CN114216758A - 用于高压冷冻的样品的制备 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于制备用于高压冷冻过程的显微镜样品(1)的装置(10)，其中样品(1)是使用包括高压冷冻盒(30)的中间板(33)和培养室(100、200)的布置提供的，中间板(33)附接到培养室(100、200)，并通过实现中间板(33)和培养室(100、200)之间的相对移动而从培养室(100、200)可拆卸，并且样品(1)提供在待装配到中间板(33)的开口(36)中的包封元件(37)上，其中，装置(10)包括接合结构(11、21)，接合结构(11、21)适于与中间板(33)接合，并在培养室(100、200)被移动时限制中间板(33)的移动，以便实现中间板(33)和培养室(100、200)之间的所述相对移动，从而从培养室(100、200)拆卸中间板(33)。此外，培养室(100、200)、高压冷冻盒(30)的中间板(33)、包括这些部件的布置以及相应的方法也是本发明的一部分。

Description

用于高压冷冻的样品的制备

技术领域

本发明涉及一种用于制备用于高压冷冻过程的显微镜样品的装置以及可与这种装置结合使用的手段和相应方法。

背景技术

在光学显微镜成像期间，活细胞应保持在有利的环境条件下。阶段培养箱、阶段加热器、二氧化碳室等是用于此目的的常用工具。

有几种用于在可用的光学显微镜检查期间调节样品周围的气体气氛的阶段培养箱和室。DE 20 2016 007 488 U1中公开了特定类型的培养室的操作原理，其提供了在不同位置之间转移样品同时仍维持环境条件的选项。

在下面的图1中，在纵向剖面中示出了这种类型的培养室的组件。本发明不限于与任何特定类型的培养室一起使用，并且提供图1仅作说明之用。

为了组装图1所示的培养室900，打开的硅胶圆筒110安装到形成培养室的底部120的玻璃板。圆筒110由玻璃盖130封闭，玻璃盖130可以另外用金属环140固定。然后，整个组件由金属罩150覆盖，金属罩150例如由铝制成，包含玻璃窗160。样品所暴露在的气体经由连接到气体供应手段的馈通孔170或端口被引入罩150中。从那里，气体通过扩散经过硅胶圆筒110而维持室内的气氛。如图1所示，培养室900可以用于在液体介质2中培养样品1，例如一层细胞。

通常希望尽可能迅速地(即在检测到生理事件时)捕捉在光学显微镜中(特别是在刚才提到的培养室中)观察到的细胞状态，以保存它们用于电子显微镜研究。在这方面，高压冷冻是样品固定的合适工具，下面将进行更详细地解释。然而，对于这种方法，样品必须装在用于高压冷冻装置的合适的样品保持手段或载体构造(通常被称为“盒”)中。转移到这些盒中是复杂和耗时的，特别是当样品先前被装在提到的培养室中时。这是现有技术的方法和布置中快速固定细胞状态的主要障碍。

本发明的目的是针对高压冷冻保持在培养室中的限定环境条件下的样品，提供一种先进的解决方案。

发明内容

在此背景下，本发明提出了根据独立权利要求的一种用于制备用于高压冷冻过程的显微镜样品的装置、可与这种装置结合使用的手段和相应方法。优选的实施方式是从属权利要求和以下描述的主题。

在此，如果提及“用于制备”用于高压冷冻过程的显微镜样品的装置，则旨在指适于进行作为一个整体制备用于高压冷冻过程的样品的方法的至少一个步骤的装置。在这方面，术语“样品制备”旨在还包括样品的培养，特别是在限定的气氛中。该装置不一定要用于整个程序，但也可以用于其中的至少一个步骤，因为每个步骤均在某种程度上“制备”用于高压冷冻过程的样品。提及方法时这同样适用。

在谈及本发明的特征和具体优势之前，先展现与高压冷冻有关的一些进一步的细节以及将样品从培养室转移到高压冷冻装置中的方法的问题，以便理解本发明的基础。

水是最丰富的细胞成分，因此对保存生物样品的细胞超微结构很重要。目前，固定细胞成分而又不引入重大结构改变的唯一方法是低温固定。目前有两种常用的方法：骤降式冷冻和高压冷冻。本发明涉及到高压冷冻。

一般来说，低温固定比化学固定有两个明显的优势。它可以在几毫秒内实现，并确保同时固定所有大分子成分。许多蛋白质网络是非常脆弱的，在最轻微的渗透或温度变化下就会解体，而在低温固定期间，这些不必要的影响被降到最低。这些技术使生物样品的研究具有改善的超微结构保存，并能够促进对动态过程的研究。目前，使较厚的样品(达200微米)玻璃化的唯一方法是通过高压冷冻。

成功的低温固定(玻璃化)应该导致水从液体转变为无定形的固体状态，而不会诱发冰晶的成核。冰晶的成核取决于温度和压力。结晶也取决于冷却率，因为冷冻是与时间有关的过程。冷却速率取决于水的热性能、样品厚度和试样表面的热提取流量。因此，高压冷冻在高压下并且以高流量的制冷剂(特别是液氮)进行。

对于高压冷冻，换句话说，生物样品在高压下与低温温度下提供的制冷剂接触。

由于用于高压冷冻的生物或其他水溶液制剂的厚度通常或一般不应超过200微米，因此样品的厚度必须受到限制。此外，样品必须被保护以免受冷却介质的流动影响。为此，由金属样品载体或蓝宝石板或其他合适的材料构成的覆盖元件被放置在与携带样品的样品载体有一定距离的地方，携带样品的载体可以是例如蓝宝石板。目前，载体、中间环和覆盖环是用镊子操纵的。

用于生物和工业样品的高压冷冻的装置由Leica Microsystems以“EM ICE”、“EMHPM100”和“EM PACT”的名称销售。例如，A.Kaech和U.Ziegler，“高压冷冻：目前的状态和未来的前景”，2014年，卷号1117，DOI 10.1007/978-1-62703-776-1_8,第151至171页，JohnKuo(编辑)的第八章，电子显微镜学：方法和协议，分子生物学中的方法，描述了此类装置。

利用这些装置，就可以在几毫秒内用液氮在高达2,100(两千一百)巴的压力下将样品冷却到低温温度，特别是低于-100℃的温度。在这些装置中，如前所述，在高压冷冻期间使用样品盒来保持样品。样品盒可以由例如高强度塑料制成，并可包括三个部分，即两个半圆筒以及样品保持布置，两个半圆筒具有适于由高压冷冻装置供应制冷剂流的通道，样品保持布置通常被称为“中间板”，具有开口以用于保持样品，中间板夹在半圆筒之间。如前所提到的，本发明并不限于特定类型的样品盒，只要与本发明提出的解决方案兼容即可。

在中间板中，样品本身在中间板的开口内被包封在两个足够薄的且因此是导热材料(如蓝宝石、铝或铜)的盘之间，其中盘本身包括凹部以接收样品，或由间隔件环分开以形成用于样品的保持器。样品位置处的压力是由制冷剂产生的，为此目的，制冷剂被加压至例如2,100巴。这方面的更多细节将参照下面的图来解释。如果下文提到了“中间板”，这旨在指大体上平坦的元件或元件的布置，其适于提供接收待玻璃化的样品的空间。特别地，在组装状态下，中间板至少由大体上平坦的结构组成，该结构具有开口，在开口中可以布置适当的盘来形成样品空间。这些盘可以由各种材料形成而且不需要是透明的。术语“中间板”在所使用的任何情况下都可以用“载体元件”代替。

用于维持生理上有利的环境条件的培养室在一开始就已经描述过了，其被设计为用于载玻片或盖玻片以作为标准样品载体。因此，对盛装在这种培养室中的样品的高压冷冻必须包括将样品转移到高压冷冻盒的中间板。这显然与样品暴露在的培养室中的环境条件的干扰有关，并可能产生不必要的生理反应。此外，这样的步骤是耗时的，因此可能导致不必要的时间滞后，这使得快速生理变化的观察成为不可能。

因此，本发明的一个方面涉及一种有利的解决方案，其中高压冷冻盒的中间板在打开状态下安装在上述类型的培养室的底部处。中间板的“打开状态”应理解为这样一种状态：上面提到的一个盘(下文称为“包封元件”)安装在中间板的开口内，而另一个盘尚未安装在那里。因此，可以从培养室取出放在已经安装好的盘上的样品，并在安装了另一个盘以关闭和密封样品空间后，直接和快速地将样品与高压冷冻盒的其他部分一起转移到高压冷冻装置。

本发明的另一方面涉及将安装在培养室的底部处的中间板从培养室移除的步骤。在未按本发明设计的布置中，这样的分离和转移需要许多手工步骤，手工步骤相应地耗时。本发明通过简单的移动将中间板和样品一起从培养室分离而解决了这个问题，其中中间板被临时保持结构保持固定。一旦拆卸，中间板就可以位于紧邻高压冷冻装置的装载区的位置，或者甚至位于其专用装载站。

所述关闭中间板或者更具体地说关闭其样品空间(包括仔细地将另一个盘装配到形成样品空间的开口中，并可选地装配间隔件环和垫圈环)需要技术，并涉及几个操纵步骤，因此在传统方法中是很耗时的。因此，本发明的一个重要方面涉及一种装置，包括将处于其打开状态的中间板放置在几何上明确限定的位置处，并借助于旋转臂将另一个盘(优选为单个金属元件)快速安全地放入开口中。

本发明的特征和优势

根据本发明，提出了一种用于制备用于高压冷冻过程的显微镜样品的装置。根据本发明提供的装置可以是适于进行高压冷冻的所有或至少部分步骤的高压冷冻装置，因此也可以包括所谓的“装载站”，装载站适于组装高压冷冻盒(例如，如下图2和3所示)，并将该盒插入空间或室中，其中高压制冷剂经过该盒。因此，该装置还可以包括用于提供高压制冷剂并使其通过室的手段。因此，该装置可以包括根据现有技术或专家文献(如Kaech和Ziegler(见上文))的用于高压冷冻过程的全部手段或其子集。然而，根据本发明提供的装置也可以是与高压冷冻装置分开的专用装置，也就是说，作为单独的结构单元，并且可以确切地包含下文描述的部件，并可选地包括其他部件。在后一情况下。该专用装置可以例如紧邻高压冷冻装置放置。

根据本发明，该装置与样品在一开始已经描述的培养室或类似类型的培养室中的培养结合使用。根据本发明，如先前结合本发明的基本或重要方面更一般地陈述的，使用一种布置提供样品，该布置包括高压冷冻盒的中间板和这样的培养室，其中中间板附接到培养室。因此，根据本发明，不再需要费力地将样品转移到高压冷冻盒的中间板，而在使用根据现有技术的设置时，这是必要的。这大大减少了对样品在培养室中所暴露的环境条件的干扰，并减少或避免了不必要的生理反应。根据本发明，由于样品可以已经提供在相应的中间板上，因此培养和高压冷冻之间的时间滞后也减少了，从而也可以观察到快速生理变化的特定点。

在本发明的背景下，中间板附接到培养室，从而通过实现中间板和培养室之间的相对移动而从培养室可拆卸，如下面进一步详细描述的。通过简单移动实现的根据本发明的这种拆卸(其中，中间板被在下文中称为“接合结构”的保持结构保持固定)减少了分离培养室和中间板的时间和精力，从而使中间板可以特别迅速地转移到高压冷冻装置。一旦拆卸，中间板就可以位于紧邻高压冷冻装置的装载区的位置，或者甚至位于其专用装载站，或者该拆卸可以在紧邻高压冷冻装置定位或者作为高压冷冻装置的一部分的结构或设备部件中实现。

如前所述，在本发明的背景下，高压冷冻盒的中间板在打开状态下安装在上述类型的培养室的底部。也就是说，样品被提供在装配到中间板的开口中的包封元件上。因此，制备用于组装高压冷冻盒的中间板基本上只需要插入另一包封元件，以密封样品，这可以在根据本发明的特别优选的实施方式的装置中实现，如下所述。

如所提到的，根据本发明提供的装置包括接合结构，接合结构适于与中间板接合，并在培养室被移动时限制中间板的移动，从而实现中间板和培养室之间的所述相对移动，并由此将中间板从培养室拆卸。特别地，接合结构可以提供成使得附接有中间板的培养室可以用手定位，从而整个中间板或其结构至少部分地插入接合结构中或与接合结构接触。通过培养室的简单移动，优选地也用手来实现，中间板可以从培养室拆卸，保持至少部分地插入接合结构中或与接合结构接触。

根据上面已经简要讨论过的本发明的特别优选的实施方式，根据本发明提供的装置适于将从培养室拆卸的中间板保持就位在处理位置。这样的位置尤其可以由用于将中间板从培养室拆卸的接合结构或其他定位元件(如止挡件、栅栏、凹部、框架等)限定。该装置包括带有容器的枢转臂，该容器适于接收待装配在中间板开口中的另一包封元件，以便将样品包封在其中。在本实施方式中，枢转臂作为一种手段，以精确地定位包封元件，用包封元件将样品密封在中间板的开口中，从而消除或大大减少了在这方面传统地所需的技术。

在本发明中，还可以减少待装配在包封元件的开口中的间隔件环和垫圈环的数量，或者完全不使用这些元件，从而进一步减少用于低温固定的样品制备所需的时间和精力。这可以是根据本发明提供的枢转臂的结果，枢转臂可以允许使用合适的包封元件，包封元件可以在没有垫圈的情况下被压装到中间板的开口中，而用手使用镊子是不可能做到的。为了减少对间隔件的需求，至少有一个包封元件可以提供有形成样品室的凹部，或者换句话说，提供有从包封元件的表面突出的外环。

为了上述目的，并为了提供刚才讨论的本发明的优势，在刚才讨论的本发明的优选实施方式中，枢转臂在装载位置和插入位置之间可枢转，在装载位置中，另一包封元件可插入枢转臂的容器中，在插入位置中，枢转臂的容器中的另一包封元件被放置在于处理位置处被保持在位的中间板的开口中。

在本发明的第一组实施方式中，高压冷冻盒的中间板通过使用机械和磁性附接手段(如插入培养室的底部的磁体、支架、夹子等)中的至少一种附接到培养室的底部的下表面。在该第一组实施方式中，培养室的底部设置有开口，该开口为中间板的开口提供通路，但其本身并不用于附接中间板。在本实施方式中，中间板的上表面直接附接到培养室的下表面。这两个表面之间可以提供有诸如密封环的密封元件，以避免培养液从培养室泄漏。

在第一组实施方式中，通过实现呈以下移动中的至少一种的形式的所述移动，中间板从培养室可拆卸：培养室在对应于培养室的底部的下表面的平面中的线性和/或旋转移动；培养室绕平行于培养室的底部的下表面的轴线的倾斜移动；以及培养室在与培养室的底部的下表面成角度的方向上的提升移动。接合结构特别适于与中间板接合，以限制线性、旋转、倾斜和提升移动中的所述至少一种。

为了限制线性移动，可以提供简单的止挡件或栅栏作为接合结构，使得当中间板附接到培养室的底部表面并从其突出时，当培养室被推到止挡件或栅栏上并停留在由止挡件或栅栏限度的位置处时，中间板可以被阻止移动。在这样的构造中，用于将中间板附接到培养室的手段设计成提供附接力，附接力可以被例如用手实现的相应推力克服。

为了限制旋转移动，可以提供凹部或至少两个栅栏作为接合结构，附接到培养室的底部表面并从其突出的中间板装配到接合结构中或装配到其间。旋转培养室，由此将附接到培养室的底部表面的中间板从培养室拆卸。同样，在这方面，用于将中间板附接到培养室的手段设计成提供附接力，附接力可以被例如用手实现的相应旋转力克服。

在这种情况下，可以提供一个或更多个(特别是两个)突起(尤其是以榫或销的形式)作为接合结构，作为额外的接合结构或作为接合结构之外的对准结构。一个或更多个突起可以设置在中间板处，并且至少一个匹配凹部可以设置在其对应部件处，培养室与该对应部件接触以拆卸中间板，或者一个或更多个突起可以设置在对应部件处，而至少一个匹配凹部可以设置在中间板处。

为了限制倾斜移动，接合结构可以被设置为具有下切口的结构，设置在中间板处的相应突起可以插入下切口中，使得当在维持中间板的突起插入在下切口中的同时将培养室倾斜时，下切口的悬突部以类似于起盖器或开瓶器的方式将中间板从培养室“拉脱”。可以通过用手将带有中间板的培养室按入下切口的方向来维持中间板的突起插入在下切口中，或通过提供限制从下切口中移出的止挡件来维持中间板的突起插入在下切口中。另外，在此，在这方面，用于将中间板附接到培养室的手段被设计成提供附接力，附接力可以被例如用手实现的相应倾斜力克服。

可以通过提供一组平行的带有下切口的引导元件(例如，以燕尾形引导件的形式)来限制提升移动，这些引导元件适于在插入方向上滑动地接收提供在中间板处的互补结构。当在与插入方向成角度的方向上提升培养室时，并且当在这里也选择合适的附接力时，中间板可以因此被从培养室拆卸。

应该理解的是，在本发明中，在第一组实施方式中，移动或移动轨迹不一定限于线性、旋转、倾斜和提升移动中的任何一种，而是例如旋转移动或线性移动之后可以跟随提升移动，等等。

一般来说，在第一组实施方式中，当附接到培养室的底部时，中间板可以从培养室的底部突出。接合结构可以被提供为凹部，其形状与中间板的形状的至少一部分互补，并适于接收从培养室的底部突出的中间板的至少一部分。在这方面，术语“凹部”应作广义的理解，可以是平坦表面上的凹部、围栏结构之间的凹部或止挡件前面的凹部、导轨的下切口或不同结构等。

在本发明的第二组实施方式中，培养室的底部包括具有引导结构的开口，引导结构适于滑动地接收中间板。也就是说，与刚才讨论的第一组实施方式相比，开口不仅提供通向中间板中开口的通路，而且还用作附接结构。适于滑动地接收中间板的引导结构尤其可以设计成一组燕尾形引导件，其设计成与中间板中的相应结构配合。在这第二组实施方式中，通过实现呈由所述引导结构定义的线性移动形式的所述移动，中间板从培养室可拆卸，并且接合结构包括止挡件，以在实现所述移动时将中间板保持在位。换句话说，中间板可以通过这样的移动被推出诸如燕尾形引导件的引导结构。在这种情况下，同样，可以提供如前面所述的额外的突起和凹部。

在提供了适于将包封元件置于适当位置的枢转臂的本发明的实施方式中，容器可以适于粘合地保持另一包封元件，以避免在枢转臂的枢转移动期间发生位移或掉出。选择粘合力，使得其可以被保持力克服。利用保持力，另一包封元件在插入后被保持在中间板的开口中，例如以压合的形式。

本发明还涉及一种培养室，适于在包括培养室和高压冷冻盒的中间板的布置中使用，培养室包括将中间板附接到培养室的手段，使得通过实现中间板和培养室之间的相对移动，中间板从培养室可拆卸。关于这种培养室及其具体特征和优势，请参考上述解释。上文所述的每个和任何特征都可以成为根据本发明提供的培养室的一部分。

适于用在包括培养室和中间板的布置中的高压冷冻盒的中间板(即用于高压冷冻的样品保持手段)也是本发明的一部分。根据本发明提供的中间板包括将中间板附接到培养室的手段，使得通过实现中间板和培养室之间的相对移动，中间板从培养室可拆卸。另外，对于中间板及其具体特征和优势，请参考上面的解释。上文所述的每个和任何特征都可以是根据本发明提供的中间板的一部分。

根据本发明的特别优选的实施方式，培养室可在适当的工艺(特别是压力成型或增材制造(3D打印))中与中间板一起制造，其中培养室和中间板之间的可断裂连接以形成有意的断裂点的薄、弱或脆结构的形式提供。通过破坏这些结构，基本上如前所述，即使用接合结构，可以从培养室拆卸中间板。

上述解释同样适用于包括培养室和根据本发明提供的高压冷冻盒的中间板的布置。

根据本发明提供的方法是为了制备用于高压冷冻过程的显微镜样品而提供的，其中使用包括高压冷冻盒的中间板和培养室的布置提供样品，中间板附接到培养室，并通过实现中间板和培养室之间的相对移动而从培养室可拆卸，并且样品被提供在装配到中间板的开口中的包封元件上。根据本发明提供的方法包括使用包括接合结构的装置，接合结构适于与中间板接合，并在培养室被移动时限制中间板的移动，并且该方法包括实现接合结构与中间板的接合，并实现中间板和培养室之间的所述相对移动，从而从培养室拆卸中间板。

另外，关于根据本发明提供的方法，请参考上面的解释。根据本发明提供的方法利用了在上述优选实施方式中描述的装置和其他元件和布置的特征和优势。

在根据本发明提供的方法的特别优选的实施方式中，所述装置适于将从培养室拆卸的中间板在处理位置处保持在位，并且该装置包括具有容器的枢转臂，容器适于接收待装配在中间板的开口中的另一包封元件，以包封样品，其中枢转臂在装载位置和插入位置之间可枢转，在装载位置中，另一包封元件可插入枢转臂的容器中，在插入位置中，插入枢转臂的容器中的另一包封元件可放置在于处理位置处被保持在位的中间板的开口中。该方法包括将从培养室拆卸的中间板在处理位置处保持在位，并使用该装置的枢转臂插入另一包封元件。

在任何情况下，在根据本发明提供的方法中，可以使用之前不同实施方式中描述的装置、培养室、中间板和/或布置。

在根据本发明的方法中，提供样品可以包括将活体物质暴露于在培养室中提供的限定的环境条件，如针对此类培养室一般已知的。

将结合附图描述本发明的其他特征，附图中与现有技术对比地描述了本发明的实施方式。需要注意的是，关于附图描述的以及上文描述的实施方式的具体特征可以在不离开本发明范围的情况下以任何组合和/或单独的方式使用。

附图说明

图1以简化的剖视图示出了不构成本发明的一部分的用于培养样品的培养室。

图2以简化的分解图示出了可以与本发明一起使用的高压冷冻盒。

图3以简化的剖视图示出了可以与本发明一起使用的高压冷冻盒的中间板。

图4以简化的剖视图示出了根据本发明的实施方式的用于培养样品的培养室。

图5以简化的立体图示出了根据本发明的实施方式的用于培养样品的培养室。

图6A和图6B示出了根据本发明的实施方式的通过倾斜将中间板从培养室拆卸的步骤。

图7A和图7B示出了根据本发明的实施方式的通过提升将中间板从培养室拆卸的步骤。

图8A至图8E示出了根据本发明的实施方式通过滑动和密封开口而从培养室拆卸中间板的步骤。

在图中，类似元件用相同的附图标记标示。仅为了简洁起见，省略了其重复说明。

具体实施方式

图1以简化的剖视图示出了不构成本发明的一部分的用于培养样品的培养室900，并且在一开始就已经说明了。请参考上面的说明。同样需要指出的是，本发明并不意图被这里所示的培养室的具体类型所限制。

图2以分解图示出了高压冷冻盒30，即样品保持手段，其可以与本发明一起使用。盒30可以用于上文提到的本领域已知的高压冷冻装置。例如，参考上文引用的LeicaMicrosystems的“EM ICE”、“EM HPM100”和“EM PACT”系统的文献(例如参考DE 10 2013003 164 A1，其进一步描述了高压冷冻系统的细节)以及科学评论文献，例如Kaech&Ziegler(见上文)。在组装状态下，盒30可以通过使用已知的保持器被转移到高压冷冻装置中。诸如盒30之类的盒的处理在其他地方有广泛的描述，为了简洁起见，这里不做解释。

盒30包括两个保持元件31、32，每个保持元件基本上均是半圆筒形形状。中间板33布置在盒30的保持元件31、32之间。保持元件31、32之间设置有制冷剂通道34，制冷剂通道34由保持元件31、32的内部平坦表面上的沿纵向方向的槽形成。经由制冷剂通道34，低温制冷剂可以基本上沿着盒30的纵向轴线并且在图2所示的虚线箭头35的方向上被传送到接收或盛装在中间板33中形成样品空间的开口36中的样品。

图3在沿竖直平面的纵向剖面中示出了在图2所示的盒30中使用的中间板33，从而开口36(如根据图1所示)中形成的样品空间被切开。开口36是圆形的，并且布置在中间板33的中心或靠近中心的地方，样品1被保持在两个包封盘之间，两个包封盘包括第一(底部)盘37和第二(顶部)盘38，例如，呈由蓝宝石、金属或其他合适的材料制成的盘的形式的圆形包封元件37、38。包封元件37、38固定在开口36中，它们的距离通过固定手段、密封手段和/或间隔手段39来调整。包封元件37、38本身也可以包括一个或更多个凹部，当包封元件插入开口36中时，样品1可以被接收在凹部中，从而减少或消除了对固定手段、密封手段和/或间隔手段39的需要。由于冷却所需的制冷剂的快速流动会带走样品，因此包封元件37、38也用于保护样品1。

在提到的现有技术中，描述了盒30及其中间板33的进一步细节和变体。同样，应该理解的是，本发明并不限于盒30和中间板33的具体构造。整个盒30的尺寸设计成使得可以建立高压冷冻所需的高压(例如超过2,000巴)，并且在优选200至500毫秒的时段内被维持，从而在这个时间间隔内实现样品1的快速冷冻。

图4以简化的剖视图示出了根据本发明的实施方式(或者如前面更详细解释的“第一组实施方式”)的用于培养样品的培养室。

图4所示的培养室100的元件与图1所示的培养室900略有不同地设计，但同样也可以以相同的方式设计。本发明不以培养室900的特定部分是否存在为特征或受其限制。图4所示的培养室100的元件用与图1所示的培养室900相同的附图标记标示。

在这里，同样地，为了组装图4所示的培养室100，打开的硅胶圆筒110安装到形成培养室的底部120的玻璃板。圆筒110也由玻璃盖130封闭。在培养室100中，整个组件由固定玻璃盖130的金属罩150覆盖，没有提供单独的玻璃窗160。可以提供样品1所暴露在的气体，并且可以用任何可想象的方式维持气体气氛。

中间板33(例如，如前面结合图2和图3所解释的)通过使用任何可想象的手段(例如，由于通用性的原因而没有具体示出的机械和磁性附接手段)附接到培养室100的底部120的下表面，并且中间板33通过实现培养室100的移动而从培养室100可拆卸，如前面针对不同的实施方式所详细描述的。如所示，中间板33以打开的状态提供，即只插入了下部的包封元件37，而样品1被提供在下部的包封元件上。培养室100的底部120包括开口180，用于提供通向中间板33的开口36的流体通路。

图5是以简化的立体图示出了根据本发明的另一实施方式(或如前面更详细解释的“第二组实施方式”)的用于培养样品的培养室。图5所示的培养室200的元件也可以与图1所示的培养室900或图4所示的培养室100略有不同地设计，但同样也可以以相同的方式设计。图5所示的培养室200的元件用与图1和图4所示的培养室900和100相同的附图标记标示。

在图5所示的培养室200中，培养室200的底部120包括细长的开口160，开口160具有适于滑动地接收中间板33的引导结构165。如前所述，这可以是燕尾形结构或任何其他适合保持中间板33的引导结构。在培养室200中，通过实现以由所述引导结构165限定的线性移动的形式的移动，即特别地与引导结构165的纵向延伸平行，中间板33从培养室200可拆卸，并且接合结构(如下面进一步详细描述的)包括例如稍后在图8B、8D和8E中以附图标记21示出的止挡件，以在实现所述移动时将中间板33保持在位。同样，培养室200的底部120包括开口，用于提供通向中间板33的开口36的液体通路，但是该液体通路在图5中不可见，因为它被中间板33覆盖。

图6A和图6B示出了根据本发明的实施方式的通过倾斜将中间板从培养室拆卸的步骤。培养室基本上如图4所示的实施方式(或者“第一组实施方式”)所描述的那样实施，因此被标示为100。

一般来说，由于中间板33在附接到培养室100的底部120时从培养室100的底部120突出，接合结构11可以提供为凹部，其形状与中间板的形状的至少一部分互补，该凹部适于接收从培养室100的底部120突出的中间板33的至少一部分。在所示的具体实施方式中，为了限制倾斜移动，接合结构11被提供为具有下切口的结构，在中间板33处提供的相应的突起13可以插入其中，使得当在维持中间板33的突起13插入下切口中的同时倾斜培养室100(如图6A中的白色箭头所示)时，下切口的悬突部分会将中间板33“拉脱”。

图7A和7B示出了根据本发明的实施方式的通过提升将中间板从培养室拆卸的步骤。在这里，同样地，培养室基本上如图4所示的实施方式(或者“第一组实施方式”)所描述的那样实施，因此被标示为100。

在这里，同样地，一般来说，由于中间板33在附接到培养室100的底部120时从培养室100的底部120突出，接合结构11可以提供为凹部，其形状与中间板的形状的至少一部分互补，该凹部适于接收从培养室100的底部120突出的中间板33的至少一部分。

通过提供一组平行的具有下切口的引导元件作为接合结构11，例如以燕尾形引导件的形式，可以具体限制提升移动，该引导元件适于在插入方向上滑动地接收以突起13的形式提供在中间板处的互补结构。在图7A和7B的图示中，该插入方向与纸张平面正交。当在与插入方向成角度的方向上提升培养室100时，如根据图7A用白色箭头标示的，可以从培养室100拆卸中间板33。

在图6A至图7B以及下面的图中，根据本发明提供的装置以局部视图示出，并标示为10。如先前所提到的，装置10也可以是高压冷冻装置，适于进行高压冷冻的另外步骤的全部或至少部分，或者装置10可以是与高压冷冻装置分开的专用装置，即单独的结构单元。根据图6A至图7B的装置10包括接合结构11，而根据后面的图的装置10包括接合结构21。装置10的表面标示为12。

图8A至图8E示出了根据本发明的实施方式的通过滑动从培养室拆卸中间板的步骤以及密封中间板中的开口的步骤。

与图6A至7B相比，培养室基本上如图5所示的实施方式(或“第二组实施方式”)所描述的那样实施，因此在此也被标示为200。

由于在培养室200中，底部120包括开口160，开口160具有适于滑动地接收中间板33的引导结构165，并且由于通过实现由所述引导结构165限定的线性移动形式的移动，中间板33从培养室200可拆卸，接合结构21可以提供为止挡件，以在实现所述移动时将中间板33保持在位。为了以这种移动引导培养室200，可以按照所示方式或类似设计提供轨道结构12。图8A和8B示出了示出培养室200和装置10的底面(图8A)和培养室200和装置10的顶面(图8B)的两个视角。如用箭头表示的，附接有中间板33的培养室200可以放置在装置10上。另外，如图8A和8B所示，可以提供相匹配的突起和凹部33a、33b，以改善中间板33和装置10的正确对准。

如也用箭头所示的，图8C示出了为了将中间板33从培养室200拆卸而进行的移动。

如图8D所示，装置10适于将从培养室200拆卸的中间板33在处理位置(如接合结构21所限定的)处保持在位，并且装置10包括具有容器26的枢转臂24，容器26适于接收要装配到中间板33的开口36中的另一(顶部)包封元件38，以便将样品1包封在其中。如图8C中的箭头所示，枢转臂24在装载位置和插入位置之间可枢转，在装载位置，另一包封元件38可插入枢转臂24的容器26中，在插入位置，枢转臂24的容器26中的另一包封元件38被放置在于处理位置处被保持在位的中间板33的开口36中。为了枢转枢转臂24，可以提供旋钮25。图8E(同样用箭头示出)示出在另一包封元件38被放置到开口36中并且枢转臂24摆回到装载位置后，如何能够从装置10上移除中间板33。

Claims (13)

1.一种用于制备用于高压冷冻过程的显微镜样品(1)的装置(10)，其中所述样品(1)是使用包括高压冷冻盒(30)的中间板(33)和培养室(100、200)的布置提供的，所述中间板(33)附接到所述培养室(100、200)，并通过实现所述中间板(33)和所述培养室(100、200)之间的相对移动而从所述培养室(100、200)可拆卸，并且所述样品(1)提供在装配到所述中间板(33)的开口(36)中的包封元件(37)上，其中，所述装置(10)包括接合结构(11、21)，所述接合结构(11、21)适于与所述中间板(33)接合，并在所述培养室(100、200)被移动时限制所述中间板(33)的移动，以便实现所述中间板(33)和所述培养室(100、200)之间的所述相对移动，从而从所述培养室(100、200)拆卸所述中间板(33)。

2.根据权利要求1所述的装置(10)，其中所述装置(10)适于将从所述培养室(100、200)拆卸的所述中间板(33)在处理位置处保持在位，并且其中所述装置(10)包括枢转臂(24)，所述枢转臂(24)具有容器(26)，所述容器(26)适于接收待装配到所述中间板(33)的所述开口(36)中的另一包封元件(38)，从而将所述样品(1)包封在其中，其中所述枢转臂(24)在装载位置和插入位置之间可枢转，在所述装载位置，所述另一包封元件(38)可插入所述枢转臂(24)的所述容器(26)中，在所述插入位置，所述枢转臂(24)的所述容器(26)中的所述另一包封元件(38)被放置在于所述处理位置处被保持在位的所述中间板(33)的所述开口(36)中。

3.根据权利要求1或2所述的装置(10)，其中所述中间板(33)通过使用机械和磁性附接手段中的至少一种附接到所述培养室(100)的底部(120)的下表面，其中通过实现呈以下移动中的至少一种的形式的所述移动，所述中间板(33)从所述培养室(100)可拆卸：所述培养室(100)在与所述培养室(100)的所述底部(120)的所述下表面相对应的平面中的线性和/或旋转移动；所述培养室(100)绕平行于所述培养室(100)的所述底部(120)的所述下表面的轴线的倾斜移动；以及所述培养室(100)在与所述培养室(100)的所述底部(120)的所述下表面成角度的方向上的提升移动，

其中所述接合结构(11、21)适于与所述中间板(33)接合，以限制线性、旋转、倾斜和提升移动中的所述至少一种。

4.根据权利要求3所述的装置(10)，其中所述中间板(33)在附接到所述培养室(100)的所述底部(120)时从所述培养室(100)的所述底部(120)突出，并且其中所述接合结构(11、21)被提供成凹部，所述凹部的形状与所述中间板的形状的至少一部分互补，并适于接收从所述培养室(100)的所述底部(120)突出的所述中间板(33)的至少一部分。

5.根据权利要求1或2所述的装置(20)，其中所述培养室(200)的底部(120)包括开口，所述开口具有引导结构(165)，所述引导结构(165)适于滑动地接收所述中间板(33)，其中通过实现以由所述引导结构(165)限定的线性移动的形式的所述移动，所述中间板(33)从所述培养室(200)可拆卸，其中所述接合结构(11、21)包括止挡件，以在实现所述移动时将所述中间板(33)保持在位。

6.根据前述权利要求中任一项所述的装置(10)，其中所述容器(26)适于粘合地保持所述另一包封元件(38)。

7.一种培养室(100、200)，适于在包括所述培养室(100、200)和高压冷冻盒(30)的中间板(33)的布置中使用，所述培养室(100、200)包括将所述中间板(33)附接到所述培养室(100、200)的手段，使得通过实现所述中间板(33)和所述培养室(100、200)之间的相对移动，所述中间板(33)从所述培养室(100、200)可拆卸。

8.一种高压冷冻盒(30)的中间板(33)，适于在包括培养室(100，200)和所述中间板(33)的布置中使用，所述中间板(33)包括将所述中间板(33)附接到所述培养室(100、200)的手段，使得通过实现所述中间板(33)和所述培养室(100、200)之间的相对移动，所述中间板(33)从所述培养室(100、200)可拆卸。

9.一种布置，包括根据权利要求7所述的培养室(100、200)和根据权利要求8所述的高压冷冻盒(30)的中间板(33)。

10.一种用于制备用于高压冷冻过程的显微镜样品(1)的方法，其中所述样品(1)是使用包括高压冷冻盒(30)的中间板(33)和培养室(100、200)的布置提供的，所述中间板(33)附接到所述培养室(100、200)，并通过实现所述中间板(33)和所述培养室(100、200)之间的相对移动而从所述培养室(100、200)可拆卸，并且所述样品(1)提供在装配到所述中间板(33)的开口(36)中的包封元件(37)上，其中，所述方法包括使用包括接合结构(11、21)的装置(10)，所述接合结构(11、21)适于与所述中间板(33)接合并在所述培养室(100、200)被移动时限制所述中间板(33)的移动，并且其中所述方法包括实现所述接合结构(11、21)与所述中间板(33)的接合，以及实现所述中间板(33)和所述培养室(100、200)之间的所述相对移动，从而将所述中间板(33)从所述培养室(100、200)拆卸。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述装置(10)适于将从所述培养室(100、200)拆卸的所述中间板(33)在处理位置处保持在位，并且其中所述装置(10)包括枢转臂(24)，所述枢转臂(24)具有容器(26)，所述容器(26)适于接收待装配到所述中间板(33)的所述开口(36)中的另一包封元件(38)，从而包封所述样品(1)，其中所述枢转臂(24)在装载位置和插入位置之间可枢转，在所述装载位置中，所述另一包封元件(38)可插入所述枢转臂(24)的所述容器(26)中，在所述插入位置中，插入所述枢转臂(24)的所述容器(26)中的所述另一包封元件(38)可放置在于所述处理位置处被保持在位的所述中间板(33)的所述开口(36)中，并且其中所述方法包括将从所述培养室(100、200)拆卸的所述中间板(33)在所述处理位置处保持在位，并使用所述装置(10)的所述枢转臂(24)插入所述另一包封元件(38)。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其中使用根据权利要求1至6中任一项所述的装置(10)、根据权利要求7所述的培养室(100、200)、根据权利要求8所述的中间板(33)和/或根据权利要求9所述的布置。

13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中提供所述样品(1)包括将活体物质暴露于在所述培养室(100、200)中提供的限定的环境条件。

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