CN114164173A - 一种间充质干细胞体外培养试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种间充质干细胞体外培养试剂盒及其应用，所述间充质干细胞体外培养试剂盒包括促贴壁培养基、调节培养基和促增殖培养基；所述促贴壁培养基包括干细胞培养基、细胞培养补充剂、胎牛血清、促贴壁细胞因子和IL‑3；所述调节培养基包括干细胞培养基、细胞培养补充剂、调节细胞因子和IL‑3；所述促增殖培养基包括干细胞培养基、细胞培养补充剂、促增殖细胞因子和IL‑3。本发明还提供了一种间充质干细胞体外培养的方法及其培养得到的间充质干细胞。本发明通过优化后的培养基与培养方法的相互配合，可以快速获得分裂能力强、纯度高的间充质干细胞，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，尤其涉及一种间充质干细胞体外培养试剂盒及其应用。
背景技术
间充质干细胞是一种多能干细胞，具有自我更新和多向分化的能力。间充质干细胞最早在骨髓中发现，随后发现，其还存在于人体发生、发育过程的多种组织中，包括骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺、羊水以及脐带血等。
间充质干细胞已广泛应用于临床研究中，除了用来促进恢复造血、与造血干细胞共移植治疗白血病和难治性贫血等以外，还用于心脑血管疾病、肝硬化、骨和肌肉衰退性疾病、脑和脊髓神经损伤、老年痴呆、红斑狼疮和硬皮病等疾病的治疗研究中，已经取得的部分临床试验结果令人鼓舞。
CN110862961A公开了一种骨髓间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：将骨髓液与0.9％的生理盐水混合，经密度梯度离心，从血浆下层收集间充质干细胞；用包被CD73抗体的细胞培养板培养白膜层细胞；待细胞长至70％～80％时，将细胞用干细胞温和消化酶消化；用包被CD90抗体的细胞培养板继续培养骨髓间充质干细胞；待细胞长至70％～80％时，将细胞用干细胞温和消化酶消化并收集高纯度的骨髓间充质干细胞。然而，骨髓来源的间充质干细胞存在以下问题：随着年龄的老化，干细胞数目显著降低，增殖分化能力大幅度衰退；制备过程不容易质控；移植给异体可能引起免疫反应；取材时对患者有损伤等，限制了其在临床治疗方面的应用。
因此，如何提供一种分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低的间充质干细胞及其制备方法，已成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种间充质干细胞体外培养试剂盒及其应用，通过对培养基的组分、含量以及培养的方法及进程进行优化，制备得到的间充质干细胞的增殖分裂能力更强，免疫原性更低，且制备方法简单，容易操作，应用价值广泛。
为达此目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种间充质干细胞体外培养试剂盒，所述间充质干细胞体外培养试剂盒包括促贴壁培养基、调节培养基和促增殖培养基；
所述促贴壁培养基包括干细胞培养基、细胞培养补充剂、胎牛血清、促贴壁细胞因子和IL-3；
所述调节培养基包括干细胞培养基、细胞培养补充剂、调节细胞因子和IL-3；
所述促增殖培养基包括干细胞培养基、细胞培养补充剂、促增殖细胞因子和IL-3。
本发明中，所述干细胞培养基为适合干细胞生长的无血清培养基。
本发明中，通过对培养基的组成及含量进行优化，对细胞的培养效果更好，促贴壁培养基可以促进细胞的贴壁作用；调节培养基帮助细胞在由促贴壁培养基向促增殖培养基的转换中实现缓慢过渡，避免因培养环境的剧烈变化而引起细胞生理状态的改变；促增殖培养基可以促进贴壁细胞的分裂，增殖效率更高。通过上述培养基的配合，制备得到的间充质干细胞的数量更多，纯度更好，分化潜能更大，免疫原性更低。
优选地，所述细胞培养补充剂在所述促贴壁培养基中的体积分数为1％～10％，例如可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述胎牛血清在所述促贴壁培养基中的体积分数为1％～10％，例如可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述促贴壁细胞因子包括rhGM-CSF、bFGF和SCF。
优选地，所述rhGM-CSF在所述促贴壁培养基中的浓度为800～1200IU/mL，例如可以是800IU/mL、850IU/mL、900IU/mL、950IU/mL、1000IU/mL、1050IU/mL、1100IU/mL、1150IU/mL或1200IU/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述bFGF在所述促贴壁培养基中的浓度为80～120ng/mL，例如可以是80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL、100ng/mL、105ng/mL、110ng/mL、115ng/mL或120ng/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述SCF在所述促贴壁培养基中的浓度为80～120ng/mL，例如可以是80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL、100ng/mL、105ng/mL、110ng/mL、115ng/mL或120ng/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述IL-3在所述促贴壁培养基中的浓度为80～120ng/mL，例如可以是80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL、100ng/mL、105ng/mL、110ng/mL、115ng/mL或120ng/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述细胞培养补充剂在所述调节培养基中的体积分数为1％～10％，例如可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述调节细胞因子包括TPO和SCF。
优选地，所述TPO在所述调节培养基中的浓度为60～100IU/mL，例如可以是60IU/mL、65IU/mL、70IU/mL、75IU/mL、80IU/mL、85IU/mL、90IU/mL、95IU/mL或100IU/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述SCF在所述调节培养基中的浓度为60～100ng/mL，例如可以是60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL或100ng/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述IL-3在所述调节培养基中的浓度为60～100ng/mL，例如可以是60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL、90ng/mL、95ng/mL或100ng/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述细胞培养补充剂在所述促增殖培养基中的体积分数为1％～10％，例如可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述促增殖细胞因子包括TPO和SCF。
优选地，所述TPO在所述促增殖培养基中的浓度为50～90IU/mL，例如可以是50IU/mL、55IU/mL、60IU/mL、65IU/mL、70IU/mL、75IU/mL、80IU/mL、85IU/mL或90IU/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述SCF在所述促增殖培养基中的浓度为50～90ng/mL，例如可以是50ng/mL、55ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL或90ng/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述IL-3在所述促增殖培养基中的浓度为50～90ng/mL，例如可以是50ng/mL、55ng/mL、60ng/mL、65ng/mL、70ng/mL、75ng/mL、80ng/mL、85ng/mL或90ng/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
作为优选技术方案，本发明所述间充质干细胞体外培养试剂盒，包括促贴壁培养基、调节培养基和促增殖培养基；
所述促贴壁培养基包括细胞培养补充剂1％～10％(v/v)、胎牛血清1％～10％(v/v)、rhGM-CSF 800～1200IU/mL、bFGF 80～120ng/mL、SCF 80～120ng/mL和IL-3 80～120ng/mL，余量为干细胞培养基；
所述调节培养基包括细胞培养补充剂1％～10％(v/v)、TPO 60～100IU/mL、SCF60～100ng/mL和IL-3 60～100ng/mL，余量为干细胞培养基；
所述促增殖培养基包括细胞培养补充剂1％～10％(v/v)、TPO 50～90IU/mL、SCF50～90ng/mL和IL-3 50～90ng/mL，余量为干细胞培养基。
第二方面，本发明提供了一种间充质干细胞体外培养的方法，所述方法包括：
清洗脐带组织并进行消毒，取出华通胶体，剪碎，离心收集组织块；
使用第一方面所述的促贴壁培养基培养组织块3～6天，促进细胞贴壁；
使用第一方面所述的调节培养基对贴壁细胞继续培养1～2天；
使用第一方面所述的促增殖培养基对细胞进行传代培养，收集细胞，得到所述间充质干细胞。
本发明中，所述培养方法操作简单，无需流式分选以及组织裂解，对操作人员的技术水平要求较低，成功率更高；且培养过程中无需饲养层细胞，细胞因子的用量也较少，生产成本更低；制备得到的间充质干细胞纯度高，增殖效率好，应用前景广阔。
优选地，所述促进细胞贴壁期间还包括去除半贴壁细胞的步骤。
优选地，所述对贴壁细胞继续培养前，细胞贴壁率不低于50％，例如可以是50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述传代培养时，细胞贴壁率不低于80％，例如可以是80％、85％、90％或95％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述传代培养的次数为不少于6次，例如可以是6次、7次、8次或9次等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述收集细胞前还包括质控检测的步骤。
作为优选技术方案，本发明所述间充质干细胞体外培养的方法，包括：
清洗脐带组织并进行消毒，取出华通胶体，剪碎，离心收集组织块；
使用第一方面所述的促贴壁培养基培养组织块3～6天，促进细胞贴壁，并去除半贴壁细胞；
细胞贴壁率不低于50％时，使用第一方面所述的调节培养基对贴壁细胞继续培养1～2天；
使用第一方面所述的促增殖培养基对细胞进行传代培养，传代培养时，细胞贴壁率不低于80％，传代培养不少于6次，质控检测，收集细胞，得到所述间充质干细胞。
第三方面，本发明提供了一种间充质干细胞，所述间充质干细胞通过第二方面所述的间充质干细胞体外培养的方法培养得到。
第四方面，本发明提供了第一方面所述的间充质干细胞体外培养试剂盒和/或第二方面所述的间充质干细胞体外培养的方法在制备间充质干细胞中的应用。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明通过对促贴壁培养基、调节培养基和促增殖培养基的组分及含量进行优化，制备得到的间充质干细胞的数量更多，增殖能力更好；本发明以华通胶体中的细胞作为材料，制备得到的间充质干细胞纯度极高，无需流式分选，简化了制备过程；所述间充质干细胞的贴壁比例高，细胞爬出快，增殖速度也较快；细胞表面表达多种标记物，活性更好，应用场景更多；制备时无需组织裂解，降低了操作的难度，实验的成功率更高；细胞在培养过程中无需饲养层细胞，使用的细胞因子量也较少，极大地降低了生产成本，应用价值极高。
附图说明
图1为本发明实施例4～6以及对比例4～6制备的间充质干细胞的贴壁比例的统计结果图片。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
材料：
干细胞培养基和胎牛血清购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；
细胞培养补充剂购自Helios Bioscience；
IL-3、rhGM-CSF、bFGF、SCF和TPO购自HZbscience；
StemProR MSC SFM培养基购自Life Technology；
CD73+抗体、CD105+抗体、CD90+抗体、CD45+抗体、CD34+抗体、CD19+抗体、HLA+DR+抗体和CD14+抗体购自BD(中国)。
实施例1
本实施例提供一种间充质干细胞体外培养试剂盒，所述间充质干细胞体外培养试剂盒包括促贴壁培养基、调节培养基和促增殖培养基；
所述促贴壁培养基包括细胞培养补充剂1％(v/v)、胎牛血清1％(v/v)、rhGM-CSF800IU/mL、bFGF 80ng/mL、SCF 80ng/mL和IL-3 80ng/mL，余量为干细胞培养基；
所述调节培养基包括细胞培养补充剂1％(v/v)、TPO 60IU/mL、SCF 60ng/mL和IL-3 60ng/mL，余量为干细胞培养基；
所述促增殖培养基包括细胞培养补充剂1％(v/v)、TPO 50IU/mL、SCF 50ng/mL和IL-3 50ng/mL，余量为干细胞培养基。
实施例2
本实施例提供一种间充质干细胞体外培养试剂盒，所述间充质干细胞体外培养试剂盒包括促贴壁培养基、调节培养基和促增殖培养基；
所述促贴壁培养基包括细胞培养补充剂6％(v/v)、胎牛血清6％(v/v)、rhGM-CSF1000IU/mL、bFGF 100ng/mL、SCF 100ng/mL和IL-3 100ng/mL，余量为干细胞培养基；
所述调节培养基包括细胞培养补充剂6％(v/v)、TPO 90IU/mL、SCF 90ng/mL和IL-3 90ng/mL，余量为干细胞培养基；
所述促增殖培养基包括细胞培养补充剂6％(v/v)、TPO 70IU/mL、SCF 70ng/mL和IL-3 70ng/mL，余量为干细胞培养基。
实施例3
本实施例提供一种间充质干细胞体外培养试剂盒，所述间充质干细胞体外培养试剂盒包括促贴壁培养基、调节培养基和促增殖培养基；
所述促贴壁培养基包括细胞培养补充剂10％(v/v)、胎牛血清10％(v/v)、rhGM-CSF 1200IU/mL、bFGF 120ng/mL、SCF 120ng/mL和IL-3 120ng/mL，余量为干细胞培养基；
所述调节培养基包括细胞培养补充剂10％(v/v)、TPO 100IU/mL、SCF 100ng/mL和IL-3 100ng/mL，余量为干细胞培养基；
所述促增殖培养基包括细胞培养补充剂10％(v/v)、TPO 90IU/mL、SCF 90ng/mL和IL-3 90ng/mL，余量为干细胞培养基。
实施例4
本实施例提供一种间充质干细胞，所述间充质干细胞通过如下方法培养得到：
(1)培养前对操作台、试剂、器材进行消毒；
(2)清洗脐带组织并进行消毒；
使用D-PBS溶液清洗脐带组织2次，置于75％酒精溶液中浸泡20s消毒；使用D-PBS溶液清洗2次，再次置于75％酒精溶液中浸泡20s；使用D-PBS溶液中清洗1次，置于含有D-PBS溶液的干净培养皿中，剪成2cm的小段；
(3)取出华通胶体，剪碎，离心收集组织块：
用止血钳将脐带置于D-PBS溶液中洗净血液，用手术刀切出小孔，撕开脐带并抽出华通胶体；
使用D-PBS溶液清洗华通胶体，剪成2×2cm2的小块，转移至离心管中，室温下400g离心10min，去上清，获得组织块；
(4)促进细胞贴壁：
将组织块接种至T75细胞培养瓶中，加入20mL实施例1中的促贴壁培养基，在37℃、5％二氧化碳浓度条件下培养3天，期间不要晃动培养瓶，促进细胞贴壁；
第4天缓慢倒出培养上清，并去除半贴壁细胞；加入20mL促贴壁培养基，在37℃、5％二氧化碳浓度条件下继续培养；
(5)调节细胞生长：
第6天，将细胞置于显微镜下观察，细胞贴壁率超过50％，缓慢倒出培养上清，去除组织块，加入20mL实施例1中的调节培养基，在37℃、5％二氧化碳浓度条件下培养；
(6)传代培养：
第8天，将细胞置于显微镜下观察，细胞贴壁率超过80％，消化细胞进行传代培养，每瓶中含有20mL实施例1中的促增殖培养基，在37℃、5％二氧化碳浓度条件下培养；
随后每隔2天对细胞进行一次半换液或传代，传代培养时细胞贴壁率不低于80％，补加对应量的促增殖培养基，传代培养7次；
(7)收集细胞：
消化细胞，质控检测后收集细胞，得到所述间充质干细胞。
实施例5
本实施例提供一种间充质干细胞，所述间充质干细胞使用实施例2中的间充质干细胞体外培养试剂盒培养得到，培养方法与实施例4相同。
实施例6
本实施例提供一种间充质干细胞，所述间充质干细胞使用实施例3中的间充质干细胞体外培养试剂盒培养得到，培养方法与实施例4相同。
对比例1
本对比例提供一种间充质干细胞体外培养试剂盒，其与实施例1的区别仅在于，将促贴壁培养基、调节培养基和促增殖培养基中的干细胞培养基替换为StemProR MSC SFM培养基，其余原料及组分与实施例1相同。
对比例2
本对比例提供一种间充质干细胞体外培养试剂盒，其与实施例2的区别仅在于，将促贴壁培养基、调节培养基和促增殖培养基中的干细胞培养基替换为StemProR MSC SFM培养基，其余原料及组分与实施例2相同。
对比例3
本对比例提供一种间充质干细胞体外培养试剂盒，其与实施例3的区别仅在于，将促贴壁培养基、调节培养基和促增殖培养基中的干细胞培养基替换为StemProR MSC SFM培养基，其余原料及组分与实施例3相同。
对比例4
本对比例提供一种间充质干细胞，所述间充质干细胞使用对比例1中的间充质干细胞体外培养试剂盒培养得到，培养方法与实施例4相同。
对比例5
本对比例提供一种间充质干细胞，所述间充质干细胞使用对比例2中的间充质干细胞体外培养试剂盒培养得到，培养方法与实施例4相同。
对比例6
本对比例提供一种间充质干细胞，所述间充质干细胞使用对比例3中的间充质干细胞体外培养试剂盒培养得到，培养方法与实施例4相同。
对实施例4～6以及对比例4～6制备的间充质干细胞的贴壁比例进行统计，步骤如下：
将培养瓶置于显微镜下，调整物镜为4×，目镜为10×，调整焦距，得到清晰的细胞成像界面，观察并计算细胞贴壁的比例。
细胞贴壁比例的统计结果如图1所示。
细胞的贴壁比例与细胞的增殖速度相关。贴壁比例越高，说明传代所需的时间较短，细胞的爬出也较快，后期有更多的时间可以用于细胞的分裂与增殖。由图1可以看出，细胞贴壁比例受培养基种类及细胞因子的含量的影响。对比实施例4～6和对比例4～6制备得到的间充质干细胞，可以看出选用Life Technology公司干细胞培养基的培养效果较好；分别对比实施例4～6以及对比例4～6，可以看出细胞因子的浓度及配比对于细胞的贴壁及增殖也有一定程度的影响，相对而言，细胞因子的含量越高，细胞的贴壁比例也越高，细胞增殖速度更快。
对实施例4～6以及对比例4～6制备的间充质干细胞进行流式检测，步骤如下：
1.将培养瓶置于生物安全柜，使用胰酶消化至细胞全部脱落，使用D-PBS消化，并收集细胞，室温下400g离心5min，再用10mL D-PBS重悬细胞；
2.取大约200万(大约400μL)个细胞置于EP管中，并加入600μL D-PBS，混匀，室温下400g离心5min，弃上清液，获得细胞；
3.使用400μL含5％FBS的D-PBS匀混细胞，各取200μL重悬液置于两个新的流式管中，标记为1号管、2号管；
4.向1号管依次加入0.5μL CD73+抗体、0.5μL CD105+抗体、0.5μL CD90+抗体和0.5μL CD45+抗体；向2号管依次加入0.5μL CD34+抗体、0.5μL CD19+抗体、0.5μL HLA+DR+抗体和0.5μL CD14+抗体；
5.置于涡旋振荡仪混匀20s，并置于4℃下避光染色20min；
6.上机，保存数据；
7.分析数据。
检测结果如表1所示。
表1
由表1可知，对比实施例4～6和对比例4～6，可以看出培养基种类对细胞表面受体的表达影响较大，选择Life Technology公司干细胞培养基具有更优的生产结果；对比实施例5和实施例6以及对比例5和对比例6，结果显示细胞因子的浓度及配比的不同对表面受体的表达也具有一定的影响，但影响并不明显，使用较低的因子浓度即可达到高浓度因子的生产结果，对于节省成本上更具有优势。
综上所述，本发明通过对所述间充质干细胞体外培养试剂盒中的培养基的组分以及含量进行优化，配合相应的体外培养方法，可以促进细胞贴壁，提高细胞对培养基的适应能力，并促进其快速增殖，制备得到的间充质干细胞分裂能力强，纯度高，无需流式分选及组织裂解，制备简单，生产效率高；无需饲养层细胞，生产成本低，具有实际应用的价值。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种间充质干细胞体外培养试剂盒，其特征在于，所述间充质干细胞体外培养试剂盒包括促贴壁培养基、调节培养基和促增殖培养基；
所述促贴壁培养基包括干细胞培养基、细胞培养补充剂、胎牛血清、促贴壁细胞因子和IL-3；
所述调节培养基包括干细胞培养基、细胞培养补充剂、调节细胞因子和IL-3；
所述促增殖培养基包括干细胞培养基、细胞培养补充剂、促增殖细胞因子和IL-3。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞体外培养试剂盒，其特征在于，所述细胞培养补充剂在所述促贴壁培养基中的体积分数为1％～10％；
优选地，所述胎牛血清在所述促贴壁培养基中的体积分数为1％～10％；
优选地，所述促贴壁细胞因子包括rhGM-CSF、bFGF和SCF；
优选地，所述rhGM-CSF在所述促贴壁培养基中的浓度为800～1200IU/mL；
优选地，所述bFGF在所述促贴壁培养基中的浓度为80～120ng/mL；
优选地，所述SCF在所述促贴壁培养基中的浓度为80～120ng/mL；
优选地，所述IL-3在所述促贴壁培养基中的浓度为80～120ng/mL。
3.根据权利要求1或2所述的间充质干细胞体外培养试剂盒，其特征在于，所述细胞培养补充剂在所述调节培养基中的体积分数为1％～10％；
优选地，所述调节细胞因子包括TPO和SCF；
优选地，所述TPO在所述调节培养基中的浓度为60～100IU/mL；
优选地，所述SCF在所述调节培养基中的浓度为60～100ng/mL；
优选地，所述IL-3在所述调节培养基中的浓度为60～100ng/mL。
4.根据权利要求1～3任一项所述的间充质干细胞体外培养试剂盒，其特征在于，所述细胞培养补充剂在所述促增殖培养基中的体积分数为1％～10％；
优选地，所述促增殖细胞因子包括TPO和SCF；
优选地，所述TPO在所述促增殖培养基中的浓度为50～90IU/mL；
优选地，所述SCF在所述促增殖培养基中的浓度为50～90ng/mL；
优选地，所述IL-3在所述促增殖培养基中的浓度为50～90ng/mL。
5.根据权利要求1～4任一项所述的间充质干细胞体外培养试剂盒，其特征在于，所述间充质干细胞体外培养试剂盒包括促贴壁培养基、调节培养基和促增殖培养基；
所述促贴壁培养基包括细胞培养补充剂1％～10％(v/v)、胎牛血清1％～10％(v/v)、rhGM-CSF 800～1200IU/mL、bFGF 80～120ng/mL、SCF 80～120ng/mL和IL-3 80～120ng/mL，余量为干细胞培养基；
所述调节培养基包括细胞培养补充剂1％～10％(v/v)、TPO 60～100IU/mL、SCF 60～100ng/mL和IL-3 60～100ng/mL，余量为干细胞培养基；
所述促增殖培养基包括细胞培养补充剂1％～10％(v/v)、TPO 50～90IU/mL、SCF 50～90ng/mL和IL-3 50～90ng/mL，余量为干细胞培养基。
6.一种间充质干细胞体外培养的方法，其特征在于，所述方法包括：
清洗脐带组织并进行消毒，取出华通胶体，剪碎，离心收集组织块；
使用权利要求1～5任一项中所述的促贴壁培养基培养组织块3～6天，促进细胞贴壁；
使用权利要求1～5任一项中所述的调节培养基对贴壁细胞继续培养1～2天；
使用权利要求1～5任一项中所述的促增殖培养基对细胞进行传代培养，收集细胞，得到所述间充质干细胞。
7.根据权利要求6所述的间充质干细胞体外培养的方法，其特征在于，所述促进细胞贴壁期间还包括去除半贴壁细胞的步骤；
优选地，所述对贴壁细胞继续培养前，细胞贴壁率不低于50％；
优选地，所述传代培养时，细胞贴壁率不低于80％；
优选地，所述传代培养的次数为不少于6次；
优选地，所述收集细胞前还包括质控检测的步骤。
8.根据权利要求6或7所述的间充质干细胞体外培养的方法，其特征在于，所述方法包括：
清洗脐带组织并进行消毒，取出华通胶体，剪碎，离心收集组织块；
使用权利要求1～5任一项中所述的促贴壁培养基培养组织块3～6天，促进细胞贴壁，并去除半贴壁细胞；
细胞贴壁率不低于50％时，使用权利要求1～5任一项中所述的调节培养基对贴壁细胞继续培养1～2天；
使用权利要求1～5任一项中所述的促增殖培养基对细胞进行传代培养，传代培养时，细胞贴壁率不低于80％，传代培养不少于6次，质控检测，收集细胞，得到所述间充质干细胞。
9.一种间充质干细胞，其特征在于，所述间充质干细胞通过权利要求6～8任一项所述的间充质干细胞体外培养的方法培养得到。
10.权利要求1～5任一项所述的间充质干细胞体外培养试剂盒和/或权利要求6～8任一项所述的间充质干细胞体外培养的方法在制备间充质干细胞中的应用。
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