CN114134048A - 一株内生真菌及其应用于桑寄生繁育中的方法和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株内生真菌，为炭疽菌Colletotrichum acutatum 4，被保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No：61992，保藏时间为：2021年10月18日，保藏单位地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学微生物研究所。本发明还公开了内生真菌应用于桑寄生繁育中的方法，包括：取炭疽菌4的发酵液喷洒在点有桑寄生种子的桑树枝条上培养。本发明还公开了内生真菌于木质素和纤维素降解、桑寄生种子萌发、桑寄生培育、植物防控和科学研究中的用途。本发明不仅为桑寄生的繁育提供应用指导和理论依据，还为其它寄生植物侵入寄主植物机理提供新的研究思路。

Description

一株内生真菌及其应用于桑寄生繁育中的方法和其用途
技术领域
本发明属于桑寄生繁育领域，涉及一株内生真菌及其应用于桑寄生繁育中的方法和其用途。
背景技术
桑寄生为桑寄生科植物广寄生Taxillus chinensis(DC.)Danser的干燥带叶茎枝，是传统的常用大宗中药材，具有祛风湿、补肝肾、强筋骨、安胎元等功效，为《中国药典》(2020 版)收载品种(国家药典委员会，2020)。桑寄生也是广西极具特色的道地寄生类药材，早在明朝万历年间的《广西通志》就记载了桑寄生和桑寄生酒是广西的主要特产(朱论欢， 2002)，以桑寄生为原料开发的梧州寄生茶早在1992年就被列入中华传统食品保健茶类，并出口东南亚近30个国家(李永华等，2006)。随着市场需求量日渐增多，桑寄生在广西乃至在全国中药材市场中具有十分重要地位。由于桑寄生野生资源越来越少，开展人工栽培势在必行，而提高桑寄生种子寄生率和解决繁育机理，是桑寄生人工繁育及栽培的重点和难点。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一株内生真菌为炭疽菌Colletotrichum acutatum4。
本发明再有一个目的是提供一种内生真菌应用于桑寄生繁育中的方法。
本发明另有一个目的是提供内生真菌菌株在木质素降解、纤维素降解和桑寄生种子萌发中的用途。
本发明另有一个目的是提供内生真菌菌株于桑寄生繁育及栽培、植物防控和科学研究中的用途。
为此，本发明提供的技术方案为：
一株内生真菌，来源于黄花梨，所述内生真菌为炭疽菌Colletotrichum acutatum4，炭疽菌Colletotrichum acutatum 4被保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No：61992，保藏时间为：2021年10月18日，保藏单位地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学微生物研究所。
本发明还提供内生真菌应用于桑寄生繁育中的方法，包括如下步骤：
1)取如权利要求1所述的炭疽菌4接种于培养基中进行培养；
2)收获步骤1)中生长的炭疽菌4的发酵液；
3)每株桑树枝条上点若干粒桑寄生种子进行培养，培养中，每天取步骤2)中的发酵液喷洒在所述桑树枝条上，所述发酵液的用量为1-10毫升/一次/一株。
优选的是，所述的内生真菌应用于桑寄生繁育中的方法中，步骤1)中，所述培养基采用PDA液体培养基。
优选的是，所述的内生真菌应用于桑寄生繁育中的方法中，步骤1)中，所述培养为：炭疽菌4于温度约28℃下恒温震荡培养约3天。
优选的是，所述的内生真菌应用于桑寄生繁育中的方法中，步骤2)中，将步骤1)培养得到的培养液经分离取上清液，即得到发酵液。
优选的是，所述的内生真菌应用于桑寄生繁育中的方法中，步骤3)中，所述发酵液的用量为5毫升/一次/一株。
优选的是，所述的内生真菌应用于桑寄生繁育中的方法中，步骤3)中，将桑树和桑寄生种子共同培养约30天至桑寄生种子萌发。
所述的内生真菌菌株炭疽菌Colletotrichum acutatum 4在以麦麸质纤维生物物质为底物生产木质纤维素降解酶中的用途。
所述的内生真菌菌株在木质素降解、纤维素降解和桑寄生种子萌发中的用途。
所述的内生真菌菌株于桑寄生繁育及栽培、植物防控和科学研究中的用途。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明探索桑寄生内生真菌在桑寄生侵入寄主植物细胞壁降解的作用机制，且鉴定得到了较好的木质纤维素降解菌株，能够生产木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶以及纤维素酶，为桑寄生侵入寄主植物细胞壁降解的作用机制奠定了理论基础。同时，本发明的内生真菌炭疽菌Colletotrichum acutatum 4应用于桑寄生繁育中，提高了桑寄生的种子萌发率。本发明不仅为桑寄生的繁育提供应用指导和理论依据，还为其它寄生植物侵入寄主植物机理提供新的研究思路。
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本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明实施例中不同菌株在显色培养基上的生长情况图(7d)；
图2为本发明实施例中不同菌株在刚果红培养基上的生长情况图(7d)。
图3为本发明实施例中不同菌株不同时间产漆酶酶活情况图。
图4为本发明实施例中不同菌株不同时间产锰过氧化物酶酶活情况图。
图5为本发明实施例中不同菌株不同时间产木质素过氧化物酶酶活情况图。
图6为本发明实施例中不同菌株不同时间产纤维素酶酶活情况图。
图7为本发明实施例中基于ITS rDNA和微管蛋白beta-tublin序列联合构建的系统发育进化树。
图8为本发明实施例中内生菌株炭疽菌4作用于桑寄生种子后的萌发照片。
图9为本发明实施例中内生菌株炭疽菌4作用于桑寄生种子后的生长照片。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如―具有”、―包含”以及―包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
申请人观察到，桑寄生自然状态下主要通过一些食果肉鸟类摄食其果实，消化果肉后的种子被排出并附着在寄主植物枝条上，之后在寄主植物表面发现桑寄生种子萌发形成的吸器穿透了寄主植物表皮，并伸长而与寄主植物之间形成―生理桥”，最终实现桑寄生的成功繁育，而将未能成功寄生的桑寄生种子从寄主植物上剥离时寄主植物表面是完好。那么，探明寄生植物如何穿透寄主植物的表皮并形成―生理桥”可能是提高桑寄生寄生率的关键。
寄生植物的吸器形成后与寄主植物形成―生理桥”必须穿透宿主植物表皮组织的障碍，为此，寄主植物吸器穿透寄生植物的机理也引起了广泛的关注(Nagar et al,1984；Ranjan et al,2014；Johnsen et al,2015；Olsen et al,2016)。有研究发现吸器的穿透对寄主植物细胞没有明显的损害，如发现独角金(Striga hermonthica)吸器穿透寄主植物的内皮层时，吸器并未造成内皮层细胞损害(Neumann et al,1999；Naseer et al,2012；Perez-de-Luque,2013)。并且在这一过程中还发现一些与细胞壁降解相关的酶类大量产生，例如大多数列当科 (Orobanchaceae)寄生植物中有此现象(Ben-Hod et al,1993；Perez-de-Luque,2013)，像 Orobanche cumana和Phelipanche aegyptiaca寄生植物的吸器穿刺点中就发现了一种被认为能降解果胶的果胶甲基酯酶(Losner-Goshen et al,1998)；还有其他一些细胞壁修饰酶，扩张酶，如菟丝子感染穿透期细胞壁修饰木葡聚糖内转葡糖苷酶活性达到高峰，相反，这些木葡聚糖修饰酶被抑制时则降低了吸器入侵成功的机率(Olsen and Krause,2017)。真菌在侵入寄主植物过程中降解寄主植物细胞壁的作用已有较多报道，可为桑寄生内生真菌在桑寄生寄主过程的作用研究提供借鉴。植物细胞壁中的主要成分木质素和纤维素方面的研究也有报道，但主要集中在一些模式木腐菌上，如白腐真菌黄孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium Burds.和虫拟蜡菌Ceriporiopsis subvermispora(Pilát)Gilb.&Ryvarden，以及褐腐真菌鲑色波斯特孔菌Postia placenta(Fr.)M.J.Larsen&Lombard等(Martinez et al, 2004,2009；Fernandez-Fueyo et al,2012)。白腐真菌被认为是降解木质素最有效、最主要的微生物，白腐菌在长期的生物进化过程中形成了一套独特的降解系统，漆酶、锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶共同构成了白腐菌的木质素降解酶系(许从峰等，2019)，能降解植物细胞壁的所有成分，包括木质素、纤维素和半纤维素(Hakala et al,2005；Kirk and Jeffries,1996)。本发明拟从不同寄主的桑寄生分离内生真菌，得到的内生真菌在愈创木酚为指示剂的选择培养基和纤维素固体培养基上筛选产生显色圈和透明圈的菌株，并已有研究报道产生显色圈和透明圈的具有降解木质素和纤维素的能力(Anderet al,1977和熊乙， 2019,徐安民等，2020)，将筛选到产生显色圈和透明圈的菌株进行漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶以及纤维素酶酶活定性测定，筛选出桑寄生内生真菌木质纤维素降解酶高产菌株，根据形态特征和分子生物学确立其分类地位，探索桑寄生内生真菌在桑寄生侵入寄主植物细胞壁降解的作用机制，不仅为桑寄生的繁育提供应用指导和理论依据，还为其它寄生植物侵入寄主植物机理提供新的研究思路。
本发明提供一株内生真菌，来源于黄花梨，所述内生真菌为炭疽菌Colletotrichum acutatum 4，炭疽菌Colletotrichum acutatum 4被保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No：61992，保藏时间为：2021年10月18日，保藏单位地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学微生物研究所。
本发明还提供了内生真菌应用于桑寄生繁育中的方法，包括：
1)取如权利要求1所述的炭疽菌4接种于培养基中进行培养；
2)收获步骤1)中生长的炭疽菌4的发酵液；
3)每株桑树枝条上点若干粒桑寄生种子进行培养，培养中，每天取步骤2)中的发酵液喷洒在所述桑树枝条上，所述发酵液的用量为1-10毫升/一次/一株。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，步骤1)中，所述培养基采用PDA液体培养基。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，步骤1)中，所述培养为：炭疽菌4于温度约28℃下恒温震荡培养约3天。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，步骤2)中，将步骤1)培养得到的培养液经分离取上清液，即得到发酵液。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，步骤3)中，所述发酵液的用量为5毫升/一次/一株。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，步骤3)中，将桑树和桑寄生种子共同培养约30天至桑寄生种子萌发。
本发明还提供所述的内生真菌菌株炭疽菌Colletotrichum acutatum 4在以麦麸质纤维生物物质为底物生产木质纤维素降解酶中的用途。
本发明还提供所述的内生真菌菌株在木质素降解、纤维素降解和桑寄生种子萌发中的用途。
本发明还提供所述的内生真菌菌株于桑寄生繁育及栽培、植物防控和科学研究中的用途。
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：
1材料与方法
1.1材料
1.1.1桑寄生样品采集
2019年1月份，在梧州岑溪富宁村桑寄生种植基地采集不同寄主的桑寄生茎枝条，包括桑树、李子、黄皮树、黄花梨、羊蹄甲、柿子、龙眼。同种植物采集3-5个枝条。
原料小麦麸皮购买自中鹤现代农业开发集团有限公司。小麦麸皮的预处理(WBDF)参照陶颜娟的方法(陶颜娟，2008)并略有改动。将小麦麸皮粉碎过40目筛，加入10倍体积的蒸馏水，用胶体磨混合粉碎25min。用150目筛过滤掉液体杂质，固体部分于烘箱中60℃干燥24h后粉碎。加入10倍体积的蒸馏水于95℃下加热30min，用HCL 调节pH为5.6，加入1.5％(w/w)的耐高温α-淀粉酶，于95℃搅拌反应30min，用碘液检测是否反应完全。降温至50℃，用NaOH调节pH为9.0，加入3％(w/w)碱性蛋白酶，搅拌反应2h。弃去上清液，用150目筛于清水中过滤冲洗直至洗涤液不浑浊，将剩余固体物质于60℃烘箱中干燥24h。将干燥得到的麦麸微型粉碎机粉碎，过100目筛， 50℃恒温烘箱烘干，过夜，备用。
1.1.2培养基
PDA培养基:马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH自然，1×105Pa灭菌30min。
种子液体培养基:葡萄糖20g/L，酵母膏2g/L，KH 2PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，VB10.5 g/L，pH自然，1×10 5Pa灭菌30min。
愈创木酚固体培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，KH 2PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，VB1 0.02g/L，愈创木酚1g/L，pH自然，1×105Pa灭菌30min。
液体发酵基础培养基:麦麸30g/L，KH2 PO4 3g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，(NH4)2SO41.4g，CaCl2 0.3g，FeSO4·7H2O 5mg/L，MnSO4·H2O 1.6mg/L，VB1 0.02g/L，pH自然，分装至250mL的三角瓶中，每瓶100mL，1×105Pa灭菌30min。
纤维素固体培养基采用刚果红染色培养基，方法参照参考文献(Kim et al,2018)，具体如下：
纤维素刚果红固体培养基：羧甲基纤维素钠5g/L，酵母膏0.5g/L，蛋白胨0.5g/L，牛肉膏0.3g/L，KH2PO4 3g/L，K2HPO4 5g/L，(NH4)2SO4 2g/L，MgSO4 0.4g/L，CaCl2 0.1 g/L，微量元素溶液1mL，琼脂粉20g/L，0.5g刚果红粉末溶于50mL无菌水中。
1.2方法
1.2.1内生真菌分离与纯化
选取不同寄主健康无病的桑寄生枝条，将组织切成5cm片段；依次用75％乙醇和0.1％升汞表面消毒2.5min，无菌水洗3次；用无菌镊子和手术刀将其切成约5mm大小组织块，将PDA(含有链霉素的培养基)平板上，每平皿5个块，每样品3个平皿，28℃培养，待组织块边缘长出菌丝，再转接至PDA平板上培养，纯化并保存。
1.2.2木质纤维素降解酶菌株初筛
木质素降解酶菌株初筛：采用0.1％创木酚加入PDA培养基中做成平板(孙江慧,2012)，在超净台上挑取纯化后直径为6mm的菌块于平板上，每个菌株3个平行，于28℃培养10d。观察并统计分析平板中菌落圈和显色圈直径的大小，以及菌落颜色变化。
纤维素降解酶菌株初筛：采用透明圈法，配置纤维素固体培养基后，将纯化后的菌株的组织块儿(直径6mm)接种在其培养基上，每组3次重复，28℃恒温培养10d，用0.1％刚果红染色15min，然后用1M NaCl脱色15min，观察记录单位菌落透明圈的直径，单位菌落透明圈直径＝透明圈直径-菌落直径。透明圈直径越大，说明产酶活性越高(Kim et al,2018)。
1.2.3木质纤维素降解酶菌株复筛
将有显色圈和透明圈的木质素纤维素降解酶菌株按照1.2.2方法进行复筛。
1.2.3酶液制备
选取有显色圈和透明圈的木质纤维素降解菌株培养5-7d，分别定量接种，吸取摇匀的种子液10mL加入装有100mL液体发酵培养基的250mL三角瓶中，每一株菌株接种2 瓶，每一瓶接5个直径为6mm菌株块，于26℃、140r/min恒温摇床中培养11d。菌种液体培养从第4天开始取样，每隔1d取样1次，发酵液用4层纱布过滤，滤液在3 000r/min 条件下离心15min，上清液即为粗酶液。
1.2.4酶活测定
漆酶酶活性的测定采用ABTS作为底物(Buswell et al.,1995)，定义为30℃条件下每分钟催化氧化1μmol底物ABTS所需的酶量为一个漆酶酶活力单位，底物ABTS的氧化通过测定反应液在420nm下的吸光值来确定，摩尔消光系数为36000Lmol-1·cm-1；木质素过氧化物酶活性的测定采用30℃条件下以藜芦醇作为氧化底物产生藜芦醛的方法(Tien etal.,1988)，一个单位的酶活性定义为每分钟每毫升反应液的吸光值变化0.1个单位；锰过氧化物酶活性的测定采用苯酚红的方法(Orth et al.,1993)，一个单位的酶活性定义为610 nm下每分钟每毫升反应液的吸光值上升0.1个单位，用U·mL-1表示。
纤维素酶活测定使用纤维素酶(CL)活性检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，采用3.5-二硝基水杨酸(DNS)法进行测定，在纤维素酶的作用下，纤维素降解产生还原性糖，测定还原性糖含量确定酶活性。将试剂盒10mg无水葡萄糖标准品(干燥失重＜0.2％)取出，加入1m L超纯水配制成10mg·mL-1葡萄糖溶液，再分梯度稀释为1.0、0.8、0.6、 0.4、0.2、0.1、0mg·mL-1。540nm处以0mg·mL-1调零，读取各浓度梯度吸光值，以浓度(X)为横坐标轴，吸光度A(Y)为纵坐标轴建立标准曲线。称取1mL发酵液，超声波冰浴破碎菌体。8000g，4℃离心10min，取上清液作为粗酶液装入2mL离心管中，置于冰上待测。反应底物和50μL样品组成反应体系350μL，反应后通过煮沸终止反应获得糖化液，取50μL糖化液，加入150μLDNS试剂混匀，再加入1050μL双蒸水于紫外分光光度计下540nm处测定吸光度(谢长校和柯丽霞等,2015)。
1.2.5内生真菌的鉴定
参考方中达的方法记录菌落形态(方中达,1998)，参考魏景超的方法(魏景超,1979) 和国际分类网站(http：//www.indexfungorum.org)进行菌落形态初步鉴定。参考Kumar 等(Kumar et al,2016)的方法，利用MEGA 7.0的邻位连接法联合构建ITS rDNA(ITS1 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和微管蛋白beta-tublin(βt-2a 5'-AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3'和βt-2b5'-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3')系统发育进化树(White et al,1990；Weir et al,2012)，进行分子生物学鉴定；采用MightyAmp DNA Polymerase Ver.3(1.25U/50μL)试剂盒(Takara Bio Inc.，Japan，cat.no.R076A)，挑取培养内生真菌的菌落作为模板直接用于PCR反应，用凝胶成像法检测目的条带，将有目的条带的PCR产物送至华大基因(广州) 股份有限公司测序；测序结果与NCBI的GenBank中的序列进行BLAST比对。利用MEGA 6.0软件的Neighbor-Joining法构建ITS rDNA系统发育树。
1.2.6数据统计分析
资料统计结果用x±s表示，±是平均值，s为标准差，各组数据均采用SPSS19.0软件进行单因素ANOVA分析，方差同质性检验，P<0.05为有统计学意义。
2结果与分析
2.1内生真菌的分离
从桑树、李子、黄皮树、黄花梨、羊蹄甲、柿子、龙眼等七种寄主桑寄生中共分离得到内生真菌菌株147株，其中桑树20株、李子20株、黄皮树9株、黄花梨27株、羊蹄甲22株、柿子23株、龙眼26株。选取不同形态类型的菌株，共计72株，进行木质素降解酶和纤维素酶活力平板检测。
2.2木质素降解酶活力平板检测
以愈创木酚为指示剂的选择培养基上产生显色圈的微生物具有降解木质素的能力，产漆酶的菌株在该培养基上长出的菌丝能产生明显的红褐色。在愈创木酚选择培养基平板上培养72株菌株11d，隔一天对各平板的变色情况进行观察记录，结果发现，即没有菌落圈也没有显色圈的菌株有11株；菌落圈直径与显色圈直径比值小于1有17株；菌落圈直径与显色圈直径比值大于1有26株；有显色圈而无菌落圈的菌株有7株；有菌落圈而无显色圈的菌株有11株。根据文献报道Eriksson等(Eriksson et al,2012)的研究表明，菌落圈与显色圈直径的比值可作为判断该菌是否能选择性降解木质素的依据，比值小于1则该菌能选择性降解木质素。综上所述，经过愈创木酚法定性初筛和复筛筛选，从24菌株(菌落圈直径与显色圈直径比值小于1和有显色圈而无菌落圈的菌株)中共筛选出5株能产生显色圈大而明显的菌株用来做后续酶活试验(表1)。从表1可以看出，这5株随着时间的增长，菌落圈和显色圈也在增长，到11d时菌落圈和显色圈均没有增长。图1为这5 株菌株在PDA显色平板上7d时的生长情况。
表1不同菌株菌落圈和显色圈直径随不同时间的变化
Table 1 Diameter changes of colony circle and chromogenic circle ofdifferent strains with time\cm
Figure RE-GDA0003485166100000121
2.3纤维素降解酶活力平板检测
在纤维素固体培养基平板上培养72株菌株11d，隔一天对各平板的变色情况进行观察记录，结果发现，既有菌落圈也无透明圈的菌株有14株；菌落圈直径与透明圈直径比值小于1有58株；无菌落圈直径与透明圈直径比值大于1的菌株。同样的从菌落圈直径与透明圈直径比值小于1的菌株中选出和木质素降解酶一样的菌株来做后续酶活试验(表 2)。从表2看出，这5株菌株随着时间的变化而逐渐变大，直到9d以后都不再变化，维持原来值范围。图2为这5株菌株在7d时纤维素固体培养基上显色的生长情况。
表2不同菌株菌落圈和显色圈直径随不同时间的变化
Table 2 Diameter changes of colony circle and chromogenic circle ofdifferent strains with time\cm
Figure RE-GDA0003485166100000122
2.4木质素降解酶系酶活分析
2.4.1漆酶酶活测定
由图3可以看出，这5株菌株产漆酶的高峰时间在7d，从9d开始下降。5株菌株产漆酶能力大小显著(P＜0.05)。其中，P6产漆酶能力最强，酶活为117.66U/mL，其次是 N6、15、31，酶活分别是51.82、32.11、21.85U/mL，4号菌株产漆酶能力最弱，酶活为 9.76U/mL。这5株内生真菌酶活大小顺序依次为P6＞N6＞15＞31＞4。
2.4.2锰过氧化物酶活测定
由图4看出，4号菌株产锰过氧化物酶出现的最高值是7d，酶活为11.61U/mL，其次是N6和31号菌株，最高酶活分别是8.47U/mL和5.58U/mL。而15和P6菌株则是在11d 时产酶能力最大，酶活分别为8.59U/mL和6.79U/mL。这5株内生真菌的锰过氧化物酶最高酶活大小分别是4＞15＞N6＞P6＞31，差异显著(P＜0.05)。
2.4.3木质素氧化物酶活测定
由图5看出，内生真菌菌株N6、4和31的木质素过氧化物酶酶活曲线随着时间的变化均是先升高，直达到酶活高峰，然后开始下降，这3株产木质素过氧化物酶能力最强是7d，酶活分别是6.64、3.0、2.9U/mL。P6和15号菌株的木质素过氧化物酶酶活均是先升高，然后是下降，到11d时又开始升高，最高酶活分别是4.21、3.4U/mL。这5株内生真菌的木质素过氧化物酶酶活大小顺序为N6＞P6＞15＞4＞31，且这5株内生真菌菌株酶活最低时的值与酶活最高时的值差异显著(P＜0.05)
2.4纤维素降解酶酶活分析
由图6看出，菌株P6、N6、31、4等4个菌株的纤维素酶活曲线随着时间的的变化都是先升高，直到达到酶活最高峰，然后开始下降，除菌株15在5d时突然下降之外，又在7d时上升到最高峰，而且这5个菌株产纤维素酶能力最强时间都是7d时，纤维素酶活分别是1.66、1.61、0.67、0.61、0.59U/mL。
2.5菌株的鉴定
ITS rDNA序列和微管蛋白beta-tublin序列进行测定并联合构建系统发育进化树，结果(图7)显示，菌株4、15、31、N6、P6分别与Colletotrichum acutatum(CBSMH860607)、 Nigrospora sphaerica(CBS MH854878)、Exserohilum rostratum(龙葵CBSMH865917)、 Diaporthe phaseolorum(CBS KC343174\KC343175\KC343176)、Pestalotiopsis arceuthobii (CBS MH858656)聚在同一分支，相似度达99％-100％。因此，分别将这5株鉴定鉴定 C.acutatum、N.sphaerica、E.rostratum、D.phaseolorum、P.arceuthobii。将这5个菌序列分别提交至GenBank数据库，获得的登录号分别为\(ITS和beta-tublin) MZ2823601/MZ964759，MZ2823600/MZ934421，MZ2823597/MZ934418，MZ2823599/ MZ934420，MZ2823598/MZ934419。
同时将菌株4保藏，菌株4为疽菌Colletotrichum acutatum 4，炭疽菌Colletotrichum acutatum 4被保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No：61992，保藏时间为：2021年10月18日，保藏单位地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学微生物研究所。
3内生真菌应用于桑寄生的繁育时的具体操作步骤和方法
植物内生真菌(endophytic fungi)是指在健康植物组织内的某一周期或者全部周期中，对植物组织不会造成明显的病害症状的一类真菌，它是植物微生物群落的重要组成部分。内生真菌具有丰富的生物多样性，可以无症状地在植物的茎、叶和根等不同健康组织中生长，在温带和热带雨林中自然存在，分布着约30万种陆地寄主植物。每一种植物都有一种或多种内生真菌。据估计，自然界中存在的内生真菌种类超过100万种。内生真菌与宿主植物的关系通常是互利共生关系，一方面，内生真菌生长需要的场所和养分来自宿主，另一方面，内生真菌在宿主的生长发育和系统演化中起重要作用。研究表明，内生真菌的存在可以增强宿主的免疫力和促进种子萌发的能力、以及抗病，内生真菌是植物防控技术领域重要的微生物资源。
桑寄生是一种半寄生性植物，寄主具有多样性，桑寄生种子确实是典型的顽拗性种子，脱水和低温敏感性强，严重制约桑寄生繁育，必将是其规范化栽培的技术瓶颈。
制备菌株4和P6发酵液通过喷洒的方式对寄生在桑树的桑寄生种子繁育提高其寄生率。具体步骤如下：
(1)将菌株4和P6活化在PDA培养基上，28℃培养5-7d，湿度60％。
(2)无菌条件下，每个菌株取5个直径7毫米的组织块，放进(300毫升的三角瓶) 没有琼脂的液体PDA培养基里面，180r/min在28℃恒温震荡3天，经无菌纱布过滤，以及滤纸过滤，10000r/min离心15分钟，取上清。
(3)每天取发酵液的上清液5毫升/一次/一株，一株桑树枝条点20粒种子，每个处理5个重复，共计100粒种子，25℃室内温度持续30d，对照是喷洒清水。
(4)如图8和图9所示，计算种子萌发率发现比对照提高了50％，喷洒发酵液的种子100粒种子最高可萌发50粒，而对照只有25粒。
(5)观察种子萌发的长势，喷洒发酵液的种子萌发早于对照3-5d。
4讨论
本发明选取麦麸为木质纤维生物物质底物进行发酵，选定不同时间测定漆酶、锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶以及纤维素酶等酶活性，发现产生漆酶和纤维素酶的5株菌株酶活最高时间均是7d，其中N6、4、15和31这4株的锰过氧化物没和木质素过氧化物酶的酶活最高峰也都出现在7d时，但是在11d时菌株15和P6出现第二次高峰，锰过氧化物酶酶活分别为8.59U/mL和6.79U/mL，木质素过氧化物酶酶活分别是3.4、4.21U/mL，这与所报道的一些白腐菌的木质素酶和纤维素酶相一致(Ruttimannet al.,1992；Raghukumar et al.,1999；Arora et al.,2000)，第二次峰值的出现可能是因为菌丝自溶而致使原来束缚在细胞膜上相应的胞内酶被释放出来的缘故(郝杰杰等，2006)。N6、4、15和31等这4 个菌株经形态和分子生物学分别鉴定为半知菌类间座壳属的D.phaseolorum、刺盘孢属的C.acutatum、球黑孢菌属的N.sphaerica、孢腔菌属的E.rostratum，这是首次报道4种真菌以麦麸质纤维生物物质为底物产生木质纤维素降解酶，也有前人研究6种半知菌类的真菌(Alternariasp.,Penicilliumsp.,Cephalosporiumsp.,Tricherdermasp.,Pestalotiopsissp.和 Aspergillusfumigatus)降解马尾松凋落叶片过程产漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、纤维素酶等酶活力(郝杰杰等，2006)。
木质素和纤维素的降解不是单依靠1种酶作用，而是几种酶共同作用的结果，木质素降解酶主要通过木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶这3种酶来完成(池玉杰和伊洪伟,2007)，而且，显色圈大小与漆酶活性的高低有必然联系但不是线性的正相关(杜海萍等,2006)；纤维素降解酶主要是内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，将纤维素彻底水解为单糖需要这3种酶的协同作用(Wilson 2009；Linton 2020；Siqueira et al.2020)。本发明筛选并鉴定了5株较好的木质纤维素降解菌株，以不同程度产生木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶以及纤维素酶，说明他们产生这些的酶能突破寄主的表皮细胞，从而可以成功寄生在寄主里面，为桑寄生侵入寄主植物细胞壁降解的作用机制奠定理论基础。本试验仍需以桑寄生的寄主桑树树皮为木质纤维生物物质底物，来测定这些酶活的的含量和产木质纤维素素降解酶的降解速率，并应考虑不同固体培养基的优化、延长发酵周期和添加土温80、阿魏酸、Cu2+或者二甲代苯胺等诱导因子，看是否能提高菌株的木质素纤维素降解酶活，这是需要进一步试验来剖析桑寄生内生真菌对寄主细胞壁降解的作用机制，进而为桑寄生的繁育提供理论依据和应用指导。
这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的甲酸基单细胞蛋白菌株及其应用的修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
SEQUENCE LISTING
<110> 广西壮族自治区药用植物园
<120> 内生真菌炭疽菌4、方法和用途
<130> 2020
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
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<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
aacatgcgtg agattgtaag t 21
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
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Claims (10)

1.一株内生真菌，所述内生真菌为炭疽菌Colletotrichum acutatum 4，炭疽菌Colletotrichum acutatum 4被保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC No：61992，保藏时间为：2021年10月18日，保藏单位地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学微生物研究所。
2.内生真菌应用于桑寄生繁育中的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)取如权利要求1所述的炭疽菌4接种于培养基中进行培养；
2)收获步骤1)中生长的炭疽菌4的发酵液；
3)每株桑树枝条上点若干粒桑寄生种子进行培养，培养中，每天取步骤2)中的发酵液喷洒在所述桑树枝条上，所述发酵液的用量为1-10毫升/一次/一株。
3.如权利要求2所述的内生真菌应用于桑寄生繁育中的方法，其特征在于，步骤1)中，所述培养基采用PDA液体培养基。
4.如权利要求2所述的内生真菌应用于桑寄生繁育中的方法，其特征在于，步骤1)中，所述培养为：炭疽菌4于温度约28℃下恒温震荡培养约3天。
5.如权利要求2所述的内生真菌应用于桑寄生繁育中的方法，其特征在于，步骤2)中，将步骤1)培养得到的培养液经分离取上清液，即得到发酵液。
6.如权利要求2所述的内生真菌应用于桑寄生繁育中的方法，其特征在于，步骤3)中，所述发酵液的用量为5毫升/一次/一株。
7.如权利要求2所述的内生真菌应用于桑寄生繁育中的方法，其特征在于，步骤3)中，将桑树和桑寄生种子共同培养约30天至桑寄生种子萌发。
8.如权利要求1所述的内生真菌菌株炭疽菌Colletotrichum acutatum 4在以麦麸质纤维生物物质为底物生产木质纤维素降解酶中的用途。
9.如权利要求1所述的内生真菌菌株在木质素降解、纤维素降解和桑寄生种子萌发中的用途。
10.如权利要求1所述的内生真菌菌株于桑寄生繁育及栽培、植物防控和科学研究中的用途。
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