CN114134232A - Hds在预测胃癌患者的预后、指导术后辅助化疗和预测免疫治疗疗效中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了HDS在预测胃癌患者的预后，指导术后辅助化疗和预测免疫治疗疗效中的应用。本发明筛选获得与胃癌预后相关的103个基因，基于PCA方法构建了HDS评分，分析结果证明：高HDS组比低HDS组胃癌患者有更长的生存时间；高HDS的胃癌患者更适合使用免疫治疗；II期低HDS胃癌患者比高HDS胃癌患者从术后化疗中获益更多。本发明的HDS评价体系为预测胃癌预后、选择术后辅助化疗方案和免疫治疗方案提供了一种新的方法，在临床上具有良好的应用前景。

Description

HDS在预测胃癌患者的预后、指导术后辅助化疗和预测免疫治 疗疗效中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及HDS在预测胃癌患者的预后、指导术后辅助化疗和预测免疫治疗疗效中的应用。

背景技术

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤。据2020年全球癌症统计，胃癌的发病率和死亡率已分别居恶性肿瘤的第5位和第4位，给社会造成了巨大的经济负担。目前胃癌的治疗包括外科手术结合放疗、化疗或靶向药物治疗。虽然患者的预后在逐渐改善，但结果仍不尽如人意。因此，深入探讨影响胃癌治疗和预后的因素，制定新的临床治疗策略是改善胃癌患者预后的首要任务。近年来，研究人员对肿瘤与TME之间的关系有了更深入的了解。研究发现，肿瘤相关巨噬细胞在胃癌的发生发展中起着重要作用，并具有作为胃癌治疗靶点的巨大潜力。相关研究发现，胃癌微环境的异质性可以有效预测胃癌化疗的敏感性。研究发现，肿瘤细胞可以通过过度表达PD-L1蛋白和分泌白细胞介素抑制剂来诱导免疫逃逸。此外，肿瘤相关的成纤维细胞包围肿瘤细胞，抑制免疫细胞浸润和药物渗透，导致治疗失败。研究发现，TME细胞的富集水平可以用来评估胃癌的预后。因此，分析TME的异质性，对于确定TME的定量指标，指导胃癌的治疗策略和预后评估，可能是提高疗效和预后的关键。

组蛋白脱乙酰酶(HDACs)是一类共18种类型(HDCA1-11、SIRT1-7)的蛋白酶，在染色体结构修饰和基因表达调控中发挥重要作用。组蛋白的乙酰化导致DNA和组蛋白八聚体的解离，使核小体结构松弛，从而使各种转录因子和协同转录因子能够特异性地结合DNA结合位点，激活基因转录。相反，组蛋白的脱乙酰化则有相反的效果。以前的研究表明，HDAC通过可逆地调节组蛋白和非组蛋白的乙酰化状态，在TME的发展中起着关键作用。此外，研究发现，HDAC6参与了免疫系统中几个关键因子的上调，如程序性死亡受体-1(PD-1)和程序性死亡受体配体-1(PD-L1)受体，这些受体是癌症免疫治疗的主要靶点。研究发现HDAC抑制剂治疗可以增强Foxp3的表达，从而诱导和维持免疫抑制的Treg表型。研究成发现HDAC3抑制剂可以促进CD8+T细胞分化为细胞毒效应细胞。以上研究表明，HDAC可能是调节TME的重要靶点。然而，不同类型的HDAC在调节TME细胞浸润水平方面存在异质性，单个分子或一类分子靶向抑制剂很难精确控制TME的变化。因此，迫切需要系统分析HDACs的表达谱和相应的TME特征，为胃癌的临床治疗策略和预后评估提供理论依据。

发明内容

本发明提供了利用多组学方法研究HDACs在胃癌中的作用。分析了胃癌细胞系/患者的RNA-SEQ数据，并研究了HDAC表达与TME中免疫细胞浸润的关系。通过本发明的研究确定了胃癌准确预后的新靶点，有助于开发有效的治疗策略。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于预测胃癌预后的基因标志物，所述基因标志物包含以下基因：C1S、COLEC12、CNN3、LRP12、RCAN2、TSPYL5、FAM198B、GPRASP1、L3HYPDH、PBX1、BAG2、PPP1R14A、RAB23、SEPT11、SERINC1、PJA2、BNIP2、CLIC4、TBC1D19、FBXO30、PTPRM、GOLGA8N、GINM1、RASL12、OSTM1、PPP1R12A、TMEM200B、ARHGEF1、RNF146、NDNL2、ITGB1、PAIP2、ZNF570、ZFP82、NRP2、BICD2、ADAM33、PDZD2、SPIN1、FKSG49、LRP1、ZSCAN18、FBXW12、RECK、TRAF7、RPS6、NDOR1、CC2D1A、SERINC2、ESCO2、ZBTB7B、NOP16、SPC24、USP5、AK2、CHAF1A、MCCC2、GEMIN4、TNK1、EARS2、PA2G4、HNRNPAB、GNAI3、UBE2D1、RNF126、SLC30A5、MYRF、PSME3、TUFM、YAF2、HMBS、SEMA4G、PCNXL3、DNAJA1、USP38、RCC1、SENP1、GSS、RASSF7、LMNB2、YRDC、LONP1、PDCD11、LACTB、FEN1、B3GNT3、MRPL4、NUS1、COASY、NUS1P3、ARHGEF16、HAUS6、GFM2、LYPLA1、HAUS1、ERCC6L、NEDD1、ME2、TMX1、CPNE3、ELMO3、PTPRH、HSPA4L。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了检测前面所述的基因标志物的试剂或包含其的试剂盒。

进一步，检测前面所述的基因标志物的试剂包括检测前面所述的基因标志物表达水平的试剂。

优选地，检测前面所述的基因标志物的试剂包括能够定量前面所述的基因标志物转录水平的试剂。

优选地，所述能够定量前面所述的基因标志物转录水平的试剂包括实时定量PCR中使用的特异扩增前面所述的基因标志物方法中所用的试剂。

本发明的定量前面所述的基因标志物转录水平的试剂可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern 杂交、Northern 杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该试剂可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。

进一步，所述PCR方法为已知方法， 例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统) 法、RT-PCR( 逆转录酶-PCR) 法、嵌套PCR 法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR 法)、PCR-RFLP 法、原位RT-PCR 法、PCR-SSO( 序列特异性寡核苷酸) 法、PCR-SSP 法、AMPFLP( 可扩增片段长度多态性) 法、MVR-PCR 法、和PCR-SSCP( 单链构象多态性) 法来检测。

进一步，所述能够定量前面所述的基因标志物转录水平的试剂可以是所述基因标志物或转录本的特异性引物，也可以是所述基因标志物或转录本的特异性识别探针，或同时包括引物和探针。

引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。

探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。

进一步，所述试剂盒还可包括使用说明书或标签，其中，使用说明书或标签中记载使用试剂盒中的试剂的用途和用法。

进一步，本发明的试剂盒中还可包括用于提取核酸的试剂，用于PCR的试剂，用于染色或显色的试剂等。例如，这些试剂包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、显色液、洗液等。

本发明所述的试剂盒可包含适于实用( 如针对于不同的检测方法) 的多种不同的试剂，并不限于目前所列举的试剂。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种HDS评分，所述HDS评分如下所示：

HDS=

其中，PC1i代表基因A第一主成分的特征得分，PC1j代表基因B第一主成分的特征得分。

前面提到的A基因包括：TRAF7、RPS6、NDOR1、CC2D1A、SERINC2、ESCO2、ZBTB7B、NOP16、SPC24、USP5、AK2、CHAF1A、MCCC2、GEMIN4、TNK1、EARS2、PA2G4、HNRNPAB、GNAI3、UBE2D1、RNF126、SLC30A5、MYRF、PSME3、TUFM、YAF2、HMBS、SEMA4G、PCNXL3、DNAJA1、USP38、RCC1、SENP1、GSS、RASSF7、LMNB2、YRDC、LONP1、PDCD11、LACTB、FEN1、B3GNT3、MRPL4、NUS1、COASY、NUS1P3、ARHGEF16、HAUS6、GFM2、LYPLA1、HAUS1、ERCC6L、NEDD1、ME2、TMX1、CPNE3、ELMO3、PTPRH、HSPA4L。

前面提到的B基因包括：C1S、COLEC12、CNN3、LRP12、RCAN2、TSPYL5、FAM198B、GPRASP1、L3HYPDH、PBX1、BAG2、PPP1R14A、RAB23、SEPT11、SERINC1、PJA2、BNIP2、CLIC4、TBC1D19、FBXO30、PTPRM、GOLGA8N、GINM1、RASL12、OSTM1、PPP1R12A、TMEM200B、ARHGEF1、RNF146、NDNL2、ITGB1、PAIP2、ZNF570、ZFP82、NRP2、BICD2、ADAM33、PDZD2、SPIN1、FKSG49、LRP1、ZSCAN18、FBXW12、RECK。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种HDS评分的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：

1）检测前面所述的基因标志物的mRNA表达水平；

2）采用主成分分析法PCA构建HDS评分计算公式；

HDS评分计算公式如下所示：

HDS=

其中，PC1i代表基因A第一主成分的特征得分，PC1j代表基因B第一主成分的特征得分。

前面提到的A基因包括：TRAF7、RPS6、NDOR1、CC2D1A、SERINC2、ESCO2、ZBTB7B、NOP16、SPC24、USP5、AK2、CHAF1A、MCCC2、GEMIN4、TNK1、EARS2、PA2G4、HNRNPAB、GNAI3、UBE2D1、RNF126、SLC30A5、MYRF、PSME3、TUFM、YAF2、HMBS、SEMA4G、PCNXL3、DNAJA1、USP38、RCC1、SENP1、GSS、RASSF7、LMNB2、YRDC、LONP1、PDCD11、LACTB、FEN1、B3GNT3、MRPL4、NUS1、COASY、NUS1P3、ARHGEF16、HAUS6、GFM2、LYPLA1、HAUS1、ERCC6L、NEDD1、ME2、TMX1、CPNE3、ELMO3、PTPRH、HSPA4L；

前面提到的B基因包括：C1S、COLEC12、CNN3、LRP12、RCAN2、TSPYL5、FAM198B、GPRASP1、L3HYPDH、PBX1、BAG2、PPP1R14A、RAB23、SEPT11、SERINC1、PJA2、BNIP2、CLIC4、TBC1D19、FBXO30、PTPRM、GOLGA8N、GINM1、RASL12、OSTM1、PPP1R12A、TMEM200B、ARHGEF1、RNF146、NDNL2、ITGB1、PAIP2、ZNF570、ZFP82、NRP2、BICD2、ADAM33、PDZD2、SPIN1、FKSG49、LRP1、ZSCAN18、FBXW12、RECK。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种联合预测指标，所述联合预测指标包含前面所述的HDS评分和CPS评分。

优选地，所述联合预测指标还包含MSI状态。

优选地，所述MSI状态包含MSS/MSI-L、MSI-H。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种预测胃癌患者免疫治疗疗效的产品，其特征在于，所述产品包括载体和设置在所述载体上的列线图；所述载体是卡片；所述列线图中的指标包含前面所述的HDS评分、CPS评分、MSI状态；所述列线图是将前面所述的HDS评分、CPS评分以及MSI状态应用R语言RMS运算包完成Cox回归模型的列线图可视化获得的。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种预测系统，所述预测系统包括以下任一组：

1）所述预测系统是预测胃癌患者预后的系统，所述预测系统包括计算单元，所述计算单元利用前面所述的HDS评分进行预测；

2）所述预测系统是预测胃癌患者免疫治疗疗效的系统，所述预测系统包括计算单元，所述计算单元利用前面所述的HDS评分进行预测；优选地，所述计算单元利用前面所述的联合预测指标进行预测；优选地，所述计算单元利用前面所述的列线图进行预测；

3）所述预测系统是预测胃癌患者术后辅助化疗疗效的系统；所述预测系统包括计算单元，所述计算单元利用前面所述的HDS评分进行预测。

优选地，所述化疗药物包括长春新碱、帕比瑞司、紫杉醇、水仙碱、甲氨蝶呤、脑啡肽激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、磷酸激酶抑制剂、吉西他滨、抑制细胞生长的药物、Gpx4抑制剂、Survivin抑制剂、达沙替尼。

优选地，脑啡肽激酶抑制剂包括Ro-4987655、AZD8330；

优选地，酪氨酸激酶抑制剂包括OTX015、JQ1)-(+)；

优选地，磷酸激酶抑制剂包括Ispinesib；

优选地，抑制细胞生长的药物包括SR-II-138a、SB-743921、KX2-391，GSK461364，CR-1-31，BL-2536，Austocystin D；

优选地，Gpx4抑制剂包括ML210、ML162和1S3R−RSL−3；

优选地，Survivin抑制剂包括YM-155；

优选地，所述免疫治疗包括使用免疫检查点抑制剂治疗；

优选地，所述免疫检查点抑制剂是PD-L1抑制剂；

优选地，所述PD-L1抑制剂是派姆单抗。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种预测装置，所述预测装置包括以下任一组：

1）所述预测装置是预测胃癌患者预后的装置，所述预测装置包括处理器、存储器以及存储在所述存储器中且被配置为由所述处理器执行的计算机程序，所述处理器执行所述计算机程序时运行前面所述的HDS评分计算公式；

2）所述预测装置是预测胃癌患者免疫治疗疗效的装置，所述预测装置包括处理器、存储器以及存储在所述存储器中且被配置为由所述处理器执行的计算机程序，所述处理器执行所述计算机程序时运行前面所述的HDS评分公式；优选地，所述处理器执行所述计算机程序时运行前面所述的HDS评分公式和CPS评分公式；优选地，所述处理器执行所述计算机程序时运行前面所述的列线图；

3）所述预测装置是预测胃癌患者术后辅助化疗疗效的装置；所述预测装置包括计算单元，所述计算单元利用前面所述的HDS评分进行预测；

优选地，所述化疗药物包括长春新碱、帕比瑞司、紫杉醇、水仙碱、甲氨蝶呤、脑啡肽激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、磷酸激酶抑制剂、吉西他滨、抑制细胞生长的药物、Gpx4抑制剂、Survivin抑制剂、达沙替尼。

优选地，脑啡肽激酶抑制剂包括Ro-4987655、AZD8330；

优选地，酪氨酸激酶抑制剂包括OTX015、JQ1)-(+)；

优选地，磷酸激酶抑制剂包括Ispinesib；

优选地，抑制细胞生长的药物包括SR-II-138a、SB-743921、KX2-391，GSK461364，CR-1-31，BL-2536，Austocystin D；

优选地，Gpx4抑制剂包括ML210、ML162和1S3R−RSL−3；

优选地，Survivin抑制剂包括YM-155；

优选地，所述免疫治疗包括使用免疫检查点抑制剂治疗；

优选地，所述免疫检查点抑制剂是PD-L1抑制剂；

优选地，所述PD-L1抑制剂是派姆单抗。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质包括存储的计算机程序，其中，在所述计算机程序运行时控制所述计算机可读存储介质所在装置执行以下任一操作：

1）前面所述的HDS评分；

2）前面所述的HDS评分公式和CPS评分公式；

3）前面所述的列线图。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种应用，所述应用包括以下任一项：

1）前面所述的基因标志物在构建前面所述的HDS评分、前面所述的列线图中的应用；

2）前面所述的基因标志物、前面所述的HDS评分在制备预测胃癌患者预后的产品中的应用；

3）前面所述的基因标志物、前面所述的HDS评分、前面所述的联合预测指标、前面所述的列线图在预测胃癌患者免疫治疗疗效的产品中的应用；

4）前面所述的基因标志物、前面所述的HDS评分在预测胃癌患者术后辅助化疗疗效的产品中的应用；优选地，所述胃癌患者是II期胃癌患者。

优选地，所述化疗药物包括长春新碱、帕比瑞司、紫杉醇、水仙碱、甲氨蝶呤、脑啡肽激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、磷酸激酶抑制剂、吉西他滨、抑制细胞生长的药物、Gpx4抑制剂、Survivin抑制剂、达沙替尼；

优选地，脑啡肽激酶抑制剂包括Ro-4987655、AZD8330；

优选地，酪氨酸激酶抑制剂包括OTX015、JQ1)-(+)；

优选地，磷酸激酶抑制剂包括Ispinesib；

优选地，抑制细胞生长的药物包括SR-II-138a、SB-743921、KX2-391，GSK461364，CR-1-31，BL-2536，Austocystin D；

优选地，Gpx4抑制剂包括ML210、ML162和1S3R−RSL−3；

优选地，Survivin抑制剂包括YM-155；

优选地，所述免疫治疗包括使用免疫检查点抑制剂治疗；

优选地，所述免疫检查点抑制剂是PD-L1抑制剂；

优选地，所述PD-L1抑制剂是派姆单抗。

附图说明

图1显示NMF聚类分析图，其中A：两种亚型；B：三种亚型；C：四种亚型；D：五种亚型；

图2显示HDS与胃癌预后相关性的生存曲线结果图，其中，A：ACRG队列；B：TCGA队列；

图3显示HDS与GEO数据集中的胃癌患者预后相关性的生存曲线结果图，其中，A：GSE15459队列；B：GSE34942队列；C：GSE57303；D：GSE84437；

图4显示HDS与抗原提呈分子、共刺激分子和共抑制分子表达相关性的结果图；

图5显示HDS与 CD8+T细胞浸润相关性的结果图，其中，A：免疫组化图；B：统计图；

图6显示HDS与肿瘤突变负荷相关性的结果图；

图7显示HDS与PD-L1和VEGFA蛋白表达水平相关性的结果图，其中，A：免疫组化图；B：PD-L1结果统计图；C：VEGFA结果统计图；

图8显示CD8+T细胞浸润水平与PD-L1和VEGFA蛋白水平相关性的结果图，其中，A：CD8+T与PD-L1；B：CD8+T与VEGFA；

图9显示TIDE和submap算法预测HDS高低与胃癌患者对PD-L1抑制剂治疗反应相关性的结果图；

图10显示PRJEB40416队列中HDS与免疫治疗疗效相关性的结果图，其中，A：HDS高低统计；B：样本比例统计；

图11显示PRJEB40416队列中预测派姆单抗疗效的ROC曲线图，其中，A：HDS预测；B：CPS预测；C：HDS+CPS预测；

图12显示PRJEB25780队列中HDS高低与免疫治疗疗效相关性的结果图，其中，A：HDS高低统计；B：样本比例统计；

图13显示PRJEB25780队列中每个患者不同反应的HDS瀑布图；

图14 显示PRJEB25780队列中预测胃癌免疫治疗疗效的AUC统计图；

图15显示预测免疫治疗疗效的列线图；

图16显示HDS、术后辅助化疗和预后之间的相关性的统计图；

图17显示单变量和多变量Cox回归分析结果图；

图18 显示HDS预测胃癌的1年、3年、5年和10年AUC值的ROC曲线图；

图19显示使用CIRP和PRISM数据库预测ACRG队列中HDS与胃癌患者对化疗药物敏感性的相关性结果图，其中，A：CIRP；B：PRISM。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook 等人，分子克隆：实验室手册（New York: Cold SpringHarborLaboratory Press, 1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

数据采集和处理

从GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)和TCGA(https://www.cancer.gov/)数据库获得胃癌患者的RNA-seq数据和临床信息。共有六个具有预后信息的队列（TCGA-STAD、GSE15459、GSE34942、GSE57303、GSE62254和GSE84437）被纳入研究。从欧洲核苷酸档案（ENA）数据库中获得胃癌患者的派姆单抗（PD-1）治疗队列（PRJEB25780和PRJEB40416）。Affymetrix®微阵列数据的“CEL”文件从GEO下载。使用“affy”和“simpleaffy”软件包的多阵列平均法对数据进行标准化。对于来自GEO和其他平台的微阵列数据，TPM转录本用于后续分析。从TCGA数据库中下载RNA-seq数据，作为每千碱基外显子模型每百万映射片段的片段（FPKM），然后将FPKM值转换为每千碱基外显子模型每百万映射读取的转录本（TPM）。

实施例1 计算组蛋白脱乙酰酶评分(histone deacetylase score，HDS)

对GEO中最大的数据集之一ACRG队列（也称为GSE62254队列，该数据集包含大量完整的临床信息）的HDAC表达谱进行NMF聚类分析。它可分为三个稳定的亚型（HDAC簇A、B和C）（图1）。使用Limma软件包来鉴定不同HDAC簇之间显著差异表达的基因，P<0.01代表显著差异，共有924个基因在不同HDAC簇之间差异表达。接下来，通过单变量Cox回归分析确定了488个与胃癌患者预后显著相关的基因。然后，利用Boruta算法进行基因降维，最终确定103个基因，基因列表如表1所示。59个基因的单因素Cox回归结果显示，它们的危险比(HR)均<1，这些基因的高表达提示预后良好，将这些基因定义为A型基因。反之，44个基因的单因素Cox回归结果显示，它们的比值比均>1，该类型基因的高表达提示预后不良，将这种类型的基因定义为B型基因。基于以上103个基因的表达，采用主成分分析法PCA构建了HDS来量化每个患者的评分，第一主成分（principal component 1）作为特征得分。用一种方法，如GGI来定义：

HDS=

PC1i代表基因A第一主成分（the first principal component）的特征得分，PC1j代表基因B第一主成分的特征得分。胃癌样本根据中位数分为高HDS组和低HDS组。

表1 筛选与胃癌预后相关的基因列表

实施例2 HDS 与胃癌预后相关性分析

ACRG队列中胃癌样本根据中位数分为高HDS组和低HDS组，中位数为0.08，结果显示，高HDS组比低HDS组有更长的生存时间（图2中的A）。

TCGA队列中胃癌样本根据中位数分为高HDS组和低HDS组，中位数为0.78，结果显示，低HDS比高HDS的预后更差（图2中的B）。

分析不同GEO队列中高HDS和低HDS患者的预后，胃癌样本根据中位数分为高HDS组和低HDS组，GSE1545中位数为 0.65, GSE34942中位数为 0.75，GSE57303中位数为0.69GSE84437中位数为0.106（图3）。

上述结果表明，HDS在评估胃癌的预后方面是可靠的。

实施例3 HDS与胃癌患者免疫治疗效果的相关性分析

为了阐明HDS和TME的关系，分析了6个胃癌队列（TCGA-STAD、GSE15459、GSE34942、GSE57303、GSE62254和GSE84437）中HDS的表达与抗原提呈相关分子、共刺激分子、共抑制分子和血管生成分子的相关性。结果发现HDS与大多数抗原提呈分子的表达呈正相关(图4)，提示高HDS患者的抗原提呈能力明显高于低HDS患者，其体内对肿瘤细胞的识别和杀伤能力更强。继续分析发现HDS与共刺激分子和共抑制分子的表达呈正相关(图4)，提示HDS高的患者具有较高的免疫原性，但同时也有较强的免疫抑制作用。

从北京大学人民医院采集30例新鲜胃癌样本进行测序以及免疫组化染色分析，根据测序结果将胃癌患者分为高HDS和低HDS（根据中位数分为高HDS组和低HDS组，中位数为0.102）；利用免疫组织化学方法检测CD8蛋白（以此观察CD8+T细胞浸润情况）、PD-L1蛋白和VEGFA蛋白在高、低HDS患者中的表达。这些患者在手术前没有接受新辅助治疗。研究方案经北京大学人民医院伦理委员会批准。

免疫组化染色的步骤如下：将组织块包埋在石蜡中，切成3µm的切片，并放置在玻片上。切片在72℃下烘焙1小时，用二甲苯脱蜡，并用梯度酒精脱水。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗五次后，每次2分钟（PBS中加入1%吐温20），然后进行高压修复，再次用PBS冲洗样品五次。将处理后的切片浸入3%过氧化氢溶液中，在室温下培养10分钟，并用蒸馏水和PBS清洗。接下来，将CD8小鼠源性一级抗体（Abcam，ab209775，美国；1:100）、VEGFA小鼠源性一级抗体（Abcam，ab52917，美国；1:100）或PD-L1兔源性一级抗体（Abcam，ab205921，美国；1:50）以相同比例添加到切片中，在37°C下培养1小时，并用PBS冲洗三次，每次5分钟。然后将切片与异硫氰酸荧光素结合的山羊抗鼠IgG二级抗体（ZSGB-BIO，中国北京）孵育30分钟。然后在显微镜下观察阳性细胞的数量，并为每个切片随机选择五个视野以计算阳性细胞的比例。

结果证实了高HDS患者有更高的CD8+T细胞浸润(图5)。目前的研究表明，肿瘤突变负荷(TMB)也是评价肿瘤微环境的一个指标。我们发现HDS的表达与TMB呈显著正相关(相关系数=0.57，图6)。PD-L1和VEGFA是肿瘤细胞逃避免疫杀伤的重要指标。免疫组织化学结果进一步显示，高HDS患者的PD-L1和VEGFA蛋白表达水平高于低HDS患者(图7)。此外，CD8+T细胞的浸润水平与PD-L1和VEGFA蛋白水平显著相关(图8)。

以上结果提示，高HDS可能是一种“热点肿瘤”，其微环境中免疫细胞浸润程度高，但同时存在较强的免疫抑制。免疫检查点抑制剂联合抗肿瘤血管生成药物对高HDS患者可获得最大益处。

接下来，本研究通过TIDE和submap算法预测了高HDS患者对PD-L1抑制剂治疗的反应，结果发现高HDS评分患者更能从PD1抑制剂的治疗中获益（图9）。本研究共纳入14例接受派姆单抗治疗的MSI-H晚期胃癌患者(PRJEB40416)，根据中位数分为高HDS组和低HDS组，中位数为0.089。结果显示，CR/PR组的HDS高于SD/PD组。我们观察到，CR/PR组71%的患者HDS较高（图10）。ROC曲线分析显示，在PRJEB40416队列中，HDS预测派姆单抗疗效的AUC值为0.776，而CPS值（Combined Positive Score，联合阳性评分，计算公式为：CPS={(PD-L1阳性肿瘤细胞个数+PD-L1阳性肿瘤相关免疫细胞个数)/肿瘤细胞个数} *100）仅为0.381，说明HDS具有较高的预测价值(图11)。最后，用HDS结合CPS评分预测胃癌免疫治疗的疗效，ROC曲线的AUC值为0.881(图11)。为了验证结果的可靠性，共有45名接受派姆单抗治疗的晚期胃癌患者被纳入研究（PRJEB25780），根据中位数分为高HDS组和低HDS组，中位数为0.083，这些患者包括MSS、MSI-H和EBV亚型。在这个队列中，我们发现CR/PR组的HDS明显高于SD/PD组，并且CR/PR组有75%的患者HDS较高(图12)。瀑布图显示了每个患者不同反应的HDS(图13)。ROC曲线显示PRJEB25780队列中HDS预测胃癌免疫治疗疗效的AUC值为0.71(图14)。然而，当结合HDS、MSI状态和CPS时，我们发现胃癌免疫治疗疗效的综合预测AUC高达0.96(图14)。这一结果令人振奋，提示HDS结合MSI状态和CPS可以准确筛选适合免疫治疗的胃癌患者。列线图可视化了这个预测模型(图15)。

实施例4 HDS与胃癌术后辅助治疗策略和预测预后的相关性分析

进一步利用ACRG队列中的胃癌患者信息分析HDS、术后辅助化疗和预后之间的关系，发现在III期和IV期胃癌中，无论HDS高还是低，术后化疗可提高患者的中位生存时间（图16）。化疗在II期，观察到高HDS患者的术后辅助治疗并没有显著改善患者的中位生存时间，但对于低HDS患者，术后辅助化疗可以改善患者的中位生存时间（图16）。这一结果表明，II期低HDS患者可能比高HDS患者从术后化疗中获益更多。

接下来，探讨HDS是否是胃癌的预后标志物。单变量和多变量Cox回归分析显示HDS是胃癌总生存率和RFS的独立预后因素（图17）。此外，ROC曲线进一步表明，HDS预测胃癌的1年、3年、5年和10年AUC值分别为0.784、0.792、0.794和0.795（图18）。这表明，基于HDS评分，可以有效预测胃癌患者的生存率。

此外，使用CIRP和PRISM数据库预测ACRG队列中高HDS患者和低HDS患者化疗敏感的药物。发现高HDS患者对这些化合物更敏感，如长春新碱、帕比瑞司、紫杉醇、水仙碱、甲氨蝶呤、脑啡肽激酶抑制剂(Ro-4987655和AZD8330)、酪氨酸激酶抑制剂(OTX015和JQ1)-(+)、磷酸激酶抑制剂(Ispinesib)、吉西他滨以及一些抑制细胞生长的药物(如SR-II-138a、SB-743921、KX2-391，GSK461364，CR-1-31，BL-2536，Austocystin D)（图19）。此外，发现低HDS的患者可能对胃癌中的Gpx4抑制剂(ML210、ML162和1S3R−RSL−3)、Survivin抑制剂(YM-155)和达沙替尼敏感(图19)。据预测，低HDS患者对三种Gpx4抑制剂更敏感 (图19)。

Claims (10)

1.一种用于预测胃癌预后的基因标志物，所述基因标志物包含以下基因：C1S、COLEC12、CNN3、LRP12、RCAN2、TSPYL5、FAM198B、GPRASP1、L3HYPDH、PBX1、BAG2、PPP1R14A、RAB23、SEPT11、SERINC1、PJA2、BNIP2、CLIC4、TBC1D19、FBXO30、PTPRM、GOLGA8N、GINM1、RASL12、OSTM1、PPP1R12A、TMEM200B、ARHGEF1、RNF146、NDNL2、ITGB1、PAIP2、ZNF570、ZFP82、NRP2、BICD2、ADAM33、PDZD2、SPIN1、FKSG49、LRP1、ZSCAN18、FBXW12、RECK、TRAF7、RPS6、NDOR1、CC2D1A、SERINC2、ESCO2、ZBTB7B、NOP16、SPC24、USP5、AK2、CHAF1A、MCCC2、GEMIN4、TNK1、EARS2、PA2G4、HNRNPAB、GNAI3、UBE2D1、RNF126、SLC30A5、MYRF、PSME3、TUFM、YAF2、HMBS、SEMA4G、PCNXL3、DNAJA1、USP38、RCC1、SENP1、GSS、RASSF7、LMNB2、YRDC、LONP1、PDCD11、LACTB、FEN1、B3GNT3、MRPL4、NUS1、COASY、NUS1P3、ARHGEF16、HAUS6、GFM2、LYPLA1、HAUS1、ERCC6L、NEDD1、ME2、TMX1、CPNE3、ELMO3、PTPRH、HSPA4L。

2.检测权利要求1所述的基因标志物的试剂或包含其的试剂盒。

3.一种HDS评分的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：

1）检测权利要求1所述的基因标志物的mRNA表达水平；

2）采用主成分分析法PCA构建HDS评分计算公式；

HDS评分计算公式如下所示：

HDS=

其中，PC1i代表基因A第一主成分的特征得分，PC1j代表基因B第一主成分的特征得分；

A基因包括：TRAF7、RPS6、NDOR1、CC2D1A、SERINC2、ESCO2、ZBTB7B、NOP16、SPC24、USP5、AK2、CHAF1A、MCCC2、GEMIN4、TNK1、EARS2、PA2G4、HNRNPAB、GNAI3、UBE2D1、RNF126、SLC30A5、MYRF、PSME3、TUFM、YAF2、HMBS、SEMA4G、PCNXL3、DNAJA1、USP38、RCC1、SENP1、GSS、RASSF7、LMNB2、YRDC、LONP1、PDCD11、LACTB、FEN1、B3GNT3、MRPL4、NUS1、COASY、NUS1P3、ARHGEF16、HAUS6、GFM2、LYPLA1、HAUS1、ERCC6L、NEDD1、ME2、TMX1、CPNE3、ELMO3、PTPRH、HSPA4L；

B基因包括：C1S、COLEC12、CNN3、LRP12、RCAN2、TSPYL5、FAM198B、GPRASP1、L3HYPDH、PBX1、BAG2、PPP1R14A、RAB23、SEPT11、SERINC1、PJA2、BNIP2、CLIC4、TBC1D19、FBXO30、PTPRM、GOLGA8N、GINM1、RASL12、OSTM1、PPP1R12A、TMEM200B、ARHGEF1、RNF146、NDNL2、ITGB1、PAIP2、ZNF570、ZFP82、NRP2、BICD2、ADAM33、PDZD2、SPIN1、FKSG49、LRP1、ZSCAN18、FBXW12、RECK。

4.一种联合预测指标，所述联合预测指标包含以下任一组：

1）权利要求3中所述的HDS评分和CPS评分；

2）权利要求3中所述的HDS评分、CPS评分以及MSI状态。

5.一种预测胃癌患者免疫治疗疗效的产品，其特征在于，所述产品包括载体和设置在所述载体上的列线图；所述载体是卡片；所述列线图中的指标包含权利要求3中所述的HDS评分、CPS评分、MSI状态；所述列线图是将权利要求3中所述的HDS评分、CPS评分以及MSI状态应用R语言RMS运算包完成Cox回归模型的列线图可视化获得的。

6.一种预测系统，其特征在于，所述预测系统包括以下任一组：

1）所述预测系统是预测胃癌患者预后的系统，所述预测系统包括计算单元，所述计算单元利用权利要求3中所述的HDS评分进行预测；

2）所述预测系统是预测胃癌患者免疫治疗疗效的系统，所述预测系统包括计算单元，所述计算单元利用以下任一组进行预测：

a、权利要求3中所述的HDS评分；

b、权利要求4所述的联合预测指标；

c、权利要求5所述的列线图；

3）所述预测系统是预测胃癌患者术后辅助化疗疗效的系统；所述预测系统包括计算单元，所述计算单元利用权利要求3中所述的HDS评分进行预测。

7.一种预测装置，其特征在于，所述预测装置包括以下任一组：

1）所述预测装置是预测胃癌患者预后的装置，所述预测装置包括处理器、存储器以及存储在所述存储器中且被配置为由所述处理器执行的计算机程序，所述处理器执行所述计算机程序时运行权利要求3中所述的HDS评分计算公式；

2）所述预测装置是预测胃癌患者免疫治疗疗效的装置，所述预测装置包括处理器、存储器以及存储在所述存储器中且被配置为由所述处理器执行的计算机程序，所述处理器执行所述计算机程序时运行以下任一组：

a、权利要求3中所述的HDS评分公式；

b、权利要求3中所述的HDS评分公式和CPS评分公式；

c、权利要求5所述的列线图；

3）所述预测装置是预测胃癌患者术后辅助化疗疗效的装置；所述预测装置包括计算单元，所述计算单元利用权利要求3中所述的HDS评分进行预测。

8.一种计算机可读存储介质，其特征在于，所述计算机可读存储介质包括存储的计算机程序，其中，在所述计算机程序运行时控制所述计算机可读存储介质所在装置执行以下任一操作：

1）权利要求3中所述的HDS评分；

2）权利要求3中所述的HDS评分公式和CPS评分公式；

3）权利要求5所述的列线图。

9.一种应用，所述应用包括以下任一项：

1）权利要求1的基因标志物在构建权利要求3中所述的HDS评分、权利要求5所述的列线图中的应用；

2）权利要求1的基因标志物、权利要求3中所述的HDS评分在制备预测胃癌患者预后的产品中的应用；

3）权利要求1的基因标志物、权利要求3中所述的HDS评分、权利要求4所述的联合预测指标、权利要求5所述的列线图在预测胃癌患者免疫治疗疗效的产品中的应用；

4）权利要求1的基因标志物、权利要求3中所述的HDS评分在预测胃癌患者术后辅助化疗疗效的产品中的应用。

10. 根据权利要求 9所述的应用，其特征在于，所述化疗药物包括长春新碱、帕比瑞司、紫杉醇、水仙碱、甲氨蝶呤、脑啡肽激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、磷酸激酶抑制剂、吉西他滨、抑制细胞生长的药物、Gpx4抑制剂、Survivin抑制剂、达沙替尼。

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