CN114184779A - 用于检测颗粒物中有机物毒性的测试方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于检测颗粒物中有机物毒性的测试方法，具体按照以下步骤实施：步骤1，对颗粒物进行预处理，提取有机组分，得到颗粒物有机组分染毒液；步骤2，大肠杆菌菌液培养；步骤3，将所述步骤2中培养好的大肠杆菌菌液稀释，并接入384孔板中，然后培养箱中培养至对数期；步骤4，将所述步骤1中的颗粒物染毒液等梯度稀释，与步骤3中的在对数期的大肠杆菌进行混合，确定颗粒物样本最大耐受浓度；步骤5，将所述步骤4中的最大耐受浓度等梯度稀释，并将稀释过后的样品溶液加入到培养好的384孔板中，送入酶标仪进行2h检测；步骤6，通过计算TELIgenei和TELItotal对颗粒物的毒性进行定量分析。该发明能够定量确定颗粒物中有机物对环境的毒性效应。
Description
技术领域
本发明属于有机物毒性检测方法技术领域，具体涉及用于检测颗粒物中有机物毒性的测试方法。
背景技术
长期以来，针对颗粒物的毒性检测大部分是从单一元素或单一化学成分角度进行毒性分析，而颗粒物大多是一种复杂的、非均匀的混合物，其化学组分随时间和空间的变化而变化，不同的化学组分，对人体健康的影响和作用机制也不同，因此仅仅对单一元素和单一化学成分进行毒性分析显得不全面、不精准；同时由于环境样品的复杂性(有机组分，无机组份等)使得颗粒物全组分的毒性检测手段过于复杂，现有的技术手段通过细胞体外培养和动物暴露实验，再观察和检测细胞对毒物的反应，此类方法成本较高且系统结构复杂。因此，迫切需要一种成本更低、速度更快、信息更完整可靠的生态毒性筛选和测试方法针对颗粒物样品进行毒性分析。
发明内容
本发明的目的是提供用于检测颗粒物中有机物毒性的测试方法，能够定量确定颗粒物中有机物对环境的毒性效应。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：用于检测颗粒物中有机物毒性的测试方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1，对颗粒物进行预处理，提取有机组分，得到颗粒物有机组分染毒液；
步骤2，大肠杆菌菌液培养；
步骤3，将所述步骤2中培养好的大肠杆菌菌液稀释，并接入384孔板中，然后培养箱中培养至对数期，然后将384孔板取出；
步骤4，将所述步骤1中的颗粒物染毒液等梯度稀释，与步骤3中的在对数期的大肠杆菌进行混合，确定颗粒物样本最大耐受浓度；
步骤5，将所述步骤4中的最大耐受浓度等梯度稀释，并将稀释过后的样品溶液加入到培养好的384板中，送入酶标仪进行2h检测；
步骤6，通过计算TELIgenei和TELItotal对颗粒物的毒性进行定量分析。
本发明的技术方案，还具有以下特点：
步骤1具体为：取颗粒物样品，加入到装有有机溶剂的离心管中进行超声震荡，然后对离心管进行氮吹干，再加入超纯水，超声震荡，用滤膜过滤，得到颗粒物有机组分染毒液。
有机溶剂为甲醇和丙醇的混合物，其中甲醇和丙醇按照体积比1:1混合。
滤膜为0.45μm滤膜，超纯水和有机溶剂的体积比为1:1，两次超声震荡的时间均为30min。
步骤2具体为：在96微孔板中加入培养基及大肠杆菌，在恒温培养箱中培养，得到大肠杆菌菌液。
培养箱中的温度为36℃，在培养箱中的培养时间为16-22h。
步骤3中将5×M9培养基按照比例稀释成1×M9，然后大肠杆菌用1×M9培养基按1：5稀释，将培养基及稀释好的大肠杆菌菌液接入384孔板。
步骤4具体为：将颗粒物染毒液依次10倍稀释7个浓度梯度，每个浓度的颗粒物染毒液分别与对数期的大肠杆菌混合，用大肠杆菌中的U66进行预实验，放入酶标仪中同时进行吸光度和荧光读数，在2h内间隔5min测定一次，当大肠杆菌的存活率≥95％，得到EC5时的浓度，该浓度为颗粒物样本的最大耐受浓度。
步骤5中将最大耐受浓度依次10倍稀释6个浓度梯度。
步骤6中通过式(1)-(2)计算TELIgenei和TELItotal：
其中，t是暴露时间，n是特定基因的数量，Wi是gene(i)的权重因子。
本发明的有益效果是：本发明的用于检测颗粒物中有机物毒性的测试方法，可深入了解颗粒物不良反应在分子水平的改变以便更好的阐述与人类相关的作用模式(MOA)；同时根据相类似的基因表达图谱建立化学组，提供目前传统毒性测试所没有的毒性作用终点且具有高通量、耗时短等特点。
附图说明
图1是本发明用于检测颗粒物中有机物毒性的测试方法的测试流程图。
图中，1.96微孔板，2.384孔板，3.恒温培养箱，4.颗粒物样品，5.酶标仪。
具体实施方式
以下结合具体附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明的用于检测颗粒物中有机物毒性的测试方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1，对颗粒物进行预处理，提取有机组分，得到颗粒物有机组分染毒液；
步骤1具体为：取颗粒物样品，加入到装有有机溶剂的离心管中进行超声震荡30min，然后对离心管进行氮吹至近干，再加入超纯水，超声30min，用0.45μm滤膜过滤，得到颗粒物有机组分染毒液，超纯水和有机溶剂的体积比为1:1，有机溶剂为甲醇和丙醇的混合物，其中甲醇和丙醇按照体积比1:1混合。
步骤2，大肠杆菌菌液培养；
步骤2具体为：在96微孔板中加入培养基及大肠杆菌，在恒温培养箱中培养，得到大肠杆菌菌液，培养箱中的温度为36℃，在培养箱中的培养时间为16-22h。
步骤3，将5×M9培养基按照比例稀释成1×M9，将所述步骤2中培养好的大肠杆菌用1×M9培养基按1：5稀释，将1×M9培养基(55μL)及稀释好的大肠杆菌菌液(5μL)接入384孔板，并在培养箱中培养至对数期(OD值达到0.2左右)；
步骤4，将所述步骤1中的颗粒物染毒液等梯度稀释，与步骤3中的在对数期的大肠杆菌进行混合，确定颗粒物样本最大耐受浓度；
步骤4具体为：将颗粒物染毒液依次10倍稀释7个浓度梯度，每个浓度的颗粒物染毒液分别与对数期的大肠杆菌混合，用大肠杆菌中的U66进行预实验，放入酶标仪中同时进行吸光度((OD600))和荧光((GFP水平，EX：485nm,EM：528nm))读数，在2h内间隔5min测定一次，当大肠杆菌的存活率≥95％，得到EC5的浓度，该浓度为颗粒物样本的最大耐受浓度。
步骤5，将所述步骤4中的最大耐受浓度依次10倍稀释6个浓度梯度，并将稀释过后的样品溶液加入到培养好的384孔板中，送入酶标仪进行2h检测；
步骤6，通过计算TELIgenei和TELItotal对颗粒物的毒性进行定量分析；
步骤6中通过式(1)-(2)计算TELIgenei和TELItotal：
其中，t是暴露时间，n是特定基因的数量，Wi是gene(i)的权重因子，权重因子赋值1。
实施例1
如图1所示，本实施例采用本发明的方法进行毒性测试分析，具体步骤如下：
(1)颗粒物样品的预处理
取10mg高炉颗粒物样品4，加入装有10ml的甲醇：丙醇＝1:1溶剂的离心管中，超声震荡30min，氮吹至无明显液体时加入10ml超纯水，超声30min，再通过0.45μm滤膜过滤，得到颗粒物染毒液；
(2)大肠杆菌的培养
将96微孔板1中的大肠杆菌复苏培养，加入120μLLB培养基及20μL大肠杆菌，在36℃恒温培养箱3中培养16h。将培养好的大肠杆菌用的1×M9培养基按1：5稀释，将1×M9培养基(55μL)及稀释好的大肠杆菌菌液(5μL)接入黑色384孔板2，并在培养箱中培养至对数期(OD值达到0.2左右)
(3)最大耐受浓度的确定
预处理过后的样品浓度依次10倍稀释7个浓度梯度，用大肠杆菌中的U66进行预实验，放入酶标仪中同时进行吸光度(OD600)和荧光(GFP水平，EX：485nm,EM：528nm)读数，测定时长2h，时间间隔5min。得到EC5(存活率≥95％)的浓度，确定该浓度为颗粒物样品最大耐受浓度。
(4)毒理实验
将最大耐受浓度依次10倍稀释6个浓度梯度，取10uL稀释过后的样品溶液加入培养好的黑色384孔板2中，送入酶标仪5进行2h检测；计算得到高炉6个浓度下的TELItotal值如下表1所示：
表1
| 浓度mg/ml | 0.0001 | 0.001 | 0.01 | 0.1 | 1 | 10 |
| TELI<sub>total</sub> | 1.6066 | 1.6330 | 1.8236 | 1.8774 | 1.8399 | 1.8779 |
结果分析：通常认为基因表达水平低于1.5是未表达的。毒性测试结果显示，高炉颗粒物在不同浓度下的TELI值均达到1.5以上，说明在研究浓度范围内，受试颗粒物会影响所测试基因的转录表达水平。其中，随浓度增加，TELI值也在增加，说明浓度越大，对基因的转录表达水平影响越大，即浓度越大，高炉颗粒物样品的毒性作用越明显。
本发明用于检测颗粒物中有机物毒性的测试方法，可深入了解颗粒物不良反应在分子水平的改变以便更好的阐述与人类相关的作用模式(MOA)；同时根据相类似的基因表达图谱建立化学组，提供目前传统毒性测试所没有的毒性作用终点且具有高通量、耗时短等特点。
Claims (10)
1.用于检测颗粒物中有机物毒性的测试方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：
步骤1，对颗粒物进行预处理，提取有机组分，得到颗粒物有机组分染毒液；
步骤2，大肠杆菌菌液培养；
步骤3，将所述步骤2中培养好的大肠杆菌菌液稀释，并接入384孔板中，然后在培养箱中培养至对数期；
步骤4，将所述步骤1中的颗粒物染毒液等梯度稀释，与步骤3中的在对数期的大肠杆菌进行混合，确定颗粒物样本最大耐受浓度；
步骤5，将所述步骤4中的最大耐受浓度等梯度稀释，并将稀释过后的样品溶液加入到培养好的384孔板中，送入酶标仪进行2h检测；
步骤6，通过计算TELIgenei和TELItotal对颗粒物的毒性进行定量分析。
2.根据权利要求1所述的用于检测颗粒物中有机物毒性的测试方法，其特征在于，所述步骤1具体为：取颗粒物样品，加入到装有有机溶剂的离心管中进行超声震荡，然后对离心管进行氮吹干，再加入超纯水，超声震荡，用滤膜过滤，得到颗粒物有机组分染毒液。
3.根据权利要求2所述的用于检测颗粒物中有机物毒性的测试方法，其特征在于，所述有机溶剂为甲醇和丙醇的混合物，其中甲醇和丙醇按照体积比1:1混合。
4.根据权利要求2所述的用于检测颗粒物中有机物毒性的测试方法，其特征在于，所述滤膜为0.45μm滤膜，所述超纯水和有机溶剂的体积比为1:1，两次超声震荡的时间均为30min。
5.根据权利要求1所述的用于检测颗粒物中有机物毒性的测试方法，其特征在于，所述步骤2具体为：在96微孔板中加入培养基及大肠杆菌，在恒温培养箱中培养，得到大肠杆菌菌液。
6.根据权利要求5所述的用于检测颗粒物中有机物毒性的测试方法，其特征在于，所述培养箱中的温度为36℃，在培养箱中的培养时间为16-22h。
7.根据权利要求1所述的用于检测颗粒物中有机物毒性的测试方法，其特征在于，所述步骤3中将5×M9培养基按照比例稀释成1×M9，然后大肠杆菌用1×M9培养基按1：5稀释，将培养基及稀释好的大肠杆菌菌液接入384孔板中。
8.根据权利要求1所述的用于检测颗粒物中有机物毒性的测试方法，其特征在于，所述步骤4具体为：将颗粒物染毒液依次10倍稀释7个浓度梯度，每个浓度的颗粒物染毒液分别与对数期的大肠杆菌混合，用大肠杆菌中的U66进行预实验，放入酶标仪中同时进行吸光度和荧光读数，在2h内间隔5min测定一次，当大肠杆菌的存活率≥95％，得到EC5的浓度，该浓度为颗粒物样本的最大耐受浓度。
9.根据权利要求1所述的用于检测颗粒物中有机物毒性的测试方法，其特征在于，所述步骤5中将最大耐受浓度依次10倍稀释6个浓度梯度。
10.根据权利要求1所述的用于检测颗粒物中有机物毒性的测试方法，其特征在于，所述步骤6中通过式(1)-(2)计算TELIgenei和TELItotal：
其中，t是暴露时间，n是特定基因的数量，Wi是gene(i)的权重因子。
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