CN114158275A - 腹膜转移细胞的检测和分离方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供了用于从获得自受试者的样品检测和分离转移细胞的方法。还提供了用于该方法中的包含微芯片的装置。还提供了分离转移细胞用于培养和表征的方法。本文提供了用于本文方法的试剂盒。
Description
本申请要求2019年5月3日提交的美国临时申请序列号62/842,689的优先权，其通过引用整体并入。
1.发明领域
本文提供了用于在从受试者获得的样品中检测和分离转移细胞的方法。还提供了包括用于该方法的微芯片的装置。还提供了分离转移细胞用于培养和表征的方法。本文提供了用于其中方法的试剂盒。
2.发明背景
起源于胃肠道恶性肿瘤和妇科恶性肿瘤的腹膜转移与不良预后和疾病进展迅速有关。它是胃肠道癌症和妇科癌症相关死亡的主要原因之一，估计平均生存期少于数月。不良预后主要是由于在肿瘤细胞很少且微小的最早阶段缺乏有效的方法来检测播散性肿瘤。评估早期腹膜播散有利于延长生存。然而，目前检测腹膜转移的策略仅限于低灵敏度和特异性的侵入性病理分析和成像方法。此外，检测、分离、繁殖和分子表征腹膜转移细胞的能力将对临床实践和基础医学研究具有重要价值。由于转移特异性生物标志物的缺乏，从疾病疑似组织的混合细胞中鉴定腹膜转移亚群仍然具有挑战性。
该疾病往往随着腹水的积累而被发现，通常伴随着较难治疗的相当大的肿瘤负荷而发生。目前检测腹膜转移的策略仅限于低灵敏度和特异性的侵入性病理分析和成像方法。此外，检测、分离、传播和分子表征腹膜转移亚群的能力可以促进转移相关生物标志物的发现并发展转移生物学的知识。这对于避免目前对惰性癌症过度诊断和过度治疗以及对侵袭性癌症治疗不足的问题也很重要。然而，仍然缺乏捕捉和分离腹膜转移亚群的方法。
腹膜转移难以通过临床和仪器技术在疾病早期诊断。它在其早期可以完全无症状，症状随着相当大的肿瘤负荷的发展而显示。通过生检或外科手术获得的肿瘤细胞可用于组织学分析以收集病理学特征。然而，侵入性和有风险的样品收集规程使得连续生检不可行。此外，诊断很大程度上取决于医师，这可能具有医师之间的变化性。
成像
尽管成像技术、超声、CT扫描、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层摄影术(PET)成像取得了显著进步，但腹膜转移的评估仍然具有挑战性。由于腹膜解剖结构的复杂性和成像特征的重叠，这些成像方法在检测小腹膜植入物和评估疾病程度中具有有限的灵敏度和准确性。此外，成像设备的高成本和临床放射科医师的要求限制了其应用。
液体生检
液体生检是检测血液中分子生物标志物的微创技术，具有实时评估肿瘤进展、治疗响应、微小残留疾病存在的潜力。液体生检标志物包括循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤DNA(ctDNA)和胞外囊泡(EV)。大多数液体生检技术集中于血源性转移，很少有研究解决其在腹膜转移早期检测中的应用。尽管已经做了相当大的努力来鉴定新的生物标志物，但相对较少的鉴定候选物已经经过严格验证。
虽然多种血清肿瘤标志物：癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、碳水化合物抗原CA19-9和CA125在大多数腹膜转移患者中升高，但其不能特异性区分局部或弥漫性腹膜疾病并指示腹膜转移的风险。
已经开发了各种技术来鉴定和富集已公认是转移性疾病起源的CTC。CTC在血源性转移性疾病患者的血液中罕见，腹膜转移患者中存在甚至更低浓度的CTC。例如，与乳腺癌和前列腺癌患者相比，结直肠癌患者中CTC不太可能存在，在卵巢癌和胰腺癌中更加罕见。因此，到目前为止，很少有研究解决其在腹膜转移中的应用。
3.发明概述
本公开涉及诊断受试者中腹膜癌或转移性原发性肿瘤的方法，以及向诊断为发展转移的原发性肿瘤，特别是腹膜癌的受试者提供预后的方法，其包括确定腹膜细胞与P选择素或E选择素的结合的步骤。此外，本公开涉及诊断试剂盒，其包含至少一种用于检测腹膜细胞与P选择素的结合的物质，单独或者联合E选择素用于腹膜癌和/或转移性原发性肿瘤的诊断或预后。
本文公开了检测和分离腹膜转移细胞的方法。该方法包括将肿瘤细胞样品引入微流控装置的入口，其中通道底部包被有P选择素重组蛋白，在期望的壁面剪切应力(wallshear stress)下使样品流动，并随着在流动条件下通过P选择素捕捉腹膜转移细胞，将腹膜转移细胞与样品中的其他细胞分离。
本方法充当腹膜转移风险预测平台，其可用于早期转移检测。该方法还能够分离转移亚群，因此可广泛用于与腹膜转移有关的研究，特别地，适用于与对癌细胞的抗转移作用有关的研究。
发明人发现了腹膜转移细胞和非转移细胞在流动下对P选择素的差异结合能力，并首次鉴定P选择素为潜在的腹膜转移特异性生物标志物。发明人进一步公开了用微流控芯片鉴定和分离腹膜转移细胞的方法。
P选择素是钙依赖性碳水化合物结合分子，其在流体动力学流动下介导瞬时异型细胞-细胞相互作用。发明人鉴定腹膜间皮上表达的P选择素为介导肿瘤细胞附着在腹膜上的功能性粘附分子，并且它是一种腹膜转移特异性生物标志物，其可应用于疾病可疑样品中腹膜转移细胞的鉴定。本文公开了通过微流控系统从疾病疑似样品中检测和选择性捕捉腹膜转移的方法。
本文还提供了额外的生物标志物涂层材料(例如E选择素)和流动条件，以实现更有效的检测和分离系统。在某些实施方案中，良性肿瘤细胞用作对照并使用来自各种类型癌症的样品测试该方法的功效。
本文提供用于检测从受试者获得的样品中的腹膜转移细胞的方法，其包括：(a)将样品中的腹膜转移细胞和腹膜非转移细胞与P选择素接触；以及(b)检测腹膜转移细胞与P选择素的选择性结合。
在某些实施方案中，腹膜转移细胞来自胃肠癌或妇科癌症。
在某些实施方案中，妇科癌症是卵巢癌、子宫癌、宫颈癌或阴道癌。
在某些实施方案中，胃肠癌是肝癌、结肠癌、前列腺癌、膀胱癌和直肠癌。
在某些实施方案中，该方法进一步包括分离腹膜转移细胞的步骤。
在某些实施方案中，该方法进一步包括培养腹膜转移细胞的步骤。
在某些实施方案中，该方法进一步包括表征腹膜转移细胞。
本文提供了用于检测从受试者获得的样品中的腹膜转移细胞的方法，其包括：(a)将样品引入微流控装置的入口，其中微流控装置包含用P选择素包被的通道；(b)在有效壁面剪切应力下使样品流动；(c)将腹膜转移细胞与非腹膜转移细胞分离，其中腹膜转移细胞与P选择素结合；以及(d)检测腹膜转移细胞。
在某些实施方案中，有效壁剪切应力为约0.1达因/cm2。
在某些实施方案中，该装置是微流控芯片。
在某些实施方案中，通过标记物检测腹膜转移细胞。
在某些实施方案中，腹膜转移细胞来自胃肠癌或妇科癌症。
在某些实施方案中，妇科癌症是卵巢癌、子宫癌、宫颈癌或阴道癌。
在某些实施方案中，胃肠癌是肝癌、结肠癌、前列腺癌、膀胱癌和直肠癌。
在某些实施方案中，该方法进一步包括分离腹膜转移细胞的步骤。
在某些实施方案中，该方法进一步包括培养腹膜转移细胞的步骤。
本文提供了用于分离从受试者获得的样品中的腹膜转移细胞的装置，其包括：(a)将样品引入微流控装置的入口，其中微流控装置包含用可检测P选择素包被的通道；(b)通过腹膜转移细胞与可检测P选择素的选择性结合，将样品中的腹膜转移细胞与非腹膜转移细胞分离。
在某些实施方案中，有效壁剪切应力为约0.1达因/cm2。
在某些实施方案中，该装置是微流控芯片。
在某些实施方案中，通过标记物检测腹膜转移细胞。
在某些实施方案中，腹膜转移细胞来自胃肠癌或妇科癌症。
在某些实施方案中，妇科癌症是卵巢癌、子宫癌、宫颈癌或阴道癌。
在某些实施方案中，胃肠癌是肝癌、膀胱癌和直肠癌。
在某些实施方案中，该方法进一步包括分离腹膜转移细胞的步骤。
在某些实施方案中，该方法进一步包括培养腹膜转移细胞的步骤。
本文提供了筛选抗转移药物的方法，其包括：(a)将转移细胞与测试剂接触；(b)经处理的转移细胞与P选择素的选择性结合；(c)检测不与P选择素选择性结合的与测试剂接触的转移细胞，其中不与P选择素结合的转移细胞指示细胞与具有抗转移特性的测试剂接触。
在某些实施方案中，通过标记物检测腹膜转移细胞。
在某些实施方案中，腹膜转移细胞来自胃肠癌或妇科癌症。
在某些实施方案中，妇科癌症是卵巢癌、子宫癌、宫颈癌或阴道癌。
在某些实施方案中，胃肠癌是肝癌、膀胱癌和直肠癌。
在某些实施方案中，该方法进一步包括分离腹膜转移细胞的步骤。
在某些实施方案中，该方法进一步包括培养腹膜转移细胞的步骤。
本文提供了用于检测从受试者获得的样品中的腹膜转移细胞的试剂盒，所述试剂盒包含微流控芯片和可检测的P选择素。
4.附图说明
图1A-1G转移性癌症干细胞的分离和表征。(A)卵巢转移癌干细胞的分离。蓝色圆圈，原发性肿瘤。红星，转移。(B,C)经由(B)原位或(C)i.p.注射的移入M-CSC或NM-CSC的NOD/SCID小鼠。左：代表性生物发光图像。右：腹膜腔内转移的代表性视图。箭头，转移。比例尺，1cm。每组n＝5只(原位)或3只小鼠(i.p)。(D,E)来自原位移植M-CSC或NM-CSC的小鼠的原发性肿瘤的代表性图像(D)和H&E染色(E)。箭头，肿瘤。比例尺＝1cm(D)或50μm(E)。(G)移入患者样品M-CSC的小鼠中转移的代表性视图。箭头，转移。比例尺，1cm。n＝7只小鼠，从三名患者收集的样品。(H)与来自卵巢癌患者TCGARNA-seq数据的转移性(Met.)相对于非转移性(非Met.)肿瘤相比，M-CSC和NM-CSCS的基因表达模式。左：热图代表M-CSC和NM-CSC中的基因。行代表不同的基因，并且列代表每个样品。蓝色：下调；红色：上调。右：针对TCGA转移性卵巢肿瘤中已排名的基因表(从上调到下调)，M-CSC样品中差异性上调基因的基因集富集分析。X轴从左到右：TCGA转移性肿瘤中从上调到下调的有序基因。独立进行两次(a-f)或三次(g，每组n＝3)实验。结果表示为平均值±SEM。使用未配对Student’s t检验进行统计分析。ns，不显著。**，P<0.01。
图2A-2C M-CSC和NM-CSC在HPMC上滚动粘附的差异能力。(A)M-CSC和NM-CSC上HPMC上的拴系的百分比。(B)HPMC单层上CSC的滚动速度。每个点代表单个癌症球体。虚线：两个细胞系的中位数速度。(C)在不同剪切应力下M-CSC和NM-CSC在HPMC上的粘附的百分比。结果代表三个独立实验。误差棒指示平均值的SEM。n＝44/49(0.03)、35/43(0.04)、54/30(0.05)、52/74(0.07)、51/28(0.1)、92/103(0.15)。使用卡方检验(A,C)和单尾未配对Student’s t检验(B)进行统计分析。ns，不显著。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。
图3A-3K P选择素调节M-CSC的转移进展。(A)选择素在HPMC上的细胞表面表达。E选择素(E-sel)、P选择素(P-sel)、L选择素(L-sel)。(B)用抗选择素抗体染色的人网膜组织。比例尺，50μm。(C,D)在0.05达因cm-2下与抗选择素抗体或IgG预孵育的HPMC上的M-CSC的滚动速度(C)、粘附百分比(D)。n＝59、45、83、48。(E)在0.05达因cm-2下，CSC粘附到选择素重组蛋白或Fc上的百分比。n＝35/39、46/45、52/63、54/52。(F)在0.05达因cm-2下，患者腹水衍生的肿瘤粘附到选择素上的百分比。n＝100、131、160、247，从3名患者收集的肿瘤样品。数据(平均值±SEM)来自三个独立实验之一，卡方检验(D-F)。(G,H)P选择素野生型(SelpWT)或敲除(Selp-/-)Rag2缺陷小鼠原位(G)或i.p.(H)接种M-CSC细胞。箭头：转移。比例尺，1cm。来自两个独立实验的n＝6只小鼠(原位)或9只小鼠(i.p.)。(I,J)卵巢原发性肿瘤的代表性图像(I)和H&E染色(I)。箭头，肿瘤。比例尺＝1cm(I)或50μm(J)。(K)粘附在小鼠腹膜上的肿瘤细胞的荧光信号。M-CSC衍生自SKOV-3(左，n＝3只小鼠)和患者样品(右，n＝6只小鼠，从两名患者收集的肿瘤样品)。数据(平均值±SEM)来自两个独立实验，未配对Student’s t检验(I,K)。ns，不显著。*，P<0.05；**，P<0.01。
图4A-4J sLex介导M-CSC与HPMC上的P选择素相互作用。(A-E)处理后M-CSC与HPMC或P选择素-Fc粘附的百分比。(A)神经氨酸酶处理。n＝73/35、46/108。(B)岩藻糖苷酶处理。n＝98/153、67/64。(C)NaClO3处理。n＝49/65、35/89。(D)抗sLex处理。n＝108/68、89/71。(E)抗sLea处理。n＝108/68、89/71。(F)sLea/x在CSC上的细胞表面表达。左：流式细胞术的代表性图像。右：相对阳性细胞图。n＝3。(G-J)处理后粘附到HPMC或P选择素-Fc的M-CSC的百分比。(G)胰蛋白酶处理。n＝32/36；28/68。(H)PPMP处理。n＝77/37、54/46。(I)OSGE处理。n＝42/109、54/95。(J)PNGase处理。n＝42/31、54/31。数据(平均值±SEM)来自三个独立实验之一，卡方检验(A-E,G-J)或来自三个生物学重复，未配对Student’s t检验(F)。ns，不显著。*，P<0.05；**，P<0.01。
图5A-5F含有sLex的P选择素配体是IGF-1R依赖性的。(A,B)HPMC上经RTK抑制剂处理后粘附M-CSC的百分比。染料木素(Genistein)，通用RTK抑制剂；AG1024，IGF-1R抑制剂；AG1478，EGFR抑制剂；K252a，c-Met抑制剂；SU5402，FGF-1R抑制剂。n＝39、36、56、20、24、24。(B)经抗IGF-1R处理后M-CSC与HPMC或P选择素-Fc粘附的百分比。n＝45/71、70/72。数据(平均值±SEM)来自三个独立实验之一，卡方检验(A,B)。(C)经P选择素-Fc下拉的M-CSC蛋白裂解物中IGF-1R的存在。(D)在M-CSC的IGF-1R上检测HECA-452抗原。(E)结合在M-CSC上的P选择素激活IGF-1R的磷酸化作用。(F)M-CSC和NM-CSC中CD24(左)和IGF-1R(右)的mRNA表达。数据(平均值±SEM)来自三个生物学重复，n＝3，未配对Student’s t检验。ns，不显著；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。
图6A-6G FUT5对卵巢癌进展至关重要。(A)与sLex生物合成相关的糖基因(glycogene)的mRNA表达。左：示意图指示sLex生物合成。sLex是通过将N-乙酰葡糖胺(GalNAc)、半乳糖(Gal)、唾液酸(NeuAc)和岩藻糖(Fuc)依次添加到由N-乙酰葡糖胺转移酶(GnT)、1,4-半乳糖基转移酶(B4GalT1-4)、α2,3-唾液酸转移酶(ST3Gal3、4、6)和α1,3-岩藻糖基转移酶(FUT3-7、9)催化的骨架上而合成的。中：M-CSC和NM-CSC中糖基因的mRNA表达。每组n＝3。右：正常人卵巢表面上皮(OSE)细胞和收集自卵巢癌患者(OvCa)的M-CSC中糖基因的mRNA表达。n＝2名患者(OSE)或n＝4(OvCa)。数据表示为平均值±SEM，未配对Student’s t检验。(B)在FUT5敲低的M-CSC上检测HECA-452抗原。数据(平均值±SEM)来自三个生物学重复，n＝3，未配对Student’s t检验。(C)粘附到HPMC或P选择素-Fc上的FUT5敲低M-CSC的百分比。n＝64/55、67/35。数据(平均值±SEM)来自三个独立实验之一，卡方检验。(D)经NS或FUT5 shRNA转导的M-CSC原位(上)或i.p.(下)异种移植模型小鼠中的转移。箭头：转移。比例尺，1cm。n＝3只小鼠(原位)或6只小鼠(i.p.)。(E,F)小鼠原发性肿瘤的代表性图像(E)和H&E染色(F)。箭头，肿瘤。比例尺＝1cm(E)或50μm(F)。(G)FUT5 mRNA在原发性肿瘤中的表达。每组n＝3只小鼠。数据(平均值±SEM)来自三个生物学重复，n＝3，未配对Student’s t检验。实验独立进行两次(D-F)或三次(A-C,G)。ns，不显著。*，P<0.05。**，P<0.01；***，P<0.001。
图7sLex-P选择素在腹膜转移中结合的示意图。
图8A-B(A)肿瘤细胞流过微通道的示意图，其中在P选择素包被的通道底部选择性地捕捉转移细胞。(B)微流控通道的几何图案(左)和通道内体积流速到壁面剪切应力的转换方程(右)。
图9A-9E显示了流动粘附测定的结果。(A)P选择素重组蛋白上代表性细胞的瞬时速度。三角形代表滚动粘附高度转移(HM)细胞；圆圈代表快速通过通道的非相互作用非转移(NM)细胞。在0.1达因/cm2的剪切应力下，HM细胞在P选择素基底上牢固粘附之前表现出稳定滚动。(B)NM和HM细胞在P选择素重组蛋白上的滚动百分比。(C)累积频率滚动速度直方图。(D)NM和HM细胞在P选择素重组蛋白上的粘附百分比。将HM或NM细胞以0.1达因/cm2的剪切应力引入经1g/ml P选择素-Fc嵌合体或Fc对照预包被的流动室。在显微镜下观察细胞运动并用高速相机捕捉。癌细胞滚动速度通过用持续时间除以移动距离来计算。将滚动定义为癌细胞在临界速度(流体动力学流速的50％)下移动并且在观察期间没有停止。将粘附定义为癌细胞在记录过程中停止移动超过一秒。通过将滚动或粘附细胞的数目除以进入观察视野区域(the field of observation area)30秒的细胞总数目来量化滚动或粘附分数。(E)NM和HM细胞在0.05-0.15达因/cm2剪切应力下对P选择素-Fc嵌合体的粘附百分比。数据表示为平均值±S.E.；*P<0.05，**P<0.01。
HM细胞在流动下对P选择素重组蛋白具有明显的结合能力。与NM细胞相比，HM展现出更高的滚动频率P选择素(77.2％)(9B)，具有更低的速度(9C)，随后显著更高的P选择素上粘附能力(比NM高约6倍)(9D)。随着壁面剪切应力的增加，转移细胞与非转移细胞之间的差异结合特性变得更加明显，NM细胞在超过0.1达因/cm2(9E)的剪切应力下全部被洗走，表明HM细胞在更广泛的剪切应力范围内支持P选择素介导的滚动粘附的更大能力。
图10A-10B显示了EDTA脱附(detachment)测定。通过灌注EDTA溶液，捕捉的转移细胞很容易从通道底部分离。(A)捕捉的HM细胞的明场显微镜图像。白点是粘附在通道底部上的肿瘤细胞。(B)EDTA脱附后通道的明场显微镜图像。将结合缓冲液中的HM细胞以0.1达因/cm2的剪切应力引入P选择素重组蛋白包被的通道1min，然后以相同的剪切应力用PBS灌注1min。然后以1达因/cm2的应力剪切用5mM EDTA溶液灌注通道1min。在显微镜下观察EDTA脱附前或后的微流控通道。比例尺，50μm。
图11显示了流动下原发性肿瘤细胞在P选择素重组蛋白上的粘附百分比。
图12显示了抗体和重组蛋白表。
图13显示了生化抑制剂表。
图14显示了DNA引物表。
图15显示了SelpWT和Selp-/-小鼠中的转移的表。
图16显示了具有NS或FUT5 shRNA转导M-CSC的小鼠中的转移(meatstatsis)的表。
图17显示了HEYA8 M-CSC的表征。经原位(a)或i.p.(b)注射植入HEYA8M-CSC或NM-CSC的NOD/SCID小鼠。每组N＝3只小鼠，进行两次体内肿瘤异种移植实验。左：代表性生物发光图像。右：腹膜腔内转移的代表性视图。比例尺，1cm。在0.05达因cm-2下，cHEYA8 M-CSC和NM-CSC在HPMC上拴系的百分比。d在0.05达因cm-2下，癌症球体在HPMC上的滚动速度。在HPMC上粘附的eHEYA8 M-CSC和NM-CSC百分比。n＝31/45。数据(平均值±SEM)来自三个独立实验之一。使用卡方检验(c,e)和单尾未配对Student’s t检验(d)进行统计分析。**，P<0.01；***，P<0.001。
图18显示了HPMC的形态学和基因表达。a在低传代(传代0和3)时HPMC的代表性明场图像。比例尺，100mm。b HPMC不同传代中EMT标志物的mRNA表达。c HPMC和HUVEC中选择素的mRNA表达。数据(平均值±SEM)来自两个生物学重复，n＝2，配对(b)或未配对(c)Student’s t检验。ns，不显著；*，p<0.05。
图19显示了P选择素介导HEYA8 M-CSC-HPMC相互作用。a,b在0.05达因cm-2下，HEYA8 M-CSC在经抗P选择素阻断的HPMC上的累积频率(a)和粘附的百分比(b)。n＝93/65。c在0.05达因cm-2下，粘附到选择素上的HEYA8 M-CSC和NM-CSC百分比。n＝36/76、20/22、65/97、21/17。数据(平均值±SEM)来自三个独立实验之一。使用未配对Student’s t检验(a)和卡方检验(b,c)进行统计分析。**，p<0.01；***，p<0.001。
图20显示了P选择素介导的结合是抗剪切和Ca2+依赖性的。a SKOV-3M-CSC在HPMC上的脱附。b在0.05达因cm-2下，EDTA存在或缺乏的情况下，粘附在HPMC或P选择素-Fc上的SKOV-3M-CSC百分比。n＝31/58、21/11。数据(平均值±SEM)来自两个独立实验之一，卡方检验。**，p<0.01。c在EDTA存在或缺乏的情况下，SKOV-3M-CSC在P选择素-Fc上的脱附。
图21显示了HEYA8M-CSC和NM-CSC细胞上的sLea/x表达。左：流式细胞术的代表性图像。右图：相对阳性细胞图。数据(平均值±SEM)来自三个生物学重复，n＝3，未配对Student’s t检验。*，p<0.05。
图22显示了抑制剂处理后P选择素-Fc上的粘附M-CSC百分比。在P选择素-Fc重组蛋白上灌注之前，SKOV-3M-CSC经或不经通用RTK抑制剂染料木素或IGF-1R抑制剂AG1024处理。n＝41、33、46。数据(平均值±SEM)来自三个独立实验之一，卡方检验。**，P<0.01；***，P<0.001。
图23显示了糖基转移酶与转移特性和患者预后之间的相关性。a HEYA8M-CSC和NM-CSC中糖基因的mRNA表达。数据(平均值±SEM)来自三个生物学重复，n＝3，未配对Student’s t检验。*，P<0.05。b具有高(红色)和低(黑色)特定基因表达水平的晚期卵巢癌患者中B4GalT4、ST3Gal3、ST3Gal4和FUT5表达的Kaplan-Meier无进展生存(PFS)分析。使用对数秩检验进行统计分析。
图24显示了流式细胞术分析的门控策略。a HPMC上选择素细胞表面染色的代表性门控策略。b SKOV-3M-CSC上HECA-452细胞表面染色的代表性门控策略。
图25显示全印迹。
图26显示了微流控芯片对高转移性和非转移性SKOVip1细胞的差异捕捉。高度转移(HM)SKOVip1和非转移性(NM)SKOVip1细胞以0.1达因/cm2的剪切应力灌注到微流控芯片中。在混合样品中，HM和NM细胞以1:1的比例混合，其中只有一种经荧光标记和计数。用CMFDACelltracker(2.5mg/mL)标记细胞。在荧光显微镜下观察细胞的运动，并以1图像/s的速度捕捉30s。每个样品选择4个随机区域进行数据分析。***P<0.001。
图27显示具有不同转移潜能的卵巢癌细胞系的差异捕捉。(a)高度转移(HM)HeyA8和非转移性(NM)HeyA8细胞；(b)网膜衍生(omen)和卵巢衍生(ov)的OVSAHO细胞；(c)SKOV-3和OVCAR-3细胞以0.1达因/cm2的剪切应力灌注到微流控芯片中。用CMFDA Celltracker(2.5mg/mL)标记细胞。在荧光显微镜下观察细胞的运动，并以1图像/s的速度捕捉30s。每个样品选择4个随机区域进行数据分析。**P<0.01；***P<0.001。
图28显示了具有不同转移潜能的结肠直肠癌细胞和前列腺癌细胞的差异捕捉。(a)SW620和SW480大肠癌细胞单独，或以1:1的比例混合；(b)LNCaP和PC3前列腺癌细胞；(c)MKN45和AGS胃癌细胞以0.1达因/cm2的剪切应力灌注到微流控芯片中。用CMFDACelltracker(2.5mg/mL)标记细胞。在荧光显微镜下观察细胞的运动，并以1图像/s的速度捕捉30s。每个样品选择4个随机区域进行数据分析。**P<0.01；***P<0.001。
图29显示微流控芯片作为抗转移药物筛选平台。经(a)德法替尼(Defactinib)或DMSO(作为溶剂对照)；(b)A6肽或PBS(作为溶剂对照)处理24h的高度转移SKOVip1细胞。细胞随后以0.1达因/cm2的剪切应力灌注到微流控芯片中。用CMFDA Celltracker(2.5mg/mL)标记细胞。在荧光显微镜下观察细胞的运动，并以1图像/s的速度捕捉30s。每个样品选择4个随机区域进行数据分析。***P<0.001。
5.发明详述
器官特异性定殖表明特异性细胞-细胞识别至关重要。然而，人们对这种特殊的相互作用知之甚少。此外，肿瘤细胞沉积(lodgement)需要在剪切应力条件下而非静态条件下结合。在这里，我们成功地分离了癌症干/肿瘤起始细胞(M-CSC)的转移群体。我们显示M-CSC相比非转移性(NM)-CSC拴系更多，滚动更慢，从而导致在腹水剪切应力下优先结合腹膜间皮。从机制上讲，这种相互作用是由腹膜间皮表达的P选择素介导的。携带不常见的非硫酸化唾液酰基-Lewisx(sLex)表位的胰岛素样生长因子受体-1充当独特的P选择素结合决定簇。几种糖基转移酶，尤其是对sLex合成具有限速活性的α1,3-岩藻糖基转移酶，在M-CSC中高度表达。肿瘤异种移植物和临床样品证实了这些发现的相关性。这些数据促进了我们对腹膜转移分子调控的理解，并支持了靶向sLex-P选择素级联的治疗潜力。
由于广泛的腹膜转移病灶，在所有妇科恶性肿瘤中卵巢癌具有最低的5年生存率(<25％)1。尽管不如血源性转移常见，但因为腹膜腔中的转移以正前馈方式快速增长，腹膜转移的治疗众所周知地具有挑战性2。目前的治疗令人不满意，并且在过去几十年中患者几乎没有取得总体临床益处。可以想象，阐明调节这一过程的潜在分子机制将可以想象地有利于有效治疗策略的开发。
不同器官中转移的屏障不同，这表明癌细胞和腹膜间皮之间的特异性识别对于腹膜特异性定殖至关重要3。此外，腹膜中的肿瘤细胞沉积始终暴露于腹水流产生的剪切力4。然而，由于难以操纵动态流动条件，很大程度上忽视机械力在这种粘附中的作用。因此，粘附分子和在腹水流下操作癌细胞粘附的潜在信号传导仍然是知识上的空白。
选择素(E、P和L选择素)是钙依赖性糖蛋白家族，是迄今为止所描述的抗剪切相互作用的主要聚糖受体5。虽然三种选择素的结构高度相似，但它们的组织分布和结合动力学不同，反映了它们在包括肿瘤转移的各种病理生理过程中的不同作用。因此，选择素与其配体之间的选择性结合决定了转移目的地。肿瘤细胞在剪切应力下利用选择素-聚糖结合进行包括拴系和滚动的初始细胞-细胞相互作用，这进一步引起促进细胞牢固粘附的分子信号传导6。这种相互作用已在血源性转移中得到广泛研究7,8。相比之下，选择素在腹膜间皮细胞上表达，表明由选择素介导相互作用启动的类似受体/配体级联可能促进肿瘤细胞腹膜靶向9,10。然而，控制腹膜转移粘附的详细潜在机制知之甚少。腹膜剪切应力(约0.1达因cm-2；至少比血管剪切应力低10倍)11的差异表明腹膜播散的生物学与血源性转移的生物学不同，并且可能涉及不同的分子机制。
我们讨论了与非转移性(NM)-CSC相比，转移性癌症干/肿瘤起始细胞(M-CSC)与腹膜间皮的优先结合。我们还提供了以下证据：P选择素是腹膜间皮上的关键分子，在腹水流诱导的剪切应力下，它通过含有独特唾液酰基-Lewisx(sLex)的胰岛素样生长因子受体-1(IGF-1R)配体介导结合。
患者样品
为了检测癌症，从患者获得测试样品。患者可能患有或可能没有癌症。在这种情况下，本发明的方法用于诊断或检测患者是否患有癌症或特定类型的癌症，或具有发展癌症或特定类型癌症的倾向。或者，本发明的方法可用于已知患有癌症或特定类型癌症的患者。在这种情况下，可以监测癌症或特定类型癌症的预后。补充的此类方法用于各种特定癌症中的任一种，包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌等，诸如和包括如下文和本文所进一步描述的。
对于用于评估的疾病或癌症，从患者获得的测试样品可以是任何组织、病理学或体液样品。例如，测试样品可以是血液样品、血清样品、血浆样品、尿液样品、宫颈分泌物样品、阴道分泌物样品、卵巢液或卵巢组织样品、腹水样品、多种腹水样品、唾液样品、脑脊液样品或组织样品。在许多实施方案中，样品是血清样品。
结合的检测可以是直接的，例如，通过检测附着在与抗体或其他蛋白质或多肽结合的分子上的标记。检测可以是间接的，例如，通过检测可以与人抗体结合的标记二抗。可以使用任何可用的检测方法观察结合标记。例如，可以采用阵列扫描仪以检测结合到阵列的荧光标记分子。在本文所示的实验中，使用了ScanArray 5000(GSI Lumonics,Watertown,Mass.)共焦扫描仪。来自这种阵列扫描仪的数据可以通过本领域可用的方法进行分析，例如，通过使用ImaGene图像分析软件(BioDiscovery Inc.,El Segundo,CA)。
一般而言，如本文所示，通过抗体(或其他结合实体)检测患者血清中的P选择素结合增加是患者可能患有癌症，包括如本文所述的卵巢癌、乳腺癌、肺癌的指标。P选择素结合水平随时间变化的比较提供了癌症是否正在向转移进展、患者是否正响应所选治疗或者癌症是否正在缓解期的指标。因此，本文还提供了用于监测患者癌症进展的方法。
根据一方面，生物样品可以是来自患者的流体或固体样品，特别是血液、血清、血浆、尿液、组织、骨、软骨、器官等的样品。该组织样品可以是原发肿瘤样品，对照可以是非转移性肿瘤组织的样品或标准。这些样品可以根据本领域技术人员已知的方法获取并如果必要的话进行制备。在某些实施方案中，公开了在微流控装置(或“芯片”)中扩增细胞的方法。微流控装置可以包括微流控通道和与通道流体连接的隔离栏(sequestration pen)，配置隔离栏以支持细胞的培养和扩增。在某些实施方案中，微流控装置可以是纳米流控装置。隔离栏可以具有，例如约0.5x106至约5.0x106立方微米，或约0.5x106至约2.0x106立方微米的体积。此外，微流控装置可具有多于一个的微流控通道和与每个微流控通道流体连接的多个隔离栏，配置多个隔离栏中的每个隔离栏以支持细胞的培养和扩增。细胞可以是转移性或非转移性细胞。可以调节隔离栏的一个或多个表面。
扩增细胞的方法可以包括：将一个或多个细胞引入微流控装置的隔离栏中；并且用标记物、P选择素或E选择素接触该一个或多个细胞。在一些实施方案中，将20个或更少、10个或更少、6至10个、5个或更少、约5个、约4个、约3个、约2个或1个细胞引入隔离栏中。如果微流控装置包括多个隔离栏、一个或多个细胞(例如，20个或更少、10个或更少、6至10个、5个或更少、约5个、约4个、约3个、约2个或1个细胞)可以引入一个或多个隔离栏中的每一个。扩增细胞的方法可以进一步包括通过微流控装置的微流控通道灌注培养基。灌注可以是连续的或间断的，并且可以持续一段足够的时间以允许引入一个隔离栏(或多个隔离栏)中的一个或多个细胞经历至少一轮有丝分裂细胞分裂。腹膜细胞与本文所公开标志物的特异性结合可以通过流动粘附试验来确定。通过用移动距离除以持续时间来计算腹膜转移细胞和腹膜非转移细胞的瞬时速度。定义滚动为癌细胞在临界速度(流体动力学流速的50％)下移动并且在观察期间没有停止。定义粘附为癌细胞在记录过程中停止移动超过一秒钟。然后量化滚动或粘附分数。转移细胞在流动下对P选择素具有截然不同的结合能力。
在一个实施方案中，转移细胞从受试者的实体瘤样品获得。实体瘤样品可以是细针抽吸(FNA)或肿瘤生检(例如，核心生检)。实体瘤可以是乳腺癌、泌尿生殖系统癌症(例如，起源于泌尿道诸如肾脏(例如肾细胞癌)、输尿管、膀胱或尿道的癌症；男性生殖道癌症(例如睾丸癌、前列腺癌或者精囊、精管或阴茎的癌症)；或女性生殖道癌症(例如卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、阴道癌或输卵管癌)、神经系统癌症(例如神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤)、肠癌(例如结直肠癌)、肺癌、黑色素瘤或其他类型的癌症。在具体实施方案中，实体瘤可以是髓样乳腺癌、间皮瘤或黑素瘤。
样品可以来自受试者，例如患有癌症(例如，本文所描述或本领域已知的任何类型的癌症)的受试者。样品可以是外周血样品或其衍生物(例如PBMC样品)。或者，样品可以是实体瘤生检。在一些实施方案中，处理外周血样品以富集细胞。在其他实施方案中，处理肿瘤样品以富集细胞。依然在其他实施方案中，处理肿瘤样品以富集腹膜细胞。
在某些实施方案中，通过微流控装置的微流控通道灌注培养基至少24小时(例如，至少48、72、96、110或更多小时，或其间的任何数目)。在某些实施方案中，培养基包括哺乳动物血清，其可以是人血清(例如，人AB血清)，任选地联合牛血清(例如，胎牛血清或小牛血清)。
试剂盒
提供了诊断试剂盒，其用于确定样品中的腹膜细胞与生物样品中根据本公开的标志物的特异性结合，即通过比较含有一个或多个标志物的感兴趣样品中的腹膜细胞与对照或标准的结合，特别是关于标志物表达的增加。因此，特别地，诊断试剂盒非常适用于转移性原发肿瘤的早期检测，这继而允许快速和靶向治疗。因此，该诊断试剂盒以及要求保护的方法也可用于例如区分非转移性和转移性腹膜细胞。诊断试剂盒应优选包含例如与根据本公开的标志物/标志物或细胞反应的一种或多种标记物。
本公开提供了用于诊断或监测个体中癌症的试剂盒，其中确定来自所述个体的测试样品的P选择素结合谱(profile)，并将测得的谱与正常患者的谱或具有癌症家族史的患者的谱进行比较。
本公开进一步关于包装的药物或诊断组合物，诸如用于检测、控制、预防或治疗新生物(例如卵巢癌、乳腺癌、肺癌)或其他病症的试剂盒。在一个示例性实施方案中，试剂盒或容器装有用于检测癌症的P选择素阵列或库和使用该P选择素阵列或库检测癌症的说明。该阵列包括至少一种与癌症患者血清样品中存在的抗体结合的P选择素。
试剂盒还可以包括带有用于施用本发明组合物的工具的容器。此类工具包括注射器、拭子、导管、抗菌溶液等等。
微流控装置
本文所述的任何方法都可以使用具有一个或多个内表面(例如，基板表面、覆盖表面和/或回路材料的表面)的微流控装置执行，该内表面已经过处理或涂覆以呈现一层有机和/或亲水性分子，其提供在微流控装置和其中生长的细胞之间的主要界面。例如，流动路径和隔离栏可以用与一个或多个内表面结合并呈现有机和/或亲水分子层的涂层溶液进行处理。因此，涂层溶液可包含与一个或多个内表面结合的涂层剂，例如血清、血清白蛋白(例如BSA)、聚合物、洗涤剂、酶或其任何组合。
在某些实施方案中，微流控装置可包括包含涂层材料的内基板表面(和/或内盖表面和/或回路材料的内表面)。在一些实施方案中，涂层材料包括具有连接基团和烷基部分的分子。连接基团可以共价键合到内基板表面，并且可以是例如甲硅烷氧基(siloxy)连接基团。烷基部分可以是例如未取代的烷基部分或取代的烷基部分，诸如氟烷基部分或全氟烷基部分。烷基部分可包括包含至少10个碳原子(例如，至少12、14、16、18、20、22或更多个碳原子)的线性碳链。涂层材料的分子可以形成共价结合到内基板表面(和/或内盖表面和/或回路材料的内表面)的致密填充的单层结构。
在一些实施方案中，涂层材料包含具有连接基团和阳离子部分和/或阴离子部分的分子，其中连接基团共价键合至内基板表面(和/或内盖表面和/或回路材料的内表面)。阳离子部分可包括季铵基团。阴离子部分可包括膦酸、羧酸或磺酸。在一些相关实施方案中，涂层材料可包含具有连接基团和两性离子部分的分子，其中连接基团共价结合到内基板表面(和/或内盖表面和/或回路材料的内表面)。两性离子部分选自羧基甜菜碱、磺基甜菜碱、氨基磺酸和氨基酸。在一些实施方案中，阳离子、阴离子或两性离子部分能够与封闭剂离子键合。
在一些实施方案中，涂层材料包括包含亚烃醚部分、糖部分或氨基酸部分的聚合物。例如，涂层材料可包括葡聚糖或聚乙二醇(PEG)。或者或另外，涂层材料可包括蛋白质聚合物(例如，维持细胞生长的蛋白质)。
微流控装置是包括一个或多个经配置以容纳流体的离散微流控回路的装置，每个微流控回路由流体互连的回路元件组成，包括但不限于区域、流动路径、通道、腔室和/或栏，以及至少一个端口，其配置为允许流体(和，任选地，悬浮在流体中的微物体(micro-object))流入和/或流出微流控装置。通常，微流控装置的微流控回路将包括流动路径(可包括微流控通道)和至少一个腔室，并且将容纳小于约1mL的流体体积，例如流体体积小于约750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2μL。在某些实施方案中，微流控回路容纳约1-2、1-3、1-4、1-5、2-5、2-8、2-10、2-12、2-15、2-20、5-20、5-30、5-40、5-50、10-50、10-75、10-100、20-100、20-150、20-200、50-200、50-250或50-300μL。微流控回路可以配置为具有与微流控装置中的第一端口(例如，入口)流体连接的第一端点和与微流控装置中的第二端口(例如，出口)流体连接的第二端点。
如本文所用，“微流控通道”或“流体通道”是指长度显著长于水平和垂直尺寸的微流控装置的流动路径。例如，流体通道可以是水平或垂直尺寸的至少5倍长度，例如长度的至少10倍、长度的至少25倍、长度的至少100倍、长度的至少200倍、长度的至少500倍、长度的至少1,000倍长度、长度的少5,000倍或更长。在一些实施方案中，流体通道的长度在约100,000微米至约500,000微米的范围内，包括其间的任何范围。在一些实施方案中，水平尺寸在约100微米至约1000微米(例如，约150至约500微米)的范围内并且垂直尺寸在约25微米至约200微米的范围内，例如，从约40至约150微米。注意到，在微流控装置中，流体通道可以具有多种不同的空间构造，因此不限于完美线性元件。例如，流体通道可以是或包括具有以下构造的一个或多个部分：曲线、弯曲、螺旋、倾斜、下降、叉形(例如，多个不同的流动路径)及其任何组合。此外，流体通道沿其路径可具有不同的横截面积，加宽和收缩以在其中提供期望的流体流动。流体通道可以包括阀，并且阀可以是微流控领域中已知的任何类型。包括阀的微流控通道的实例公开于美国专利No.6,408,878和9,227,200中，其中每篇均通过引用整体并入本文。
如本文关于流体介质所用，“扩散”指流体介质的组分顺浓度梯度向下的热力学运动。
短语“介质的流动”意指主要由于除扩散之外的任何机制所致的流体介质的整体运动。例如，由于点之间的压差，介质的流动可以涉及流体介质从一个点到另一点的移动。这种流动可以包括液体的连续、脉冲、周期、随机、间歇或往复流动，或其任何组合。当一种流体介质流入另一种流体介质时，会导致介质的湍流和混合。
短语“实质上无流动”指随时间平均而言小于材料(例如，感兴趣的分析物)的组分进入或在流体介质内的扩散速率的流体介质的流动速率。这种材料的组分的扩散速率可取决于例如温度、组分的尺寸以及组分与流体介质之间相互作用的强度。
如本文关于微流控装置内的不同区域所用，短语“流体连接”意指，当不同区域实质上填充有流体，例如流体介质时，每个区域中的流体得到连接以形成流体的单一体。这并不意味着不同区域中的流体(或流体介质)在成分上必须相同。相反，微流控装置的不同流体连接区域中的流体可以具有不同的组成(例如，诸如蛋白质、碳水化合物、离子或其他分子的溶质的不同浓度)，这些组成随着溶质顺其各自浓度梯度向下移动和/或流体流过微流控装置而处于流通。
如本文所用，“流动路径”或“流动区域”指一个或多个流体连接的回路元件(例如通道、区域、腔室等等)，其界定并受制于介质流动的轨迹。因此，流动路径是微流控装置的扫描(swept)区域的示例。其他回路元件(例如，未扫描的区域)可以与包括流动路径的回路元件流体连接而不受流动路径中介质流动的影响。
如本文所用，“分离微物体”将微物体限制在微流控装置内的界定区域。微物体可能仍然能够在原位生成的捕捉结构内运动。
微流控(或纳米流控)装置可以包括“扫描”区域和“未扫描”区域。如本文所用，“扫描”区域由微流控回路的一个或多个流体互连的回路元件组成，当流体流过微流控回路时，每个元件经历介质流。扫描区域的回路元件可以包括例如区域、通道和腔室的全部或部分。如本文所用，“未扫描”区域由微流控回路的一个或多个流体互连的回路元件组成，当流体流过微流控回路时，每个元件实质上不经历流体通量。未扫描区域可以流体连接到扫描区域，只要将流体连接构造成在扫描区域和未扫描区域之间能够扩散但实质上没有介质流动。因此可以将微流控装置构造成将未扫描区域与扫描区域中的介质流实质上隔离，同时使扫描区域和未扫描区域之间实质上仅能够进行扩散流体连通。例如，微流控装置的流体通道是扫描区域的示例，而微流控装置的隔离区域(下文进一步详细描述)是未扫描区域的示例。
可以在此类微流控装置中测定生物微物体(例如，生物细胞)产生特定生物材料(例如，蛋白质诸如抗体)的能力。在测定的具体实施方案中，包含用于产生感兴趣的分析物的待测定生物微物体(例如，细胞)的样品材料可以加载到微流控装置的扫描区域中。可以针对特定特征选择一种生物微物体(例如，哺乳动物细胞诸如人类细胞)并将其布置在未扫描区域中。然后剩余的样品材料可以流出扫描区域并且测定材料可以流入扫描区域。由于选定的生物微物体处于未扫描区域，因此选定的生物微物体实质上不受剩余样品材料流出或测定材料流入的影响。可以允许选定的生物微物体产生感兴趣的分析物，该分析物可以从未扫描区域扩散到扫描区域，在扫描区域感兴趣的分析物可以与测定材料反应以产生局部可检测的反应，每个反应都可以与特定的未扫描区域相关。可以分析与检测到的反应相关的任何未扫描区域以确定未扫描区域中生物微物体的哪些(如果有)是感兴趣分析物的充分产生者。
在本公开中有用的标志物和/或细胞可以具有附着于它们的接头、标志物、连接部分和/或其他部分。这些研究中最常用的标记包括放射性元素、酶、暴露于紫外线时会发荧光的化学品和其它。许多荧光材料是已知的并且可以用作标记。这些包括例如荧光素、罗丹明、金胺、Texas Red、AMCA蓝和Lucifer Yellow。特定的检测材料是在山羊中制备并通过异硫氰酸盐与荧光素缀合的抗兔抗体。P选择素和/或细胞也可以用放射性元素或酶标记。可以通过任何当前可用的计数规程检测放射性标记物。酶标记物同样有用，并且可以通过本领域公认的比色、分光光度法、荧光分光光度法、安培计或气体定量技术中的任一种进行检测。酶通过与桥接分子诸如碳二亚胺、二异氰酸酯、戊二醛等的反应与选定的颗粒结合。可以用于这些规程的许多酶是已知的并且可以使用。美国专利No.3,654,090；3,850,752和4,016,043出于其对替代标记材料和方法的公开而引用作为示例。
数据分析/审查/传输
在另一个实施方案中，使用本文所描述方法获得的结果用于检测/治疗/预防个体，例如患者的早期疾病和/或新生物。在进一步实施方案中，早期疾病和/或新生物的检测/治疗/预防方法包括审查或分析，例如与样品中的癌症相关表位反应的循环抗体的存在相关的数据。然后向患者、医疗保健提供者或医疗保健管理者提供结论，该结论基于对疾病诊断或早期疾病检测有关数据的审查或分析。可以设想，在另一个实施方案中，向患者、医疗保健提供者或医疗保健管理者提供结论包括通过网络传输数据。
6.材料和方法
6.1细胞和细胞培养
人卵巢癌细胞系SKOV-3和HEYA8(分别由不列颠哥伦比亚大学的N.Auersperg博士和MD安德森癌症中心的J Liu博士馈赠)在含有5％FBS的Medium 199:MCDB105中维持。通过几代无血清低贴壁培养从萤光素酶标记的SKOV-3和HEYA8中富集CSC，并表征干样(stem-like)特性，如所描述12。HEK293细胞(CRL-1573，ATCC)在含有10％FBS的DMEM培养基中培养。HUVEC(CC-2519，Clonetics)在补充有10％FBS、20μg mL-1内皮细胞生长补充剂、90UmL-1肝素以及1％青霉素和链霉亲合素的F12K中培养。原发肿瘤样品在中国台北医科大学审查委员会知情同意和批准的情况下从卵巢癌患者获得，并进行分离，如描述25。人类肿瘤手术标本和组织样品的使用由香港大学伦理审查委员会批准。正常人卵巢表面上皮(OSE)细胞衍生自患有非恶性妇科疾病的女性正常卵巢的表面刮片(scraping)。从非恶性疾病患者腹膜透析的透析液流出物中分离的HPMC47在补充有10％FBS、1％青霉素和链霉亲合素的Medium199:MCDB105中维持。3代内的HPMC用于确保培养物的遗传稳定性。
M-CSC的分离
将CSC(1x105)注射到NOD/SCID小鼠(雌性，6-8周龄)的卵巢中以允许原发肿瘤形成和腹膜内播散。M-CSC是从腹水中收集的，而NM-CSC是从接种后3周保留在卵巢中的肿瘤负荷中收集的。如前所述，M-CSC或NM-CSC在低贴壁培养皿的无血清培养基中维持。为了进一步验证分离群体的肿瘤发生和转移潜能，将NM-CSC或M-CSC原位(1x105)或腹膜内(5x105)注射到NOD/SCID小鼠中。通过生物发光成像监测肿瘤负荷，并在接种后3-4周收获小鼠。所有动物实验方案均由香港大学活体动物教学及研究委员会批准。
抗体
用于流式细胞术、Western印迹、IHC或微流控灌注测定的抗体或重组蛋白详见图12。
RNA测序和TCGA数据分析
将从三对M-CSC和NM-CSC中提取的总RNA送到北京基因组研究所(BGI)进行RNA测序(RNA-seq)。通过用limma软件的矫正t检验(moderated t-test)确定M-CSC和NM-CSC之间的差异基因表达。与NM-CSC相比，在M-CSC中鉴定出200个基因上调(log2(倍数变化)>1和P<0.05)，并鉴定出216个基因下调(log2(倍数变化)<-1和P<0.05)。对416个差异表达基因(DEG)的表达谱进行分层聚类，发现每个样品组内具有高度的内部一致性。为了发现M-CSC是否可以反映临床转移过程，我们从癌症基因组图谱(TCGA)卵巢癌RNA-seq数据计算了这些基因在转移性和非转移性肿瘤中的倍数变化。为了量化一致性，我们针对TCGA卵巢转移性肿瘤中排序的基因列表(从上调到下调)对M-CSC样品中的DEG进行基因集富集分析。
流式细胞术
培养的贴壁细胞或肿瘤球体经2mM EDTA PBS脱附，悬浮在PBS中并计数。按照制造商的说明，将细胞与一抗、选择素-Fc嵌合体(5μg mL-1，于1mM CaCl2、1mM MgCl2、PBS结合缓冲液中)或同种型对照共同孵育。一抗或重组蛋白用适当的Alexa Fluor 488二抗染色。在FACS AriaIII(BD Biosciences)上收集结果。使用具有图24所示门控策略的FlowJo软件(Tree Star Inc.)分析数据。
微流控CSC灌注测定
如所述13制造微流控芯片。为了用选择素重组蛋白包被微流控通道，通道与1μgmL-1选择素-Fc重组蛋白在PBS中4℃孵育过夜。为了用HPMC包被微流控通道，通道与10μgmL-1人纤连蛋白在无血清培养基中4℃孵育过夜。洗涤后，用HPMC悬浮液(3.5x106mL-1)引入通道，并在CO2培养箱中37℃培养过夜。为了在功能上阻断选择素，在测定前，将HPMC与20μgmL-1抗E选择素、抗P选择素、抗L选择素或同种型抗体在室温下孵育1h。
直径为70-100μm的CSC经细胞过滤器收集，并经CMFDA Celltracker(2.5μg mL-1，C7025，Life Technologies)按照制造商的说明荧光标记以用于测定。在期望的剪切应力下，通过注射泵(LongerPump)将重悬于结合缓冲液(1500个球体mL-1)中的荧光标记的CSC灌注到微流控通道中。结合缓冲液(0.9cp)的粘度在各种腹水病因患者的腹水粘度(0.95±0.15cp)范围内48。在荧光显微镜(Nikon ECLIPSE Ti)下观察癌症球体的运动，并捕捉30sec的连续延时图像(1图像sec-1)。每次处理都捕捉了三个以上随机选择的区域(4x物镜)。
使用ImageJ(美国国立卫生研究院)离线分析流动下癌症球体的运动，并如所述用于相互作用的分类49。简而言之，将拴系在表面上，然后在流动中脱附的癌症球体定义为拴系。将低于流体动力学速度的速度移动超过一个球体直径的癌症球体定义为滚动。将在记录期间保持静止超过一帧的癌症球体确定为粘附。拴系或粘附的百分比通过将拴系或粘附球体的数量除以在30sec持续时间内飞过观察场的球体总数来计算。
在一些实验中，根据制造商的说明，在染色前，将M-CSC与或不与神经氨酸酶(neuramidase)(100mU,N2876,Sigma-Aldrich)、α1-3,4岩藻糖苷酶(150mU,P0769S,NewEngland BioLabs)、OSGE(100μg mL-1,CLE100,Cedarlane)或PNGase(10U mL-1,P0704S,NewEngland BioLabs)在37℃下孵育1h。为了抑制硫酸化，将M-CSC与氯酸钠(25mM,403016,Sigma-Aldrich)在无血清培养基中孵育48h。为了在功能上阻断M-CSC上的sLex、sLea或IGF-1R，将M-CSC分别地与CSLEX-1(10μg mL-1,551344,BD Biosciences)、抗CA19-9(10μg mL-1,ab15146,Abcam)、抗IGF-1R(2μg mL-1,24-60,Invitrogen)或同种型抗体在37℃下孵育1h。为了去除细胞表面糖蛋白，将M-CSC与胰蛋白酶/EDTA溶液(0.05％,25300054,Gibco)一起孵育5min，然后用完全培养基中和。为了抑制糖脂合成，将M-CSC与或不与DL-PPMP(2.5μM,sc-205655,Santa Cruz)在无血清培养基中共同培养5天。为了测试RTKs在介导CSC粘附中的参与，在灌注前用或不用如图13所示的小分子抑制剂处理M-CSC。所有CSC灌注实验都用从至少3名不同患者中分离的HPMC重复。
肿瘤细胞对小鼠腹膜的粘附
衍生自SKOV-3和卵巢癌患者的M-CSC(1x107)经CMFDA荧光标记并i.p.注射到NOD/SCID小鼠中。为了抑制P选择素，在细胞注射前1h将KF38789(1mg kg-1,2748,Tocris)或载体对照注射到小鼠腹腔中。16h后处死小鼠，用PBS清洗腹腔以去除非贴壁细胞。在IVIS光谱中获得贴壁肿瘤细胞的荧光信号，用1％NP-40裂解腹膜、肠系膜和网膜，并用VICTOR(PerkinElmer)测量荧光。
P选择素敲除Rag2免疫缺陷小鼠
C57BL/6Selp-/-(JAX#002289,The Jackson Laboratory)与Rag2-/-(JAX#008449,The Jackson Laboratory)小鼠杂交以产生Selp+/-Rag2+/-杂合子后代。将杂合子后代进一步杂交以(and to)产生纯合P选择素野生型(SelpWT Rag2-/-)和P选择素敲除(Selp-/-Rag2-/-)小鼠，其在杰克逊实验室(Jackson Lab)中通过基因分型进行验证和选择。Selp和Rag2突变体的PCR基因分型用图14中描述的引物进行。纯合株各自地通过在具有相同基因型小鼠之间的繁殖来维持。将SKOV-3M-CSC原位接种(3x106)或i.p.注射(5x106)到SelpWTRag2-/-或Selp-/-Rag2-/-小鼠(雌性，6-8周龄)并如所述监测肿瘤转移进展。
Western印迹
蛋白质(20μg)在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离并转移到硝酸纤维素膜(Bio-Rad)上。使用特异性一抗在4℃下过夜检测靶蛋白。用适当的辣根过氧化物酶偶联的二抗检测一抗，并用增强的化学发光(PerkinElmer)显色。全印迹的扫描显示在图25中。
下拉测定
在冰冷的裂解缓冲液(50mM Tris pH7.4、150mM NaCl、1mM CaCl2和1％Triton X-100和蛋白酶抑制剂混合物(磷酸酶抑制剂1mM Na3VO4、1mM NaF和蛋白酶抑制剂1μg mL-1胃酶抑素，2μg mL-1亮抑酶肽，4μg mL-1抑肽酶、20μg mL-1PMSF))中裂解M-CSC。将1mg细胞裂解物用40μL蛋白A/G琼脂糖珠在4℃搅拌下预清除1h。预清除的裂解物与2μg Fc或P选择素-Fc嵌合体和20μl每管的蛋白A/G琼脂糖珠在4℃下搅拌孵育过夜。收集沉淀的珠并用冰冷的裂解缓冲液清洗。用洗脱缓冲液(50mM Tris pH7.4、10mM EDTA、0.1％Triton、蛋白酶抑制剂混合物)在冰上洗脱P选择素-Fc相互作用蛋白5min。收集洗脱液并通过与laemmli样品缓冲液一起煮沸10min来变性。通过Western印迹检测IGF-1R与P选择素的相互作用。
免疫沉淀
用2mM EDTA、150mM NaCl、1％NP40、50mM Tris pH7.4和蛋白酶抑制剂混合物提取细胞外蛋白。根据制造商的说明，将抗IGF-1R(sc-463,Santa Cruz Biotechnology)固定在溴化氰(CNBr)活化的琼脂糖凝胶(GE Healthcare)上。使用无偶联抗体的CNBr活化的琼脂糖凝胶用作阴性对照。细胞裂解物用CNBr活化的琼脂糖凝胶预清除2h，然后与抗IGF-1R或同种型对照缀合珠在4℃下孵育过夜。免疫沉淀物用冰冷的裂解缓冲液清洗，用0.1％TFA洗脱以及用1M Tris pH8.8中和。通过Western印迹检测IGF-1R上sLea/x的修饰。
组织学分析
组织在4％多聚甲醛中固定，石蜡包埋并经苏木精和伊红染色。对采集自非恶性疾病患者的5μm福尔马林固定、石蜡包埋的人网膜组织切片进行免疫组化检测。热诱导抗原修复在pH6.0柠檬酸钠缓冲液中进行。以1:50稀释度使用单克隆小鼠抗E选择素、抗P选择素和抗-L选择素抗体。应用链霉亲合素-生物素免疫过氧化物酶Histostain SP Bulk试剂盒(Invitrogen)和ImmPACT AEC过氧化物酶底物试剂盒(Vector Laboratories)进行检测，并使用苏木精作为核复染剂。
RNA提取、逆转录和PCR
用Trizol提取总RNA，并使用第一链cDNA合成试剂盒(Invitrogen)将500μgRNA逆转录为cDNA。使用图14中描述的引物通过实时PCR扩增和定量特定基因。使用StepOnePlus实时检测系统和Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)进行实时PCR。在每个退火步骤期间记录荧光测量值。PCR质量和特异性通过熔解曲线分析和凝胶电泳进行验证。通过归一化为GAPDH内源对照来确定相对表达。这些实验一式两份进行，并独立重复三次。
shRNA稳定敲低FUT5
按照制造商的说明用构建体和慢病毒包装质粒(Sigma-Aldrich)共转染HEK293细胞以生成携带靶向FUT5的shRNA(图14中描述的序列)或非特异性(NS)shRNA的慢病毒。用含有病毒颗粒的培养基转导M-CSC，并用1μg mL-1嘌呤霉素(Calbiochem)在转导24h后选择细胞3天。通过q-PCR验证敲低效率。
统计分析
结果表示为平均值±SEM。使用卡方检验确定分类变量之间差异的显著性。使用单尾Student’s t检验评估序数变量。
数据可用性
RNA测序数据已存放在NCBI Trace Archive中，登录号为PRJNA530706。支持本研究结果的所有其他数据可在文章及其补充信息文件中获得，或可根据合理要求从通讯作者处获得。
Kaplan-Meier分析
在综合卵巢癌数据集中进行了无进展生存(PFS)分析1。根据特定基因的mRNA水平，将晚期(FIGO III-IV期)卵巢癌患者(所有临床亚型)分为低表达组和高表达组。使用对数秩检验估计两组的风险差异。选择了给出最显著(pronounced)P值的截止点。
7.结果
7.1M-/NM-CSC模型的建立。为了探索决定卵巢癌转移成功的限制因素，我们推断转移性定殖是一个非常低效的过程，并且仅由癌症干/肿瘤起始细胞(CSC)的一个子集完成3。我们先前已经分离了CSC12。通过将CSC原位植入小鼠卵巢囊中进行体内选择，我们进一步在SKOV-3中分离了高度转移的CSC群体(M-CSC)(图1A)，其持续转移到腹膜，重演了当通过原位或腹腔内(i.p.)注射植入时，人类卵巢癌的临床进展(图1B-E)。相反，同样具有致瘤性的非转移性(NM)-CSC(图1D、E)在两种模型中均未发生转移(图1B-E，表1)。在由原发性卵巢癌样品生成的富含CSC的培养物中观察到类似的转移能力(图1F，表1)。此外，M-CSC具有与卵巢癌患者转移性肿瘤相似的基因表达谱(图1G)，表明体外M-CSC可以密切反映患者的自发性转移性细胞事件。我们还从HEYA8细胞中衍生了M-和NM-CSC，并获得了类似的结果(图17A、B)。
表1肿瘤发生和转移能力的比较
结果表示为来自两个独立实验的平均值±SEM，未配对Student’s t检验。ns，不显著。**，
P<0.01。
拴系、滚动和粘附中的差异能力。为了评估两个CSC群体中不同的转移表型在肿瘤-间皮相互作用中是否具有不同的能力，我们开发了一个可定制的微流控平台，以克服常规方法的技术限制并重演动态流中的腹膜散播13。在明确定义的流速下，将CSC球体灌注到原代人腹膜间皮细胞(HPMC)包被的微流控芯片。如所示，CSC在0.03至0.15达因cm-2(腹水的生理相关剪切应力范围14)下有效捕捉到HPMC，在0.05达因cm-2的剪切应力下具有最大活性(图2A)，与需要清楚的阈值剪切以启动滚动的捕捉键(catch bond)一致15。引人注目的是，控制肿瘤-间皮相互作用的动力学和机械特性在两个CSC群体之间都有显著差异。与NM-CSC相比，M-CSC在HPMC上具有更高的拴系频率(在0.05达因cm-2下为1.8倍)(图2A、图17C)和更低的滚动速度(图2B、图17D)，导致M-CSC与HPMC牢固粘附的百分比更高(在0.05达因cm-2下为2.3倍)(图2C、图17E)。尽管HPMC足以在某些细胞环境中诱导EMT16，但我们显示这些细胞保留了其上皮细胞形态，由紧密堆积的细胞集落组成(图18B)，并且原代培养和后期传代培养物之间的N-钙粘蛋白和波形蛋白mRNA水平相似。(图18B)。
P选择素在流动下介导M-CSC-HPMC相互作用。HPMC清楚地显示了选择素的组成型细胞表面表达(图3A、B)。我们还进行了实时PCR表达以验证E、P和L选择素的表达。与用作参考细胞群的内皮细胞一样，选择素在HPMC上表达，表明存在其在脉管系统外的表达，这与之前的观察结果一致9,10(图18C)。为了确定HPMC上的哪种选择素在流动下捕捉M-CSC中起主要作用，使用了抗选择素阻断抗体。与同种型对照相比，用抗E、P或L选择素处理增加了M-CSC的滚动速度(在中位数滚动速度中，通过抗E选择素增加24.8％，通过抗P选择素增加63.3％，以及通过抗L选择素增加22.5％)(图3c，图19A)。值得注意的是，在0.05达因cm-2下，P选择素的阻断几乎完全消除了(约88％)肿瘤-间皮粘附，而E选择素或L选择素的抑制具有部分效果(通过抗E选择素为48％；通过抗L选择素为28％)(图3D，图19B)。一致地，在M-CSC中观察到对P选择素-Fc(59％)而非E选择素-或L选择素-Fc的显著粘附(图3E，图19C)，证实了P选择素的主要作用。相反，NM-CSC没有表现出与选择素-Fc的类似相互作用。我们进一步显示，正如在M-CSC中观察到的，卵巢癌患者腹水中的CSC利用了P选择素依赖性的结合，因为从腹水中分离的肿瘤球体滚动并粘附到P选择素-Fc而非Fc对照(图3F)。P选择素-Fc介导的结合是抗剪切和Ca2+依赖性的。一旦M-CSC粘附到HPMC上，M-CSC和HPMC之间的结合就很强，以至于M-CSC只有在施加4达因cm-2的最大剪切应力时才能完全分离(图20A)。用EDTA处理M-CSC抑制了M-CSC对HPMC的粘附(图20B)并且即使在大约1达因cm-2的剪切应力下，也可以很容易地使粘附的M-CSC从HMPC和P选择素嵌合体上脱附(图20C)。
P选择素是体内腹膜转移所需的。接下来，我们利用Selp-/-Rag2-/-小鼠来研究M-CSC腹膜内转移中P选择素的需求。在野生型P选择素(SelpWT Rag2-/-)小鼠中，M-CSC在原位或i.p.注射后迅速播散至整个腹腔(图3G、H)，伴有可见的肿瘤结节生长于网膜、肠系膜和小肠上(图3G、H)并形成大量腹水(图15)。相反，Selp-/-Rag2-/-小鼠的转移进展显著减少(图3G、H)，原发性肿瘤生长无显著差异(图3I、J)。为了进一步证实P选择素的作用并探索针对P选择素的治疗剂是否能够消除肿瘤-间皮粘附，我们在体内测试了P选择素介导的细胞-细胞粘附的选择性抑制剂KF38789。与上述结果一致，当注射衍生自SKOV-3和卵巢癌患者两者的M-CSC前1h处理时，KF38789显著抑制网膜、肠系膜和腹膜壁上的肿瘤转移范围(图3K)，证实了P选择素在介导M-CSC粘附中的特定作用。
O-糖蛋白上的sLex是M-CSC上的P选择素配体。唾液酸化、岩藻糖基化和硫酸化是P选择素配体的主要特征17。如所示，用神经氨酸酶去除唾液酸使M-CSC与HPMC或P选择素-Fc的结合减少了约50％(图4A)。值得注意地，在用岩藻糖苷酶去除岩藻糖后观察到几乎完全消除了M-CSC与HPMC或P选择素-Fc的结合(图4B)，而氯酸钠对硫酸化的抑制并未改变结合活性(图4C)，指示M-CSC和HPMC或P选择素-Fc之间的结合是高度岩藻糖基化以及相对较弱的唾液酸化依赖，而非硫酸化依赖的。我们接下来检查了岩藻糖基化和唾液酸化聚糖sLex或sLea参与介导M-CSC粘附。如图4D和E所示，M-CSC与抗sLex阻断抗体的预孵育减少了M-CSC与HPMC和P选择素-Fc的结合，而抗sLea阻断抗体不影响该相互作用。通过流式细胞术，虽然M-CSC而非NM-CSC表现出HECA-452和CSLEX-1(分别识别sLea/x和sLex)的反应性，但它们在抗sLea(CA19-9)表达上没有显示差异。(图4F、图21)。我们进一步发现含有sLex的聚糖在蛋白质上而不是脂质上经修饰，因为蛋白酶(胰蛋白酶)对M-CSC的处理几乎完全消除了M-CSC在HPMC和P选择素-Fc两者上的粘附(图4G)，而糖脂合成抑制剂(PPMP)处理没有效果(图4H)。O-唾液酸糖蛋白内肽酶(OSGE)的处理显著降低了M-CSC在HPMC和P选择素-Fc两者上的粘附(图4I)，而为了去除N-聚糖的肽：N-糖苷酶F(PNGase)处理没有影响(图4J)。
M-CSC上的P选择素配体主要由IGF-1R赋予。为了鉴定介导P选择素对HPMC的相互作用的M-CSC上呈现sLex的蛋白质，我们检查了一组有效浓度的抑制剂，这些抑制剂特异性靶向先前涉及卵巢癌进展的各种细胞表面受体酪氨酸激酶(RTK)，包括c-Met、EGFR、FGFR和IGF-1R 18-21。我们发现只有染料木素(通用RTK抑制剂)和AG1024(IGF-1R抑制剂)导致M-CSC与HPMC或P选择素-Fc的结合显著降低(图5A，图22)。此外，用抗IGF-1R观察到M-CSC粘附到HPMC或P选择素-Fc结合的阻断(图5B)。此外，内源性IGF-1R可以很容易地在P选择素-Fc免疫沉淀物中检测到(图5C)。在两个IGF-1R亚基中都检测到大量sLex(图5D)。P选择素-Fc结合后不久，磷酸-IGF-1R的水平升高(图5E)。这些实验均在不存在IGF-1的情况下进行，表明P选择素结合后IGF-1R的配体非依赖性激活。检测到已知携带sLex的P选择素配体，诸如CD24。然而，与IGF-1R不同，M-CSC和NM-CSC之间没有CD24的差异表达(图5F)。
FUT5对卵巢肿瘤进展至关重要。为了进一步限定有助于P选择素结合的分子特性，我们检查了M-CSC和NM-CSC中参与sLex合成的糖基转移酶的表达谱(图6A)。我们发现，与NM-CSC相比，M-CSC中的几种糖原，包括B4GalT4、ST3Gal3、ST3Gal4和FUT5显著增加(图6A、图23A)。在患者衍生的CSC上也观察到这些基因的类似的更高表达(图6A)。糖基转移酶的高mRNA表达与晚期(FIGO III、IV期)卵巢癌患者中较差的无进展生存相关(图23B)。在这些基因中，我们对FUT5特别感兴趣，其编码限速酶1,3-岩藻糖基转移酶，该酶催化sLex合成中岩藻糖残基的添加22,23。FUT5敲低消除了M-CSC上的sLex细胞表面表达(图6B)，并在剪切应力下很大程度降低了M-CSC对HPMC和P选择素-Fc的粘附(图6C)。此外，与注射了非特异性shRNA M-CSC的小鼠相比，用携带FUT5 shRNA的M-CSC的原位或i.p.(图6D)异种移植物接种的小鼠具有显著减少的腹腔中的转移性植入物和腹水形成(图16)，原发肿瘤生长没有明显差异(图6E、F)。在研究结束时从小鼠收获的肿瘤样品的实时PCR证实了成功的FUT5靶基因敲低(图6G)。
8.讨论
肿瘤微环境是控制转移进展的主要因素之一；然而，尚未探索操作卵巢癌在腹腔内传播的详细分子机制，特别是在腹水剪切应力下。在这项研究中，我们提供了以下证据：卵巢M-CSC的IGF-1R上携带sLex的聚糖与HPMC上的P选择素相互作用，控制剪切应力下腹膜播散中的拴系、滚动和随后的粘附。
多项证据表明，CSC可能是卵巢癌转移的关键因素。首先，卵巢CSC富集在可以进行上皮-间质转化(转移的关键过程)的细胞中24。其次，CSC具有更高的致瘤性25。第三，卵巢癌细胞具有干样基因签名(signature)，与癌症患者较差的无进展生存和总生存相关26。第四，这些CSC在卵巢癌早期的存在可以很好地解释早期转移的临床观察2。近年来，在包括乳腺癌和结直肠癌的各种癌症类型中的多项研究显示，只有CSC亚群能够转移27-29。在本报告中，我们显示了卵巢癌腹水中的高转移性亚群CSC；更重要的是，我们通过与腹膜微环境的直接相互作用提供了对它们转移能力的详细分子理解，这在先前的转移性CSC模型中没有研究过。
关于卵巢癌细胞上的选择素配体知之甚少30。我们目前的工作已经在卵巢癌细胞中揭露了携带sLex的P选择素配体，其与那些先前定义的P选择素配体不同，特别是众所周知的携带酪氨酸硫酸化的配体PSGL-1。许多证据暗示了sLex与卵巢癌转移之间的偶然关系。例如，针对sLex表位的抗体先前已显示与人类卵巢癌细胞反应31。催化sLex合成的糖基转移酶在卵巢癌组织和细胞系中显著升高32,33。高sLex表达与卵巢癌患者的不良生存相关34。存在于M-CSC上的携带sLex的聚糖以严格的岩藻糖基化依赖和相对松散的唾液酸化依赖的方式结合P选择素，而不是平等地依赖于岩藻糖和唾液酸部分的简单sLex结构35。这种生物化学具有生物学意义，因为岩藻糖基化已显示出增加的亲和力和更有效地结合选择素36-38。虽然硫酸化是P选择素配体的共同特征39,40，但我们的结果表明，M-CSC上的携带sLex的聚糖不需要为了与P选择素结合而硫酸化。有证据表明，P选择素配体的硫酸化部分在高剪切条件下的结合倾向于对应力更有弹性41。
虽然与P选择素在介导肿瘤-间皮相互作用中的直接作用一致，但我们的发现似乎也与近期显示携带sLex的P选择素配体的工作的发现10略有不同；然而，在这项近期工作中具有不同遗传背景的细胞的使用可以解释这种差异。虽然一些细胞系中CD24表达较高，但经由P选择素的细胞粘附似乎较少，这表明存在P选择素的其他含sLex的配体。使用仔细控制的条件并与非转移性对应物比较，虽然我们也在M-CSC和NM-CSC中显示了CD24表达，但与IGF-1R不同，M-CSC和NM-CSC中没有CD24上的差异表达，表明IGF-1R在介导M-CSC粘附中的重要性。此外，我们的发现与将IGF-1R与肿瘤进展联系起来的大量文献一致。
携带sLex的P选择素配体呈现于IGF-1R上，其在卵巢癌和其他腹膜转移模型中经常过度表达，并导致较差的临床预后42,43。最近，已鉴定出sLex在各种意想不到的蛋白质上装饰，并且sLex的功能在很大程度上是未知的44。据我们所知，IGF-1R以前没有显示其具有sLex。尽管未完全理解，但人们日渐认识到sLex在调节蛋白质活性中的作用。在胃癌细胞中，c-Met的sLex增加与二聚化和磷酸化的增加有关，这导致与肿瘤侵袭性相关的c-Met介导的信号传导增加45。虽然我们推测IGF-1R在功能上与卵巢癌的进展和转移相关，但我们的工作表明需要阻断sLex介导的IGF-1R以提供有希望的效果。
此外，我们的发现强调了FUT5在转移的发展和维持过程中的关键作用。M-CSC中sLex的较高发生率与糖基转移酶的较高表达相一致。与具有低或无FUT5表达肿瘤的患者相比，具有FUT5过表达肿瘤的卵巢癌患者与较差的生存相关。重要的是，阻断M-CSC中FUT5的表达充当治疗腹膜播散的有效策略。大多数参与sLex合成的糖基转移酶基因组成型表达以产生sLex直接前体，然而，编码α1-3岩藻糖基转移酶的FUT通常被关闭22,23，所述α1-3岩藻糖基转移酶通过向前体中添加岩藻糖来催化sLex合成的最后且限速的步骤。此外，报道了FUT5的下调抑制胃癌细胞的腹膜定殖46。这些数据表明，聚糖表达的背景有助于器官向性。
总之，该研究提供的证据显示P选择素是HPMC上的关键分子，并且在HM-CSC上携带sLex的IGF-1R为腹水流诱导的剪切应力下介导腹膜播散中的配体(图7)。该研究不仅与卵巢癌有关，而且适用于诸如乳腺癌和结肠癌的其他肿瘤类型，其中腹膜转移是重要的病理过程，表明sLex-P选择素可能成为有希望的治疗靶点。
以下编号的项目提供了关于本文描述的实施方案的进一步的非限制性细节。
1.用于检测从受试者获得的样品中的腹膜转移细胞的方法，其包括：(a)将样品中的腹膜转移细胞和腹膜非转移细胞与P选择素接触；以及(b)检测腹膜转移细胞与P选择素的选择性结合。
2.第1项的方法，其中腹膜转移细胞来自胃肠癌或妇科癌症。
3.任一前述项中的方法，其中妇科癌症是卵巢癌、子宫癌、宫颈癌或阴道癌。
4.任一前述项中的方法，其中胃肠癌是肝癌、结肠癌、前列腺癌、膀胱癌和直肠癌。
5.任一前述项中的方法，其进一步包括分离腹膜转移细胞的步骤。
6.任一前述项中的方法，其进一步包括培养腹膜转移细胞的步骤。
7.任一前述项中的方法，其进一步包括表征腹膜转移细胞。
8.用于检测从受试者获得的样品中的腹膜转移细胞的方法，包括：(a)将样品引入微流控装置的入口，其中微流控装置包含用P选择素包被的通道；(b)在有效壁面剪切应力下使样品流动；(c)将腹膜转移细胞与非腹膜转移细胞分离，其中腹膜转移细胞与P选择素结合；以及(d)检测腹膜转移细胞。
9.任一前述项中的方法，其中有效壁剪切应力为约0.1达因/cm2。
10.任一前述项中的方法，其中装置是微流控芯片。
11.任一前述项中的方法，其中通过标记物检测腹膜转移细胞。
12.任一前述项中的方法，其中腹膜转移细胞来自胃肠癌或妇科癌症。
13.任一前述项中的方法，其中妇科癌症是卵巢癌、子宫癌、宫颈癌或阴道癌。
14.任一前述项中的方法，其中胃肠癌是肝癌、结肠癌、前列腺癌、膀胱癌和直肠癌。
15.任一前述项中的方法，其进一步包括分离腹膜转移细胞的步骤。
16.任一前述项中的方法，其进一步包括培养腹膜转移细胞的步骤。
17.用于分离从受试者获得的样品中的腹膜转移细胞的方法，其包括：(a)将样品引入微流控装置的入口，其中微流控装置包含用可检测P选择素包被的通道；(b)通过腹膜转移细胞与可检测P选择素的选择性结合，将样品中的腹膜转移细胞与非腹膜转移细胞分离。
18.任一前述项中的方法，其中有效壁剪切应力为约0.1达因/cm 2。
19.任一前述项中的方法，其中装置是微流控芯片。
20.任一前述项中的方法，其中通过标记物检测腹膜转移细胞。
21.任一前述项中的装置，其中腹膜转移细胞来自胃肠癌或妇科癌症。
22.任一前述项中的装置，其中妇科癌症是卵巢癌、子宫癌、宫颈癌或阴道癌。
23.任一前述项中的装置，其中胃肠癌是肝癌、膀胱癌和直肠癌。
24.任一前述项中的方法，其进一步包括分离腹膜转移细胞的步骤。
25.任一前述项中的方法，其进一步包括培养腹膜转移细胞的步骤。
26.筛选抗转移药物的方法，其包括：(a)将转移细胞与测试剂接触；(b)经处理的转移细胞与P选择素的选择性结合；以及(c)检测不选择性结合P选择素的与测试剂接触的转移细胞，其中不与P选择素结合的转移细胞指示细胞与具有抗转移特性的测试剂接触。
27.任一前述项中的方法，其中通过标记物检测腹膜转移细胞。
28.任一前述项中的装置，其中腹膜转移细胞来自胃肠癌或妇科癌症。
29.任一前述项中的装置，其中妇科癌症是卵巢癌、子宫癌、宫颈癌或阴道癌。
30.任一前述项中的装置，其中胃肠癌是肝癌、膀胱癌和直肠癌。
31.任一前述项中的方法，其进一步包括分离腹膜转移细胞的步骤。
32.任一前述项中的方法，其进一步包括培养腹膜转移细胞的步骤。
33.用于检测从受试者获得的样品中的腹膜转移细胞的试剂盒，所述试剂盒包含微流控芯片和可检测的P选择素。
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具体实施方案的前述描述将如此充分地揭示本公开的一般性质，以至于其他人可以通过应用相关领域技术范围内的知识(包括引用和通过引用并入本文的文件的内容)，轻而易举地修改和/或适应诸如特定实施方案的各种应用而无需过度实验，且不脱离本公开的一般概念。因此，基于本文呈现的教导和指导，此类适应和修改意图处于所公开实施方案的等同物的含义和范围内。应当理解，本文中的短语或术语是为了描述而非限制的目的，因此本说明书的术语或短语将由本领域技术人员根据本文中呈现的教导和指导，结合相关领域技术人员的知识进行解释。
尽管上文已经描述了本公开的各种实施方案，但是应当理解它们通过实施例的方式呈现，而非限制。对于相关领域的技术人员来说显而易见的是，可以在形式和细节上作出各种改变而不脱离本公开的精神和范围。因此，本公开不应受任何上述示例性实施方案限制，而应仅依照以下权利要求及其等同物进行定义。
Claims (26)
1.用于检测从受试者获得的样品中的腹膜转移细胞的方法，其包括：(a)将所述样品中的腹膜转移细胞和腹膜非转移细胞与P选择素接触；以及(b)检测所述腹膜转移细胞与所述P选择素的选择性结合。
2.权利要求1所述的方法，其中所述腹膜转移细胞来自胃肠癌或妇科癌症。
3.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述妇科癌症是卵巢癌、子宫癌、宫颈癌或阴道癌。
4.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胃肠癌是肝癌、结肠癌、前列腺癌、膀胱癌和直肠癌。
5.前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括分离所述腹膜转移细胞的步骤。
6.前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括培养所述腹膜转移细胞的步骤。
7.前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括表征所述腹膜转移细胞。
8.用于检测从受试者获得的样品中的腹膜转移细胞的方法，其包括：(a)将所述样品引入微流控装置的入口，其中所述微流控装置包含用P选择素包被的通道；(b)在有效壁面剪切应力下使所述样品流动；(c)将所述腹膜转移细胞与非腹膜转移细胞分离，其中所述腹膜转移细胞与P选择素结合；以及(d)检测所述腹膜转移细胞。
9.前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括培养所述腹膜转移细胞的步骤。
10.用于分离从受试者获得的样品中的腹膜转移细胞的方法，其包括：(a)将所述样品引入微流控装置的入口，其中所述微流控装置包含用可检测P选择素包被的通道；(b)通过所述腹膜转移细胞与所述可检测P选择素的选择性结合，将所述样品中的所述腹膜转移细胞与非腹膜转移细胞分离。
11.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述有效壁面剪切应力是约0.1达因(dyne)/cm2。
12.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述装置是微流控芯片。
13.前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过标记物检测所述腹膜转移细胞。
14.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述腹膜转移细胞来自胃肠癌或妇科癌症。
15.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述妇科癌症是卵巢癌、子宫癌、宫颈癌或阴道癌。
16.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胃肠癌是肝癌、结肠癌、前列腺癌、膀胱癌和直肠癌。
17.前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括分离所述腹膜转移细胞的步骤。
18.前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括培养所述腹膜转移细胞的步骤。
19.筛选抗转移药物的方法，其包括：(a)将转移细胞与测试剂接触；(b)经处理的转移细胞与P选择素的选择性结合；以及(c)检测不与所述P选择素选择性结合的与所述测试剂接触的转移细胞，其中不与所述P选择素结合的转移细胞指示所述细胞与具有抗转移特性的测试剂接触。
20.前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过标记物检测所述腹膜转移细胞。
21.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述腹膜转移细胞来自胃肠癌或妇科癌症。
22.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述妇科癌症是卵巢癌、子宫癌、宫颈癌或阴道癌。
23.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胃肠癌是肝癌、膀胱癌和直肠癌。
24.前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括分离所述腹膜转移细胞的步骤。
25.前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括培养所述腹膜转移细胞的步骤。
26.用于检测从受试者获得的样品中的腹膜转移细胞的试剂盒，所述试剂盒包含微流控芯片和可检测P选择素。
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