CN117924387A - 一种分离纯化鼠李糖脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分离纯化鼠李糖脂的方法。所述方法包含以下步骤：酸解鼠李糖脂发酵液，得到酸解液；酸解液中加入有机溶媒，获得萃取液，经相分离分别得到有机溶媒相、乳化相和水相；加入碱溶液处理有机溶媒相，经相分离获得的水相浓缩后为鼠李糖脂质量浓度≥50％，色谱纯度≥99％的高品质鼠李糖脂水溶液；任选地，加入破乳剂对乳化相破乳，固液分离得到清液，浓缩得到鼠李糖脂质量浓度≥10％，色谱纯度≥95％的低品质鼠李糖脂水溶液。同时可回收两种不同品质的鼠李糖脂产品，鼠李糖脂的回收率达到98％以上，色谱纯度大于99％或大于95％。
Description
技术领域
本发明属于鼠李糖脂领域，具体涉及一种分离纯化鼠李糖脂的方法。
技术背景
表面活性剂是一种两亲性分子，其特征是它们能够降低不混溶性流体之间的界面张力，如油和水。这使得它们有广泛地工业应用，如去污、乳化和发泡。然而，目前与健康、污染、气候变化和化石燃料储备枯竭有关的问题需要大量使用传统表面活性剂，通常来自石化来源。在这一背景下，生物表面活性剂和生物基表面活性剂由于其独特的性能和潜在的应用而成为一种很有前景的候选材料。
鼠李糖脂是一种非常有前途的糖基生物表面活性剂，通常由是由假单胞菌发酵产生的阴离子生物表面活性剂。它兼具良好的化学和生物特性，具有油、水两亲性，可以降低水表面张力，可以在温度、PH值及盐度处于极端状况下使用，并且无毒，可以生物降解，在化妆品、食品科学、石油回收及环境保护等领域具有广泛的应用。
目前，生产鼠李糖脂的方法主要包括酶法和发酵法。酶法是利用外源酶催化合成鼠李糖脂，优点是生产过程迅速、副产物少、产物易分离，缺点是合成的鼠李糖脂结构简单，应用效果较差。发酵法是利用微生物细胞内多种酶的联合作用合成鼠李糖脂的方法，但通过微生物发酵生产鼠李糖脂会导致复杂的产品混合物，并需要引入复杂的分离策略，以确保所获得的鼠李糖脂的纯度。
鼠李糖脂的分离方法主要有萃取法、酸沉法、柱层析法等。传统萃取法缺点明显，需要反复进行5-8次转相操作，有机溶液用量大，有机溶剂的回收成本、废液产生量都大大增加，由于无法有效回收乳化相中的鼠李糖脂，最终收率约60％；而盐析萃取法产生大量高浓度含盐废水，三废处理成本增加；酸沉法对于不同粘度的发酵液不具有普适性，当发酵液粘度升高则菌体去除率及鼠李糖脂收率菌显著下降；柱层析法在理论上具有较好的分离效果，但一次性设备投资太大，是萃取法的十倍以上。
综上，目前鼠李糖脂分离工艺仍存在菌体分离困难、回收成本高、产品收率低的问题。
发明内容
本发明目的之一在于，针对现有技术的不足，提供一种直接从鼠李糖脂发酵液中回收鼠李糖脂的方法，通过对不同粘度的鼠李糖脂发酵液具有普适性，通过降低发酵液粘度从而获得100％的菌体去除率，同时可回收两种不同品质的鼠李糖脂产品，鼠李糖脂的回收率达到98％以上，色谱纯度大于99％或大于95％。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种从发酵液中分离纯化鼠李糖脂的方法，所述方法包含以下步骤：
S1：酸解鼠李糖脂发酵液，得到酸解液；
S2：酸解液中加入有机溶媒，获得萃取液，经相分离分别得到有机溶媒相、乳化相和水相；
S3：加入碱溶液处理有机溶媒相，经相分离获得的水相浓缩后为鼠李糖脂质量浓度≥50％，色谱纯度≥99％的高品质鼠李糖脂水溶液；
任选地，S4：加入破乳剂对乳化相破乳，固液分离得到清液，浓缩得到鼠李糖脂质量浓度≥10％，色谱纯度≥95％的低品质鼠李糖脂水溶液。
发明人发现，利用鼠李糖脂在不同pH下在水相和溶媒相中分配系数的不同实现鼠李糖脂在不同相之间的转移，可以实现产品的分离，首先通过加入溶剂降低发酵液粘度，从而获得100％的菌体去除率，其次根据不同应用场景对鼠李糖脂进行分级回收，使产品纯度及收率均有显著提升。
在本发明的一种实施方案中，S1中所述发酵液的发酵菌种为假单胞细菌，优选铜绿假单胞菌和/或恶臭假单胞菌。
在本发明的一种实施方案中，S1中鼠李糖脂发酵液的粘度为5cP～2000cP。
在本发明的一种实施方案中，S1中酸解采用强酸；优选地，所述强酸为无机酸，优选硫酸、盐酸、硝酸中的一种或多种；优选地，酸解调节pH至1.0-5.0。
在本发明的一种实施方案中，S1中酸解液的粘度为1cP～50cP。
在本发明的一种实施方案中，S2所述有机溶媒为有机酸酯、低分子量酮、烷烃、取代烷烃中的一种或多种，优选乙酸甲酯、丙酮、正己烷中的一种或多种，更优选乙酸乙酯；优选地，有机溶媒加入体积为物料体积的0.5～5倍，优选1.5倍。
在本发明的一种实施方案中，S3中处理的方法为反萃；优选地，处理用的碱溶液pH值为7.0～13.0，优选8.0～11.0；优选地，处理用的碱水加入量为被处理物料体积的1～4倍，优选1.2～2.5倍；优选地，处理次数为1～5次，优选2次。
在本发明的一种实施方案中，S3处理的温度为4℃～20℃，优选6～12℃。
在本发明的一种实施方案中，S4中破乳剂为低分子量醇，优选一元醇、多元醇、有机酸酯、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂的一种或多种，更优选乙醇；优选地，S4中破乳剂加入量为物料体积的1～5倍，优选2.5～4.5倍；优选地，S4中乳化相和水相合并。
在本发明的一种实施方案中，S4低品质鼠李糖脂水溶液与S3高品质鼠李糖脂水溶液的比例为1:(8～20)。
在本发明的一种实施方案中，所述方法中鼠李糖脂的收率大于98％。
本发明的另一目的在于提供一种高品质鼠李糖脂水溶液。
一种高品质鼠李糖脂水溶液，所述鼠李糖脂水溶液采用上述方法制备，鼠李糖脂质量浓度≥50％，色谱纯度≥99％及以上。
本发明的又一目的在于提供一种低品质鼠李糖脂水溶液。
一种低品质鼠李糖脂水溶液，所述鼠李糖脂水溶液采用上述方法制备，鼠李糖脂质量浓度≥10％，色谱纯度≥95％及以上。
本发明的再一目的在于提供一种高品质鼠李糖脂水溶液的用途。
一种高品质鼠李糖脂水溶液的用途，所述鼠李糖脂水溶液采用上述方法制备，所述高品质鼠李糖脂作为高端生物表面活性剂，优选用于日用化妆品、食品工业及医药领域。
本发明的还一目的在于提供一种低品质鼠李糖脂水溶液的用途。
一种低品质鼠李糖脂水溶液的用途，所述鼠李糖脂水溶液采用上述方法制备，所述低品质鼠李糖脂用于石油工业以减少昂贵驱油剂的用量，或用于环境领域处理水体中难降解的COD及处理重金属污染。
与现有技术相比较，本发明可以获得以下积极效果：
本发明通过一步萃取法获得两种可应用于不同领域的不同品质的鼠李糖脂，分离过程无废水产生，萃取剂可回收利用，鼠李糖脂全程收率达98％，显著优于当前的技术水平。
附图说明
图1为本发明工艺流程示意图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的工艺技术做进一步描述.
本发明涉及到试剂信息如下表所示
| 试剂名称 | 厂家 | 纯度 | 状态 |
| 甲醇 | 伊诺凯 | 99.5％AR | 液体 |
| 乙醇 | 伊诺凯 | 99.7％AR | 液体 |
| 正己烷 | 伊诺凯 | 99％AR | 液体 |
| 氯仿 | 伊诺凯 | 99.9％AR | 液体 |
| 乙酸乙酯 | 伊诺凯 | 99.5％AR | 液体 |
| 乙酸甲酯 | 伊诺凯 | 99.9％AR | 液体 |
| 氢氧化钠 | 伊诺凯 | 99％AR | 固体颗粒 |
本发明采用液相色谱对鼠李糖脂进行定量分析，设备型号安捷伦1260InfinityII，检测器为示差折光检测器，流动相为甲醇、水、甲酸，流速1mL/min，柱温35℃，运行时间40min。
粘度测试：粘度计制造商BROOKFIELD，设备型号DV2TLVJT0，测试温度为25℃。
实施例1
将铜绿假单胞菌鼠李糖脂发酵液(粘度100cP)，用98％硫酸调节pH至3.0，获得鼠李糖脂酸解液(粘度25cP)。取100mL酸解液倒入500mL锥形瓶中，加入150mL乙酸乙酯萃取，完成后将萃取液离心，离心后物料分为三相，分别为有机溶媒相、乳化相和水相，将有机溶媒相单独收集，将剩余两相合并收集。
有机溶媒相体积150mL，加入2.0倍体积的pH为10.0的氢氧化钠水溶液反萃，分离得到水相和有机相，将有机相再次加入2.0倍体积的pH为10.0的氢氧化钠水溶液萃取，萃取温度为10℃，将萃取水相混合收集，浓缩后即为高品质鼠李糖脂水溶液，鼠李糖脂质量浓度80％，色谱纯度99.2％。
乳化相和水相的混合物100mL，加入3倍体积的乙醇，混合均匀破除乳化，离心收集上清，将上清于60℃，10kPa(绝压)下蒸发浓缩，蒸发回收轻组分做下一轮套用，浓缩后的重组分即为低品质鼠李糖脂水溶液，鼠李糖脂质量浓度40％，色谱纯度95.1％。
经过本工艺处理，发酵液中的除菌率达100％，鼠李糖脂的总体收率达98.8％，其中低品质鼠李糖脂与高品质鼠李糖脂的比例为1：20，有机溶剂实现套用，无废水产生。
实施例2
将恶臭假单胞菌鼠李糖脂发酵液(粘度2000cP)，用36％盐酸调节pH至1.0，获得鼠李糖脂酸解液(粘度45cP)。取100mL酸解液倒入500mL锥形瓶中，加入50mL正己烷萃取，完成后将萃取液离心，离心后物料分为三相，分别为有机溶媒相、乳化相和水相，将有机溶媒相单独收集，将剩余两相合并收集。
有机溶媒相体积50mL，加入2.0倍体积的pH为13.0的氢氧化钠水溶液反萃，分离得到水相和有机相，相同条件重复萃取4次，萃取温度为20℃，将萃取水相混合收集，浓缩后即为高品质鼠李糖脂水溶液，鼠李糖脂质量浓度55％，色谱纯度99.2％。
乳化相和水相的混合物100mL，加入1倍体积的丁二醇，混合均匀破除乳化，离心收集上清，将上清于60℃，10kPa(绝压)下蒸发浓缩，蒸发回收轻组分做下一轮套用，浓缩后的重组分即为低品质鼠李糖脂水溶液，鼠李糖脂质量浓度25％，色谱纯度95.1％。
经过本工艺处理，发酵液中的除菌率达100％，鼠李糖脂的总体收率达98.0％，其中低品质鼠李糖脂与高品质鼠李糖脂的比例为1：12，有机溶剂实现套用，无废水产生。
实施例3
将铜绿假单胞菌鼠李糖脂发酵液(粘度5.0cP)，用30％硝酸调节pH至5.0，获得鼠李糖脂酸解液(粘度5.0cP)。取100mL酸解液倒入1000mL锥形瓶中，加入500mL丙酮萃取，完成后将萃取液离心，离心后物料分为三相，分别为有机溶媒相、乳化相和水相，将有机溶媒相单独收集，将剩余两相合并收集。
有机溶媒相体积500mL，加入1.0倍体积的pH为7.0的氢氧化钠水溶液反萃，分离得到水相和有机相，萃取温度为4℃，将萃取水相混合收集，浓缩后即为高品质鼠李糖脂水溶液，鼠李糖脂质量浓度88％，色谱纯度99.2％。
乳化相和水相的混合物100mL，加入5倍体积的正丁醇，混合均匀破除乳化，离心收集上清，将上清于60℃，10kPa(绝压)下蒸发浓缩，蒸发回收轻组分做下一轮套用，浓缩后的重组分即为低品质鼠李糖脂水溶液，鼠李糖脂质量浓度11％，色谱纯度95.1％。
经过本工艺处理，发酵液中的除菌率达100％，鼠李糖脂的总体收率达98.3％，其中低品质鼠李糖脂与高品质鼠李糖脂的比例为1：8，有机溶剂实现套用，无废水产生。
对比例1
根据现有技术CN 114249779 B的实施例1制备鼠李糖脂。
取铜绿假单胞菌的含菌体发酵液200ml，得到质量浓度为35g/L的鼠李糖脂溶液。往发酵液中加入硫酸铵固体至不同浓度(150-400g/L)，然后分别加入乙醇或者异丙醇，所述乙醇或异丙醇占含无机盐的鼠李糖脂溶液体积的40％，摇晃均匀后，然后经过2000rpm离心5min，可形成上下两相，收集有机相(上相)。向有机相中再加入3倍体积的乙醇或者异丙醇，离心去除析出的盐，再进行浓缩干燥，可获得鼠李糖脂产品。该方案鼠李糖脂收率约为96％，低于本发明公开的技术方案98％的鼠李糖脂收率，且对比方案在分离过程中加入大量的盐，产生大量的带菌体的高盐废水导致三废处理的成本增加，而本发明公开的技术方案不产生有含盐废水，优于对比方案。
Claims (10)
1.一种从发酵液中分离纯化鼠李糖脂的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：
S1：酸解鼠李糖脂发酵液，得到酸解液；
S2：酸解液中加入有机溶媒，获得萃取液，经相分离分别得到有机溶媒相、乳化相和水相；
S3：加入碱溶液处理有机溶媒相，经相分离获得的水相浓缩后为鼠李糖脂质量浓度≥50％，色谱纯度≥99％的高品质鼠李糖脂水溶液；
任选地，S4：加入破乳剂对乳化相破乳，固液分离得到清液，浓缩得到鼠李糖脂质量浓度≥10％，色谱纯度≥95％的低品质鼠李糖脂水溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，S1中所述发酵液的发酵菌种为假单胞细菌，优选铜绿假单胞菌和/或恶臭假单胞菌；
和/或，S1中鼠李糖脂发酵液的粘度为5cP～2000cP；
和/或，S1中酸解采用强酸；
优选地，所述强酸为无机酸，优选硫酸、盐酸、硝酸中的一种或多种；
优选地，酸解调节pH至1.0-5.0；
和/或，S1中酸解液的粘度为1cP～50cP。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，S2所述有机溶媒为有机酸酯、低分子量酮、烷烃、取代烷烃中的一种或多种，优选乙酸甲酯、丙酮、正己烷中的一种或多种，更优选乙酸乙酯；
优选地，有机溶媒加入体积为物料体积的0.5～5倍，优选1.5倍。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，S3中处理的方法为反萃；
优选地，处理用的碱溶液pH值为7.0～13.0，优选8.0～11.0；
优选地，处理用的碱水加入量为被处理物料体积的1～4倍，优选1.2～2.5倍；
优选地，处理次数为1～4次，优选2次；
和/或，S3处理的温度为4℃～20℃，优选6～12℃。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，S4中破乳剂为低分子量醇，优选一元醇、多元醇、有机酸酯、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂的一种或多种，更优选乙醇；
优选地，S4中破乳剂加入量为物料体积的1～5倍，优选2.5～4.5倍。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法中S4低品质鼠李糖脂水溶液与S3高品质鼠李糖脂水溶液的比例为1:(8～20)；
和/或，所述方法中鼠李糖脂的收率大于98％。
7.一种高品质鼠李糖脂水溶液，所述鼠李糖脂水溶液采用权利要求1-6中任一项所述方法制备，其特征在于，鼠李糖脂质量浓度≥50％，色谱纯度≥99％。
8.一种低品质鼠李糖脂水溶液，所述鼠李糖脂水溶液采用权利要求1-6中任一项所述方法制备，其特征在于，鼠李糖脂质量浓度≥10％，色谱纯度≥95％。
9.一种高品质鼠李糖脂水溶液的用途，所述鼠李糖脂水溶液采用权利要求1-6中任一项所述方法制备，所述高品质鼠李糖脂作为高端生物表面活性剂，优选用于日用化妆品、食品工业及医药领域。
10.一种低品质鼠李糖脂水溶液的用途，所述鼠李糖脂水溶液采用权利要求1-6中任一项所述方法制备，所述低品质鼠李糖脂用于石油工业以减少昂贵驱油剂的用量，或用于环境领域处理水体中难降解的COD及处理重金属污染。
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