CN114149418A - 一种高吗啉类化合物、制备方法、药物组合物及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高吗啉类化合物、制备方法、药物组合物及用途，所述高吗啉类化合物或其药学上可接受的盐的通式如(I)所示。本发明所述的高吗啉类化合物对癌细胞，尤其是人前列腺癌细胞株PC3、人乳腺癌细胞株MCF‑7、人神经胶质瘤细胞U87以及人喉鳞状细胞癌细胞株SNU1076等具有明显的增殖抑制作用，阻断细胞周期在G1期，在分子水平上有效地抑制PI3K/AKT/mTOR通路中关键蛋白的磷酸化水平，具有制备成为新型抗肿瘤药物的潜力，具有较好的市场化前景。

Description

一种高吗啉类化合物、制备方法、药物组合物及用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其是涉及一种高吗啉类化合物、制备方法、药物组合物及用途。
背景技术
恶性肿瘤冠有人类的“头号杀手”、“不治之症”之称，它对全人类的身心健康状况都带来了极大的威胁。当前，癌症患者数量逐年递增，因癌症所导致的死亡率也居高不下，位居十种重大疾病的第二位。全球20％的新发癌症病人在中国，24％的癌症死亡病人在中国。在此大背景下，抗肿瘤药物市场急速发展。
传统的抗肿瘤药物以细胞毒类药物为主，这类药物由于其抗肿瘤机理在于杀伤细胞，其对于正常细胞也具有杀伤作用从而导致骨髓抑制、脱发等严重毒副作用。这些毒副作用的产生导致患者不得不停药，临床上也有很多肿瘤病人死于细胞毒类药物导致的严重毒副作用。抑制肿瘤细胞生长增殖而不直接杀伤细胞的药物则不会产生这种毒副作用。细胞的生长增殖基于细胞周期的调控，因此通过抑制肿瘤细胞的细胞周期从而抑制细胞的生长增殖可实现高效低毒的抗肿瘤效果。
从上世纪80年代以来，人们逐渐认识到肿瘤的发生与PI3K/AKT/mTOR通路密切相关，在许多恶性肿瘤中PI3K/AKT/mTOR信号通路的表达出现异常，影响多个靶标分子的功能，在肿瘤发生、发展过程中起着关键作用，与肿瘤细胞生长增殖、周期调控、侵袭转移及肿瘤血管形成等过程密切相关。因此抑制该通路的小分子化合物已成为当今抗肿瘤药物的研究热点，在国际上得到了广泛重视。
发明内容
有鉴于此，为解决现有抗肿瘤药物缺乏特异性、毒副作用严重、抑制活性不高等缺陷，本发明提出了一种高吗啉类化合物，并提供了其制备方法、药物组合物，及其在制备抗肿瘤药物中的应用；所述高吗啉类化合物对癌细胞，尤其是人前列腺癌细胞株PC3、人乳腺癌细胞株MCF-7、人神经胶质瘤细胞U87以及人喉鳞状细胞癌细胞株SNU1076等具有明显的增殖抑制作用，阻断细胞周期在G1期，在分子水平上有效地抑制PI3K/AKT/mTOR通路中关键蛋白的磷酸化水平，具有制备成为新型抗肿瘤药物的潜力，具有较好的市场化前景。
具体而言，本发明一方面提供了一种高吗啉类化合物，其技术方案是这样实现的：
一种如通式(I)所示的高吗啉类化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0003354422410000021
其中，X和Y独立地选自CH或N；
R1为氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基或CHnZ3-n，其中Z为卤素，n为0、1或2；
R2和R3独立地选自氢、卤素、硝基、氨基、C1-6的烷基、-OR1a、-OC(O)R1a、-OC(O)OR1a、-OC(O)NR1bR1c、-NR1bR1c、-NR1aC(O)R1d、-NR1aC(O)OR1d、-NR1aC(O)NR1bR1c、-NR1aS(O)R1d、-NR1aS(O)2R1d、-NR1aS(O)NR1bR1c或-NR1aS(O)2NR1bR1c；
其中，每个R1a、R1b、R1c和R1d独立地选自氢、C1-6的烷基、C3-7环烷基、C6-14芳基、C7-15芳烷基、杂芳基或杂环基；或R1b和R1c与它们连接的氮原子一起形成杂环基；
R4为卤素、高吗啉基、吗啉基、哌嗪基、恶唑烷基、哌啶基、吡咯烷基、C1-6的烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C3-7环烷基-C1-6烷基、C6-14芳基、C7-15芳烷基、杂芳基、杂芳基-C1-6烷基、杂环基、杂环基-C1-6烷基或-NR1eR1f或-NR1g-杂环基；
其中，R1e、R1f和R1g独立地选自氢、C1-6烷基、C2-C6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C6-14芳基、C7-15芳烷基、杂芳基、C1-6烷基-芳基或C1-6烷基-杂环基。
进一步的，R1为C1-6烷基或CHnZ3-n，其中，Z优选为F。
进一步的，R1为甲基、二氟甲基或三氟甲基。
进一步的，R2和R3独立地选自氢原子、氨基；
进一步的，R2和R3在基团-OR1a、-OC(O)R1a、-OC(O)OR1a、-OC(O)NR1bR1c中，独立地优选为-OR1a；其中R1a、R1b和R1c独立地选自C1-6的烷基，优选为甲基；
进一步的，R2和R3在基团-NR1bR1c、-NR1aC(O)R1d、-NR1aC(O)OR1d、-NR1aC(O)NR1bR1c、-NR1aS(O)R1d、-NR1aS(O)2R1d、-NR1aS(O)NR1bR1c或-NR1aS(O)2NR1bR1c中，独立地优选为-NR1bR1c或-NR1aC(O)OR1d；其中R1a、R1b、R1c为氢，R1d为C1-6的烷基，优选地R1d为叔丁基。
进一步的，R2和R3独立地选自氢原子、氨基、-OCH3或-NHC(O)OC(CH3)3。
进一步的，R4为卤素、高吗啉基、吗啉基、哌嗪基、恶唑烷基。
进一步的，所述的-NR1eR1f中，R1e和R1f独立地选自氢或杂环基，优选为氢或吗啉基。
进一步的，所述的-NR1g-杂环基中，R1g为C1-6烷基，优选为C2-3烷基。
进一步的，所述的-NR1g-杂环基中，杂环基为吗啉基。
进一步的，其中，R1为甲基，R2和R3为氢原子；
或R1为二氟甲基，R2和R3为氢原子、氨基、-OCH3或-NHC(O)OC(CH3)3；
或R1为三氟甲基，R2和R3为氢原子。
进一步的，其中，R1为甲基，R2和R3为氢原子，R4为吗啉基或卤素；
或R1为二氟甲基，R2和R3为氢原子、氨基、-OCH3或-NHC(O)OC(CH3)3，R4为卤素、高吗啉基、吗啉基、哌嗪基、恶唑烷基、吗啉基-3-氨基、N-(3-氨丙基)吗啉基或N-(2-氨基乙基)吗啉基；
或R1为三氟甲基，R2和R3为氢原子，R4为卤素、高吗啉基、吗啉基、哌嗪基。
进一步的，为如下化合物中的任一种：
4-(4-(2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-6-吗啉基-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉；
2-(二氟甲基)-4-甲氧基-1-(4-吗啉基-6-(1,4-高吗啉基-4-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-6-胺；
2-(二氟甲基)-4-甲氧基-1-(4-((3-吗啉丙基)氨基)-6-(1,4-高吗啉基-4-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-6-胺；
N-(4-(6-氨基-2-(二氟甲基)-4-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-6-(1,4-高吗啉基-4-基)-1,3,5-三嗪-2-基)吗啉-4-胺；
2-(二氟甲基)-4-甲氧基-1-(4-((2-吗啉乙基)氨基)-6-(1,4-高吗啉基-4-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-6-胺；
N-(4-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-6-(1,4-高吗啉基-4-基)-1,3,5-三嗪-2-基)吗啉-4-胺；
4-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-N-(2-吗啉乙基)-6-(1,4-高吗啉基-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺；
4-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-N-(3-吗啉丙基)-6-(1,4-高吗啉基-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺；
4-(4-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-6-吗啉-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉；
4-(4-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-6-(哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉；
4,4'-(6-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-1,3,5-三嗪-2,4-二基)双(1,4-高吗啉)；
4,4'-(2-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)嘧啶-4,6-二基)双(1,4-高吗啉)；
4-(6-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-2-吗啉并嘧啶-4-基)-1,4-高吗啉；
4-(4-氯-6-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉；
4-(2-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-6-(恶唑烷-3-基)嘧啶-4-基)-1,4-高吗啉；
4-(4-(哌嗪-1-基)-6-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉；
4-(4-吗啉基-6-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉；
4,4'-(6-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-1,3,5-三嗪-2,4-二基)双(1,4-高吗啉)；
4,4'-(2-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)嘧啶-4,6-二基)双(1,4-高吗啉)；
4-(4-氯-6-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉。
当本发明化合物结构中存在不对称的碳原子，其存在由不对称碳原子引起的异构体及其混合物(外消旋体)，这些也包括在本发明化合物的范围内。
本发明化合物可以是作为药学上可接受的盐的酸加成盐的形式。
本发明另一方面还提供了如通式(I)所示的高吗啉类化合物的制备方法，所述制备方法为如下合成路线一或合成路线二：
所述合成路线一包括如下步骤：在有机溶剂中，化合物Ⅱ与化合物Ⅳ进行反应，得化合物Ⅲ；化合物Ⅲ与化合物Ⅴ或Ⅵ进行反应得到高吗啉类化合物Ⅰ-Ⅰ；
Figure BDA0003354422410000051
所述合成路线二包括如下步骤：在有机溶剂中，化合物Ⅶ与化合物Ⅷ进行反应，得到化合物Ⅸ；化合物Ⅸ与化合物Ⅹ进行反应得到高吗啉类化合物Ⅰ-Ⅱ；
Figure BDA0003354422410000052
其中，合成路线一和合成路线二中的R1、R2、R3、R4、X和Y的定义如所述通式(I)所示的高吗啉类化合物中所述。
进一步的，所述合成路线一中：
反应物的用量可为本领域常规用量，较佳的，化合物Ⅱ与化合物Ⅳ的摩尔比为1：(3～5)；化合物Ⅲ与化合物Ⅴ或Ⅵ的摩尔比为1：1；
采用的有机溶剂为本领域常规的溶剂，较佳的，化合物Ⅱ与化合物Ⅳ反应，采用的溶剂为PPA；化合物Ⅲ与化合物Ⅴ或Ⅵ反应，采用的溶剂为DMF；
反应温度为本领域此类反应的常规温度，较佳的，化合物Ⅱ与化合物Ⅳ反应温度为125℃～135℃；化合物Ⅲ与化合物Ⅴ或Ⅵ反应温度为20℃～30℃。
进一步的，所述合成路线二中：
反应物的用量可为本领域常规用量，较佳的，化合物Ⅶ与化合物Ⅷ的摩尔比为1：1；化合物Ⅸ与化合物Ⅹ的摩尔比为1：(1～10)；
采用的有机溶剂为本领域常规的溶剂，较佳的，化合物Ⅶ与化合物Ⅷ反应，采用的溶剂为DMF；化合物Ⅸ与化合物Ⅹ反应，采用的溶剂为THF或高吗啉；
反应温度为本领域此类反应的常规温度，较佳的，化合物Ⅶ与化合物Ⅷ反应温度为20℃～30℃；化合物Ⅸ与化合物Ⅹ反应温度为70℃～80℃。
合成路线一和合成路线二中，反应的进程可采用本领域中的常规监测方法(例如TLC、HPLC、NMR或MS)进行监测，一般以化合物II、Ⅲ或Ⅴ(Ⅵ)、Ⅶ、Ⅸ消失时为反应终点，反应时间可为1h～24h。
合成路线一和合成路线二中包括以下后处理步骤：如中和、除去溶剂或过滤；所述的中和、除去溶剂或过滤可以采用本领域中该类操作的常规方法。
合成路线一和合成路线二中包括以下分离纯化步骤：如重结晶、柱层析、薄层板、萃取、减压蒸馏；分离纯化方法可以采用本领域中该类操作的常规方法；所述的重结晶采用的溶剂优选采用酯类或醚类溶剂，所述的酯类溶剂优选乙酸乙酯或醚类溶剂优选为石油醚。
本发明再一方面提供了一种药物组合物，包括如通式(I)所示的高吗啉类化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
所述载体包括药用辅料，所述药用辅料的选择因施用途径和作用特点而异，通常是填充剂、稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、乳化剂或助悬剂。
药物组合物可根据公开的内容使用本领域技术人员已知的任何方法来制备，例如常规混合、溶解、造粒、乳化、磨细、包封、包埋或冻干工艺。
进一步的，如通式(I)所示的高吗啉类化合物或其药学上可接受的盐在药物组合物中的质量百分比为0.1％～99.9％，所述的质量百分比是指所述的如式(I)所示的高吗啉类化合物或其药学上可接受的盐占药物组合物总质量的百分比。所述的如式(I)所示的高吗啉类化合物或其药学上可接受的盐与药用辅料的质量分数之和为100％。
本发明的药物组合物可以通过口服、注射(静脉、肌肉、皮下和冠状动脉内)、舌下、经颊、经直肠、经尿道、经阴道、经鼻、吸入或局部途径施用。
本发明再一方面提供了如通式(I)所示的高吗啉类化合物或其药学上可接受的盐或所述的药物组合物作为有效成分在制备抗肿瘤药物中的用途。
进一步的，在制备对人前列腺癌细胞株PC3、人乳腺癌细胞株MCF-7、人神经胶质瘤细胞株U87和/或人喉鳞状细胞癌细胞株SNU1076具有抑制活性的抗肿瘤药物中的应用。
所述的对人前列腺癌细胞株PC3具有抑制活性的抗肿瘤药物为抗人前列腺癌的药物。所述的对人乳腺癌细胞株MCF-7具有抑制活性的抗肿瘤药物为抗人乳腺癌的药物。所述的对人神经胶质瘤细胞株U87具有抑制活性的抗肿瘤药物为抗人神经胶质瘤的药物，所述的对人喉鳞状细胞癌细胞株SNU1076具有抑制活性的抗肿瘤药物为抗人喉鳞状细胞癌的药物。
相对于现有技术，本发明所述的高吗啉类化合物、制备方法、药物组合物及应用具有以下优势：
本发明提供的化合物带有高吗啉类骨架，此类型化合物的制备方法以及潜在应用未见前人报道。我们的实验结果表明，本发明的化合物对人癌细胞，尤其是人前列腺癌细胞株PC3、人乳腺癌细胞株MCF-7、人神经胶质瘤细胞株U87或人喉鳞状细胞癌细胞株SNU1076，具有明显的增殖抑制作用，具有制备成为新型抗肿瘤药物的潜力，具有较好的市场化前景。
附图说明
图1为实施例2制备的化合物2对PC3细胞周期的影响；
图2为实施例2制备的化合物2对MCF-7细胞周期的影响；
图3为实施例9制备的化合物9对PC3细胞周期的影响；
图4为实施例9制备的化合物9对MCF-7细胞周期的影响；
图5为实施例9制备的化合物9对PC3细胞凋亡的调控作用；
图6为实施例9制备的化合物9对MCF-7细胞凋亡的调控作用；
图7为实施例2制备的化合物2对PI3K/Akt/mTOR通路蛋白磷酸化水平的影响；
图8为实施例9制备的化合物9对PI3K/Akt/mTOR通路蛋白磷酸化水平的影响；
图9为实施例2制备的化合物2在PC3裸鼠移植瘤模型体内抗肿瘤试验结果：其中，A为各组小鼠肿瘤大小对照图，B为各组小鼠肿瘤体积变化曲线图，C为各组小鼠肿瘤重量对比图，D为为各组小鼠体重变化曲线图；
图10中，为实施例9制备的化合物9在PC3裸鼠移植瘤模型体内抗肿瘤试验结果：其中，A为各组小鼠肿瘤大小对照图，B为各组小鼠肿瘤体积变化曲线图，C为各组小鼠肿瘤重量对比图，D为为各组小鼠体重变化曲线图；
图11中，为实施例9制备的化合物9在在U87裸鼠移植瘤模型体内抗肿瘤试验结果：其中，A为各组小鼠肿瘤大小对照图，B为各组小鼠肿瘤体积变化曲线图，C为各组小鼠肿瘤重量对比图，D为各组小鼠体重变化曲线图；
图12中，为实施例9制备的化合物9与Rucaparib联用对U87细胞的增殖抑制作用实验结果：其中，A为化合物9、Rucaparib单用时，化合物9与Rucaparib联用时的IC50值；B为化合物9与Rucaparib联合应用的联合指数(CI值)。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
除非另有特别说明，以下所有实施例中的说明都是以质量(克)为单位，所提到的室温是指20℃～30℃，。
下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
合成路线一(实施例1～11，13～20采用的为合成路线一)：
Figure BDA0003354422410000081
合成路线二(实施例12采用的为合成路线二)：
Figure BDA0003354422410000091
实施例1
4-(4-(2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-6-吗啉基-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉的制备：
将2-甲基-1H-苯并咪唑(0.30g，2.28mmol)、4-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉(0.54g，2.28mmol)、碳酸钾(1.26g，9.12mmol)溶于DMF(9mL)。加毕，室温搅拌。TLC，加入5mL水于反应液中，过滤得沉淀，DMF洗涤，干燥，得到0.05g(收率6.4％)4-(4-氯-6-(2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)吗啉；
取4-(4-氯-6-(2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)吗啉(0.03g,0.08mmol)于高吗啉(0.30g,2.97mmol)中，加毕，加热回流反应，冷却，加水稀释，TLC，抽滤,得到0.02g(收率64.0％)4-(4-(2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-6-吗啉基-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉。
对制得的目标产物进行检测，其检测结果如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.26(s,1H),7.67(s,1H),7.27(s,2H),3.96(s,16H),2.97(s,3H),2.03(s,2H)；
MS m/z:396.3(M+1)。
实施例2
2-(二氟甲基)-4-甲氧基-1-(4-吗啉基-6-(1,4-高吗啉基-4-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-6-胺的制备：
将2-甲氧基-4-硝基苯胺(20g,120mmol)，冰乙酸(60mL)，冰浴下，搅拌，缓慢滴加入浓硫酸(100mL)，冰浴下控温0-10℃，将混酸(70％硝酸(7.8mL,120mmol)和浓硫酸(4.6mL,80mmol))滴加到体系中，滴毕，继续保持0～10℃搅拌反应15min，升温到室温继续反应，TLC监测，反应完毕，将体系倒入冰水中，搅拌20min，抽滤，固体水洗，干燥，干燥后产品在用乙酸乙酯打浆，抽干，干燥，得到8.1g(收率31.6％)2-甲氧基-4,6-二硝基苯胺。
将2-甲氧基-4,6-二硝基苯胺(8g,37.5mmol)溶于三乙胺(24mL)和乙腈(20mL)中，再加入10％Pd/C(0.37g)，冷却到15℃，将制备的甲酸乙腈溶液(96％的甲酸(8mL)和乙腈(20mL))滴加入体系，控温20～30℃，滴毕，回流反应，TLC，过滤，除去催化剂，减压除去溶剂，柱层析得到2.90g(收率42.2％)3-甲氧基-5-硝基苯-1,2-二胺；
将3-甲氧基-5-硝基苯-1,2-二胺(2.90g,15.80mmol)，二氟乙酸(1.67g,17.40mmol)，加入到HCl(4mol/L,30mL)中，升温回流反应，TLC，反应完毕降温到室温，用饱和碳酸钠溶液中和体系中的盐酸，抽滤，用适量水洗涤固体，于50℃下烘干，得到2.30g(收率59.9％)2-(二氟甲基)-4-甲氧基-6-硝基-1H-苯并[d]咪唑；
将2-(二氟甲基)-4-甲氧基-6-硝基-1H-苯并[d]咪唑(2.30g,9.50mmol),加入甲醇(100mL),10％Pd/C(100mg),加氢反应，TLC，反应完毕，过滤，除去催化剂，减压除去溶剂，将Boc酸酐(二碳酸二叔丁酯)(6.40g)加入体系，加入二氧六环(40mL)，回流反应，反应完毕，减压除去溶剂，加入甲醇(60mL)，冰浴下加入氢氧化钠溶液(2mol/L,25mL)，20℃反应1h，用醋酸调节PH至中性，减压浓缩，乙酸乙酯萃取，合并有机相，水洗，干燥浓缩，柱层析得到1.36g(收率45.6％)(2-(二氟甲基)-4-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)氨基甲酸叔丁酯；
将(2-(二氟甲基)-4-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)氨基甲酸叔丁酯(1.36g,4.30mmol)，4-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)吗啉(1.02g，4.30mmol)，碳酸钾(2.37g,17.20mmol)中加入DMF(25mL)，常温搅拌，TLC，反应完毕，将体系倒入冰水(100mL)中，搅拌、抽滤，适量水洗，再用适量甲醇洗，干燥，得到1.10g(收率50.0％)(1-(4-氯-6-吗啉基-1,3,5-三嗪-2-基)-2-(二氟甲基)-4-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)氨基甲酸叔丁酯；
将(1-(4-氯-6-吗啉基-1,3,5-三嗪-2-基)-2-(二氟甲基)-4-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-6-基)氨基甲酸叔丁酯(0.21g,0.40mmol)，高吗啉(0.40g,4mmol)中加入THF(20mL)，室温反应，TLC，反应完毕，将反应液倒入水(50mL)中，搅拌，析出固体，过滤，用适量甲醇洗涤，干燥，得到0.18g(收率77.9％)(2-(二氟甲基)-4-甲氧基-1-(4-吗啉基-6-(1,4-恶氮杂环-4-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-6-基)氨基甲酸叔丁酯；
将(2-(二氟甲基)-4-甲氧基-1-(4-吗啉基-6-(1,4-恶氮杂环-4-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-6-基)氨基甲酸叔丁酯(0.18g,0.31mmol)中加入二氯甲烷(2mL)和三氟乙酸(2mL)，TLC，反应完毕，减压除去溶剂，柱层析得到0.07g(收率45.9％)2-(二氟甲基)-4-甲氧基-1-(4-吗啉基-6-(1,4-高吗啉基-4-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-6-胺。
对制得的目标产物进行检测，其检测结果如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.55-7.40(m,1H),7.37-7.26(m,1H),6.27(s,1H),3.93-3.60(m,21H),1.97-1.90(m,2H)；
MS m/z:477.2(M+1)。
实施例3
2-(二氟甲基)-4-甲氧基-1-(4-((3-吗啉丙基)氨基)-6-(1,4-高吗啉基-4-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-6-胺的制备：
将无水碳酸钠(0.53g,5mmol)溶于水(6mL)中，搅拌溶解后，0℃下加入三聚氯氰(0.92g,5mmol)，搅拌均匀后，将高吗啉(0.51g,5mmol)的水(1.25mL)溶液缓慢滴入上述体系中，滴加完毕，温度控制在0-5℃，反应4h，抽滤后水洗，柱层析得到0.008g(收率0.65％)4-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉；
将4-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)吗啉换成4-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)-1，4-高吗啉，高吗啉换成N-(3-氨丙基)吗啉，其余所需的原料、试剂及制备方法同实施例2，得到收率51.3％的产物2-(二氟甲基)-4-甲氧基-1-(4-((3-吗啉丙基)氨基)-6-(1,4-高吗啉基-4-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-6-胺。
对制得的目标产物进行检测，其检测结果如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.77-7.29(m,3H),6.20(d,J＝10.0Hz,1H),3.97(s,9H),3.87-3.82(m,3H),3.74(s,7H),2.52(s,6H),2.04-1.99(m,2H)；
MS m/z:534.3(M+1)。
实施例4
N-(4-(6-氨基-2-(二氟甲基)-4-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-6-(1,4-高吗啉基-4-基)-1,3,5-三嗪-2-基)吗啉-4-胺的制备：
将4-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)吗啉换成4-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)-1，4-高吗啉，高吗啉换成4-氨基-吗啉基，其余所需的原料、试剂及制备方法同实施例2，得到收率48.7％的产物N-(4-(6-氨基-2-(二氟甲基)-4-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-6-(1,4-高吗啉基-4-基)-1,3,5-三嗪-2-基)吗啉-4-胺。
对制得的目标产物进行检测，其检测结果如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.03(s,3H),6.15(s,1H),3.98-3.57(m,21H),1.94(s,2H)；
MS m/z:492.2(M+1)。
实施例5
2-(二氟甲基)-4-甲氧基-1-(4-((2-吗啉乙基)氨基)-6-(1,4-高吗啉基-4-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1H苯并[d]咪唑-6-胺的制备：
将4-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)吗啉换成4-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉，高吗啉换成N-(2-氨基乙基)吗啉基，其余所需的原料、试剂及制备方法同实施例2，得到收率35.9％的产物N-(4-(6-氨基-2-(二氟甲基)-4-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-6-(1,4-高吗啉基-4-基)-1,3,5-三嗪-2-基)吗啉-4-胺。
对制得的目标产物进行检测，其检测结果如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.77-7.29(m,3H),6.20(d,J＝10.0Hz,1H),3.97(s,9H),3.87-3.82(m,3H),3.74(s,7H),2.52(s,6H),2.04-1.99(m,2H)；
MS m/z:520.3(M+1)。
实施例6
N-(4-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-6-(1,4-高吗啉基-4-基)-1,3,5-三嗪-2-基)吗啉-4-胺的制备：
将2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑(0.02g,0.10mmol),4-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉(0.03g,0.10mmol),碳酸钾(0.06g,0.40mmol)溶于DMF(0.4mL)中，室温搅拌过夜，加水析出白色固体，抽滤得到0.08g(收率52.0％)4-(4-氯-6-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉；
将4-(4-氯-6-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉(0.04g,0.10mmol)，4-氨基-吗啉(0.10g,1mmol)中加入THF(0.4mL)，室温反应，TLC，反应完毕，柱层析得到0.03g(收率65.9％)N-(4-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-6-(1,4-高吗啉基-4-基)-1,3,5-三嗪-2-基)吗啉-4-胺。
对制得的目标产物进行检测，其检测结果如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.56(d,J＝22.8Hz,1H),7.66(d,J＝190.3Hz,4H),4.21-3.69(m,12H),2.98(s,4H),2.07(d,J＝16.8Hz,2H)；
MS m/z:447.2(M+1)。
实施例7
4-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-N-(2-吗啉乙基)-6-(1,4-高吗啉基-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺的制备：
将4-氨基-吗啉换成N-(2-氨基乙基)吗啉，其余所需的原料、试剂及制备方法同实施例6，得到收率45.7％的产物4-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-N-(2-吗啉乙基)-6-(1,4-高吗啉基-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺。
对制得的目标产物进行检测，其检测结果如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.47(d,J＝39.1Hz,1H),7.64(d,J＝208.0Hz,4H),5.86(s,1H),3.86(d,J＝72.6Hz,12H),3.58(d,J＝22.6Hz,2H),2.61(d,J＝53.0Hz,6H),2.04(d,J＝17.7Hz,2H)；
MS m/z:475.2(M+1)。
实施例8
4-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-N-(3-吗啉丙基)-6-(1,4-高吗啉基-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺的制备：
将4-氨基-吗啉换成N-(3-氨丙基)吗啉，其余所需的原料、试剂及制备方法同实施例6，得到收率33.8％的产物4-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-N-(3-吗啉丙基)-6-(1,4-高吗啉基-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺。
对制得的目标产物进行检测，其检测结果如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.56-8.41(m,1H),7.93-7.35(m,4H),6.75(dd,J＝44.9,19.5Hz,1H),4.14-3.73(m,13H),3.59(s,2H),2.53(d,J＝12.0Hz,6H),2.03(d,J＝10.9Hz,4H)；
MS m/z:498.2(M+1)。
实施例9
4-(4-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-6-吗啉-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉的制备：
将4-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉换成4-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)吗啉、4-氨基-吗啉换成高吗啉，其余所需的原料、试剂及制备方法同实施例6，得到收率66.3％的产物。
对制得的目标产物进行检测，其检测结果如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.38(dd,J＝22.0,7.8Hz,1H),7.90(d,J＝7.3Hz,1H),7.79-7.35(m,3H),3.96(s,4H),3.88(s,6H),3.80(s,6H,),2.04(dd,J＝11.5,5.7Hz,2H)；
MS m/z:432.3(M+1)。
实施例10
4-(4-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-6-(哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉的制备：
将4-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉换成4-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)吗啉、4-氨基-吗啉换成哌嗪，其余所需的原料、试剂及制备方法同实施例6，得到收率60.4％的产物4-(4-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-6-(哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉。
对制得的目标产物进行检测，其检测结果如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.42(s,1H),7.89(s,1H),7.81-7.34(m,3H,),3.85(t,J＝34.3Hz,13H),3.29-2.83(m,4H),1.99(d,J＝36.0Hz,2H)；
MS m/z:431.3(M+1)。
实施例11
4,4'-(6-(2-(二氟甲基)-1H苯并[d]咪唑-1-基)-1,3,5-三嗪-2,4-二基)双(1,4-高吗啉)的制备：
将4-氨基-吗啉换成高吗啉，其余所需的原料、试剂及制备方法同实施例6，得到收率57.9％的产物4,4'-(6-(2-(二氟甲基)-1H苯并[d]咪唑-1-基)-1,3,5-三嗪-2,4-二基)双(1,4-高吗啉)。
对制得的目标产物进行检测，其检测结果如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.48(s,1H),7.93-7.35(m,4H),4.11-3.72(m,16H),1.99(d,J＝54.5Hz,4H)；
MS m/z:446.1(M+1)。
实施例12
4,4'-(2-(二氟甲基)-1H苯并[d]咪唑-1-基)嘧啶-4,6-二基)双(1,4-高吗啉)的制备：
将2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑(0.84g,5mmol)溶于DMF(25mL)，再加入60％NaOH溶液(0.24g，6mmol),室温搅拌30min,加入2,4,6-三氯嘧啶(0.92g,5mmol)，搅拌2h，水稀释得固体，干燥，柱层析得到0.40g(收率25.4％)1-(4,6-二氯嘧啶-2-基)-2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑；
将1-(4,6-二氯嘧啶-2-基)-2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑(0.08g，0.26mmol),于高吗啉(0.27g，2.63mmol)，70℃加热，冷却过滤，得到0.01g(收率34.3％)4,4'-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)嘧啶-4,6-二基)双(1,4-高吗啉)。
对制得的目标产物进行检测，其检测结果如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.28(s,1H),7.90(s,1H),7.45(t,J＝85.8Hz,3H),5.32(s,1H),3.81(d,J＝41.1Hz,16H),2.07(d,J＝21.2Hz,4H)；
MS m/z:445.1(M+1)。
实施例13
4-(4-(哌嗪-1-基)-6-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉的制备：
将2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑换成2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑，4-氨基-吗啉换成哌嗪，其余所需的原料、试剂及制备方法同实施例6，得到0.06g(收率55.9％)4-(4-(哌嗪-1-基)-6-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉。
对制得的目标产物进行检测，其检测结果如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.46-8.14(m,1H),7.63(t,J＝107.3Hz,3H,),4.66-1.28(m,19H)；
MS m/z:449.3(M+1)。
实施例14
4-(4-吗啉基-6-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉的制备：
将2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑换成2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑，将4-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉换成4-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)吗啉、4-氨基-吗啉换成高吗啉，其余所需的原料、试剂及制备方法同实施例6，得到0.02g(收率64.0％)4-(4-吗啉基-6-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉。
对制得的目标产物进行检测，其检测结果如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.19(dd,J＝16.0,8.2Hz,1H),7.90(d,J＝7.9Hz,1H),7.44(dd,J＝28.0,7.3Hz,2H),4.07-3.65(m,16H),2.03(dd,J＝21.6,5.9Hz,2H)；
MS m/z:450.0(M+1)。
实施例15
4,4’-(6-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-1,3,5-三嗪-2,4-二基)双(1,4-高吗啉)的制备：
将2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑换成2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑，4-氨基-吗啉换成高吗啉，其余所需的原料、试剂及制备方法同实施例6，得到0.02g(收率56.5％)4,4’-(6-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-1,3,5-三嗪-2,4-二基)双(1,4-高吗啉)。
对制得的目标产物进行检测，其检测结果如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.29-8.17(m,1H),7.91(s,1H),7.45(s,2H),3.97(s,4H),3.83(s,11H),2.04(dt,J＝17.4,5.7Hz,5H)；
MS m/z:464.2(M+1)。
实施例16
4-(4-氯-6-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉的制备：
将2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑换成2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑，其余所需的原料、试剂及制备方法同实施例6，得到0.06g(收率62.7％)4-(4-氯-6-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉。
对制得的目标产物进行检测，其检测结果如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ8.42(d,J＝8.3Hz,1H),7.91(d,J＝8.0Hz,1H),7.56(s,2H),4.03(s,4H),3.93(dd,J＝11.1,5.4Hz,2H),3.76(s,1H),2.03(d,J＝44.8Hz,3H)；
MS m/z:400.1(M+1)。
实施例17
4,4-(2-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)嘧啶-4,6-二基)双(1,4-高吗啉)的制备：
将2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑换成2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑，其余所需的原料、试剂及制备方法同实施例11，得到0.02g(收率18.3％)4’,4’-(2-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)嘧啶-4,6-二基)双(1,4-高吗啉)。
对制得的目标产物进行检测，其检测结果如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.96(d,J＝7.7Hz,1H),7.83(d,J＝7.7Hz,1H),7.33(t,J＝7.7Hz,2H),5.29(s,1H),3.75(d,J＝23.8Hz,20H)；
MS m/z:463.2(M+1)。
实施例18
4-(4-氯-6-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉的制备：
制备方法同实施例6，得到0.08g(收率52.0％)4-(4-氯-6-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉。
对制得的目标产物进行检测，其检测结果如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.45(dd,J＝15.9,8.0Hz,1H),7.91(t,J＝13.9Hz,1H),7.55(ddd,J＝34.3,26.8,14.6Hz,3H),4.07-3.78(m,8H),2.22-1.92(m,2H)；
MS m/z:381.0(M+1)。
实施例19
4-(2-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-6-(恶唑烷-3-基)嘧啶-4-基)-1,4-高吗啉的制备：
将高吗啉换成高吗啉和1,3-恶唑烷的混合液(摩尔比：高吗啉：恶唑烷＝1:1),其余所需的原料、试剂及制备方法同实施例11，得到0.03g(收率38.4％)4,4-(2-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)嘧啶-4,6-二基)双(1,4-高吗啉)。
对制得的目标产物进行检测，其检测结果如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.37(s,1H),7.88(d,J＝8.3Hz,1H),7.65-7.27(m,4H),7.24-5.24(m,2H),4.42-0.60(m,14H)；
MS m/z:417.2(M+1)。
实施例20
4-(6-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-2-吗啉并嘧啶-4-基)-1,4-高吗啉的制备：
将2-甲基-1H-苯并咪唑换成2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑，将4-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉换成4-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)吗啉，其余所需的原料、试剂及制备方法同实施例1，得到0.01g(收率62.6％)4-(6-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-2-吗啉并嘧啶-4-基)-1,4-高吗啉。
对制得的目标产物进行检测，其检测结果如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.94(s,1H),7.67(s,1H),7.42(s,2H),6.05(s,1H),5.30(s,1H),3.89-3.74(m,16H),2.02(dd,J＝11.8,5.9Hz,2H)；
MS m/z:431.1(M+1)。
性能测试
下文中将实施例1～20制得的目标产物以化合物1～20表示。
1.对癌细胞的增殖抑制作用的测试
利用MTT细胞增殖抑制实验检测高吗啉类化合物对PC3、SNU1076、MCF-7或U87细胞活性的影响。取对数期生长的四种癌细胞，均用胰酶消化得到细胞悬液，计数并调整至适宜细胞密度。每孔200μL细胞接种于96孔板中，于37℃、5％CO2的孵箱内培养24h后加入不同浓度的化合物，每个浓度3个复孔，对照组加入相应体积的溶剂(DMSO)后继续置于37℃，5％CO2的孵箱内培养48h。之后加入终浓度为5mg/mL的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2即(MTT)20μL培养4h。用Bio-Rad酶标仪检测各孔在490nm波长下吸光度值。细胞数(％空白组)＝100×(化合物处理组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)，每组实验重复3次，用GraphPad Prism软件作图并计算其IC50值。
化合物2和化合物9对PC3和SNU1076细胞的增殖抑制作用，具体结果见表1。
表1
Figure BDA0003354422410000181
表1测试结果显示，本发明化合物在PC3和SNU1076细胞上的抑制增殖效果显著。
化合物2和化合物9对MCF-7和U87细胞的增殖抑制作用，具体结果见表2
表2
Figure BDA0003354422410000182
表2测试结果显示，本发明化合物在MCF-7和U87细胞上的抑制增殖效果显著。
2.流式细胞术检测化合物2和化合物9对PC3和MCF-7细胞周期阻滞的影响
(1)将PC3和MCF-7细胞以适宜的细胞密度接种于6孔板中，37℃孵育24小时，更换培养液后给予对照组DMSO及不同浓度的化合物2和化合物9，孵育24时；
(2)收集细胞于EP管中，冰PBS洗涤2次；
(3)向下层细胞中加入250μL冰PBS，吹打混匀，将细胞缓慢固定于750μL冰乙醇中，置于4℃冰箱中过夜；
(4)离心除去乙醇后用冰PBS洗涤2次，于下层细胞沉淀中加入100μL PBS使细胞重悬，每管中加入200μL提前配制好的PI染液，包裹锡纸，置于4℃冰箱染色1h。尼龙网过滤，流式细胞仪上机检测并分析。
(5)利用Flow Jo 7.6.1软件分析流式结果。
化合物2对PC3细胞周期的影响
化合物2(浓度：5、25、125nM)作用于PC3细胞24h后,化合物2浓度为25nM和125nM的两组相比于空白对照组的G0/G1期52.5％有明显增加，分别增加到74.2％和77.1％，表明化合物2能够将PC3细胞周期阻滞于G0/G1期，见图1。
化合物2对MCF-7细胞周期的影响
化合物2(浓度：5、25、125nM)作用于MCF-7细胞24h后,化合物2浓度为25nM和125nM的两组相比于空白对照组的G0/G1期56.6％有明显增加，分别增加到76.6％和78.9％，表明化合物2能够将MCF-7细胞周期阻滞于G0/G1期，见图2。
化合物9对PC3细胞周期的影响
化合物9(浓度：0.1、1、5μM)作用于PC3细胞24h后,化合物9浓度为1μM和5μM的两组相比于空白对照组的G0/G1期58.6％有明显增加，分别增加到71.9％和72.3％，表明化合物9能够将PC3细胞周期阻滞于G0/G1期，见图3。
化合物9对MCF-7细胞周期的影响
化合物9(浓度：0.1、1、5μM)作用于MCF-7细胞24h后,化合物9浓度为1μM和5μM的两组相比于空白对照组的G0/G1期62.3％有明显增加，分别增加到70.2％和76.2％，表明化合物9能够将MCF-7细胞周期阻滞于G0/G1期，见图4。
3.流式细胞术检测化合物9对PC3和MCF-7细胞凋亡的调控作用
(1)将PC3和MCF-7细胞以适宜的细胞密度接种于6孔板中，37℃孵育24小时，更换培养液后给予对照组DMSO及不同浓度的化合物9，孵育48h；
(2)吸出培养基，PBS清洗，胰酶消化细胞，将培养基对应的加回各孔吹打混匀成细胞悬液；
(3)吸取细胞悬液，放入1.5mL EP管中，将EP管置于离心机中离心5min，设置转速为1000rpm。离心结束后弃去上清液，细胞沉淀用冰的PBS清洗2次；
(4)设置细胞终浓度为1×105个/mL，计算需加入100μL的1×Binding Buffer，重悬，能使细胞达到所需浓度，分别加入2.5μL Annexin-V染液和2.5μL PI染液进行双染。加入染液后室温避光孵育15min，每管分别加入200μL 1×Binding Buffer终止反应，尼龙网过滤后使用流式细胞仪上机检测。
化合物9对PC3细胞凋亡的调控作用
化合物9不能诱导PC3细胞凋亡，见图5。
化合物9对MCF-7细胞凋亡的调控作用
化合物9不能诱导MCF-7细胞凋亡，见图6。
4.Western blot实验检测化合物2和化合物9对PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表达的影响
(1)细胞处理：选取处于对数生长期的PC3、MCF-7细胞，配制成细胞悬液。将细胞悬液以每孔2mL均匀接种于6孔板中，孵育24h后，更换培基，分别加入DMSO、不同浓度的化合物2和化合物9，放置在37℃，5％的CO2下培养48h；
(2)蛋白质的提取:将6cm培养皿从孵箱中取出置于冰上，用刮板刮培养皿底部，将贴壁生长的细胞都刮取下来，移液枪吸取分装至多个1.5mL EP管中。离心机提前预冷，以3000rpm离心5min，弃去旧培养基，取1mL冰PBS清洗混匀细胞，以3000rpm再离心5min。吸去上清液后，相同的步骤再进行一次。吸去上清液，配制裂解液，RIPA与广谱磷酸酶抑制剂按100:1的比例进行配制，涡旋混匀，每个EP管中加入50μL，混匀。于-80℃冰箱中冷冻。2h后取出置于冰上，待蛋白融化后，每5min涡旋一次，每次时间不短于10s，共涡旋6次。离心机提前预冷，以12000rcf离心15min，吸取上清液至新1.5mL EP管，即为总蛋白；
(3)蛋白质的定量:利用BSA和超纯水配制不同浓度的BSA标准样品A、B、C、D、E、F、G、H、I，根据细胞浓度将蛋白样品适当稀释为10倍(1μL蛋白样品+9μL超纯水)。取96孔板，从上到下依次加入10μL配制好的BSA标准样品A、B、C、D、E、F、G、H、I，空白孔加入稀释后的蛋白样品。计算所需工作液的量，按A液与B液50:1的比例配制，涡旋混匀后倒入上样槽，用排枪将每孔加入200μL工作液，充分混匀，震荡30s，放于孵箱中孵育30min，孵箱温度维持在37℃。取出后置于酶标仪中，选取波长为570nm进行检测。记录数据,绘制标准曲线，计算所需蛋白浓度；
(4)制胶:将玻璃板清洗干净，防止有胶粘附在上面，然后下端、左右均对齐放入夹子中，两侧同时卡紧，垂直放置，夹在架子上，倒入超纯水至溢出小玻璃板上缘验漏，同时准备配制10％分离胶。加入30％丙烯酰胺、1.5M Tris(PH 8.8)、10％SDS、超纯水后，如玻璃板中的水位未下降，则可将水倒出并用纸吸干，继续配制10％分离胶，加入TEMED及APS后立即混匀，用移液枪将胶均匀加入直至玻璃板中线高度，若出现边缘不齐或有气泡的情况，在胶上均匀加入一层异丙醇。静置40min，待分离胶凝固后，用超纯水将上层异丙醇冲洗干净，洗净之后用纸吸干。提前准备1.5mm 10well的梳子，精确配制4％浓缩胶，加入TEMED及APS后立即混匀加入到玻璃板中，至上边缘，赶出气泡后，将梳子垂直插入。静置约20min，待浓缩胶凝固；
(5)样品的处理:按计算后的数据，先加入超纯水，将蛋白样品涡旋离心后再加入，再次涡旋离心，加入一定量5×loading上样缓冲液，使其最终浓度为1×loading，涡旋离心后，置于95℃水浴中加热5min使蛋白变性，取出放冷后再次离心；
(6)上样:用水冲洗干净胶板，将外侧粘附的胶清洗干净，将其夹好放入电泳槽中，两块胶板之间倒满电泳缓冲液，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻拔除梳子，如泳道中有气泡需除尽。上样，上样完毕后缓慢加入适量电泳缓冲液；
(7)电泳；
(8)转膜：1、电泳期间做的转膜准备：转膜缓冲液提前冰浴，剪取大小为8cm×5.5cm的PVDF膜泡入甲醇中激活，再转入转膜缓冲液中，将合适大小的滤纸和海绵泡入转膜缓冲液中。2、在转膜装置中先铺一层海绵，再将四层滤纸平铺在海绵上，撬开玻璃板，将浓缩胶轻轻刮去，剥离下分离胶，放入转膜缓冲液中。将分离胶平铺在滤纸上，将PVDF膜平铺在分离胶上，排尽气泡，过程中避免分离胶和PVDF膜过干，在PVDF膜上面铺好四层滤纸和一层海绵，将夹子卡好。转膜时转移槽中按：正极(白色)—海绵—四层滤纸—PVDF膜—分离胶—四层滤纸—海绵—负极(黑色)，安装好转膜仪，接好正负极，置于冰盆中，在220mA电流下转膜约2.5h。；
(9)封闭：配制5％脱脂奶粉(脱脂奶粉：TTBS＝1:20)封闭液，转膜结束后，用镊子将PVDF膜取出，两膜正面接触封闭液，室温下在摇床上慢摇1h；
(10)免疫反应：孵育一抗：按比例配制一抗(抗体：封闭液＝1:1000)，封闭结束后，根据Marker显示的分子量，将含有目的蛋白的区域切下放入杂交袋中，根据条带的宽度加入适量配制好的一抗，排出气泡，将杂交袋密封，置于摇床上，在4℃的条件下缓慢平摇过夜。第二天取出后，将条带取出放入1×TTBS，在摇床上洗4次，每10min更换一次TTBS。孵育二抗：按比例配制二抗(抗体：TTBS＝1:2000)，将条带放入杂交袋中，加入配制好的二抗，杂交袋密封，室温下在摇床上慢摇孵育1h。将条带取出放入1×TTBS，在摇床上洗4次，每10min更换一次TTBS；
(11)ECL显色：配制显影液(A液：B液＝1:1)，使用Bio-Rad化学发光系统成像。条带正面朝上摆放在成像区，将显影液滴加到PVDF膜上，每条约加200μL显影液，选择合适参数显影。
化合物2对PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表达的影响
在PC3和MCF-7细胞中，化合物2剂量依赖性的诱导p-PDK1、p-Akt、p-mTOR和p-p70S6K表达水平的降低，见图7。
化合物9对PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表达的影响
在PC3和MCF-7细胞中，化合物9剂量依赖性的诱导p-PDK1、p-Akt、p-mTOR和p-GSK3β表达水平的降低，见图8。
5.化合物2和化合物9在PC3裸鼠移植瘤模型体内抗肿瘤试验
向BALB/C裸鼠皮下注射PC3细胞制备荷瘤小鼠(肿瘤种鼠)，从该荷瘤种鼠中取新鲜鱼肉质地的瘤块分割成2mm×2mm×2mm左右肿块，使用穿刺针于另外的BALB/C裸鼠右侧腹部进针，将瘤块植入小鼠侧腹部皮下，伤口酒精消毒，待肿瘤体积增大到5mm×5mm×5mm后开始随机分为以下各组：对照(模型)组，阳性对照组(化合物A(ZSTK474):200mg/kg)、化合物2低剂量组(25mg/kg)，化合物2中剂量组(50mg/kg)，化合物2高剂量组(100mg/kg)、化合物9低剂量组(100mg/kg)，高剂量组(200mg/kg)。然后按照以上剂量分别每天一次灌胃给药，共16天。16天后，给动物拍照，解剖裸鼠取出肿瘤，拍照，测量体积，称重。
化合物2在PC3裸鼠移植瘤模型体内抗肿瘤试验。
口服化合物16天后，给药组肿瘤体积和重量与对照组相比显著变小，与化合物A(200mg/kg)相比，一半剂量的化合物2(100mg/kg)给药组的肿瘤体积和重量显著变小。各处理组间裸鼠体重的差异并无显著性意义，证明各处理组均无显著毒副作用。总体显示化合物2具有显著的抗肿瘤效果，见图9。
化合物9在PC3裸鼠移植瘤模型体内抗肿瘤试验。
口服化合物16天后，给药组肿瘤体积和重量与对照组相比显著变小，且相同剂量下化合物9给药组的肿瘤体积和重量与化合物A相比显著变小。各处理组间裸鼠体重的差异并无显著性意义，证明各处理组均无显著毒性作用。总体显示化合物9具有显著的抗肿瘤效果，见图10。
6.化合物9在U87裸鼠移植瘤模型体内抗肿瘤试验。
向BALB/C裸鼠皮下注射U87细胞制备荷瘤小鼠(肿瘤种鼠)，从该荷瘤种鼠中取新鲜鱼肉质地的瘤块分割成2mm×2mm×2mm左右肿块，使用穿刺针于另外的BALB/C裸鼠右侧腹部进针，将瘤块植入小鼠侧腹部皮下，伤口酒精消毒，待肿瘤体积增大到5mm×5mm×5mm后开始随机分为以下各组：对照(模型)组，阳性对照组(化合物B(temozolomide):30mg/kg)、化合物9低剂量组(100mg/kg)，化合物2高剂量组(200mg/kg)。然后按照以上剂量分别每天一次灌胃给药，共13天。13天后，给动物拍照，解剖裸鼠取出肿瘤，拍照，测量体积，称重。
化合物9在U87裸鼠移植瘤模型体内抗肿瘤试验
结果见下图，口服化合物13天后，给药组肿瘤体积和重量与对照组相比显著变小。剂量为200mg/kg化合物9给药组的肿瘤体积和重量与化合物B相比无显著性差异。但其他剂量给药组与化合物B给药组相比，在裸鼠体重上差异存在显著性意义，证明化合物B处理组存在一定毒副作用。总体显示化合物9在发挥抗肿瘤效果的同时具有毒副作用小的优势，见图11。
7.化合物9与Rucaparib联用对U87细胞的增殖抑制作用
测定化合物9与Rucaparib单用时的IC50值，测定方法同性能测试的1部分。
接下来采用Chou and Talalay’s方法研究化合物9与Rucaparib联合应用对U87细胞的抗增殖效果。根据(1)得到的化合物9、Rucaparib单药作用于U87细胞的IC50值,将化合物9与Rucaparib联用药浓度比分别设为IC50化合物9：1/2IC50Rucaparib、IC50化合物9：1/4IC50Rucaparib。将制好的细胞悬液以每孔200μL加入96孔板，按固定比例IC50化合物9：1/2IC50Rucaparib、IC50化合物9：1/4IC50Rucaparib分别加入化合物9(20％，40％，60％，80％，100％)和rucaparib(20％，40％，60％，80％，100％)，或将化合物9与Rucaparib同时加入，以等量的DMSO为对照组，每一个浓度设置三个副孔。将96孔板放置于孵育箱中，在37℃，5％CO2中培养48h。加入MTT试剂4h后，利用酶标仪在490nm处检测OD值。采用CalcuSyn软件分析化合物9与Rucaparib联合应用的联合指数(CI)，当CI值小于1时两化合物联用产生协同作用；当CI值等于1时两化合物联用产生相加作用；当CI值大于1时两化合物联用产生拮抗作用。
化合物9与Rucaparib联用对U87细胞的增殖抑制作用
化合物9与Rucaparib联用对U87细胞的增殖抑制作用较化合物9或Rucaparib单独使用更强。按照不同浓度固定比将两化合物作用于U87细胞后，通过采用CalcuSyn软件来分析CI值，结果图所示，当化合物9与Rucaparib按浓度比为IC50化合物9：1/2IC50rucaparib作用于U87细胞时，在ED50、ED75、ED90下的药物联合指数(CI值)均小于1。据此可知，当化合物9与Rucaparib按浓度比为IC50化合物9：1/2IC50rucaparib作用于U87细胞时具有协同抗肿瘤作用，见图12。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种如通式(I)所示的高吗啉类化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0003354422400000011
其中，X和Y独立地选自CH或N；
R1为氢、C1-6烷基、C1-6烷氧基或CHnZ3-n，其中Z为卤素，n为0、1或2；
R2和R3独立地选自氢、卤素、硝基、氨基、C1-6的烷基、-OR1a、-OC(O)R1a、-OC(O)OR1a、-OC(O)NR1bR1c、-NR1bR1c、-NR1aC(O)R1d、-NR1aC(O)OR1d、-NR1aC(O)NR1bR1c、-NR1aS(O)R1d、-NR1aS(O)2R1d、-NR1aS(O)NR1bR1c或-NR1aS(O)2NR1bR1c；
其中，每个R1a、R1b、R1c和R1d独立地选自氢、C1-6的烷基、C3-7环烷基、C6-14芳基、C7-15芳烷基、杂芳基或杂环基；或R1b和R1c与它们连接的氮原子一起形成杂环基；
R4为卤素、高吗啉基、吗啉基、哌嗪基、恶唑烷基、哌啶基、吡咯烷基、C1-6的烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C3-7环烷基-C1-6烷基、C6-14芳基、C7-15芳烷基、杂芳基、杂芳基-C1-6烷基、杂环基、杂环基-C1-6烷基或-NR1eR1f或-NR1g-杂环基；
其中，R1e、R1f和R1g独立地选自氢、C1-6烷基、C2-C6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C6-14芳基、C7-15芳烷基、杂芳基、C1-6烷基-芳基或C1-6烷基-杂环基。
2.根据权利要求1所述的高吗啉类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：其中R1为甲基、二氟甲基或三氟甲基。
3.根据权利要求2所述的高吗啉类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：
其中，R1为甲基，R2和R3为氢原子；
或R1为二氟甲基，R2和R3为氢原子、氨基、-OCH3或-NHC(O)OC(CH3)3；
或R1为三氟甲基，R2和R3为氢原子。
4.根据权利要求3所述的高吗啉类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于：
其中，R1为甲基，R2和R3为氢原子，R4为吗啉基或卤素；
或R1为二氟甲基，R2和R3为氢原子、氨基、-OCH3或-NHC(O)OC(CH3)3，R4为卤素、高吗啉基、吗啉基、哌嗪基、恶唑烷基、吗啉基-3-氨基、N-(3-氨丙基)吗啉基或N-(2-氨基乙基)吗啉基；
或R1为三氟甲基，R2和R3为氢原子，R4为卤素、高吗啉基、吗啉基、哌嗪基。
5.根据权利要求1所述的高吗啉类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，为如下化合物中的任一种：
4-(4-(2-甲基-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-6-吗啉基-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉；
2-(二氟甲基)-4-甲氧基-1-(4-吗啉基-6-(1,4-高吗啉基-4-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-6-胺；
2-(二氟甲基)-4-甲氧基-1-(4-((3-吗啉丙基)氨基)-6-(1,4-高吗啉基-4-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-6-胺；
N-(4-(6-氨基-2-(二氟甲基)-4-甲氧基-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-6-(1,4-高吗啉基-4-基)-1,3,5-三嗪-2-基)吗啉-4-胺；
2-(二氟甲基)-4-甲氧基-1-(4-((2-吗啉乙基)氨基)-6-(1,4-高吗啉基-4-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1H-苯并[d]咪唑-6-胺；
N-(4-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-6-(1,4-高吗啉基-4-基)-1,3,5-三嗪-2-基)吗啉-4-胺；
4-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-N-(2-吗啉乙基)-6-(1,4-高吗啉基-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺；
4-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-N-(3-吗啉丙基)-6-(1,4-高吗啉基-4-基)-1,3,5-三嗪-2-胺；
4-(4-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-6-吗啉-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉；
4-(4-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-6-(哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉；
4,4'-(6-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-1,3,5-三嗪-2,4-二基)双(1,4-高吗啉)；
4,4'-(2-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)嘧啶-4,6-二基)双(1,4-高吗啉)；
4-(6-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-2-吗啉并嘧啶-4-基)-1,4-高吗啉；
4-(4-氯-6-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉；
4-(2-(2-(二氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-6-(恶唑烷-3-基)嘧啶-4-基)-1,4-高吗啉；
4-(4-(哌嗪-1-基)-6-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉；
4-(4-吗啉基-6-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉；
4,4'-(6-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-1,3,5-三嗪-2,4-二基)双(1,4-高吗啉)；
4,4'-(2-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)嘧啶-4,6-二基)双(1,4-高吗啉)；
4-(4-氯-6-(2-(三氟甲基)-1H-苯并[d]咪唑-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基)-1,4-高吗啉。
6.权利要求1所述的高吗啉类化合物的制备方法，其特征在于：所述制备方法为如下合成路线一或合成路线二：
所述合成路线一包括如下步骤：在有机溶剂中，化合物Ⅱ与化合物Ⅳ进行反应，得化合物Ⅲ；化合物Ⅲ与化合物Ⅴ或Ⅵ进行反应得到化合物Ⅰ-Ⅰ；
Figure FDA0003354422400000031
所述合成路线二包括如下步骤：在有机溶剂中，化合物Ⅶ与化合物Ⅷ进行反应，得到化合物Ⅸ；化合物Ⅸ与化合物Ⅹ进行反应得到化合物Ⅰ-Ⅱ；
Figure FDA0003354422400000032
其中，合成路线一和合成路线二中的R1、R2、R3、R4、X和Y的定义如权利要求1所述。
7.根据权利要求6所述的高吗啉类化合物的制备方法，其特征在于：
所述合成路线一中：
化合物Ⅱ与化合物Ⅳ的摩尔比为1：(3～5)；化合物Ⅲ与化合物Ⅴ或Ⅵ的摩尔比为1：1；
化合物Ⅱ与化合物Ⅳ反应，采用的溶剂为PPA；化合物Ⅲ与化合物Ⅴ或Ⅵ反应，采用的溶剂为DMF；
化合物Ⅱ与化合物Ⅳ反应温度为125℃～135℃；化合物Ⅲ与化合物Ⅴ或Ⅵ反应温度为20℃～30℃；
所述合成路线二中：
化合物Ⅶ与化合物Ⅷ的摩尔比为1：1；化合物Ⅸ与化合物Ⅹ的摩尔比为1：(1～10)；
化合物Ⅶ与化合物Ⅷ反应，采用的溶剂为DMF；化合物Ⅸ与化合物Ⅹ反应，采用的溶剂为THF或高吗啉；
化合物Ⅶ与化合物Ⅷ反应温度为20℃～30℃；化合物Ⅸ与化合物Ⅹ反应温度为70℃～80℃。
8.一种药物组合物，其特征在于：包括如权利要求1到5任一项所述的高吗啉类化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
9.权利要求1到5任一项所述的高吗啉类化合物或其药学上可接受的盐或权利要求8所述的药物组合物作为有效成分在制备抗肿瘤药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：权利要求1到5任一项所述的高吗啉类化合物或其药学上可接受的盐或权利要求8所述的药物组合物作为有效成分在制备对人前列腺癌细胞株PC3、人乳腺癌细胞株MCF-7、人神经胶质瘤细胞株U87和/或人喉鳞状细胞癌细胞株SNU1076具有抑制活性的抗肿瘤药物中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000043385A1 (fr) * 1999-01-25 2000-07-27 Zenyaku Kogyo Kabushiki Kaisha Composes heterocycliques et agents antitumoraux les comprenant en tant que principe actif

Patent Citations (1)

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Title
ZHENG LI等: "Discovery and antitumor activity of Benzo[d]imidazol-containing 2, 4-diarylaminopyrimidine analogues as ALK inhibitors with mutation-combating effects", BIOORG. MED.CHEM., vol. 37, pages 116108 - 4 *

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