CN114195907A - 一种低分子量螺旋藻多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于功能食品技术领域，公开了一种低分子量螺旋藻多糖及其制备方法和应用，本发明通过乙醇分级沉淀并分离纯化得到的螺旋藻多糖分子量较小，水溶性好，并明确了其精细结构，由一个新的重复单元组成。本发明所述的低分子量螺旋藻多糖能显著增强免疫，在浓度为100μg/mL时调节免疫的能力优于阳性对照LPS，并能较好抑制A549肺癌细胞增殖，其IC₅₀值为1.037mg/mL，可应用于癌症患者的辅助营养治疗食品的研制与开发。本发明首次从螺旋藻多糖中分离鉴定了一个新的不同于已有文献报道的酸性杂多糖，具有显著促进免疫功能和抑制肿瘤活性，可应用于癌症患者的辅助营养治疗食品。

Description

一种低分子量螺旋藻多糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于功能食品技术领域，更具体地，涉及一种低分子量螺旋藻多糖及其制备方法 和应用。

背景技术

天然藻类多糖的潜在免疫调节活性和抗癌活性，以及无毒安全，使其在食品，保健食品 和药物领域发挥重要作用。多糖可刺激T细胞，B细胞，自然杀伤细胞和巨噬细胞依赖性免 疫反应，可以作为癌症的辅助治疗，不仅可以增强机体对癌细胞的免疫力，还可以对放化疗 引起的免疫抑制起到很好缓解作用，是潜在的营养功能物质。

螺旋藻是一种蓝绿藻，富含60-70％蛋白质，15-20％的多糖和其他营养物质，通常作为营 养食品补充剂食用。螺旋藻还是免疫系统的滋补品，在一定程度上有抵抗癌症治疗的副作用。 螺旋藻中的多糖是一种天然活性物质，研究表明具有抗肿瘤、增强免疫、抗氧化、抗辐射、 降血糖和改善胃肠道功能等功效。申请号为201810577088.1的专利公开了一种水煎醇沉法提 取得到螺旋藻多糖提取物具有提高机体免疫器官指数及白细胞水平。螺旋藻多糖由于培养条 件，提取方法不同得到的多糖组成和结构也存在差异，从而表现出不同活性。

因此，从螺旋藻中提取新的结构和具体不同活性的多糖，有助于丰富螺旋藻多糖库，也 为开发新的功能性食品或者保健品提供理论基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述问题，首先提供一种全新结构 的低分子量螺旋藻多糖。

本发明的第二个目的是提供一种低分子量螺旋藻多糖的制备方法。

本发明的第三个目的是提供上述一种低分子量螺旋藻多糖的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种低分子量螺旋藻多糖，由以下重复单元组成：

所述螺旋藻多糖分子量为63.92kDa，由鼠李糖，葡萄糖，半乳糖和葡萄糖醛酸组成，其 摩尔比分别为：63:15:8:7。具有的重复单元主链结构为[→2)-α-D-Rhap-(1→]₂-[→2,3)-α-D-Rhap-(1 →]₂-[→4)-β-D-Glcp-(1→]₂-[→3)-β-D-Rhap-(1→]₆，侧链为→4)-α-D-GlcAp-(1→和→4)-β-D-Galp-(1→以 (1→3)链接于→2,3)-α-D-Rhap-(1→上。

优选的，本发明所述螺旋藻多糖的原料来源于海水养殖的钝顶螺旋藻。

本发明还提供一种低分子量螺旋藻多糖的制备方法，包括以下步骤：

(1)细胞破碎：取螺旋藻粉，随后反复冻融3次使细胞破碎得到螺旋藻悬液；

(2)热水浸提：将步骤(1)经过细胞破碎的螺旋藻悬液用热水提取，离心取上清液；

(3)分级醇沉：将步骤(2)所得上清液减压浓缩；

加入无水乙醇至体系乙醇度为30％，4℃过夜，离心后取第一次醇沉上清；

第一次醇沉上清液再加入无水乙醇至体系乙醇度为60％，4℃过夜，离心后取第二次醇 沉上清；

第二次醇沉上清液再加入无水乙醇至体系乙醇度为90％，4℃过夜，离心后取沉淀即为 螺旋藻多糖沉淀；

(4)纯化：将步骤(3)所得多糖沉淀经过脱蛋白、超滤，浓缩冻干、离子交换柱纯化、透析脱盐后冻干得到低分子量螺旋藻多糖。

优选的，所述的低分子量螺旋藻多糖的制备方法，步骤(2)热水提取的温度为85-95℃， 提取时间为2-4h。

优选的，所述的低分子量螺旋藻多糖的制备方法，步骤(4)具体为：多糖沉淀用蒸馏水 复溶，Sevege法脱蛋白，浓缩蒸发有机溶剂，再用3kDa超滤膜超滤24h后，浓缩冻干得到 螺旋藻多糖，将冻干所得多糖用阴离子交换柱分离纯化，以NaCl水溶液为流动相进行洗脱， 流速为1.0mL/min，透析脱盐，冻干即得低分子量螺旋藻多糖。

优选的，所述的低分子量螺旋藻多糖的制备方法，步骤(1)细胞破碎加入的蒸馏水体积 为螺旋藻粉质量的20-30倍。

优选的，所述的低分子量螺旋藻多糖的制备方法，步骤(4)用2-3倍体积蒸馏水复溶多 糖粗品，Sevege法脱蛋白次数为2-4次，阴离子交换柱分离纯化以0.3mol/LNaCl水溶液洗脱， 用500-1000Da透析袋脱盐48h。

本发明所述的低分子量螺旋藻多糖在25-100μg/mL浓度范围内能显著促进RAW264.7巨 噬细胞的增殖，提高其吞噬能力，并促进NO，IL-6，IL-1β和TNF-α免疫因子的分泌，特别 在浓度为100μg/mL时优于阳性对照LPS。

因此，本发明还提供上述的低分子量螺旋藻多糖促进免疫因子的分泌的应用，所述免疫 因子为NO，IL-6，IL-1β和TNF-α。

本发明所述的低分子量螺旋藻多糖表现出较好的抑制A549肺癌细胞增殖，半数抑制浓 度为1.037mg/mL。

因此，本发明还提供所述的低分子量螺旋藻多糖在制备抑制肺癌细胞增殖的功能产品中 的应用。

具体的，上述功能产品包括但不限于保健食品、药品、功能食品等。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过乙醇分级沉淀并分离纯化得到的螺旋藻多糖分子量较小，水溶性好，并明确 了其精细结构，由一个新的重复单元组成。本发明所述的低分子量螺旋藻多糖能显著增强免 疫，在浓度为100μg/mL时调节免疫的能力优于阳性对照LPS，并能较好抑制A549肺癌细胞 增殖，其IC₅₀值为1.037mg/mL，可应用于癌症患者的辅助营养治疗食品的研制与开发。

首次从螺旋藻多糖中分离鉴定了一个新的不同于已有文献报道的酸性杂多糖，具有显著 促进免疫功能和抑制肿瘤活性，可应用于癌症患者的辅助营养治疗食品。

附图说明

图1为低分子量螺旋藻多糖SP901的DEAE-cellulose-52谱图；

图2为低分子量螺旋藻多糖SP901的HPSEC分离谱图及分子量；

图3为低分子量螺旋藻多糖SP901的红外光谱图；

图4为低分子量螺旋藻多糖SP901的1H-NMR图；

图5为低分子量螺旋藻多糖SP901的13C-NMR图；

图6为低分子量螺旋藻多糖SP901的HSQC图；

图7为低分子量螺旋藻多糖SP901的COSY图；

图8为低分子量螺旋藻多糖SP901的HMBC图；

图9为低分子量螺旋藻多糖SP901的主链结构图；

图10显示低分子量螺旋藻多糖SP901调节RAW264.7巨噬细胞活性；

图11显示低分子量螺旋藻多糖SP901抑制A549肺癌细胞活性。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的 说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实 施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例以及实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材 料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料；所用的设备，如无特殊说 明，均为常规实验设备。

实施例1

本发明所述的低分子量螺旋藻多糖的制备分离纯化包括细胞破碎，热水提取，乙醇分级 沉淀，阴离子层析分离纯化。

具体步骤包括：

(1)细胞破碎：采用反复冻融的方法，取螺旋藻粉，加入30倍体积蒸馏水，搅拌冷冻， 随后反复冻融3次使细胞破碎。

(2)热水浸提：将步骤(1)细胞破碎的螺旋藻悬液用90℃热水提取2h，3000r/min离心10min取上清液。

(3)分级醇沉：将步骤(2)所得上清液减压浓缩至原来体积的五分之一，加入无水乙 醇至体系乙醇度为30％，4℃过夜，3500r/min离心10min取第一次醇沉上清。上清液再加入 无水乙醇至体系乙醇度为60％，4℃过夜，3500r/min离心10min取第二次醇沉上清。上清液 再加入无水乙醇至体系乙醇度为90％，4℃过夜，3500r/min离心10min后取沉淀即为螺旋藻 多糖。

(4)纯化：将步骤(3)所得螺旋藻多糖沉淀用2倍体积蒸馏水复溶，Savage法脱蛋白3次，浓缩蒸发有机溶剂，再用3kDa超滤膜超滤24h后，浓缩冻干得到螺旋藻多糖，将所得 多糖用阴离子交换柱分离纯化，以0-0.5mol/L NaCl水溶液为流动相进行洗脱，流速为1.0mL/min，收集0.3mol/L NaCl水溶液洗脱峰，500-1000Da透析袋透析脱盐，冻干即得低分子量螺旋藻多糖SP901，得率为21.5％。

实施例2

本发明所述的低分子量螺旋藻多糖的精细结构分析：

螺旋藻多糖粗品经DEAE-cellulose-52离子交换层析柱分离后获得一个主要的酸性多糖 S901(图1)，经高效凝胶柱层析HPSEC-RI表明螺旋藻多糖为单一峰，分子量为63.92kDa (图2)。

红外光谱图显示低分子量螺旋藻多糖具有典型的多糖吸收峰，在3273和2929cm^-1的吸 收峰分别为-OH和-CH的伸缩振动，1000到1200cm^-1之间的吸收归因于吡喃糖环中C-O-C 糖苷键的伸缩振动，912.33cm^-1处的峰表明SP901中存在β型糖苷键。此外，1731cm^-1处的吸收峰归因于C＝O伸缩振动，1633.71cm^-1和1417.68cm^-1处的吸收峰归因于羧基的不对 称和对称C＝O伸缩振动,表明SP901中存在糖醛酸(图3)。

通过HPAEC单糖分析该低分子量螺旋藻多糖为杂多糖，主要由鼠李糖，葡萄糖，半乳 糖和葡萄糖醛酸组成，其摩尔比分别为：63:15:8:7，还含有少量的岩藻糖和木糖。

根据甲基化反应结果分析，SP901的甲基化糖醇乙酸酯比例见表1，根据甲基化糖的摩尔 比，SP901的主链由1,3-Rhap、1,2,3-Rhap、1,2-Rhap、1,4-Glcp、1,4-GlcpA、1,4-Galp，末端 单元由Fusp-(1→和Xylp-(1→)组成(表1)，存在于侧链中，这与上述单糖组成非常一致。

表1单糖的糖苷键链接方式

根据1D-NMR(¹H-NMR,¹³C-NMR)和2D-NMR(HSQC,COSY和HMBC)结果(图4 到图9)可知，SP901具有的重复单元主链结构为[→2)-α-D-Rhap-(1→]₂-[→2,3)-α-D-Rhap-(1 →]₂-[→4)-β-D-Glcp-(1→]₂-[→3)-β-D-Rhap-(1→]₆，侧链为→4)-α-D-GlcAp-(1→和 →4)-β-D-Galp-(1→以(1→3)链接于→2,3)-α-D-Rhap-(1→上。

实施例3

低分子量螺旋藻多糖SP901的细胞免疫活性研究：

RAW264.7细胞培养于含有10％FBS、1％青霉素(10000U/mL)和链霉素(10000μg/mL)的 DMEM培养基中(v/v)，在37℃，5％CO₂孵箱中培养，收集对数期RAW264.7细胞用于免疫 活性研究。取对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔板中，每孔细胞数为2×10⁴个，培养 24h后，无菌操作下按实验分组进行干预处理。各孔均弃去上清液，空白对照组给予100μL 完全培养基(n＝5)；给药组给予SP901终质量浓度为0、12.5、25、50、100、200μg/mL的完全培养基(n＝5)干预24h后，每孔加入20μL的5mg/mL MTT溶液，置于37℃，5％CO₂细胞 培养箱中孵育4h。吸去上清液后，每孔加入100μL DMSO，室温静置20min，于酶标仪振荡 10s后于波长490nm处检测其吸光值，并根据吸光值计算出细胞存活率。另外采用中性红方 法检测RAW264.7细胞的吞噬能力，Griess法检测RAW264.7细胞释放NO的含量，ELISA 检测细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β含量。

结果显示，低分子量螺旋藻多糖SP901在12.5-200μg/mL的浓度下以剂量方式显着增加 细胞活力。而且，当SP901在25μg/mL的相对低浓度时，细胞增殖率已超过150％。此外，6.25-50μg/mL浓度的SP901处理RAW264.7巨噬细胞的吞噬活性呈剂量方式显着增强，甚至在低浓度为12.5μg/mL吞噬指数接近LPS组。活化的巨噬细胞产生一系列NO、TNF-α、IL-6 和IL-1β以激活适应性免疫反应，RAW264.7细胞中NO的释放在6.25-100μg/mL浓度下 呈剂量依赖性显着增加，与LPS组在100μg/mL浓度下无显着差异。与对照组相比，SP901 在25-100μg/mL的浓度下以剂量依赖性方式显着促进TNF-α、IL-6和IL-1β的释放。并且SP901 的TNF-α、IL-6和IL-1β含量在100μg/mL浓度下显着高于LPS组(图10)。这些结果表明 低分子量螺旋藻多糖SP901通过促进NO、TNF-α、IL-6和IL-1β的释放来增强免疫调节活 性。

实施例4

低分子量螺旋藻多糖SP901的抑制肿瘤细胞活性研究：

肺癌细胞A549细胞培养于含有10％FBS、1％青霉素(10000U/mL)和链霉素(10000μg/mL) 的RPMI-1640培养基中，在37℃，5％CO₂孵箱中培养，收集对数期A549细胞用于活性研 究。细胞消化后转移入384孔板，培养24h后，加入低分子量螺旋藻多糖(0-5mg/mL)干预24h后，采用MTT法测定细胞毒性，根据细胞存活率在570nm波长下用酶标仪检测各孔的 OD值，并计算细胞存活率，判断海藻多糖的半数抑制浓度(IC₅₀)。结果显示低分子量螺旋 藻多糖具有较好的抑制肿瘤细胞生长，半数抑制浓度为1.037mg/mL(图11)。

对比例

螺旋藻多糖的制备分离纯化包括超声辅助热水提取，乙醇分级沉淀，阴离子层析分离纯 化。

具体步骤包括：

(1)超声辅助热水浸提：螺旋藻粉加入30倍体积蒸馏水，设定超声时间为30min，超声/间隙为5s/3s，功率900W，温度90℃，超声结束后继续热水浸提1.5h。

(2)分级醇沉：将步骤(1)所得上清液减压浓缩至原来体积的五分之一，加入无水乙 醇至体系乙醇度为30％，4℃过夜，3500r/min离心10min取第一次醇沉上清。上清液再加入 无水乙醇至体系乙醇度为60％，4℃过夜，3500r/min离心10min取第二次醇沉上清。上清液 再加入无水乙醇至体系乙醇度为90％，4℃过夜，3500r/min离心10min后取沉淀即为螺旋藻 多糖。

(3)纯化：将步骤(2)所得多糖沉淀用2倍体积蒸馏水复溶，Savage法脱蛋白3次，浓缩蒸发有机溶剂，再用3kDa超滤膜超滤24h后，浓缩冻干得到螺旋藻多糖，将所得多糖 用阴离子交换柱分离纯化，以0-0.5mol/L NaCl水溶液为流动相进行洗脱，流速为1.0mL/min，收集到蒸馏水，0.1mol/L和0.3mol/L NaCl水溶液洗脱峰，500-1000Da透析袋透析脱盐，冻干得螺旋藻多糖，得率分别为12.8％，2.3％和5.7％。

(4)体外细胞活性分析：蒸馏水，0.1mol/L和0.3mol/L NaCl水溶液洗脱峰组分对肺癌 细胞A549的半数抑制IC₅₀值都大于5.0mg/mL。在12.5-200μg/mL的浓度下以剂量方式能增 加RAW264.7细胞活力，其中蒸馏水和0.3mol/L NaCl水溶液洗脱峰组分在200μg/mL浓度 下能显著促进NO的释放，与LPS组无显著性差异，而0.1mol/L NaCl水溶液洗脱峰组分没有促进NO释放活性。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领 域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、 修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种低分子量螺旋藻多糖，其特征在于，螺旋藻多糖由以下重复单元组成：

所述螺旋藻多糖分子量为63.92kDa，由鼠李糖，葡萄糖，半乳糖和葡萄糖醛酸组成，其摩尔比分别为：63:15:8:7。

2.一种低分子量螺旋藻多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)细胞破碎：取螺旋藻粉，随后反复冻融3次使细胞破碎得到螺旋藻悬液；

(2)热水浸提：将步骤(1)经过细胞破碎的螺旋藻悬液用热水提取，离心取上清液；

(3)分级醇沉：将步骤(2)所得上清液减压浓缩；

加入无水乙醇至体系乙醇度为30％，4℃过夜，离心后取第一次醇沉上清；

第一次醇沉上清液再加入无水乙醇至体系乙醇度为60％，4℃过夜，离心后取第二次醇沉上清；

第二次醇沉上清液再加入无水乙醇至体系乙醇度为90％，4℃过夜，离心后取沉淀即为螺旋藻多糖沉淀；

(4)纯化：将步骤(3)所得多糖沉淀经过脱蛋白、超滤，浓缩冻干、离子交换柱纯化、透析脱盐后冻干得到低分子量螺旋藻多糖。

3.根据权利要求2所述的低分子量螺旋藻多糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)热水提取的温度为85-95℃，提取时间为2-4h。

4.根据权利要求2所述的低分子量螺旋藻多糖的制备方法，其特征在于，步骤(4)具体为：多糖沉淀用蒸馏水复溶，Sevege法脱蛋白，浓缩蒸发有机溶剂，再用3kDa超滤膜超滤24h后，浓缩冻干得到螺旋藻多糖，将冻干所得多糖用阴离子交换柱分离纯化，以NaCl水溶液为流动相进行洗脱，流速为1.0mL/min，透析脱盐，冻干即得低分子量螺旋藻多糖。

5.根据权利要求2所述的低分子量螺旋藻多糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)细胞破碎加入的蒸馏水体积为螺旋藻粉质量的20-30倍。

6.根据权利要求4所述的低分子量螺旋藻多糖的制备方法，其特征在于，步骤(4)用2-3倍体积蒸馏水复溶多糖粗品，Sevege法脱蛋白次数为2-4次，阴离子交换柱分离纯化以0.3mol/LNaCl水溶液洗脱，用500-1000Da透析袋脱盐48h。

7.权利要求1所述的低分子量螺旋藻多糖促进免疫因子的分泌的应用，其特征在于，所述免疫因子为NO，IL-6，IL-1β和TNF-α。

8.权利要求1所述的低分子量螺旋藻多糖在制备抑制肺癌细胞增殖的功能产品中的应用。

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