CN114146827A - 富血小板血浆的一次离心制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富血小板血浆的一次离心制备方法：将混有抗凝剂的全血以600~5000g离心5~25min，分离为贫血小板血浆、血小板浓缩物及红细胞上中下三层；先抽取血小板浓缩物，继续抽取贫血小板血浆，即获得富血小板血浆。本发明与二次离心法相比更加方便快捷，省去了中间移液过程，缩短了操作时间，降低了污染风险；采用特制的离心管耗材，先吸取血小板浓缩物，再吸取贫血小板血浆，直接获得富血小板血浆，能更好的满足科研或临床的要求；离心管耗材结构相对简单，零部件少，降低了PRP制备的成本，医废也更少。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药与医疗器械技术领域，具体涉及一种富血小板血浆的一次离心制备方法。
背景技术
富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）中富含生长因子、细胞因子和抗菌肽等多种生物活性物质，具有促进细胞增殖、分化、基质合成、组织再生与修复等作用，在再生医学中扮演着重要角色。PRP的制备方法较多，目前并无统一标准，文献《自体富血小板血浆制备技术专家共识》（单桂秋等）中介绍了如下几种较成熟方法：（1）成分血单采机采集制备PRP，（2）血袋采集制备PRP，（3）PRP专用分离套装制备PRP，（4）试管法手工采集全血制备PRP。
其中，第三种方法采用的是专用于PRP制备而设计的一整套制备耗材，配备离心机，其特点在于：在全封闭或半封闭状态下采集PRP，制品的安全性相对较高；血小板浓度能≥4倍患者血小板基础浓度。基于血液本身的特性，该方法多采用二次梯度离心法进行分离作业：第一次离心可将血液分为3层，最底端的部分为约占血液总体积分数55%的红细胞，顶端部分为约占总体积分数40%的贫血小板血浆（platelet-poor plasma，PPP)，主要是纤维蛋白原等血浆成分，中间层为仅占总体积分数5%的血小板浓缩物（platelet concentrate，PC），即俗称的黄衣层或白膜层；吸取贫血小板血浆、血小板浓缩物以及少量红细胞后，进行第二次离心即可得到上层的贫血小板血浆及下层的富富血小板血浆。
上述二次血液离心分离方法的主要缺陷是，两次离心操作各需要一套离心管作为制备耗材，成本高，产生的医废多，而且移液过程较麻烦，更严重的是增大了污染风险。
专利文献（CN103505910A，一种一次离心法制备富血小板血浆的方法）公开了两种一次离心法制备富血小板血浆的方法，其共同的缺点是有较多的血小板被舍弃，血小板浓缩物的吸取也比较麻烦。
另外，专利文献（CN203609925U，密闭式血小板浓缩器）公开了一种密闭式血小板浓缩器，通过巧妙的设计，使两次离心在一套耗材内完成，但明显的，其结构较复杂，耗材成本较高。
发明内容
为了克服现有PRP专用分离套装及PRP制备方法的上述缺陷，本发明提供了一种富血小板血浆的一次离心制备方法，以期方便快捷、安全可靠、成本低廉的制备PRP。
本发明采用的技术方案如下：一种富血小板血浆的一次离心制备方法，步骤如下：
步骤1. 将混有抗凝剂的全血注入离心管耗材，置于离心机上，以600~5000g的离心力离心5~25min，全血在离心管耗材内分为三层，上层为贫血小板血浆，中层为血小板浓缩物，下层为红细胞；
步骤2. 抽取中层的血小板浓缩物，上层的贫血小板血浆沉降；
步骤3. 继续抽取部分或全部的沉降后的贫血小板血浆，即可制得富血小板血浆。
优选的，离心管耗材的规格范围：容积为5~100mL，内径为10~50mm。
优选的，抗凝剂为枸櫞酸钠、肝素、草酸盐合剂、草酸钾或乙二胺四乙酸二钠盐中的任一种。
优选的，离心参数为：5~30mL全血，在600~1000g条件下，离心5~10min，室温；30~70mL全血，在800~1400g条件下，离心8~15min，室温；离心分为升速、稳速与降速三个阶段，降速阶段的时长大于升速阶段的时长。
优选的，所述步骤2中，采用中心取液管直接抽取中层的血小板浓缩物。
优选的，所述步骤2具体为：
步骤2.1. 调节血小板浓缩物与红细胞分界面在离心管耗材内的竖直位置，使中心取液管的取液管口处于以血小板浓缩物与红细胞分界面为基准的指定位置；
步骤2.2. 抽吸装置经中心取液管抽取血小板浓缩物，至中心取液管的取液管口接触上层的贫血小板血浆为止；
步骤2.3. 测量所抽取的血小板浓缩物的体积V1。
优选的，所述步骤2中，中心取液管的取液管口处于血小板浓缩物与红细胞分界面上方的1~2mm处。
优选的，所述步骤2.1中，离心管耗材的中部位置设视窗，配合光电传感器，实现血小板浓缩物与红细胞分界面调节的自动控制。
优选的，所述步骤3具体为：
步骤3.1. 根据所抽取的血小板浓缩物的体积V1，由经验值或试验值估算所需的贫血小板血浆的体积V2；
步骤3.2. 按估算所得的V2值，抽取离心管耗材内沉降后的贫血小板血浆，即可制得富血小板血浆。
优选的，所述步骤3中，理论浓缩倍率为n的取值范围为1.0~10.0。
本发明具有如下有益效果：
1. 本发明为一次离心法，与二次离心法相比更加方便快捷，省去了二次离心法的中间移液过程，缩短了操作时间，降低了污染风险；
2. 采用特制的离心管耗材，实现了先吸净血小板浓缩物，再定量吸取贫血小板血浆，直接获得富血小板血浆，从而更好的满足科研或临床的要求；
3. 离心管耗材结构相对简单，零部件少，降低了PRP制备的成本，另外，产生的医废也更少。
附图说明
图1是本发明实施例中离心管耗材的立体示意图。
图2是本发明实施例中离心管耗材的正视示意图。
图3是本发明实施例中离心管耗材A-A向剖视图。
图4是本发明实施例中离心管耗材B-B向剖视图。
图5是本发明实施例中离心管耗材中C处放大图。
外管身1，上仓体101，下仓体102，喉仓103，注入口104，通气口105，橡胶塞106，阻菌膜107，抽吸口108，隔膜109，视窗110；中心取液管2，取液管口201；底盖3；底密封圈4。
具体实施方式
下面结合实施例与附图，对本发明作进一步说明。
本发明的一次离心法，除了加大离心力、延长离心时间，以使滞留于上层的血小板尽量沉降至中层外，其主要的改进点在于采用先抽取血小板浓缩物，再根据血小板浓缩物的量抽取贫血小板血浆，从而获得浓缩倍率为1.0~10倍的富血小板血浆。为实现上述目的，本发明的改进点主要在于离心管耗材。
实施例一：离心管耗材的结构。
为了实现上述功能，如图1~5所示，本实施例的离心管耗材具有一外管身1，其内设置专门的中心取液管2，且保证中心取液管2的取液管口201位置精准的对准以血小板浓缩物与红细胞的分界面为基准的指定位置。但由于血液源个体间存在差异，不同来源的血液中，各成分的比例各不相同，因此难以保证每份全血离心后，中心取液管2的取液管口201相对于血小板浓缩物与红细胞的分界面处于指定位置。此处有两种解决思路，一是中心取液管2为活动管，管口位置可调，二是外管身1的容积可调，即成分血的分界面的位置可调。由于第一种方案比较难实现，本实施例采用的是第二种方案。
具体的，如图1~5所示，离心管耗材的外管身1的设计规格一般在5~100mL范围内，通常为10ml、15ml、30ml、40ml、60ml，直径在10~50mm。分为上仓体101与下仓体102，上仓体101与下仓体102之间通过喉仓103连通为一体。外管身1内置有中心取液管2，中心取液管2的下端为取液管口201，位于喉仓103内，中心取液管2的上端与上仓体101的顶壁焊接或胶接固定，并与顶壁上的抽吸口108连通。下仓体102的下方为敞口，配有螺纹连接的底盖3，底盖3与下仓体102之间设有的底密封圈4。通过旋盖3的旋转即可调节外管身1的容积，也就是调节血小板浓缩物与红细胞的分界面的位置。
如图1~5所示，上仓体101的周壁顶部设有注入口104与通气口105。注入口104设有橡胶塞106，橡胶塞106通过压环扣紧，压环采用超声波焊接或胶粘与上仓体101固定为一体。通气口105中设置有阻菌膜107，使通气口105起到阻菌通气作用。抽吸口108处设有隔膜109，为一起注塑而成。橡胶塞106、隔膜109及阻菌膜107分别起到密闭、阻菌作用。橡胶塞106在注入全血时可由针头刺入，离心时仍能保持密封，而隔膜109则在抽吸前保持密封，抽吸富血小板血浆时则一次性破坏。
如图3~4所示，中心取液管2下端的取液管口201，与喉仓103的内壁贴合，此结构利用液体的内聚性和吸附性，能提高抽吸效果，避免血小板浓缩物残留在外管身1中。
如图5所示，底盖3与下仓体102之间的底密封圈4为哑铃状的截面，具有较大的密封面积。此种密封结构具有两个优点，一是提供好的密封性能，避免泄漏和污染，二是保持一定的摩擦力，底盖3不能轻易旋转，使外管身1的容积稳定，保证装置的稳定性与可靠性。
如图1所示，底盖3的周向壁具有多个平面，方便实现机械夹紧后实现自动旋转动作。相应的，如图1所示，喉仓103上设有对应取液管口201的视窗110，光电传感器通过视窗110进行检测，利用透光性识别下层的红细胞，从而分辨出血小板浓缩物与红细胞的分界面，进而控制机械装置带动底盖3，完成液面的调节，使该分界面与中心取液管2下端的取液管口201处于特定的位置。喉仓103的内径一般为上仓体101与下仓体102内径的1/3,使得血小板浓缩物能显示较高的高度，便于检测与操作。
另外，离心管耗材采用注塑加超声波焊接/粘接的工艺进行制造，具有工艺简单可靠的优点；材料为医用级透明材料，如PVC、PC、ABS等。
实施例二：为高倍基线（浓缩倍率5~9倍）富血小板血浆的一次离心制备方法的实例，其应用了实施例一中的离心管耗材。
具体步骤如下：
步骤1. 将混有抗凝剂的全血注入离心管耗材，置于离心机上进行离心分离，全血在离心管耗材内分为三层，上层为贫血小板血浆，中层为血小板浓缩物，下层为红细胞。
具体的，实施例二中离心管耗材的额定容积为30mL，内径10mm，全血的体积也为30mL。抗凝剂采用枸櫞酸钠粉剂，每毫升血加3～5mg。离心机为可从商业途径获得的离心设备，离心参数为900g条件下离心9min。另外，实施例中的全血样品为冷藏样品，因此血小板的浓度偏低。
步骤2. 抽取中层的血小板浓缩物，上层的贫血小板血浆沉降。
步骤2.1. 光电传感器通过视窗110进行检测，利用透光性识别下层的红细胞，分辨出血小板浓缩物与红细胞的分界面，自动调节血小板浓缩物与红细胞的分界面在离心管耗材内的竖直位置，使中心取液管的取液管口处于分界面上方的1~2mm处。
特别的，可根据临床或科研的需求调整血小板浓缩物与红细胞的分界面的位置。在某些场合，允许富血小板血浆中含一定量的红细胞，此时中心取液管2的取液管口201可处于该分界面下方的1mm左右处。
步骤2.2. 利用活塞式抽吸装置经中心取液管2抽取血小板浓缩物，至中心取液管的取液管口接触上层的贫血小板血浆为止，同样由光电传感器实现自动控制。
步骤2.3. 通过活塞式抽吸装置来测量所抽取的血小板浓缩物的体积V1。活塞式抽吸装置采用步进电机控制，步进电机旋转一周抽吸装置抽吸0.1mL，因此通过步进电机的转角能准确测量所抽取的血小板浓缩物的体积V1。此处，V1约1.5mL。
步骤3. 继续抽取部分或全部的沉降后的贫血小板血浆，即可制得富血小板血浆。
步骤3.1. 根据所抽取的血小板浓缩物的体积V1，来确定需要抽取的贫血小板血浆的体积V2，V2=nV1，n为V2与V1的比例关系系数。
根据经验，制备高倍基线（浓缩倍率5~9倍）富血小板血浆，n一般取1.0~3.0；制备低倍基线（浓缩倍率2.5~3倍）富血小板血浆，n一般取5.0~7.0。针对不同的血液源，n值也可由多次试验获得。此处取n=1.2（1.0~3.0范围内），即V2为1.8mL。
步骤3.2. 继续利用抽吸装置抽取贫血小板血浆1.8mL，即直接获得富血小板血浆约3.0mL。
经测定，分离前全血中血小板浓度为31x109/L，所获得富血小板血浆中血小板浓度为247x109/L，即所制备富血小板血浆的浓缩倍率为7.97倍。
由上述分析可知，本实施例具有如下优点：
1. 与传统的一次离心法相比，制备得到的PRP浓度及纯度更高，而且各成分的抽取更方便；
2. 与二次离心法相比更加方便快捷，省去了二次离心法的中间移液过程，缩短了操作时间，降低了污染风险；
3. 采用特制的离心管耗材，实现了先吸净血小板浓缩物，再吸取贫血小板血浆，直接获得富血小板血浆，从而更好的满足科研或临床的要求；
4. 离心管耗材结构相对简单，零部件少，降低了PRP制备的成本，另外，产生的医废也更少。
实施例三：为低倍基线（浓缩倍率2.5~3倍）富血小板血浆的一次离心制备方法的实例，实施例三与实施例二步骤一致，部分参数有区别。
实施例三中的全血样品与实施例二相同，也为冷藏样品。同样的离心管耗材的额定容积为30mL，内径10mm，全血的体积也为30mL。抗凝剂采用枸櫞酸钠粉剂，每毫升血加3～5mg。离心机为可从商业途径获得的离心设备，离心参数为900g条件下离心9min。
先抽取血小板浓缩物，V1约1.5mL；再抽取贫血小板血浆，此处取n=5.5（5.0~7.0范围内），即V2为8.3mL。最终获得富血小板血浆约9.8mL。
经测定，分离前全血中血小板浓度为31x109/L，所获得富血小板血浆中血小板浓度为86x109/L，即所制备富血小板血浆的浓缩倍率为2.77倍。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为了说明本发明所作的举例，而并非对本发明的实施方式的限定。其他由本发明的实质精神所引申出的显而易见的变化或变动仍属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种富血小板血浆的一次离心制备方法，其特征在于步骤如下：
步骤1. 将混有抗凝剂的全血注入离心管耗材，置于离心机上，以600~5000g的离心力离心5~25min，全血在离心管耗材内分为三层，上层为贫血小板血浆，中层为血小板浓缩物，下层为红细胞；
步骤2. 抽取中层的血小板浓缩物，上层的贫血小板血浆沉降；
步骤3. 继续抽取部分或全部的沉降后的贫血小板血浆，即可制得富血小板血浆。
2.根据权利要求1所述的富血小板血浆的一次离心制备方法，其特征在于，离心管耗材的规格范围：容积为5~100mL，内径为10~50mm。
3.根据权利要求1所述的富血小板血浆的一次离心制备方法，其特征在于，所述步骤1中，抗凝剂为枸櫞酸钠、肝素、草酸盐合剂、草酸钾或乙二胺四乙酸二钠盐中的任一种。
4.根据权利要求1所述的富血小板血浆的一次离心制备方法，其特征在于，所述步骤1中，离心参数为：
5~30mL全血，在600~1000g条件下，离心5~10min，室温；
30~70mL全血，在800~1400g条件下，离心8~15min，室温；
离心分为升速、稳速与降速三个阶段，降速阶段的时长大于升速阶段的时长。
5.根据权利要求1所述的富血小板血浆的一次离心制备方法，其特征在于，所述步骤2中，采用中心取液管直接抽取中层的血小板浓缩物。
6.根据权利要求5所述的富血小板血浆的一次离心制备方法，其特征在于，所述步骤2具体为：
步骤2.1. 调节血小板浓缩物与红细胞分界面在离心管耗材内的竖直位置，使中心取液管的取液管口处于以血小板浓缩物与红细胞分界面为基准的指定位置；
步骤2.2. 抽吸装置经中心取液管抽取血小板浓缩物，至中心取液管的取液管口接触上层的贫血小板血浆为止；
步骤2.3. 测量所抽取的血小板浓缩物的体积V1。
7.根据权利要求6所述的富血小板血浆的一次离心制备方法，其特征在于，所述步骤2中，中心取液管的取液管口处于血小板浓缩物与红细胞分界面上方的1~2mm处。
8.根据权利要求6所述的富血小板血浆的一次离心制备方法，其特征在于，所述步骤2.1中，离心管耗材的中部位置设视窗，配合光电传感器，实现血小板浓缩物与红细胞分界面调节的自动控制。
9.根据权利要求6所述的富血小板血浆的一次离心制备方法，其特征在于，所述步骤3具体为：
步骤3.1. 根据所抽取的血小板浓缩物的体积V1，由经验值或试验值估算所需的贫血小板血浆的体积V2；
步骤3.2. 按估算所得的V2值，抽取离心管耗材内沉降后的贫血小板血浆，即可制得富血小板血浆。
10.根据权利要求9所述的富血小板血浆的一次离心制备方法，其特征在于，所述步骤3中，理论浓缩倍率为n的取值范围为1.0~10.0。
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