CN114249779A - 一种鼠李糖脂的分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种鼠李糖脂的分离方法，尤其涉及一种双水相分离鼠李糖脂的新方法。基于硫酸铵溶液‑异丙醇体系，构建双水相系统从发酵液中萃取回收鼠李糖脂，有机相经过脱盐，浓缩干燥，可回收90％以上的鼠李糖脂。所述的发酵液为铜绿假单胞菌代谢产生的糖脂型生物表面活性剂溶液。本发明提供的分离方法，可有效地回收发酵液中的鼠李糖脂，对含有或不含有菌体的发酵液都适用，与现有分离技术相比，具有绿色、高效、条件温和、回收率高等优势，可用于高效分离回收鼠李糖脂。

Description

一种鼠李糖脂的分离方法

技术领域

本发明涉及到一种生物表面活性剂的分离方法，尤其涉及一种鼠李糖脂的分离方法。

背景技术

鼠李糖脂是目前研究最为广泛，也是最具应用前景的生物表面活性剂之一，具有卓越的表/界面活性，对疏水性有机物有着良好的乳化、增溶、分散等作用，又兼具环境友好，可完全生物降解的优点，因此在石油化工、环境保护、日用化妆品行业中有着良好的应用前景。目前鼠李糖脂的发酵水平在逐渐趋于完善，但其生产生本仍无法与化学表面活性剂竞争，这与缺乏高效的分离方法有关，因此也限制了鼠李糖脂的应用推广。

目前，大量的研究着眼于鼠李糖脂的发酵生产，而对成本影响很大的下游分离过程却未引起足够的重视(分离过程的成本占整个产品生产成本的60-80％)。传统的鼠李糖脂分离方法包括：有机溶剂萃取法(固-液、液-液)、膜分离法、色谱层析法、吸附法等，但这些工艺大多存在工艺复杂、分离成本高、耗费大量有毒有机溶剂等问题。例如：传统的萃取工艺需要使用大量的有毒有害的氯仿、二氯甲烷和甲醇等溶剂，而这些高毒性溶剂的使用也会严重限制鼠李糖脂在日用化工、食品等领域上的应用；固液萃取对溶剂的用量虽然较少，但高度依赖酸性条件下(pH 2～3)鼠李糖脂产物的析出与沉淀，即“酸沉”。但已有研究与实验表明了“酸沉”的不稳定性，当发酵液酸沉性能较差时回收率会受到严重的影响，此外，包含菌体的发酵液对回收率的影响也很大。色谱法等工艺虽然纯度较高，但分离成本高昂，回收率也较低，同样不适合大规模的应用。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种鼠李糖脂的分离方法，能高效回收鼠李糖脂，并且避免使用有毒有害的有机溶剂。

本发明的目的可通过以下技术方案来实现：一种鼠李糖脂的分离方法，包括以下步骤：

(1)往浓度为35g/L的鼠李糖脂溶液中加入无机盐至无机盐的浓度为100～300g/L,得到含无机盐的鼠李糖脂溶液，调节pH至3-7；然后加入短链醇，所述短链醇占含无机盐的鼠李糖脂溶液体积的20-50％，充分混匀后，静置，可分层上下两相；

(2)收集上相，加入短链醇，所述上相与短链醇的体积比为1：0.5-3，去除沉淀出来的盐后，收集有机相，干燥后即可获得鼠李糖脂产品。

进一步地，步骤(1)中所述的鼠李糖脂溶液为带菌体或不带菌体的鼠李糖脂发酵液。

进一步地，所述鼠李糖脂发酵液优选铜绿假单胞菌的不含菌体的发酵液。

进一步地，步骤(1)中所述的无机盐优选为硫酸铵、氯化钠、柠檬酸钠。

进一步地，步骤(1)中所述的无机盐更优选为硫酸铵。

进一步地，步骤(1)中所述的pH值优选为5。

进一步地，步骤(1)中所述的短链醇为与水互溶的醇类，

进一步地，步骤(1)中所述的所述短链醇优选为乙醇、丙醇、异丙醇或丁醇。

进一步地，步骤(1)中所述的短链醇更优选为异丙醇。

进一步地，所述步骤(2)中优选离心或者过滤的方式去除沉淀出来的盐。

与现有的技术相比，本发明构建了全新的鼠李糖脂分离方法，利用醇/高浓度盐水构成的双相体系萃取回收鼠李糖脂，该萃取体系与双水相体系类似，但具有更强的选择性。此外，该方法操作条件温和、重复性良好，避免了现有分离工艺中大量有毒溶剂的应用。此外，本发明的分离方法对发酵液或鼠李糖脂溶液本身无要求，具有良好的普适性，可用于各种场合下进行鼠李糖脂的分离回收。

具体实施方式

鼠李糖脂(rhamnolipids,RLs)是一类由铜绿假单胞菌利用油脂、葡萄糖或者甘油为原料发酵生产的阴离子型生物表面活性剂。本发明中的鼠李糖脂可以是含菌体或者不含菌体的发酵液。本发明通过构建盐水/醇的双水相系统，用于鼠李糖脂的分离。不仅具有高效的回收率，而且避免使用有毒有害的有机溶剂，而且可以解决传统酸沉无法回收鼠李糖脂的难题，可用于高效、大量的分离回收鼠李糖脂。

下面结合实施例对本发明予以进一步详细说明。

实施例1

取铜绿假单胞菌的含菌体发酵液200ml，得到浓度为35g/L的鼠李糖脂溶液。往发酵液中加入硫酸铵固体至不同浓度(150-400g/L)，然后分别加入乙醇或者异丙醇，所述乙醇或异丙醇占含无机盐的鼠李糖脂溶液体积的40％，摇晃均匀后，然后经过2000rpm离心5min，可形成上下两相，收集有机相(上相)。向有机相中再加入3倍体积的乙醇或者异丙醇，离心去除析出的盐，再进行浓缩干燥，可获得鼠李糖脂产品。结果表明：由表1可知，异丙醇-硫酸铵两相体系具有比乙醇体系更强的回收能力，在浓度为250g/L的硫酸铵溶液下即可实现约96％的回收率，而乙醇体系则需要盐溶液浓度为350g/L及以上才能保证相似的回收率。综上，该方法可以保证鼠李糖脂较高的回收率。

表1：异丙醇-硫酸铵体系和乙醇体系的回收率对比表

实施例2

取铜绿假单胞菌的含菌体发酵液200ml，鼠李糖脂的浓度为35g/L。往发酵液中加入硫酸铵固体至200g/L，然后调节至不同的pH(3-7)。加入40％体积比的异丙醇，摇晃均匀后，然后经过2000rpm离心5min，可形成上下两相，收集有机相(上相)。有机相经过脱盐后，浓缩干燥，可获得鼠李糖脂产品。结果表明：由下表2可知，较低的pH更有利于鼠李糖脂的回收，与pH＝5相比，调节pH＝3时对鼠李糖脂回收率的不再有促进作用。在pH＝5时。鼠李糖脂的回收率为97.4％。因此，pH值优选为5。

表2：pH值与鼠李糖脂回收率关系表

盐相pH	鼠李糖脂回收率
		3	97.5％
4	97.6％
		5	97.4％
6	95.1％
		7	92.3％

实施例3

取铜绿假单胞菌的含菌体发酵液200ml，鼠李糖脂溶液的浓度为35g/L。往发酵液中加入硫酸铵固体至浓度为200g/L，然后加入1.83M的稀硫酸调节至pH＝5。加入不同体积比例的异丙醇(20％、30％、40％、50％)。摇晃均匀后，然后经过2000rpm离心5min，可形成上下两相，收集有机相(上相)。有机相经过脱盐后，浓缩干燥，可获得鼠李糖脂产品。由表3 可知，提升异丙醇的用量有助于提高分离过程中鼠李糖脂的回收率。当异丙醇加入量为40％时，鼠李糖脂的回收率可达98％以上，而进一步提升的异丙醇用量不能继续提高鼠李糖脂的回收率。

表3：异丙醇比例与鼠李糖脂回收率关系表

对比实施例1

取铜绿假单胞菌S1的含菌体发酵液200ml，鼠李糖脂的浓度为35g/L。其中100ml通过1000rpm离心5min去除菌体，另外100ml直接用于回收鼠李糖脂。往上述发酵液中加入1.83M的硫酸溶液，调节pH至2左右；然后发酵液于12000rpm离心5min，分析上清中的鼠李糖脂浓度，计算鼠李糖脂回收率。结果表明：即使通过高速离心，鼠李糖脂仍无法有效的沉淀，上清较为浑浊。经过酸沉处理后，去除菌体发酵液的鼠李糖脂回收率仅为50％，而含菌体发酵液的鼠李糖脂回收率仅为40％左右。而本发明构建的盐水/醇双水相体系，可实现 95％以上的鼠李糖脂回收率，而且pH更加温和，与传统的酸沉工艺相比，具有显著性优势。

以上所述，仅为本发明专利的较佳示例而已，并非用于限定本发明专利的保护范围。除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变化形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种鼠李糖脂的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)往鼠李糖脂溶液中加入无机盐至无机盐的浓度为100～300g/L，得到含无机盐的鼠李糖脂溶液，调节pH至3-7；然后加入短链醇，所述短链醇占含无机盐的鼠李糖脂溶液体积的20-50％，充分混匀后，静置，可分层上下两相；

(2)收集上相，加入短链醇，所述上相与短链醇的体积比为1：0.5-3，去除沉淀出来的盐后，收集有机相，干燥后即可获得鼠李糖脂产品。

2.根据权利要求1所述的鼠李糖脂分离方法，其特征在于，步骤(1)中所述的鼠李糖脂溶液为带菌体或不带菌体的鼠李糖脂发酵液。

3.根据权利要求2所述的鼠李糖脂分离方法，其特征在于，所述鼠李糖脂发酵液优选铜绿假单胞菌的不含菌体的发酵液。

4.根据权利要求1所述的鼠李糖脂分离方法，其特征在于，步骤(1)中所述的无机盐优选为硫酸铵、氯化钠、柠檬酸钠。

5.根据权利要求3所述的鼠李糖脂分离方法，其特征在于，步骤(1)中所述的无机盐更优选为硫酸铵。

6.根据权利要求1所述的鼠李糖脂分离方法，其特征在于，步骤(1)中所述的pH值优选为5。

7.根据权利要求1所述的鼠李糖脂分离方法，其特征在于，步骤(1)中所述的短链醇为与水互溶的醇。

8.根据权利要求7所述的鼠李糖脂分离方法，其特征在于，步骤(1)中所述的所述短链醇优选为乙醇、丙醇、异丙醇或丁醇。

9.根据权利要求1所述的鼠李糖脂分离方法，其特征在于，步骤(1)中所述的短链醇更优选为异丙醇。

10.根据权利要求1所述的鼠李糖脂分离方法，其特征在于，所述步骤(2)中优选离心或者过滤的方式去除沉淀出来的盐。