CN114216751A - 用于高压冷冻的样品的制备 - Google Patents

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CN114216751A CN202111021893.4A CN202111021893A CN114216751A CN 114216751 A CN114216751 A CN 114216751A CN 202111021893 A CN202111021893 A CN 202111021893A CN 114216751 A CN114216751 A CN 114216751A
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Abstract

提供一种包括用于制备用于高压冷冻过程的显微镜样品(1)的程序的一个或更多个步骤的方法，其中样品(1)是用包括高压冷冻盒(30)的中间板(33)和培养室(100)的布置提供的，其中中间板(33)通过粘合剂附接到培养室(100)的底部(120)的下表面，并通过实现中间板(33)和培养室(100)之间的相对移动而从培养室(100)可拆卸，其中样品(1)提供在装配到中间板(33)的开口(36)中的包封元件(37)上，其中，当样品(1)要经受高压冷冻过程时，实现中间板(33)和培养室(100)之间的相对移动，从而将带有样品(1)的中间板(33)从培养室(100)拆卸。用于实施该方法的手段也是本发明的一部分。

Description

用于高压冷冻的样品的制备
技术领域
本发明涉及一种用于制备用于高压冷冻过程的显微镜样品的方法以及实施相应方法的手段。
背景技术
在光学显微镜成像期间，活细胞应保持在有利的环境条件下。阶段培养箱、阶段加热器、二氧化碳室等是用于此目的的常用工具。
有几种用于在可用的光学显微镜检查期间调节样品周围的气体气氛的阶段培养箱和室。DE 20 2016 007 488 U1中公开了特定类型的培养室的操作原理，其提供了在不同位置之间转移样品同时仍维持环境条件的选项。
在下面的图1中，在纵向剖面中示出了这种类型的培养室的组件。本发明不限于与任何特定类型的培养室一起使用，并且提供图1仅作说明之用。
为了组装图1所示的培养室900，打开的硅胶圆筒110安装到形成培养室的底部120的玻璃板。圆筒110由玻璃盖130封闭，玻璃盖130可以另外用金属环140固定。然后，整个组件由金属罩150覆盖，金属罩150例如由铝制成，包含玻璃窗160。样品所暴露在的气体经由连接到气体供应手段的馈通孔170或端口被引入罩150中。从那里，气体通过扩散经过硅胶圆筒110而维持室内的气氛。如图1所示，培养室900可以用于在液体介质2中培养样品1，例如一层细胞。
通常希望尽可能迅速地(即在检测到生理事件时)捕捉在光学显微镜中(特别是在刚才提到的培养室中)观察到的细胞状态，以保存它们用于电子显微镜研究。在这方面，高压冷冻是样品固定的合适工具，下面将进行更详细地解释。然而，对于这种方法，样品必须装在用于高压冷冻装置的合适的样品保持手段或载体构造(通常被称为“盒”)中。转移到这些盒中是复杂和耗时的，特别是当样品先前被装在提到的培养室中时。这是现有技术的方法和布置中快速固定细胞状态的主要障碍。
本发明的目的是针对高压冷冻保持在培养室中的限定环境条件下的样品，提供一种先进的解决方案。
发明内容
在此背景下，本发明提出了根据独立权利要求的一种用于制备用于高压冷冻过程的显微镜样品的方法以及实施相应方法的手段。优选的实施方式是从属权利要求和以下描述的主题。
在此，如果提及“用于制备”用于高压冷冻过程的显微镜样品的方法，则旨在指作为一个整体制备用于高压冷冻过程的样品的一系列步骤中的一个或更多个步骤。在这方面，术语“样品制备”旨在还包括样品的培养，特别是在限定的气氛中。该方法不一定包括涉及的所有方法步骤，因为每个步骤均在某种程度上“制备”用于高压冷冻过程的样品。提及装置时这同样适用。
在谈及本发明的特征和具体优势之前，先展现与高压冷冻有关的一些进一步的细节以及将样品从培养室转移到高压冷冻装置中的方法的问题，以便理解本发明的基础。
水是最丰富的细胞成分，因此对保存生物样品的细胞超微结构很重要。目前，固定细胞成分而又不引入重大结构改变的唯一方法是低温固定。目前有两种常用的方法：骤降式冷冻和高压冷冻。本发明涉及到高压冷冻。
一般来说，低温固定比化学固定有两个明显的优势。它可以在几毫秒内实现，并确保同时固定所有大分子成分。许多蛋白质网络是非常脆弱的，在最轻微的渗透或温度变化下就会解体，而在低温固定期间，这些不必要的影响被降到最低。这些技术使生物样品的研究具有改善的超微结构保存，并能够促进对动态过程的研究。目前，使较厚的样品(达200微米)玻璃化的唯一方法是通过高压冷冻。
成功的低温固定(玻璃化)应该导致水从液体转变为无定形的固体状态，而不会诱发冰晶的成核。冰晶的成核取决于温度和压力。结晶也取决于冷却率，因为冷冻是与时间有关的过程。冷却速率取决于水的热性能、样品厚度和试样表面的热提取流量。因此，高压冷冻在高压下并且以高流量的制冷剂(特别是液氮)进行。
对于高压冷冻，换句话说，生物样品在高压下与低温温度下提供的制冷剂接触。
由于用于高压冷冻的生物或其他水溶液制剂的厚度通常或一般不应超过200微米，因此样品的厚度必须受到限制。此外，样品必须被保护以免受冷却介质的流动影响。为此，由金属样品载体或蓝宝石板或其他合适的材料构成的覆盖元件被放置在与携带样品的样品载体有一定距离的地方，携带样品的载体可以是例如蓝宝石板。目前，载体、中间环和覆盖环是用镊子操纵的。
用于生物和工业样品的高压冷冻的装置由Leica Microsystems以“EM ICE”、“EMHPM100”和“EM PACT”的名称销售。例如，A.Kaech和U.Ziegler，“高压冷冻：目前的状态和未来的前景”，2014年，卷号1117，DOI 10.1007/978-1-62703-776-1_8,第151至171页，JohnKuo(编辑)的第八章，电子显微镜学：方法和协议，分子生物学中的方法，描述了此类装置。
利用这些装置，就可以在几毫秒内用液氮在高达2,100(两千一百)巴的压力下将样品冷却到低温温度，特别是低于-100℃的温度。在这些装置中，如前所述，在高压冷冻期间使用样品盒来保持样品。样品盒可以由例如高强度塑料制成，并可包括三个部分，即两个半圆筒以及样品保持布置，两个半圆筒具有适于由高压冷冻装置供应制冷剂流的通道，样品保持布置通常被称为“中间板”，具有开口以用于保持样品，中间板夹在半圆筒之间。如前所提到的，本发明并不限于特定类型的样品盒，只要与本发明提出的解决方案兼容即可。
在中间板中，样品本身在中间板的开口内被包封在两个足够薄的且因此是导热材料(如蓝宝石、铝或铜)的盘之间，其中盘本身包括凹部以接收样品，或由间隔件环分开以形成用于样品的保持器。样品位置处的压力是由制冷剂产生的，为此目的，制冷剂被加压至例如2,100巴。这方面的更多细节将参照下面的图来解释。如果下文提到了“中间板”，这旨在指大体上平坦的元件或元件的布置，其适于提供接收待玻璃化的样品的空间。特别地，在组装状态下，中间板至少由大体上平坦的结构组成，该结构具有开口，在开口中可以布置适当的盘来形成样品空间。这些盘可以由各种材料形成而且不需要是透明的。术语“中间板”在所使用的任何情况下都可以用“载体元件”代替。
用于维持生理上有利的环境条件的培养室在一开始就已经描述过了，其被设计为用于载玻片或盖玻片以作为标准样品载体。因此，对盛装在这种培养室中的样品的高压冷冻必须包括将样品转移到高压冷冻盒的中间板。这显然与样品暴露在的培养室中的环境条件的干扰有关，并可能产生不必要的生理反应。此外，这样的步骤是耗时的，因此可能导致不必要的时间滞后，这使得快速生理变化的观察成为不可能。
因此，本发明的一个方面涉及一种有利的解决方案，其中高压冷冻盒的中间板在打开状态下安装在上述类型的培养室的底部处。中间板的“打开状态”应理解为这样一种状态：上面提到的一个盘(下文称为“包封元件”)安装在中间板的开口内，而另一个盘尚未安装在那里。因此，可以从培养室取出放在已经安装好的盘上的样品，并在安装了另一个盘以关闭和密封样品空间后，直接和快速地将样品与高压冷冻盒的其他部分一起转移到高压冷冻装置。
本发明的另一方面涉及将安装在培养室的底部处的中间板从培养室移除的步骤。在未按本发明设计的布置中，这样的分离和转移需要许多手工步骤，手工步骤相应地耗时。本发明通过简单的移动将中间板和样品一起从培养室分离而解决了这个问题，其中中间板被临时保持结构保持固定。一旦拆卸，中间板就可以位于紧邻高压冷冻装置的装载区的位置，或者甚至位于其专用装载站。
本发明的特征和优势
根据本发明，提出了一种用于制备用于高压冷冻过程的显微镜样品的方法。根据本发明提供的方法，除了下面进一步描述的步骤外，还可以包括高压冷冻装置的使用，高压冷冻装置适于进行高压冷冻的进一步步骤的全部或至少部分，因此也可以包括所谓的“装载站”的使用，装载站适于组装高压冷冻盒(例如，如下图2和3所示)，并将该盒插入空间或室中，其中高压制冷剂经过该盒。因此，该方法还可以包括用于提供高压制冷剂并使其通过室的手段的使用。因此，该方法可以包括根据现有技术或专家文献(如Kaech和Ziegler(见上文))的用于高压冷冻过程的全部步骤或其子集。然而，根据本发明提供的方法也可以在不使用高压冷冻装置的情况下进行，也就是说，它可以只包含样品制备的步骤(包括在明确限定的条件下的培养)以及将中间板上的样品从培养室拆卸的步骤(如下文所述)。
根据本发明，样品是通过使用一种布置提供的，该布置包括高压冷冻盒的中间板和培养室，其中中间板附接到培养室的底部的下表面。因此，根据本发明，不再需要费力地将样品转移到高压冷冻盒的中间板，而在使用根据现有技术的设置时，这是必要的。这大大减少了对样品在培养室中所暴露的环境条件的干扰，并减少或避免了不必要的生理反应。根据本发明，由于样品可以已经提供在相应的中间板上或在相应的中间板中，因此培养和高压冷冻之间的时间滞后也减少了，从而也可以观察到快速生理变化的特定点。
根据本发明，附接是通过粘合剂实现的，并且通过实现中间板和培养室之间的相对移动，中间板从培养室可拆卸，如将在下面进一步详细描述。通过简单移动实现的根据本发明的这种拆卸(其中，中间板被在下文中称为“接合结构”的保持结构保持固定)减少了分离培养室和中间板的时间和精力，从而使中间板可以特别迅速地转移到高压冷冻装置。一旦拆卸，中间板就可以位于紧邻高压冷冻装置的装载区的位置，或者甚至位于其专用装载站，或者该拆卸可以在紧邻高压冷冻装置定位或者作为高压冷冻装置的一部分的结构或设备部件中实现。
如前所述，在本发明的背景下，高压冷冻盒的中间板在打开状态下安装在上述类型的培养室的底部。也就是说，样品被提供在装配到中间板的开口中的包封元件上。因此，制备用于组装高压冷冻盒的中间板基本上只需要插入另一包封元件，以密封样品，从而将操纵步骤降至最少。
一般来说，根据本发明，可以使用任何合适的粘合剂，包括蜡、聚合物等或包括这些粘合剂的材料。因此，术语“粘合剂”被广义地理解为指任何类型的物质或物质的任何混合物，它们在两个固体元件之间提供粘合剂的效果。特别优选的是，粘合剂表现出低的氧气渗透率或氧气透过率。根据本发明，用于将中间板附接到培养室的底部下表面的粘合剂优选地包括如由氧气透过率分析仪确定的小于2或1g·m-1·sec-1·Pa-1×10-14的氧气渗透率。也就是说，粘合剂的氧气渗透率通常可以在蜡(如蜡烛蜡、棕榈蜡和微晶蜡)的范围内。
氧气渗透率的确定可以例如通过形成粘合剂的独立膜并使用Donhowe,G.和Fennema,O，“蜡膜的水蒸气和氧气渗透率”，J Am Oil Chem Soc 70,867-873(1993)中公开的方法进行。也就是说，粘合剂膜的氧气渗透率可以用氧气透过率分析仪来确定，如Ox-tran 100(Modern Controls,Inc.,Minneapolis)或后续型号，特别是包括量热传感器。例如，可以使用包括1％的氢气和99％的氮气的载气以及测试气体，测试气体是氧气或空气(20.95％的氧气)。校准系数可以在25、30、35和40℃时用诸如标准聚酯膜的标准膜来确定。可以使用不锈钢框架来减少可用于氧气透过的面积。在于测量的最低温度下达到稳态气体通量后，测试单元的温度可以增加到下一个更高的温度。可以在25、30、35和40℃的温度下，均在相对湿度为0％的情况下，确定氧气透过率。氧气渗透率可以计算并表示为g·m-1·sec-1·Pa-1。可以确定重复的数量。然而，也可以使用文献中已知的其他方法，并且还可以简单地确定室内部的氧气的分压，以表明氧气透过是否足够低。
在具体的示例中，可以使用石蜡、天然蜡、环氧树脂胶、甲基丙烯酸酯胶和胶带中的至少一种，尤其是包括任何所述物质，作为粘合剂。借助粘合剂将中间板附接到培养室的底部的下表面。例如，在这方面可以使用所谓的牙科蜡。
在根据本发明的方法中，中间板和培养室之间的所述相对移动可以特别通过使用一种装置来实现，该装置包括接合结构，接合结构适于与中间板接合，并在培养室被移动时限制中间板的移动，从而实现中间板和培养室之间的所述相对移动，并由此将中间板从培养室拆卸。特别地，接合结构可以提供成使得附接有中间板的培养室可以用手定位，从而整个中间板或其结构至少部分地插入接合结构中或与接合结构接触。通过培养室的简单移动，优选地也用手来实现，中间板可以从培养室拆卸，同时保持至少部分地插入接合结构中或与接合结构接触。
根据本发明的特别优选的实施方式，通过实现呈以下移动中的至少一种的形式的所述移动，中间板从培养室可拆卸：培养室在对应于培养室的底部的下表面的平面中的线性和/或旋转移动；培养室绕平行于培养室的底部的下表面的轴线的倾斜移动；以及培养室在与培养室的底部的下表面成角度的方向上的提升移动。接合结构特别适于与中间板接合，以限制线性、旋转、倾斜和提升移动中的所述至少一种。
为了限制线性移动，可以提供简单的止挡件或栅栏作为接合结构，使得当中间板附接到培养室的底部表面并从其突出时，当培养室被推到止挡件或栅栏上并停留在由止挡件或栅栏限度的位置处时，中间板可以被阻止移动。在这样的构造中，用于将中间板附接到培养室的手段设计成提供附接力，附接力可以被例如用手实现的相应推力克服。
为了限制旋转移动，可以提供凹部或至少两个栅栏作为接合结构，附接到培养室的底部表面并从其突出的中间板装配到接合结构中或装配到其间。旋转培养室，由此将附接到培养室的底部表面的中间板从培养室拆卸。同样，在这方面，用于将中间板附接到培养室的手段设计成提供附接力，附接力可以被例如用手实现的相应旋转力克服。
在这种情况下，可以提供一个或更多个(特别是两个)突起(尤其是以榫或销的形式)作为接合结构，作为额外的接合结构或作为接合结构之外的对准结构。一个或更多个突起可以设置在中间板处，并且至少一个匹配凹部可以设置在其对应部件处，培养室与该对应部件接触以拆卸中间板，或者一个或更多个突起可以设置在对应部件处，而至少一个匹配凹部可以设置在中间板处。
为了限制倾斜移动，接合结构可以被设置为具有下切口的结构，设置在中间板处的相应突起可以插入下切口中，使得当在维持中间板的突起插入在下切口中的同时将培养室倾斜时，下切口的悬突部以类似于起盖器或开瓶器的方式将中间板从培养室“拉脱”。可以通过用手将带有中间板的培养室按入下切口的方向来维持中间板的突起插入在下切口中，或通过提供限制从下切口中移出的止挡件来维持中间板的突起插入在下切口中。另外，在此，在这方面，选择用于将中间板附接到培养室的粘合剂，以提供附接力，附接力可以被例如用手实现的相应倾斜力克服。
可以通过提供一组平行的带有下切口的引导元件(例如，以燕尾形引导件的形式)来限制提升移动，这些引导元件适于在插入方向上滑动地接收提供在中间板处的互补结构。当在与插入方向成角度的方向上提升培养室时，并且当在这里也选择合适的附接力时，中间板可以因此被从培养室拆卸。
应该理解的是，在本发明中，在全部实施方式中，移动或移动轨迹不一定限于线性、旋转、倾斜和提升移动中的任何一种，而是例如旋转移动或线性移动之后可以跟随提升移动，等等。
一般来说，在全部实施方式中，当附接到培养室的底部时，中间板可以从培养室的底部突出。接合结构可以被提供为凹部，其形状与中间板的形状的至少一部分互补，并适于接收从培养室的底部突出的中间板的至少一部分。在这方面，术语“凹部”应作广义的理解，可以是平坦表面上的凹部、围栏结构之间的凹部或止挡件前面的凹部、导轨的下切口或不同结构等。
在根据本发明的方法中，提供样品可以包括将活体物质暴露于在培养室中提供的限定的环境条件，如针对此类培养室一般已知的。
一种用于培养待经受高压冷冻的显微镜样品的布置也是本发明的一部分。该布置包括培养室和高压冷冻盒的中间板，中间板通过粘合剂附接到培养室的底部的下表面，并通过实现中间板和培养室之间的相对移动而从培养室可拆卸，并且培养室的底部包括开口，用于提供通向中间板的开口的流体通路。
另外，一种适于在包括培养室和包括高压冷冻盒的中间板的布置中使用的培养室是本发明的一部分。根据本发明，培养室适于通过粘合剂将中间板附接到培养室，特别是通过提供与粘合剂兼容的平坦表面，使得通过实现中间板和培养室之间的相对移动，中间板从培养室可拆卸，并且培养室的底部包括开口，用于提供通向中间板的开口的流体通路。
根据本发明提供的高压冷冻盒的中间板适于在包括培养室并包括中间板的布置中使用。中间板适于通过粘合剂附接到培养室，特别是通过设置有与粘合剂兼容的表面，使得通过实现中间板和培养室之间的相对移动，中间板从培养室可拆卸。
在优选的实施方式中，根据本发明的中间板包括至少在中间板的一个边缘处的至少一个突起，至少一个突起适于与包括至少一个下切口的接合结构接合，并被提供在适于用于实现中间板和培养室之间的相对移动的装置中。
一种用于制备用于高压冷冻过程的显微镜样品的装置(特别是以所述方法)也是本发明的一部分。在这个过程中，使用包括高压冷冻盒的中间板和培养室的布置来提供样品，其中中间板通过粘合剂附接到培养室的底部的下表面，并通过实现中间板和培养室之间的相对移动而从培养室可拆卸，其中样品提供在装配到中间板的开口中的包封元件上。当样品要经受高压冷冻过程时，实现中间板和培养室之间的相对移动，从而将带有样品的中间板从培养室拆卸。该装置包括接合结构，接合结构适于与中间板接合并在培养室被移动时限制中间板的移动。
至于根据本发明提供的布置、培养室、中间板和装置的进一步特征和优势，请参考与所提供的方法及其实施方式有关的解释。
将结合附图描述本发明的其他特征，附图中与现有技术对比地描述了本发明的实施方式。需要注意的是，与关于附图描述的以及上文描述的实施方式的具体特征可以在不离开本发明范围的情况下以任何组合和/或单独的方式使用。
附图说明
图1以简化的剖视图示出了不构成本发明的一部分的用于培养样品的培养室。
图2以简化的分解图示出了可以与本发明一起使用的高压冷冻盒。
图3以简化的剖视图示出了可以与本发明一起使用的高压冷冻盒的中间板。
图4以简化的剖视图示出了根据本发明的实施方式的用于培养样品的培养室。
图5A和图5B示出了根据本发明的实施方式的通过倾斜将中间板从培养室拆卸的步骤。
图6A和图6B示出了根据本发明的实施方式的通过提升将中间板从培养室拆卸的步骤。
在图中，类似元件用相同的附图标记标示。仅为了简洁起见，省略了其重复说明。
具体实施方式
图1以简化的剖视图示出了不构成本发明的一部分的用于培养样品的培养室900，并且在一开始就已经说明了。请参考上面的说明。同样需要指出的是，本发明并不意图被这里所示的培养室的具体类型所限制。
图2以分解图示出了高压冷冻盒30，即样品保持手段，其可以与本发明一起使用。盒30可以用于上文提到的本领域已知的高压冷冻装置。例如，参考上文引用的LeicaMicrosystems的“EM ICE”、“EM HPM100”和“EM PACT”系统的文献(例如参考DE 10 2013003 164 A1，其进一步描述了高压冷冻系统的细节)以及科学评论文献，例如Kaech&Ziegler(见上文)。在组装状态下，盒30可以通过使用已知的保持器被转移到高压冷冻装置中。诸如盒30之类的盒的处理在其他地方有广泛的描述，为了简洁起见，这里不做解释。
盒30包括两个保持元件31、32，每个保持元件基本上均是半圆筒形形状。中间板33布置在盒30的保持元件31、32之间。保持元件31、32之间设置有制冷剂通道34，制冷剂通道34由保持元件31、32的内部平坦表面上的沿纵向方向的槽形成。经由制冷剂通道34，低温制冷剂可以基本上沿着盒30的纵向轴线并且在图2所示的虚线箭头35的方向上被传送到接收或盛装在中间板33中形成样品空间的开口36中的样品。
图3在沿竖直平面的纵向剖面中示出了在图2所示的盒30中使用的中间板33，从而开口36(如根据图1所示)中形成的样品空间被切开。开口36是圆形的，并且布置在中间板33的中心或靠近中心的地方，样品1被保持在两个包封盘之间，两个包封盘包括第一(底部)盘37和第二(顶部)盘38，例如，呈由蓝宝石、金属或其他合适的材料制成的盘的形式的圆形包封元件37、38。包封元件37、38固定在开口36中，它们的距离通过固定手段、密封手段和/或间隔手段39来调整。包封元件37、38本身也可以包括一个或更多个凹部，当包封元件插入开口36中时，样品1可以被接收在凹部中，从而减少或消除了对固定手段、密封手段和/或间隔手段39的需要。由于冷却所需的制冷剂的快速流动会带走样品，因此包封元件37、38也用于保护样品1。
在提到的现有技术中，描述了盒30及其中间板33的进一步细节和变体。同样，应该理解的是，本发明并不限于盒30和中间板33的具体构造。整个盒30的尺寸设计成使得可以建立高压冷冻所需的高压(例如超过2,000巴)，并且在优选200至500毫秒的时段内被维持，从而在这个时间间隔内实现样品1的快速冷冻。
图4以简化的剖视图示出了根据本发明的实施方式的用于培养样品的培养室。
图4所示的培养室100的元件与图1所示的培养室900略有不同地设计，但同样也可以以相同的方式设计。本发明不以培养室900的特定部分是否存在为特征或受其限制。图4所示的培养室100的元件用与图1所示的培养室900相同的附图标记标示。
在这里，同样地，为了组装图4所示的培养室100，打开的硅胶圆筒110安装到形成培养室的底部120的玻璃板。圆筒110也由玻璃盖130封闭。在培养室100中，整个组件由固定玻璃盖130的金属罩150覆盖，没有提供单独的玻璃窗160。可以提供样品1所暴露在的气体，并且可以用任何可想象的方式维持气体气氛。
中间板33(例如，如前面结合图2和图3所解释的)通过使用由于通用性的原因而没有具体示出的粘合剂附接到培养室100的底部120的下表面，并且中间板33通过实现培养室100的移动而从培养室100可拆卸，如前面针对不同的实施方式所详细描述的。如所示，中间板33以打开的状态提供，即只插入了下部的包封元件37，而样品1被提供在下部的包封元件上。培养室100的底部120包括开口180，用于提供通向中间板33的开口36的流体通路。
图5A和图5B示出了根据本发明的实施方式的通过倾斜将中间板从培养室拆卸的步骤。培养室基本上如图4所示的实施方式所描述的那样实施，因此被标示为100。
一般来说，由于中间板33在附接到培养室100的底部120时从培养室100的底部120突出，接合结构11可以提供为凹部，其形状与中间板的形状的至少一部分互补，该凹部适于接收从培养室100的底部120突出的中间板33的至少一部分。在所示的具体实施方式中，为了限制倾斜移动，接合结构11被提供为具有下切口的结构，在中间板33处提供的相应的突起13可以插入其中，使得当在维持中间板33的突起13插入下切口中的同时倾斜培养室100(如图5A中的白色箭头所示)时，下切口的悬突部分会将中间板33“拉脱”。
图6A和6B示出了根据本发明的实施方式的通过提升将中间板从培养室拆卸的步骤。在这里，同样地，培养室基本上如图4所示的实施方式所描述的那样实施，因此被标示为100。
在这里，同样地，一般来说，由于中间板33在附接到培养室100的底部120时从培养室100的底部120突出，接合结构11可以提供为凹部，其形状与中间板的形状的至少一部分互补，该凹部适于接收从培养室100的底部120突出的中间板33的至少一部分。
通过提供一组平行的具有下切口的引导元件作为接合结构11，例如以燕尾形引导件的形式，可以具体限制提升移动，该引导元件适于在插入方向上滑动地接收以突起13的形式提供在中间板处的互补结构。在图6A和6B的图示中，该插入方向与纸张平面正交。当在与插入方向成角度的方向上提升培养室100时，如根据图6A用白色箭头标示的，可以从培养室100拆卸中间板33。
在图5A至图6B中，根据本发明提供的装置以局部视图示出，并标示为10。如先前所提到的，装置10也可以是高压冷冻装置，适于进行高压冷冻的另外步骤的全部或至少部分，或者装置10可以是与高压冷冻装置分开的专用装置，即单独的结构单元。根据图5A至图6B的装置10包括接合结构11。装置10的表面标示为12。

Claims (13)

1.一种用于制备用于高压冷冻过程的显微镜样品(1)的方法，其中所述样品(1)是使用包括高压冷冻盒(30)的中间板(33)和培养室(100)的布置提供的，其中所述中间板(33)通过粘合剂附接到所述培养室(100)的底部(120)的下表面，并通过实现所述中间板(33)和所述培养室(100)之间的相对移动而从所述培养室(100)可拆卸，其中所述样品(1)提供在装配到所述中间板(33)的开口(36)中的包封元件(37)上，其中，当所述样品(1)要经受所述高压冷冻过程时，实现所述中间板(33)和所述培养室(100)之间的所述相对移动，从而将带有所述样品(1)的所述中间板(33)从所述培养室(100)拆卸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述粘合剂包括如由氧气透过率分析仪测定的小于2g·m-1·sec-1·Pa-1×10-14的氧气渗透率。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中石蜡、天然蜡、环氧树脂胶、甲基丙烯酸酯胶和胶带中的至少一种被用作所述粘合剂，所述中间板(33)通过所述粘合剂附接到所述培养室(100)的所述底部(120)的所述下表面。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述中间板(33)和所述培养室(100)之间的所述相对移动是通过使用包括接合结构(11)的装置(10)来实现的，所述接合结构(11)适于与所述中间板(33)接合，并在所述培养室(100)被移动时限制所述中间板(33)的移动。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述中间板(33)和所述培养室(100)之间的所述相对移动是在所述中间板(33)与所述装置(10)的所述接合结构(11)接合的情况下以以下移动中的至少一种的形式实现的：所述培养室(100)在对应于所述培养室(100)的所述底部(120)的所述下表面的平面中的线性和/或旋转移动；所述培养室(100)绕平行于所述培养室(100)的所述底部(120)的所述下表面的轴线的倾斜移动；以及所述培养室(100)在与所述培养室(100)的所述底部(120)的所述下表面成角度的方向上的提升移动。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述中间板(33)平行地附接到所述培养室(100)的所述底部(120)，以从所述培养室(100)的所述底部(120)突出，并且其中所述中间板(33)完全地或部分地插入所述接合结构(11)中，而所述培养室(100)的所述底部(120)在所述中间板(33)和所述培养室(100)之间的所述相对移动被实现之前安置在所述(10)的表面(12)上。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中所述接合结构(11)被提供为与所述中间板(33)的外周形状相匹配的凹部和/或其中所述接合结构(11)被提供为包括与由所述中间板(33)的至少一个边缘提供的至少一个突起(13)相匹配的至少一个下切口的结构。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中提供所述样品(1)包括将活体物质暴露于所述培养室(100)中提供的限定的环境条件。
9.一种用于培养要经受高压冷冻的显微镜样品(1)的布置，所述布置包括培养室(100)和高压冷冻盒(30)的中间板(33)，所述中间板(33)通过粘合剂附接到所述培养室(100)的底部(120)的下表面，并通过实现所述中间板(33)和所述培养室(100)之间的相对移动而从所述培养室(100)可拆卸，并且所述培养室(100)的所述底部(120)包括开口(180)，用于提供通向所述中间板(33)的开口(36)的流体通路。
10.一种培养室(100)，适于在包括所述培养室(100)和包括高压冷冻盒(30)的中间板(33)的布置中使用，所述培养室(100)适于通过粘合剂将所述中间板(33)附接到所述培养室(100)，使得通过实现所述中间板(33)和所述培养室(100)之间的相对移动，所述中间板(33)从所述培养室(100)可拆卸，并且所述培养室(100)的所述底部(120)包括开口(180)，用于提供通向所述中间板(33)的开口(36)的流体通路。
11.一种高压冷冻盒(30)的中间板(33)，适于在包括培养室(100)并包括所述中间板(33)的布置中使用，所述中间板(33)适于通过粘合剂附接到所述培养室(100)，使得通过实现所述中间板(33)和所述培养室(100)之间的相对移动，所述中间板(33)从所述培养室(100)可拆卸。
12.根据权利要求11所述的中间板(33)，包括至少在所述中间板(33)的一个边缘处的至少一个突起(13)，所述至少一个突起(13)适于与接合结构(11)接合，所述接合结构(11)包括至少一个下切口，并被提供在适于用于实现所述中间板(33)和所述培养室(100)之间的所述相对移动的装置(10)中。
13.一种用于制备用于高压冷冻过程的显微镜样品(1)的装置(10)，其中所述样品(1)是使用包括高压冷冻盒(30)的中间板(33)和培养室(100)的布置提供的，其中所述中间板(33)通过粘合剂附接到所述培养室(100)的底部(120)的下表面，并通过实现所述中间板(33)和所述培养室(100)之间的相对移动而从所述培养室(100)可拆卸，其中，所述样品(1)被提供在装配到所述中间板(33)的开口(36)中的包封元件(37)上，其中，当所述样品要经受所述高压冷冻过程时，实现所述中间板(33)和所述培养室(100)之间的所述相对移动，从而将带有所述样品(1)的所述中间板(33)从所述培养室(100)拆卸，并且其中所述装置(10)包括接合结构(11)，所述接合结构(11)适于与所述中间板(33)接合，并在所述培养室(100)被移动时限制所述中间板(33)的移动。
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