CN114250225A - 一种dna转座子在调控水稻光保护中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种DNA转座子在调控水稻光保护中的应用。所述的转座子位于水稻光保护相关基因OsPsbS1的转录起始位点前‑1601～‑1000以及‑2108～‑2047区域，具体的序列信息分别如序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。本发明发现这两个区域的DNA转座子会被甲基化从而影响紧邻基因OsPsbS1的表达，本发明验证了这两个DNA转座子的功能及其在水稻光保护中的应用，为水稻光保护潜能优化及遗传改良提供了新的遗传资源和应用途径。

Description

一种DNA转座子在调控水稻光保护中的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种DNA转座子在调控水稻光保护中的应用。所述的转座子位于水稻光保护关键基因OsPsbS1的转录起始位点前-1601～-1000以及-2108～-2047区域，这两个区域的DNA转座子能显著抑制OsPsbS1的表达，本发明验证了这两个DNA转座子的功能及其在水稻光保护调控中的应用，为水稻光保护潜能的优化及遗传改良提供了新的遗传资源和应用途径。
背景技术
光是植物光合作用所必需的，植物光合机构中叶绿体色素吸收的光能通过光化学过程转化为稳定的化学能。然而，当植物吸收的光能超过其所需时，过剩的光能会导致光抑制现象，从而明显降低光合效率。为了优化光合作用和防止高光胁迫，植物在进化过程中形成各种光适应和光保护的机制。当植物吸收的光能超过其所需时，过剩的光能会导致光抑制现象，从而明显降低光合效率。不能用于光化学反应，也不能以荧光及热的形式耗散的激发能将转移到氧分子，产生对光合机构具高度破坏性的活性氧自由基。热耗散是以反馈去激发机制介导进行的，可以通过测量叶绿素荧光非光化淬灭(Non-photochemicalquenching,NPQ)参数来衡量。非光化淬灭调节着光系统II的能量转换，保护植物免受或减轻光抑制。非光化淬灭由高光强诱导产生，随着关闭高光强而弛豫。根据其弛豫动力学(Relaxation kinetics)特性，非光化淬灭可以分为至少3个组分：依赖能量的淬灭qE、状态转换淬灭qT及光抑制淬灭qI，其中qE是高等植物中的最主要组分。对模式植物拟南芥的研究表明，类囊体跨膜pH梯度、叶黄素循环中合成积累的玉米黄素、光系统ⅡPsbS蛋白及其表达量是控制非光化淬灭产生以及决定qE及整个NPQ容量大小的重要因子。
PsbS是叶绿体类囊体膜上光系统Ⅱ的一个亚基，一类叶绿素a/b结合蛋白。qE的激活需要二聚的PsbS蛋白单体化以及增强PsbS与捕光复合物体在光系统II中的相互作用。PsbS与捕光复合物体的相互作用受到ΔpH和玉米黄质水平的影响。水稻通常在高自然光强条件下生长，另一方面受水稻冠层内部叶片相互遮蔽、风及太阳入射角度变化等因素影响，水稻叶片接受的光强极具动态性，因此qE的快速诱导与弛豫对于水稻健康生长非常重要。目前在水稻中发现了控制qE自然变异的主效基因OsPsbS1，该基因表达量与植株NPQ值呈显著正相关。
水稻基因组中有很多转座元件和重复序列。转座元件包括DNA转座子和反转座子。研究表明，植物可以从转座元件和重复序列产生24-nt小干涉RNA(siRNA)，激发CG,CHG及CHH(H＝A,T或C)的DNA甲基化，进而影响邻近基因表达。水稻中OsDCL3a主要负责24-ntsiRNA的加工。
发明内容
本发明在水稻光保护关键基因OsPsbS1的启动子区域检测到两个DNA转座子，并发现这两个DNA转座子区域产生的24-nt siRNA会影响该区域DNA甲基化程度，从而最终影响OsPsbS1基因表达和水稻的光保护能力。
具体地，本发明的技术方案如下所示:
申请人使用启动子截短的方法发现含两个DNA转座子的区段对启动子活性存在显著效应。申请人将OsPsbS1启动子-2153～322区域逐步截短为-1705～322,-1225～322,-689～322和-34～322四个区域，并使用原生质体瞬时表达(图2)和稳定转化检测GUS报告基因(图3)的方法分别检测启动子活性。发现将-2153～-1225区域截掉后，启动子活性显著升高，表明该区域有元件对OsPsbS1基因表达起抑制作用。而进一步将-1225～-689区域截掉后，启动子活性再次显著升高，表明该区域也有元件对OsPsbS1基因表达起抑制作用。
申请人在重复序列数据库(http://www.repeatmasker.org/)中检索OsPsbS1基因的启动子区域，在OsPsbS1基因转录起始位点前-1601～-1000以及-2108～-2047区域找到两个DNA转座子。植物重复序列中会产生24-nt siRNA，这些24-nt siRNA在CG、CHG和CHH(H＝A、T或C)位点触发DNA甲基化，影响附近基因的表达。申请人发现在-1601～-1000以及-2108～-2047两个DNA转座子区域的24-nt siRNA和DNA甲基化的富集(图3，图4)，而这种DNA甲基化的修饰会使得下游基因的表达下降。
为了证明这两个DNA转座子对下游OsPsbS1基因的影响，申请人向中国科学院遗传与发育生物学研究所曹晓风老师索要了OsDCL3a表达受抑制的转基因水稻材料，即水稻家系dcl3a-3和dcl3a-1。水稻中OsDCL3a主要负责24-nt sRNA的加工，该基因缺失或表达受抑制会导致24-nt siRNA合成受阻。申请人比较了dcl3a-3、dcl3a-1水稻家系和野生型家系(日本晴)中上述两个DNA转座子区段24-nt siRNA积累情况，发现由于dcl3a-3和dcl3a-1家系中24-nt siRNA合成受阻可导致上述两个DNA转座子对应区段BSP1及BSP2中24-nt siRNA减少(图4)。
申请人使用亚硫酸氢钠测序检测OsPsbS1基因的启动子两个DNA转座子区域的甲基化水平，发现相对于野生型家系，dcl3a-3和dcl3a-1家系在两个DNA转座子区域的CHG和CHH甲基化显著减少(图4)。随后申请人测定WT、dcl3a-3和dcl3a-1家系中OsPsbS1表达量以及NPQ值，图5中结果显示相对于野生型家系(WT，水稻日本晴)，dcl3a-3和dcl3a-1家系中的OsPsbS1基因表达量以及NPQ值都显著升高。
以上结果证明了：OsPsbS1基因转录起始位点前-1601～-1000及-2108～-2047两个DNA转座子区域会通过产生24-nt siRNA，激发该区域CHG和CHH DNA甲基化，从而影响紧邻基因OsPsbS1的表达，最终影响到水稻的光保护能力。这两个转座子在调控及优化水稻光保护中具有重要作用。
附图说明
图1：本发明的技术路线图。
图2：OsPsbS1启动子截短原生质体瞬时表达结果。
图3：OsPsbS1启动子截短稳定转化GUS活性结果。
图4：WT(水稻日本晴)、水稻dcl3a-3和dcl3a-1家系中OsPsbS1基因区域siRNA测序结果。
图5：WT(水稻，日本晴)、水稻家系dcl3a-3和dcl3a-1中两个DNA转座子区域甲基化水平。
图6：WT(水稻，日本晴)、水稻家系dcl3a-3和dcl3a-1中OsPsbS1表达量和NPQ值。图7：是本发明涉及的pGreen II载体的图谱。
具体实施方式
对序列表的说明：
序列表SEQ ID NO:1是位于-2108～-2047区域内重复序列转座子元件(62bp)。
序列表SEQ ID NO:2是位于-1601～-1000区域内重复序列转座子元件(602bp)。
实施例1
1利用转录活性分析OsPsbS1启动子截短的转录活性
1.1构建载体
利用OsPsbS1启动子PPsbS1-2153～+322、PPsbS1-1705～+322、PPsbS1-1225～+322、PPsbS1-689～+322、PPsbS1-34～+322分步截短的序列构建到pGreen II载体(见图7)，并用于驱动萤火虫荧光素酶报告基因Luc，内参使用35S启动的Ren报告基因(图2)。
1.2转化水稻原生质体
(1)母液试剂
2M Mannitol(Sigma，FW:182.17)：36.434g加ddH2O定容至100ml，微波加热溶解；
0.2M KCl(Sangon，FW:74.55)：1.491g加ddH2O定容至100ml；
1M CaCl2(BBI，FW:147.02)：14.7g加ddH2O定容至100ml；
0.5M MgCl2(Sigma，FW:95.21)：4.76g加ddH2O定容至100ml；
1.54M NaCl(BBI，FW:58.44)：8.99g加ddH2O定容至100ml；
0.1M MES-KOH(pH5.7)：MES hydrate(Sigma，FW:195.24)19.524g加ddH2O定容至100ml，KOH调至pH5.7
(2)配制酶解液，现配现用：
Figure BDA0002690466520000041
搅拌溶解，55℃加热10min，自然冷却，再加入以下试剂：
0.1％BSA 0.01g
1mM CaCl2 10μl 1M CaCl2
ddH2O 6ml
同时准备0.6M Mannitol；
(3)将酶解液倒到大小合适干净的培养皿中。将暗培养10-15天的黄化苗取出，将叶鞘浸在0.6M Mannitol中，用锋利的刀片快速切割叶鞘成1mm以下的小段，越细越好，不要撕扯。切下的叶鞘立即转入配好的酶解液中。一般50棵黄化苗的叶鞘用10ml酶解液酶解，可至少转化5个质粒组合。更多的转化可扩大相应反应体系。叶鞘切完毕，泡在酶解液中，抽真空5-10min，使大部分叶鞘下沉到酶解液底部。将酶解液用锡纸包被以避光，放置在28℃，40-50rpm的摇床上，酶解4-5hrs。酶解完成后，取一滴酶解液镜检，如果细胞圆而发亮，则健康，继续往下做；如果细胞扁且发黑，则弃去。
酶解将近完成时，配制以下溶液：
Figure BDA0002690466520000042
用ddH2O定容至100ml。
Figure BDA0002690466520000043
Figure BDA0002690466520000051
用ddH2O定容至100m。
W5和MMG只要没有长菌，就可以继续使用。
(4)将酶解液混匀，用150目的筛子过滤到新的培养皿中，再转移至10ml圆底离心管中。100g转速，加速、减速加速度为2，离心10min，并预冷MMG溶液。
(5)用1ml枪吸走上清，可见到管底有较多黄绿色沉淀，此为健康的细胞；如果沉淀很少，或者沉淀很白，则细胞质量不好。缓缓加入4ml W5溶液，轻轻混匀，再以100g转速，加速、减速加速度为2，离心10min。
(6)用1ml枪吸走上清，缓缓加入4ml预冷的MMG溶液，以4℃，100g转速，加速、减速加速度为2，离心10min。
(7)用1ml枪吸走上清，缓缓加入2ml预冷的MMG溶液，轻混匀，以4℃，100g转速，加速、减速加速度为2，离心10min。计算需要原生质体的体积：200μl*N，再多留500μl。用枪吸走上清，用所需体积的MMG溶液混匀原生质体，冰浴30min。
(8)在冰浴期间准备：将需要转化的质粒稀释成20μl，质粒的量为2-10μg，加到2ml圆底离心管中。将离心机转头换成2ml的小转头，温度设定为室温。配制40％PEG 4000溶液：
Figure BDA0002690466520000052
加ddH2O至5ml。
PEG需要用微波炉稍微加热溶解，混匀，在转化前放在37℃温箱中保温，防止其再次凝固。
(9)分为4个2ml离心管中加入4种质粒：PPsbS1-2153～+322、PPsbS1-1705～+322、PPsbS1-1225～+322、PPsbS1-689～+322、PPsbS1-34～+322。将原生质体混匀，依次向2ml离心管中(已加入了20μl质粒)加入200μl原生质体和220μl 40％PEG4000溶液，立即轻柔上下颠倒混匀并计时。室温放置20min。
(10)向2ml离心管中加入1ml W5溶液，混匀，室温100g转速，加速、减速加速度为2，离心10min。用1ml枪小心吸走上清，再加1.5ml W5，28℃暗培养12-16h(标注ABA的组合加入ABA处理3h)。
(11)观察前，以室温，100g转速，加速、减速加速度为2，离心10min。吸走上部液体，仅留底部200μl细胞。
1.3检测酶活
向每个试验组合的培养的转化细胞中加入40μl细胞裂解液，并将4℃，12000g离心5min后的上清加入一次性酶标板中。在每个样品中加入25μl A液，并用酶标仪检测Luc的活性，再向每个样品中加入25μl B液，将用酶标仪检测Ren的活性。用Luc/Ren计算相对荧光活性。根据图2中结果可知：相较于-2153～322，-1705～322,-1225～322和-34～322区域，启动子-689～322区域的启动子活性最高。发现将-2153～-1225区域截去后，启动子活性显著升高，表明该区域有某些元件对OsPsbS1基因表达起抑制作用。
2利用稳定转化GUS报告基因分析OsPsbS1启动子截短的转录活性
2.1构建载体
如图3所示，在稳定表达载体上将OsPsbS1上游-2153～322，-1705～322,-1225～322,-689～322和-34～322五个片段分别构建到报告基因GUS前启动子区域，并遗传转化到水稻材料ZH11中，构建稳定转化材料。
2.2农杆菌介导的水稻转化
2.2.1试剂及培养基
1.KT(Kinetin)，公司/货号Sigma Cat No.K-0753；
2.6-BA(6-BenzylaminoPurine)，公司/货号Sigma Cat No.B-5898；
3.IAA(Indole-3-acetic acid)，公司/货号Sigma Cat No.I-5148；
4.NAA(Napthalene acetic acid)，公司/货号Sigma Cat N-0640；
5.2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid),公司/货号Sigma Cat No.D-8407；
6.CH(Casein Enzymatic Hydrolysate),公司/货号Sigma Cat No.C-7290；
7.Kanamycin，公司/货号USB Cat No.17924；
8.Cn(Carbenicillin),公司/货号GiBco BRL Cat No.10177-012；
9.Hn(hygromycin B),公司/货号GiBco BRL Cat No.10687-010；
10.AS(Acetosringone),公司/货号Aldrich chem.,CO 01531EG；
11.Pyridoxine HCl，货号Sigma Cat No.P-8666；
12.Nicotinic acid，公司/货号Sigma Cat No.N-0765；
13.Inositol，公司/货号Sigma Cat No.I-3011；
14.Thiamine HCl，公司/货号Sigma Cat No.T-3902；
15.Phytagel，公司/货号Sigma Cat No.P-8169；
16.Dimethyl Sulfoxide-DMSO，公司/货号Sigma Cat No.D-5879；
17.X-gluc(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside),公司/货号SigmaCat No.B-3783；
18.MS大量元素(MSmax)储备液(10倍体积，倍体积简写为X，下同)NH4NO3 16.5g；
KH2PO4 1.7g
KNO3 19.0g
MgSO4·7H2O 3.7g
CaCl2 3.32g或CaCl2·2H2O 4.4g
逐个溶解，然后加dH2O到1000ml。
19.MS微量元素(MSmin)储备液(100X)
MnSO4·4H2O 2.23g；
ZnSO4·7H2O 0.86g；
KI 0.083g；
H3BO3 0.62g；
Na2MoO4·2H2O 0.025g；
CoCl2·6H2O 0.0025g；
CuSO4·5H2O 0.0025g；
注：Na2MoO4必须单独溶解，再与其它组分混合，补充dH2O定容至1000ml；室温保存。
20.N6大量元素(N6max)储备液(10X)
Figure BDA0002690466520000071
逐个溶解，然后加dH2O定容至1000ml。
21.N6微量元素(N6min)储备液(100X)
Figure BDA0002690466520000072
用dH2O定容至1000ml；室温保存。
22.Fe2+-EDTA储备液(100X)
往一个试剂瓶中加入300ml dH2O和FeSO4·7H2O 2.78g，再往另一试剂瓶中加入300ml dH2O，并加热到70℃，然后加入Na2 EDTA·2H2O 3.73g，都溶解好后，将两个瓶中的溶液混合，在70℃保温2小时，然后加dH2O定容至1000ml；4℃避光保存。
23.维生素(Vitamin)储备液(100X)
Figure BDA0002690466520000081
加dH2O定容至1000ml；4℃保存。
24.AAmax储备液(10X)
Figure BDA0002690466520000082
加dH2O定容至1000ml；室温避光保存。
25.AAmin储备液(100X)
Figure BDA0002690466520000083
将Na2MoO4单独溶解，然后与其它组分混合并加dH2O定容至1000ml；室温避光保存。
26. 6-BA储备液(1mg/ml)
6-BA 100mg；
加入1.0ml 1N的KOH振摇至6-BA溶解，然后加dH2O定容至100ml；室温保存。
27.KT储备液(1mg/ml)
KT 100mg；
加入1.0ml 1N的KOH振摇至KT溶解，然后加dH2O定容至100ml；室温保存。
28. 2,4-D储备液(1mg/ml)
2,4-D 100mg
加入1.0ml 1N KOH振摇5min，然后加10ml dH2O并振摇至2,4-D溶解，用dH2O定容到100ml，室温保存。
29.100mM AS储备液
AS 0.196g；
DMSO 10ml；
用1.5ml离心管分装；4℃保存。
30.IAA储备液(1mg/ml)
IAA 100mg；
加入1.0ml 1N的KOH振摇至IAA溶解，然后用dH2O定容至100ml；室温避光保存。
31.NAA储备液(1mg/ml)
NAA 100mg；
加入1.0ml 1N的KOH振摇至NAA溶解，再用dH2O定容至100ml；室温避光保存。
32. 1N的KOH储备液
KOH 5.6g；
用100ml dH2O溶解；室温保存。
33. 0.15％的HgCl2溶液配制
HgCl2 1.5g；
先用1ml无水乙醇部分或完全溶解HgCl2，再用dH2O定容至1000ml；搅拌4-8小时
培养基配方：
诱导培养基
Figure BDA0002690466520000091
pH值：5.9；
补蒸馏水至1000ml。
继代培养基
Figure BDA0002690466520000092
Figure BDA0002690466520000101
pH值：5.9；
补蒸馏水至1000ml。
预培养基
Figure BDA0002690466520000102
pH值：5.6
补蒸馏水至250ml。
共培养培养基
Figure BDA0002690466520000103
pH值：5.6；
补蒸馏水至250ml。
悬浮培养基
Figure BDA0002690466520000104
Figure BDA0002690466520000111
pH值：5.4；
补双蒸水至100ml。
筛选培养基
Figure BDA0002690466520000112
pH值：6.0；
补水至250ml。
分化培养基
Figure BDA0002690466520000113
pH值：6.0；
补蒸馏水至1000ml。
生根培养基
Figure BDA0002690466520000121
pH值：5.8；
补蒸馏水至1000ml。
2.2.2愈伤组织的诱导
在一个100ml的三角瓶中倒入40-50ml的无菌的诱导培养基；在超净工作台中将水稻种子剥掉颖壳，先用75％浓度的乙醇浸泡1min(时间不能过长)，再用0.15％浓度的HgCl2溶液浸泡15-25min，最后用无菌水清洗5-10次，备用；每瓶培养基接入8～12颗种子，在室温暗培养下经40～50天诱导产生愈伤组织。
2.2.3继代培养
提前2-3天配制继代培养基，灭菌，使培养基干燥(太湿的培养基不利于愈伤组织的生长)。
从诱导的愈伤组织中，挑淡黄色，颗粒状，干燥，且活力强的愈伤组织转入继代培养基中室温暗培养20d；最好继代一次后做侵染，每一个愈伤组织最多继代两次，否则愈伤组织转化效率降低，第一次继代时注意将愈伤组织上附着的其他组织如胚乳或芽等去除干净。
2.2.4预培养
提前用500ml三角瓶准备适量无菌预培养基试验前每250ml培养基中加入300μlAS(Acetosringone)，5ml 40％葡萄糖并倒皿，每瓶倒培养基可配置8～10个培养皿；
从继代愈伤组织中，挑去淡黄色，颗粒状，干燥，且活力强的愈伤组织转入预培养基中，通常每个皿接种60-80块左右绿豆大小的愈伤组织，愈伤组织较大可用镊子夹碎，室温暗培养3d。
2.2.5侵染与共培养
农杆菌转化的受体是水稻品种ZH11。用含有-2153～322，-1705～322,-1225～322,-689～322和-34～322六个片段的GUS融合载体的EHA105的菌液分别侵染ZH11种子诱导得到的愈伤组织。ZH11愈伤组织经EHA105菌液侵染后，于19℃避光共培养2d，水洗，避光，28℃下培养15d进行第1次筛选，将筛选出的抗性愈伤组织避光于28℃下再培养15d进行第2次筛选，直到长出亮黄色的抗性愈伤组织。将1个片段转化的愈伤组织共有10个培养皿(直径9cm)，每个培养皿上有25粒愈伤组织。分化培养一段时间得到再生植株，即为T0代转基因苗。
2.3检测转基因材料GUS活性
2.3.1试剂
1磷酸缓冲液母液：
0.2M Na2HPO4：71.64g/L Na2HPO4·12H2O
0.2M NaH2PO4：31.21g/L NaH2PO4·2H2O
2 GUS抽提液(1L)：pH＝7.0
Figure BDA0002690466520000131
3 10mM 4-MUG(10×)：105.6mg 4-MUG溶于30mL GUS抽提液中，4℃避光保存。
4 0.2M Na2CO3反应终止液(1L)：21.2g Na2CO3溶于1000mL ddH2O。
5 BSA母液(4ug/ul)：40mgBSA溶于10mL ddH2O
6 4-MU母液(10mM)：17.6mg 4-MU溶于10mL 0.2M Na2CO3中，4℃避光保存。
7 Protein Assay Buffer(5×，Bio-Rad cat.no.500-0006)：使用前要用ddH2O稀释成1×工作液。
2.3.2样本制备
材料于液氮中研磨成粉末，取适量粉末加入3倍体积的GUS抽提液，充分混匀，置冰上。随后10000g 4℃离心10min，上清液转移到新的1.5mL离心管，则得到总蛋白粗提液。
2.3.3总蛋白浓度测定
先取BSA标准品(4ug/uL)，用ddH2O稀释8个梯度，浓度分别为2000ng/ul、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625ng/ul。方法：取8个管子，各加50uL ddH2O，取50uL 4ug/ul的BSA母液加入第一个管子，吸打混匀之后从中再取出50uL加入第二个管子，依此类推。将各个样品的总蛋白抽提液、空白对照(GUS抽提液)以及8个BSA标准品各取2μl加入到透明酶标板(Nunclon 96Flat Transparent)中，加入198uL 1×Protein Assay Buffer，在5-20min时间内测定595nm的吸光值。以标准品的浓度为横坐标，相应的OD595为纵坐标作散点图，添加线性趋势线，显示公式和R2值，将各样品的OD595值代入公式中的y，算出x则为各样品的总蛋白浓度。
2.3.4GUS活性的测定
取10-100ug总蛋白(具体用量要先做个预实验确定，注意叶绿素含量过高会影响检测)，加入1mL含有1mM 4-MUG的GUS抽提液中(反应液应提前预热)，于37℃反应，在第5min，15min，25min以及35min时各取出200ul加入800ul 0.2M Na2CO3。准备4-MU标准品，按照稀释BSA的操作用0.2M Na2CO3将10mM 4-MU稀释12个梯度，分别为1mM、0.5、0.25……去掉高浓度的5个，用低浓度的7个做标准曲线。将反应产物吸出200ul加入到黑色酶标板中(Greiner 96Flat Black)，每板都要加4-MU标准品，即7个浓度梯度稀释液各取出40ul，加入160ul 0.2M Na2CO3，上酶标仪检测。使用TECAN Infinite M200软件测量结果，得到数据之后作标准曲线，计算各个样品反应产生4-MU的浓度。计算GUS活性：pmol 4-MU/ug总蛋白/min。
2.3.5GUS活性结果
根据图3结果可知：和原生质体瞬时转化实验结果相似，相较于-2153～322，-1705～322,-1225～322和-34～322区域，启动子-689～322区域的GUS活性最高，发现将-2153～-1225区域截去后，启动子活性显著升高，表明该区域有某些元件对OsPsbS1基因表达起抑制作用。
3测定两个DNA转座子区域甲基化水平
3.1制备测序所需样品
首先将野生型家系(日本晴)和转基因dcl3a-3和dcl3a-1家系(中国科学院遗传与发育生物学研究所曹晓风老师惠赠)的叶片提取基因组DNA，抽取样品的基因组DNA的试剂盒为商用试剂盒(QIAGEN EpiTect Bisulfite Kits Print)，根据试剂盒的说明书操作，用试剂盒自带的重亚硫酸盐处理DNA样品。
3.2扩增检测片段
针对检测的两个DNA转座子区域设计甲基化测序引物：
PSB1-F：ATTGATGATGTTTGTGTGTAAA，
PSB1-R：AATCATCTCTACCATACAACCA；
PSB2-F：GAGGTGATGAGTAGGCAAG，
PSB2-R：ACTGATCTTGCATCTGCCC；
以重亚硫酸盐处理后DNA为模板进行扩增，回收PCR产物并克隆到T载体上，挑选20个以上的阳性克隆进行测序。
3.3甲基化测序结果
将测序结果导入http://katahdin.mssm.edu/kismeth/revpage.pl网站，并使用网站的分析软件进行分析。整理结果如图5所示，OsPsbS1基因的启动子两个DNA转座子区域的甲基化水平，发现相对于野生型家系(水稻日本晴)，水稻dcl3a-3和dcl3a-1家系在两个DNA转座子区域的CHG和CHH甲基化显著减少。
4.利用RT-qPCR方法鉴定转基因材料中OsPsbS1的表达量
4.1cDNA准备
将鉴定到的dcl3a-3和dcl3a-1家系以及野生型家系(WT，水稻日本晴)的叶片提取RNA，样品进行RNA抽提和反转录得到cDNA，采用Ubiquitin为内参基因对cDNA进行常规RT-PCR扩增，确保cDNA质量和浓度基本一致。
4.2引物设计
采用实时荧光定量PCR扩增片段的设计(一般遵循以下原则)，具体步骤如下所述：
(1)扩增片段长度在70-200bp为宜，片段越短扩增效率越高，但如果片段小于70bp，扩增片段很难与可能存在的引物二聚体区分。
(2)扩增片段应尽可能避免连续的单碱基重复和二级结构的产生。
(3)扩增片段优先考虑设计在基因的3`端。
(4)建议检测引物的扩增效率，扩增效率接近100％的扩增能够保证试验的重复性。
设计引物如下为：
RT-OsPsbS1-F：CTGTTCGGCAGGTCCAAG
RT-OsPsbS1-R：ACGAACAGCTCGTTCTCCTT
4.3检测转基因材料表达量
准备反应体系，在准备好cDNA样品和引物之后，即可制备样品表。一般每个样品会设置三个重复，同时设置三个重复的内参基因对照。按如下体系配置PCR反应:
Figure BDA0002690466520000151
运行反应程序如下：
Figure BDA0002690466520000152
Figure BDA0002690466520000161
4.4结果分析
步骤如下：
(1)首先对溶解曲线进行分析，单峰的溶解曲线被认为是合格的扩增，而出现双峰等情况则可能在扩增中出现了非特异扩增及二聚体等情况。生成文件，以CT值进行相对表达量的计算。使用以下公式计算：
Ct目的基因-Ct内参基因＝ΔCT
ΔCT处理样本-ΔCT对照样本＝ΔΔCT
倍数变化＝2(-ΔΔCT)
(2)如图6A显示相对于野生型WT家系，dcl3a-3和dcl3a-1家系中的OsPsbS1基因表达量显著增加。dcl3a材料影响了两个DNA转座子的处的甲基化水平从而影响了OsPsbS1基因表达。说明OsPsbS1基因的启动子区域检测到两个DNA转座子在调控OsPsbS1基因表达中起到重要作用。
5叶绿素荧光参数的测定
NPQ(非光化学淬灭)等荧光相关值的测定是采用德国Walz公司制造的PAM-2500叶绿素荧光仪。具体测量步骤参照该仪器的使用说明书，具体步骤包括：
在实验室配制0.01％的琼脂糖作为叶片存放缓冲液，将田间取样的水稻剑叶叶片样品组织置于0.01％的琼脂糖缓冲液中，将样品暗处理2h以上；避光过程中用仪器自带的2030-B叶夹夹住叶片中部，使用叶绿素荧光仪PAM-2500进行测量。
对水稻dcl3a-3和dcl3a-1家系以及野生型(WT，日本晴)家系的NPQ数据(见6B)进行比较，发现转基因阳性植株的NPQ值显著高于野生型植株。表明dcl3a材料影响了两个DNA转座子处的甲基化水平，从而导致植物的光保护能力显著性上升，证明OsPsbS1基因的启动子区域检测到两个DNA转座子对水稻的光保护过程起到显著的调控作用。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种DNA转座子在调控水稻光保护中的应用
<141> 2020-09-19
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 62
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(62)
<400> 1
aagatatagc atatgagttc tacaatcggt atgctggaga tgttggcttt agcattagaa 60
ag 62
<210> 2
<211> 602
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(602)
<400> 2
agtacctaca ggacaagcaa atggaaaacc cttcattctt ctatgcaata caagtagatg 60
aagatgagat gatgactaat atattttggg cagatgcaag atcagtattg gattttgatt 120
atttgggtga tgtcatatgc tttgacacaa catacaggac aaataattat ggtaggccat 180
ttgctctttt tgttggtgta aaccatcaca agcaaacagt tgtttttgga gcagcgttac 240
tgtatgatga aacaacatca acatttgaat ggttatttga aactttcaaa agagccatgt 300
caggcaaaga accaaggaca atattaactg atcaatgtgc agccatcatt aatgctattg 360
ggactgtctt tcccaactca actcatcgtc tctgcgtttg gcatatgtac caaaatgctg 420
cggtacattt gagtcacatt ttccaaggtt caaaaacatt taagaatgat tttggcaagt 480
gtgtttttga ttttgaagaa gttgattagt tcatatcagc atggaacaag atgatagagg 540
agtacaattt gaatgataac caatggttac atcatttatt tgagatcaag gagaagtggg 600
ct 602

Claims (1)

1.组合或分开使用的一种DNA转座子的核苷酸序列在调控水稻光保护中的应用，其特征在于所述的DNA转座子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示。
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Title
MOHAMMED NURUZZAMAN等: "Does the Upstream Region Possessing MULE-Like Sequence in Rice Upregulate PsbS1 Gene Expression?", 《PLOS》, vol. 9, no. 9, pages 1 - 10 *

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