突变的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一；
任选地，所述引物包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
4.检测基因突变或核酸的试剂在制备试剂盒或设备中的应用，其特征在于，
所述试剂盒或者设备用于检测结肠癌或肺癌；
所述基因突变为位于BRD2基因上的突变位点rs778675391；
所述核酸为与野生型BRD2基因相比，具有c.2455A>T突变。
5.生物模型在筛选药物中的用途，所述药物用于预防或治疗结肠癌或肺癌，所述生物模型携带下列至少之一：
(1)基因突变位点rs778675391；
(2)与野生型BRD2基因相比，具有c.2455A>T突变；
(3)与野生型BRD2基因所表达的蛋白相比，具有p.Glu726Asp突变的多肽；
任选地，所述生物模型为细胞模型或者动物模型。
6.特异性改变基因突变或者核酸的试剂在制备药物中的用途，其特征在于，所述药物用于治疗结肠癌或肺癌；
所述基因突变为位于BRD2基因上的突变位点rs778675391；
所述核酸为野生型BRD2基因相比，具有c.2455A>T突变；
任选地，所述试剂为基于shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1和锌指核酸酶至少之一的试剂。
7.基因突变或核酸在制备构建体中的用途，其特征在于，所述构建体用于制备治疗结肠癌或肺癌的药物，所述构建体包含所述基因突变或者所述核酸；
所述基因突变为位于BRD2基因上的突变位点rs778675391；
所述核酸为与野生型BRD2基因相比，具有c.2455A>T突变。
8.基因突变或核酸在制备重组细胞中的用途，其特征在于，所述重组细胞用于表达治疗结肠癌或肺癌的药物；
所述重组细胞中包含所述基因突变或者所述核酸；
所述基因突变为位于BRD2基因上的突变位点rs778675391；
所述核酸为与野生型BRD2基因相比，具有c.2455A>T突变。
9.一种检测结肠癌或肺癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括检测基因突变或核酸的试剂；
所述基因突变为位于BRD2基因上的突变位点rs778675391；
所述核酸为与野生型BRD2基因相比，具有c.2455A>T突变。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2；
任选地，所述试剂进一步包括dNTPs、PCR缓冲液、DNA聚合酶和ddH2O中的至少一种。
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