CN114184792A - 冠心病标志物il-29及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种诊断冠心病的标志物。所述标志物为IL‑29和/或其受体IL‑28RA。本发明首次提出了IL‑29及其受体IL‑28RA作为冠心病检测的标志物及IL‑29拮抗剂或其功能类似物在制备治疗冠心病药物中的应用。为寻找有效诊断、预防及治疗心血管疾病的分子靶标以及揭示疾病的初始失调和潜在机制提供基础。
Description
技术领域
本发明属于冠心病技术领域，具体涉及冠心病标志物IL-29及其应用。
背景技术
动脉粥样硬化引起的心肌梗死和心源性猝死等急性心血管事件已成为全球范围内危害人类健康的头号杀手。2007年到2017年，十年间全球心脑血管疾病造成的死亡人数增加了21.1％，全球30％以上的人都死于心血管疾病，其致死率甚至超过了癌症。尽管，近年来在心血管疾病预防和治疗方面给予巨大经济投入和卫生资源配置，但是由于急性心血管事件的突发性和隐匿性，心血管疾病的患病率和死亡率仍然居高不下。传统的心血管危险因素(包括高血压，糖尿病和吸烟)的评估在心血管相关疾病预防和预后方面具有重要作用，但不足以完全预测复发事件的风险。目前的心血管疾病生物标志物是基于已知炎症和机体代谢途径而开发的。C型反应性蛋白等血清炎症分子标志物获得了越来越多的关注，但仅提供了适度增加的预测能力。有效诊断、预防及治疗心血管疾病的分子靶标仍然缺乏。因此，寻找更敏感的疾病标志物以揭示疾病的初始失调和潜在机制是当前研究急需解决的问题。
白介素-29(interleukin，IL-29)属于干扰素-λ(interferon-λ，INF-λ)家族成员，主要由成熟的树突状细胞和巨噬细胞产生。IL28RA基因编码的蛋白属于II型细胞因子受体家族，是细胞因子IL-28A，IL-28B和IL-29的共同受体，且与IL-29的亲和力最强，可与IL10Rβ形成受体复合物，再与IL-28A，IL-28B，IL-29发挥相互作用发挥抗病毒及免疫调节等的作用。已有研究表明，IL28RA在白血病、乳腺癌和肺癌等多种肿瘤组织中表达，且其表达水平在某些情况下与肿瘤预后相关。目前尚未见IL-29及其受体IL28RA在冠心病中调控的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供冠心病标志物IL-29及其应用。
一种诊断冠心病的标志物，所述标志物为IL-29和/或其受体IL-28RA。
所述标志物IL-29在冠心病患者血浆中高表达。
所述标志物IL-29在冠心病患者单个核细胞中高表达。
所述标志物IL-29在oxLDL诱导泡沫细胞形成过程中高表达。
所述标志物IL-29促进泡沫细胞的形成。
所述标志物IL-28RA在冠心病患者单个核细胞中高表达。
所述标志物IL-28RA在oxLDL诱导泡沫细胞形成过程中高表达。
所述标志物在制备冠心病诊断的试剂中的应用。
IL-29拮抗剂或其功能类似物在制备治疗冠心病药物中的应用。
本发明的有益效果：本发明首次提出了IL-29及其受体IL-28RA作为冠心病检测的标志物及IL-29拮抗剂或其功能类似物在制备治疗冠心病药物中的应用。为寻找有效诊断、预防及治疗心血管疾病的分子靶标以及揭示疾病的初始失调和潜在机制提供基础。
附图说明
图1为冠心病患者血浆中IL-29的表达水平。
图2为冠心病患者单个核细胞IL-29表达水平。
图3为IL-29在oxLDL诱导的巨噬细胞泡沫细胞的形成过程中表达水平。
图4为IL-29促进oxLDL诱导的巨噬细胞泡沫细胞的形成电镜图。
图5为冠心病患者血浆中IL-28RA表达水平。
图6为IL-28RA在oxLDL诱导的巨噬细胞泡沫细胞的形成过程中的表达水平。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
实施例1：IL-29在冠心病患者血浆中高表达
收集经冠状动脉造影或手术检查的冠心病患者，为减少潜在的混淆因素，剔除合并肝脏、肾脏、造血系统等严重原发性疾病患者；恶性肿瘤患者；合并急性感染，重度心律失常、重度肺功能不全等急性疾病患者。同时收集同年龄段的体检人群作为对照，ELISA手段检测冠心病患者及对照人群血浆中IL-29表达水平，实验操作步骤如下：
1.1血液样本血浆分离
(1)用EDTA作为抗凝剂采集冠心病患者和对照人群血液标本1.5ml，并将标本在采集30min后，4℃条件下3000rpm离心15min，取上清即可进行IL-29含量测定，或将上清分装置于-80℃保存，避免反复冻融。
1.2ELISA检测IL-29表达水平
血浆内IL-29含量采用酶联免疫吸附测定试剂盒(江莱生物，JL19276)检测，参照试剂盒说明书进行操作，步骤如下：
(1)提前60min从冰箱中取出试剂盒、样本，平衡至室温。
(2)从室温平衡60min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
(3)设置标准品孔、空白孔和样本孔，标准品孔中各加入不同浓度的标准品50ul；空白孔中加样本稀释液50ul；样本孔中加待测样本50ul。
(4)标准品孔、空白孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100ul，用封板膜封住反应孔，37℃恒温箱温育60min。
(5)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(20X洗涤液提前用蒸馏水按比例稀释成1X)350ul，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。
(6)每孔加入底物A、B各50ul，37℃避光孵育15min。
(7)每孔加入终止液50ul，15min内，在450nm波长处测定各孔OD值。
(8)绘制标准曲线，在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本孔的浓度值。
如图1所示，检测发现冠心病患者血浆中IL-29表达水平显著增高，统计学分析采用t检验(Student’s t test)计算p值，数据以平均值正负标注误的形式来表示。以上结果提示IL-29的表达水平可能作为冠心病检测的标志物。
实施例2:IL-29在冠心病患者单个核细胞中高表达
收集经冠状动脉造影或手术检查的冠心病患者，为减少潜在的混淆因素，剔除合并肝脏、肾脏、造血系统等严重原发性疾病患者；恶性肿瘤患者；合并急性感染，重度心律失常、重度肺功能不全等急性疾病患者。同时收集同年龄段的体检人群作为对照，实时荧光定量PCR方法检测冠心病患者及对照人群血液总RNA中IL-29表达水平；实验操作步骤如下：
2.1冠心病患者血液总RNA提取
使用RNAprep Pure高效血液总RNA提取试剂盒(TIANGEN，DP443)，按照试剂盒说明操作。
(1)用EDTA作为抗凝剂采集冠心病患者和对照人群血液标本1.5ml，并将标本在采集30min后，4℃条件下3000rpm离心15min，吸出上清-80℃保存备用；吸取中间层(即白膜层)转移至干净离心管中。
(2)向离心管中加入全血5倍体积的1X红细胞裂解液(提前将10X红细胞裂解液用RNase-Free ddH2O稀释至1X)，在冰上孵育15min，在孵育过程中涡旋振荡混匀2次。
(3)4℃2100rpm离心10min，将上清完全去除。
(4)向白细胞沉淀中加入全血2倍体积的1X红细胞裂解液，重悬细胞，4℃2100rpm离心10min，将上清完全去除。
(5)向白细胞沉淀中加入裂解液(使用前加入β-巯基乙醇)600ul，涡旋混匀，将溶液转移至过滤柱CS中，12000rpm离心2min，弃过滤柱，收集滤液。
(6)向滤液中加入1倍体积70％乙醇，混匀，得到的溶液转入吸附柱CR4中(吸附柱CR4放入收集管中)，12000rpm离心60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。
(7)DNase I工作液配制：取10ul DNase I储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70ul RDD溶液，轻柔混匀。
(8)向吸附柱CR4中央加入80ul的DNase I工作液，室温放置15min。
(9)向吸附柱CR4中加入350ul去蛋白液RW1H，12000rpm离心60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。
(10)向吸附柱CR4中加入500ul漂洗液RW(使用前加入乙醇)，室温静置2min，12000rpm离心60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中，重复上述步骤1次。
(11)12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CR4至于室温静置数分钟，以彻底晾干漂洗液。
(12)将吸附柱CR4转入一个新的RNase-Free离心管中，加入30-50ul RNase-FreeddH2O，室温放置2min，12000rpm离心2min，得到RNA溶液，-80℃保存。
2.2RNA逆转录
使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix逆转录反应试剂盒(Toyobo，FSQ-201)，按照试剂盒说明操作。
(1)RNA65℃预变性5min，冰浴5min。
反应体系：
(2)逆转录
反应条件：37℃15min，50℃5min，98℃5min，4℃。
2.3实时定量PCR反应
使用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(Toyobo，QPS-201)试剂盒CFX96real-time PCRsystem(Bio-rad)仪器完成。使用引物序列如下：
IL-29gene；
F:5'-AACTGGGAAGGGCTGCCACATT-3'；
R:5'-GGAAGACAGGAGAGCTGCAACT-3'；
β-actin gene；
F:5'-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3'；
R:5'-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3'。
实时定量PCR反应程序：
预变性95℃5min；PCR，40个循环：95℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸10s。
如图2所示，检测发现冠心病患者IL-29表达水平显著增高，统计学分析采用t检验(Student’s t test)计算p值，数据以平均值正负标注误的形式来表示。以上结果提示IL-29的表达水平可能作为冠心病检测的标志物。
实施例3:IL-29在oxLDL诱导泡沫细胞形成过程中高表达
泡沫细胞的形成是冠心病患者动脉粥样硬化过程早期阶段非常关键的步骤。建立巨噬细胞泡沫细胞形成的体外模型，分析IL-29对动脉粥样硬化过程中的早期关键环节的调控作用，实时定量PCR检测IL-29表达水平，统计学分析采用t检验(Student’s t test)计算p值，数据以平均值正负标注误的形式来表示。
实验方法：
(1)THP-1细胞铺入六孔板中，加20ng/mL PMA诱导48hr分化后，实验组加入oxLDL(100μg/mL)孵育24小时。
(2)收集细胞，RNA提取使用TRIzol(Invitrogen)，逆转录反应使用ReverTra Ace(Toyobo)试剂盒。实时定量PCR反应使用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(Toyobo，QPS-201)试剂盒CFX96real-time PCR system(Bio-rad)仪器完成。使用引物序列如下：
IL-29gene；
F:5'-AACTGGGAAGGGCTGCCACATT-3'；
R:5'-GGAAGACAGGAGAGCTGCAACT-3'；
β-actin gene；
F:5'-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3'；
R:5'-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3'。
实验结果表明(图3)：IL-29在oxLDL诱导的巨噬细胞泡沫细胞的形成过程中显著高表达。
实施例4：IL-29促进泡沫细胞的形成
建立巨噬细胞泡沫细胞形成的体外模型，THP-1细胞加20ng/mL PMA诱导48hr分化后，实验组加IL-29处理，对照组加PBS处理，oxLDL诱导其形成泡沫细胞。通过油红O染色检测泡沫细胞的形成情况。
实验方法：
(1)THP-1细胞铺入加了细胞爬片的12孔板中，加入不同浓度IL-29(0，100ng/mL)6小时后，加入oxLDL(20μg/ml)孵育24hr；
(2)吸弃培养基，PBS洗一次；
(3)10％中性甲醛固定10min；
(4)加入60％异丙醇(PBS稀释)稍洗一下；
(5)0.5％油红O溶液(sigma)与水3:2比例稀释静置10min后中速定性滤纸过滤；
(6)染色30min，注意避光；
(7)加入60％异丙醇稍洗；
(8)苏木素染核，自来水冲洗；
(9)取出爬片，使用甘油明胶封片后显微镜下拍照。
实验结果表明(图4)：IL-29显著促进oxLDL诱导的巨噬细胞泡沫细胞的形成。
实施例5:IL-28RA在冠心病患者单个核细胞中高表达
收集经冠状动脉造影或手术检查的冠心病患者，为减少潜在的混淆因素，剔除合并肝脏、肾脏、造血系统等严重原发性疾病患者；恶性肿瘤患者；合并急性感染，重度心律失常、重度肺功能不全等急性疾病患者。同时收集同年龄段的体检人群作为对照，实时荧光定量PCR方法检测冠心病患者及对照人群血液总RNA中IL-28RA表达水平，实验步骤如下：
同实施例2，使用引物序列如下：
IL-28RAgene；
F:5'-CAGCAAGTTCTCTAAGCCCACC-3'；
R:5'-GTCATTCACGGACTCTGGTCTG-3'；
β-actin gene；
F:5'-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3'；
R:5'-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3'。
如图5所示，检测发现冠心病患者IL-28RA表达水平显著增高，统计学分析采用t检验(Student’s t test)计算p值，数据以平均值正负标注误的形式来表示。以上结果提示IL-28RA的表达水平可能作为冠心病检测的标志物。
实施例6:IL-28RA在oxLDL诱导泡沫细胞形成过程中高表达
建立巨噬细胞泡沫细胞形成的体外模型，实时定量PCR检测IL-28RA表达水平，统计学分析采用t检验(Student’s t test)计算p值，数据以平均值正负标注误的形式来表示。
实验方法：
(1)THP-1细胞铺入六孔板中，加20ng/mL PMA诱导48hr分化后，实验组加入oxLDL(100μg/mL)孵育24小时。
(2)收集细胞，RNA提取使用TRIzol(Invitrogen)，逆转录反应使用ReverTra Ace(Toyobo)试剂盒。实时定量PCR反应使用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(Toyobo，QPS-201)试剂盒CFX96real-time PCR system(Bio-rad)仪器完成。使用引物序列如下：
IL-28RAgene；
F:5'-CAGCAAGTTCTCTAAGCCCACC-3'；
R:5'-GTCATTCACGGACTCTGGTCTG-3'；
β-actin gene；
F:5'-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3'；
R:5'-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3'。
如图6所示，实验结果表明：IL-28RA在oxLDL诱导的巨噬细胞泡沫细胞的形成过程中显著高表达。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种诊断冠心病的标志物，其特征在于，所述标志物为IL-29和/或其受体IL-28RA。
2.根据权利要求1所述诊断冠心病的标志物，其特征在于，所述标志物IL-29在冠心病患者血浆中高表达。
3.根据权利要求1所述诊断冠心病的标志物，其特征在于，所述标志物IL-29在冠心病患者单个核细胞中高表达。
4.根据权利要求1所述诊断冠心病的标志物，其特征在于，所述标志物IL-29在oxLDL诱导泡沫细胞形成过程中高表达。
5.根据权利要求1所述诊断冠心病的标志物，其特征在于，所述标志物IL-29促进泡沫细胞的形成。
6.根据权利要求1所述诊断冠心病的标志物，其特征在于，所述标志物IL-28RA在冠心病患者单个核细胞中高表达。
7.根据权利要求1所述诊断冠心病的标志物，其特征在于，所述标志物IL-28RA在oxLDL诱导泡沫细胞形成过程中高表达。
8.权利要求1所述标志物在制备冠心病诊断的试剂中的应用。
9.IL-29拮抗剂或其功能类似物在制备治疗冠心病药物中的应用。
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| CN106461681A (zh) * | 2015-02-10 | 2017-02-22 | 梨花女子大学校产学协力团 | 用于诊断血管疾病的生物标志物及其用途 |
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2021
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