CN114127316A - 艰难梭菌耐药进化分支snp标记及菌株类别鉴定方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种艰难梭菌耐药进化分支SNP标记及菌株类别鉴定方法和应用，本发明的SNP标记是艰难梭菌（Clostridium difficile）clade2（主要为高毒型别核糖核酸型027）的三种类别特异性标记，能够快速准确鉴定耐多种治疗药物和相关药物的艰难梭菌的进化分支，精确区分耐药分支类别不但可以有效指导临床用药同时为耐药病原菌进化溯源提供依据。

Description

艰难梭菌耐药进化分支SNP标记及菌株类别鉴定方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物耐药技术领域，具体涉及一种艰难梭菌耐药进化分支SNP标记及菌株类别鉴定方法和应用。
背景技术
美国疾病预防控制中心(CDC)2015年发布的数据显示，仅在美国每年有近50万人感染艰难梭菌(Clostridium difficile)，年死亡例数高达3万，已经开始取代MRSA成为最常见的医院感染病原体，治疗费用高达每年15亿美金。亚洲人艰难梭菌感染总数也逐年上升。该菌对常见抗生素如红霉素、克林霉素、氟喹诺酮类均有较高的耐药程度，只能通过甲硝唑和万古霉素来治疗，但近年来对甲硝唑和万古霉素的敏感性也持续下降，尤其是艰难梭菌的clade2菌株，clade2依据艰难梭菌多位点序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)数据库(http://pubmlst.org/cdifficile)定义，该库根据艰难梭菌7个看家基因的多态性确定每个菌株的序列类型(sequence type,ST)，再根据整个物种进化关系将各ST分配到5个分支(clade1～clade5)。Clade2为其中之一，主要包括高毒型别核糖核酸型027(Ribotype027)，是艰难梭菌多达600种核糖核酸型中的一种，该型别通过实验手段利用16S-23S的基因间隔区域多态性的聚合酶链反应的方法分类获得，其耐药程度和临床严重程度受到高度关注。
对耐药菌继续使用抗生素，不但起不到治疗效果，产生资源浪费且耽误临床周期，还有可能造成更严重的耐药突变。现有的病原菌耐药性检测主要有以下两类技术：(1)通过药敏试验鉴定耐药与否；(2)已有耐药试剂盒等产品鉴定耐药。现有的病原菌耐药性检测技术存在以下问题：(1)药敏试验检测艰难梭菌，培养条件苛刻，实验周期较长，不能满足临床快检的需求。(2)已有耐药试剂盒并不是治疗药物的检测，临床指导意义不大。
发明内容
本发明提供一种艰难梭菌耐药进化分支SNP标记及菌株类别鉴定方法和应用，能够快速准确鉴定耐多种治疗药物和相关药物的艰难梭菌的进化分支，具有临床治疗指导意义。
根据第一方面，一种实施例中提供一种艰难梭菌耐药进化分支SNP标记，艰难梭菌是艰难梭菌(Clostridium difficile)clade2，上述SNP标记选自如下三种类别中任一SNP标记或它们的任意组合：
(a)类别1：基因组碱基编号1029237位为A碱基，基因组碱基编号1205938位为T碱基，基因组碱基编号2487991位为A碱基，基因组碱基编号2861888位为A碱基，基因组碱基编号882348位为T碱基，基因组碱基编号1798870位为G碱基，基因组碱基编号3083454位为A碱基；
(b)类别2：基因组碱基编号6310位为C碱基，基因组碱基编号1550363位为A碱基；
(c)类别3：基因组碱基编号118669位为G碱基，基因组碱基编号1205250位为C碱基，基因组碱基编号1235096位为C碱基，基因组碱基编号1462869位为A碱基，基因组碱基编号1549858位为T碱基，基因组碱基编号2367860位为A碱基，基因组碱基编号2851331位为A碱基，基因组碱基编号3031309位为C碱基，基因组碱基编号3419928位为G碱基，基因组碱基编号1602810位为G碱基，基因组碱基编号2585036位T碱基。
在优选实施例中，艰难梭菌(Clostridium difficile)clade2为高毒型别核糖核酸型027(Ribotype027)。
根据第二方面，一种实施例中提供一种艰难梭菌菌株类别鉴定方法，包括：获取待鉴定艰难梭菌菌株的第一方面中SNP标记中至少一个SNP标记位点的碱基信息；以及，根据上述碱基信息判断上述艰难梭菌菌株类别。
在优选实施例中，上述方法包括：获取待鉴定艰难梭菌菌株的第一方面中上述类别1、类别2或类别3中至少一个SNP标记位点的碱基信息；以及，根据上述碱基信息判断上述艰难梭菌菌株是否属于上述类别1、类别2或类别3。
在优选实施例中，上述方法包括：获取待鉴定艰难梭菌菌株的第一方面中上述类别1、类别2或类别3中至少两个类别中每个类别中的至少一个SNP标记位点的碱基信息；以及，根据上述碱基信息判断上述艰难梭菌菌株属于上述类别1、类别2或类别3中的类别。
在优选实施例中，上述方法通过使用用于特异性扩增上述SNP标记位点所在基因组区域的引物扩增上述区域，并通过测序获取上述SNP标记位点的碱基信息。
根据第三方面，一种实施例中提供一种诊断艰难梭菌感染的患者中菌株类别的方法，包括：获取来自于上述患者的上述艰难梭菌的第一方面中SNP标记中至少一个SNP标记位点的碱基信息；以及，根据上述碱基信息判断上述艰难梭菌菌株类别。
在优选实施例中，上述方法包括：获取来自于上述患者的上述艰难梭菌的第一方面中上述类别1、类别2或类别3中至少一个SNP标记位点的碱基信息；以及，根据上述碱基信息判断上述艰难梭菌菌株是否属于上述类别1、类别2或类别3。
在优选实施例中，上述方法包括：获取来自于上述患者的上述艰难梭菌的第一方面中上述类别1、类别2或类别3中至少两个类别中每个类别中的至少一个SNP标记位点的碱基信息；以及，根据上述碱基信息判断上述艰难梭菌菌株属于上述类别1、类别2或类别3中的类别。
在优选实施例中，上述方法通过使用用于特异性扩增上述SNP标记位点所在基因组区域的引物扩增上述区域，并通过测序获取上述SNP标记位点的碱基信息。
根据第四方面，一种实施例中提供一种治疗艰难梭菌感染的患者的方法，包括：获取来自于上述患者的上述艰难梭菌的第一方面中SNP标记中至少一个SNP标记位点的碱基信息；根据上述碱基信息判断上述艰难梭菌菌株类别；以及，在上述艰难梭菌菌株类别包括上述类别2时，向上述患者施用莫西沙星和/或甲硝哒唑；任选地，在上述艰难梭菌菌株类别包括上述类别2和/或类别3时，向上述患者施用万古霉素。
在优选实施例中，上述方法通过使用用于特异性扩增上述SNP标记位点所在基因组区域的引物扩增上述区域，并通过测序获取上述SNP标记位点的碱基信息。
根据第五方面，一种实施例中提供一种用于特异性扩增第一方面中上述SNP标记所在基因组区域的引物，包括正向引物和反向引物，上述正向引物和反向引物分别特异性结合上述SNP标记两侧的基因组正反链。
在优选实施例中，上述引物上带有荧光标签，上述引物用于荧光定量PCR。
在优选实施例中，上述引物作为杂交探针，用于固定于芯片上以捕获上述SNP标记所在基因组区域的序列。
根据第六方面，一种实施例中提供一种第五方面的引物在艰难梭菌菌株类别鉴定或诊断艰难梭菌感染的患者中菌株类别中的用途。
根据第七方面，一种实施例中提供一种第一方面的SNP标记在艰难梭菌菌株类别鉴定或诊断艰难梭菌感染的患者中菌株类别中的用途。
根据第八方面，一种实施例中提供一种试剂盒，该试剂盒包括引物，该引物包括正向引物和反向引物，正向引物和反向引物分别特异性结合第一方面中的SNP标记两侧的基因组正反链，用于特异性扩增SNP标记所在基因组区域；任选地，该试剂盒还包括上述引物以外的PCR扩增组分，例如Taq DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液等。
本发明提供的艰难梭菌耐药进化分支SNP标记，不仅是耐药标记，而且是鉴定整个艰难梭菌高毒型别clade2(主要为高毒型别核糖核酸型027(Ribotype027))耐药进化分支的标记，位于同一分支的菌株在全基因组范围有更近的亲缘关系，即有更多相同的基因组特征。使用本发明能够快速准确鉴定耐多种治疗药物和相关药物的艰难梭菌的进化分支，具有临床治疗指导意义。
附图说明
图1为本发明实施例中269个艰难梭菌高毒型别核糖核酸型027(RT027)菌株的进化关系及分类情况图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本发明提供一种艰难梭菌耐药进化分支SNP标记，艰难梭菌是艰难梭菌(Clostridium difficile)clade2(主要为高毒型别核糖核酸型027(Ribotype027))，SNP标记选自如下三种类别中任一SNP标记或它们的任意组合：
(a)类别1：基因组碱基编号1029237位为A碱基，基因组碱基编号1205938位为T碱基，基因组碱基编号2487991位为A碱基，基因组碱基编号2861888位为A碱基，基因组碱基编号882348位为T碱基，基因组碱基编号1798870位为G碱基，基因组碱基编号3083454位为A碱基；
(b)类别2：基因组碱基编号6310位为C碱基，基因组碱基编号1550363位为A碱基；
(c)类别3：基因组碱基编号118669位为G碱基，基因组碱基编号1205250位为C碱基，基因组碱基编号1235096位为C碱基，基因组碱基编号1462869位为A碱基，基因组碱基编号1549858位为T碱基，基因组碱基编号2367860位为A碱基，基因组碱基编号2851331位为A碱基，基因组碱基编号3031309位为C碱基，基因组碱基编号3419928位为G碱基，基因组碱基编号1602810位为G碱基，基因组碱基编号2585036位T碱基。
需要说明的是：上述所有碱基位置编号都是以Clostridium difficile CD196(NC_013315.1)作为参考基因组。
本发明中的上述20种SNP标记中，15种具有100％的类别特异性，即类别1中的前4种SNP标记仅出现在属于类别1的艰难梭菌高毒型别核糖核酸型027，类别2中的全部两种SNP标记仅出现在属于类别2的艰难梭菌高毒型别核糖核酸型027，类别3中的前9种SNP标记仅出现在属于类别3的艰难梭菌高毒型别核糖核酸型027。因此，鉴定出上述SNP标记，即可判断待鉴定的艰难梭菌高毒型别核糖核酸型027属于类别1、类别2或类别3中哪一种具体的类别。
本发明中的上述20种SNP标记中，除前述15种外，剩余5种的类别特异性大于90％，即，1)类别1中基因组碱基编号882348位为T碱基时，菌株为类别1的概率为93.3％；为C碱基时，菌株为类别2或类别3的概率为100％。基因组碱基编号1798870位为G碱基时，菌株为类别1的概率为91.8％；为A碱基时，菌株为类别2或类别3的概率为100％。基因组碱基编号3083454位为A碱基时，菌株为类别1的概率为96.6％；为G碱基时，菌株为类别2或类别3的概率为100％。2)类别3中基因组碱基编号1602810位为G或T碱基时，菌株为类别3的概率为100％；为C碱基时，菌株为类别1或类别2的概率为100％。基因组碱基编号2585036为T碱基时，菌株为类别3的概率为100％；为G碱基时，菌株为类别1或类别2的概率为95.2％。
需要说明的是，SNP标记的任意组合是指来自上述三个类别中任何1个、2个或3个类别中的SNP标记的组合。例如，类别1中任意1种、2种、3种、4种、5种、6种或7种SNP标记的组合，如类别1中基因组碱基编号1029237和1205938位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1029237和2487991位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1029237和2861888位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1029237和882348位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1029237和1798870位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1029237和3083454位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1205938和2487991位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1205938和2861888位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1205938和882348位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1205938和1798870位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1205938和3083454位的SNP标记的组合，基因组碱基编号2487991和2861888位的SNP标记的组合，基因组碱基编号2487991和882348位的SNP标记的组合，基因组碱基编号2487991和1798870位的SNP标记的组合，基因组碱基编号2487991和3083454位的SNP标记的组合，基因组碱基编号2861888和882348位的SNP标记的组合，基因组碱基编号2861888和1798870位的SNP标记的组合，基因组碱基编号2861888和3083454位的SNP标记的组合，基因组碱基编号882348和1798870位的SNP标记的组合，基因组碱基编号882348和3083454位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1798870和3083454位的SNP标记的组合；或者在上述组合的基础上，任意加入第3种、第4种、第5种、第6种或第7种SNP标记形成的具有3种、4种、5种、6种或7种SNP标记的组合。
又例如，类别2中基因组碱基编号6310和1550363位的SNP标记的组合。
还例如，类别3中任意1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或11种SNP标记的组合，如基因组碱基编号118669和1205250位的SNP标记的组合，基因组碱基编号118669和1235096位的SNP标记的组合，基因组碱基编号118669和1462869位的SNP标记的组合，基因组碱基编号118669和1549858位的SNP标记的组合，基因组碱基编号118669和2367860位的SNP标记的组合，基因组碱基编号118669和2851331位的SNP标记的组合，基因组碱基编号118669和3031309位的SNP标记的组合，基因组碱基编号118669和3419928位的SNP标记的组合，基因组碱基编号118669和1602810位的SNP标记的组合，基因组碱基编号118669和2585036位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1205250和1235096位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1205250和1462869位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1205250和1549858位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1205250和2367860位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1205250和2851331位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1205250和3031309位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1205250和3419928位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1205250和1602810位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1205250和2585036位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1235096和1462869位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1235096和1549858位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1235096和2367860位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1235096和2851331位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1235096和3031309位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1235096和3419928位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1235096和1602810位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1235096和2585036位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1462869和1549858位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1462869和2367860位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1462869和2851331位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1462869和3031309位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1462869和3419928位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1462869和1602810位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1462869和2585036位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1549858和2367860位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1549858和2851331位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1549858和3031309位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1549858和3419928位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1549858和1602810位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1549858和2585036位的SNP标记的组合，基因组碱基编号2367860和2851331位的SNP标记的组合，基因组碱基编号2367860和3031309位的SNP标记的组合，基因组碱基编号2367860和3419928位的SNP标记的组合，基因组碱基编号2367860和1602810位的SNP标记的组合，基因组碱基编号2367860和2585036位的SNP标记的组合，基因组碱基编号2851331和3031309位的SNP标记的组合，基因组碱基编号2851331和3419928位的SNP标记的组合，基因组碱基编号2851331和1602810位的SNP标记的组合，基因组碱基编号2851331和2585036位的SNP标记的组合，基因组碱基编号3031309和3419928位的SNP标记的组合，基因组碱基编号3031309和1602810位的SNP标记的组合，基因组碱基编号3031309和2585036位的SNP标记的组合，基因组碱基编号3419928和1602810位的SNP标记的组合，基因组碱基编号3419928和2585036位的SNP标记的组合，基因组碱基编号1602810和2585036位的SNP标记的组合；或者在上述组合的基础上，任意加入第3种、第4种、第5种、第6种、第7种、第8种、第9种、第10种或第11种SNP标记形成的具有3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或11种SNP标记的组合。
跨类别的SNP标记组合的典型但非限定性的例子包括：类别1中任意1种、2种、3种、4种、5种、6种或7种SNP标记，与类别2中任意1种或2种SNP标记的组合；或者类别1中任意1种、2种、3种、4种、5种、6种或7种SNP标记，与类别3中任意1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或11种SNP标记的组合；或者类别2中任意1种或2种SNP标记，与类别3中任意1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或11种SNP标记的组合；或者类别1中任意1种、2种、3种、4种、5种、6种或7种SNP标记，与类别2中任意1种或2种SNP标记，与类别3中任意1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或11种SNP标记的组合。
本发明基于全球16个国家收集的艰难梭菌高毒型别核糖核酸型027样本(共269株)，通过全基因组测序，SNP鉴定(calling)等策略构建出艰难梭菌高毒型别核糖核酸型027的进化关系，并且鉴别出耐药比例存在显著差异的进化分支及其对应的marker。RT027属于是clade2最主要的型别，与其他ribotype如198，176等在全基因组进化树上交叉分布，进一步用求得的marker将clade2进行聚类并统计耐药比例，与RT027分组有高度一致性，因为该marker可以区分整个clade2的耐药分支，具体做法如下：
(1)所有菌株做3类药(莫西沙星MOX、甲硝唑MET、万古霉素VAN，其中，莫西沙星属于氟喹诺酮类抗生素，与艰难梭菌的爆发有密切关系，后两种药物是目前艰难梭菌的治疗药物)的药敏实验，分别得到抗性或敏感表型。
(2)高毒RT027菌株对莫西沙星、甲硝哒唑、万古霉素这三种抗生素平均耐药率均大于20％(如表3)，但我们从进化关系及药敏试验结果定义出耐药或敏感分支，可将该型别菌株进一步细分为3类，发现每类的耐药率有明显的差异。图1示出了艰难梭菌高毒型别核糖核酸型027，基于MOX药物的耐药情况可分为3大类耐药分支，其中灰色虚线所含菌株为类别1，共56个菌株；黑色实线所含菌株为类别2(敏感分支)，共23个菌株；灰色实线所含菌株为类别3，共190个菌株。
(3)各分支SNP标记的鉴定：
a)遍历全基因组SNP位点；
b)若各大类菌株在该位点频率最高的碱基相同，则去除该位点；
c)若该位点存在未知信息(如由于测序错误或测序覆盖率不足，某一菌株在该位点的碱基未知)，则去除该位点。
(4)分析经步骤(3)过滤所剩余位点的碱基类型及碱基频率信息，选取在同一类菌株中主要碱基的频率大于一定阈值(例如90％或95％或100％等)的SNP，作为区分不同类别菌株的标记(marker)，如表1所示。
(5)根据应用场景，单独使用或组合应用步骤(4)所得SNP标记，对不同类别菌株进行区分、鉴定。
(6)根据菌株类别判定结果，得到所在类别的特定表型信息。
(7)利用表1的marker位点对clade2的383株菌进行聚类，并对每一个子分类统计耐药比例，结果显示与027的分类效力高度一致，如表4所示。
表1 20个菌株特异性SNP标记
Figure BDA0003378429260000111
Figure BDA0003378429260000121
表1中，SNP位点在基因组上位置为，在参考基因组Clostridium difficile CD196菌株的全基因组序列上的位置。
相应地，本发明实施例提供一种艰难梭菌菌株类别鉴定方法，包括：获取待鉴定艰难梭菌菌株的表1中SNP标记中至少一个SNP标记位点的碱基信息；以及，根据上述碱基信息判断上述艰难梭菌菌株类别。
根据应用场景，单独使用或组合使用表1中SNP标记，对不同类别菌株进行区分、鉴定。
一种情况是，获取待鉴定艰难梭菌菌株的表1中类别1、类别2或类别3特异性的SNP标记位点中至少一个的碱基信息；以及，根据碱基信息判断艰难梭菌菌株是否属于类别1、类别2或类别3。例如，在一个实施例中，若仅需鉴定出某一属于clade2(RT027)的菌株是否为类别1菌株，则可通过鉴定该菌株在位点1029237(或位点1205938，或位点2487991，或位点2861888)上的碱基类型，判别该菌株是否属于类别1。以此类推。
另一种情况是，获取待鉴定艰难梭菌菌株的表1类别1、类别2或类别3特异性的SNP标记位点中至少两个类别中每个类别中的至少一个SNP标记位点的碱基信息；以及，根据碱基信息判断艰难梭菌菌株属于类别1、类别2或类别3中的类别。例如，在一个实施例中，若仅需鉴定出某一属于clade2(RT027)的菌株的准确类别，则可通过鉴定该菌株在两种类别特异性位点如类别1特异性位点1205938和类别2特异性位点6310(或类别1特异性位点2487991和类别3特异性位点3419928，或其他任何组合)上的碱基类型。若位点1205938的判别结果显示该菌株为非类别1菌株，且位点6310的判别结果显示该菌株为非类别2菌株，则可判别该菌株为类别3菌株。以此类推。
在一个实施例中，通过使用用于特异性扩增SNP标记位点所在基因组区域的引物扩增该区域，并通过测序获取SNP标记位点的碱基信息。本发明中，引物按照本领域常规设计即可，没有特别限制。这种引物包括正向引物和反向引物，正向引物和反向引物分别特异性结合SNP标记两侧的基因组正反链。
如下表2示出了检测部分SNP标记位点的正向引物和反向引物，以及引物对应的类别特异性。
表2
Figure BDA0003378429260000131
Figure BDA0003378429260000141
Figure BDA0003378429260000151
表2中，SNP位点为艰难梭菌CD196菌株基因组上的位置；引物序列中SNP标记位点以下划线标注；用于同一SNP标记位点鉴定的两对引物共享一条反向引物，仅在正向引物的3’端最后一位碱基有区别。
表2中的引物，在实际应用时，可分别在识别同一SNP标记位点的两对引物上添加不同颜色的荧光标签，根据qPCR过程中两种颜色荧光的区别来判断菌株类别；也可以用常规PCR对序列进行扩增，然后使用质谱或测序手段进行SNP标记位点鉴定；还可以将引物改造为杂交探针，用于DNA芯片中。
本发明具有临床诊断和治疗用途。在一个实施例中，提供一种诊断艰难梭菌感染的患者中菌株类别的方法，包括：获取来自于患者的艰难梭菌的本发明中SNP标记中至少一个SNP标记位点的碱基信息；以及，根据碱基信息判断艰难梭菌菌株类别。
一种情况是，获取艰难梭菌感染的患者中菌株对应于本发明中类别1、类别2或类别3特异性的SNP标记位点中至少一个的碱基信息；以及，根据碱基信息判断艰难梭菌菌株是否属于类别1、类别2或类别3。例如，在一个实施例中，若仅需鉴定出某一艰难梭菌感染的患者中属于clade2(RT027)的菌株是否为类别1菌株，则可通过鉴定该菌株在位点1029237(或位点1205938，或位点2487991，或位点2861888)上的碱基类型，判别该菌株是否属于类别1。以此类推。
另一种情况是，获取艰难梭菌感染的患者中菌株对应于本发明中类别1、类别2或类别3特异性的SNP标记位点中至少两个类别中每个类别中的至少一个SNP标记位点的碱基信息；以及，根据碱基信息判断艰难梭菌菌株属于类别1、类别2或类别3中的类别。例如，在一个实施例中，若仅需鉴定出某一艰难梭菌感染的患者中属于clade2(RT027)的菌株的准确类别，则可通过鉴定该菌株在两种类别特异性位点如类别1特异性位点1205938和类别2特异性位点6310(或类别1特异性位点2487991和类别3特异性位点3419928，或其他任何组合)上的碱基类型。若位点1205938的判别结果显示该菌株为非类别1菌株，且位点6310的判别结果显示该菌株为非类别2菌株，则可判别该菌株为类别3菌株。以此类推。
本发明中，根据菌株类别判定结果，可以得到所在类别的特定表型信息。
Clade2(高毒RT027)菌株对莫西沙星、甲硝哒唑、万古霉素这三种抗生素平均耐药率均大于30％(如表3)，但我们从进化关系及药敏试验结果定义出耐药或敏感分支，可将该型别菌株进一步细分为3类，发现每类的耐药率有明显的差异。类别2的RT027菌株，对莫西沙星和甲硝哒唑的耐药率较低，分别只有4.35％和0.0％。而类别2和类别3的RT027菌株，对万古霉素的耐药率稍高于20％，分别为21.74％和21.05％。同样，类别2的clade2菌株，对对莫西沙星和甲硝哒唑的耐药率较低，分别只有2.08％和3.03％，而类别2和类别3的clade2菌株，对万古霉素的耐药率高于20％，分别为30.21％和22.58％。临床中对菌种进行细分类，获取对应分类的表型信息，将有助于提高抗生素的正确使用率，减少医疗资源浪费，降低患者痛苦。因此，本发明的类别特异性SNP位点，具有显著的临床应用价值。
表3 269个RT027菌株的抗生素耐药率
Figure BDA0003378429260000171
表4 383个clade2菌株的抗生素耐药率
Figure BDA0003378429260000172
基于上述耐药率的表型信息，本发明一种实施例提供一种治疗艰难梭菌感染的患者的方法，包括：获取来自于患者的艰难梭菌的本发明中SNP标记中至少一个SNP标记位点的碱基信息；根据碱基信息判断艰难梭菌菌株类别；以及，在艰难梭菌菌株类别包括类别2时，向患者施用莫西沙星和/或甲硝哒唑；任选地，在艰难梭菌菌株类别包括类别2和/或类别3时，向患者施用万古霉素。
本发明的SNP标记和引物均可用于艰难梭菌菌株类别鉴定或诊断艰难梭菌感染的患者中菌株类别。因此，本发明一种实施例提供本发明的SNP标记和引物在艰难梭菌菌株类别鉴定或诊断艰难梭菌感染的患者中菌株类别中的用途。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大生命科学研究院
<120> 艰难梭菌耐药进化分支SNP 标记及菌株类别鉴定方法和应用
<130> 18P27621
<160> 34
<170> PatentIn version 3.3
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<220>
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tggattatgc acttgaaata tgtgag 26
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tcttctcttt tgggtatatt agttga 26
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<211> 21
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<223> 合成序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成序列
<400> 34
aggtgagtgt gaatgttcat ttga 24

Claims (17)

1.一种艰难梭菌耐药进化分支SNP标记，其特征在于，所述艰难梭菌是艰难梭菌(Clostridium difficile)clade2，所述SNP标记选自如下三种类别中任一SNP标记或它们的任意组合：
(a)类别1：基因组碱基编号1029237位为A碱基，基因组碱基编号1205938位为T碱基，基因组碱基编号2487991位为A碱基，基因组碱基编号2861888位为A碱基，基因组碱基编号882348位为T碱基，基因组碱基编号1798870位为G碱基，基因组碱基编号3083454位为A碱基；
(b)类别2：基因组碱基编号6310位为C碱基，基因组碱基编号1550363位为A碱基；
(c)类别3：基因组碱基编号118669位为G碱基，基因组碱基编号1205250位为C碱基，基因组碱基编号1235096位为C碱基，基因组碱基编号1462869位为A碱基，基因组碱基编号1549858位为T碱基，基因组碱基编号2367860位为A碱基，基因组碱基编号2851331位为A碱基，基因组碱基编号3031309位为C碱基，基因组碱基编号3419928位为G碱基，基因组碱基编号1602810位为G碱基，基因组碱基编号2585036位T碱基。
2.一种艰难梭菌菌株类别鉴定方法，其特征在于，所述方法包括：获取待鉴定艰难梭菌菌株的权利要求1中SNP标记中至少一个SNP标记位点的碱基信息；以及，根据所述碱基信息判断所述艰难梭菌菌株类别。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括：获取待鉴定艰难梭菌菌株的权利要求1中所述类别1、类别2或类别3中至少一个SNP标记位点的碱基信息；以及，根据所述碱基信息判断所述艰难梭菌菌株是否属于所述类别1、类别2或类别3。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括：获取待鉴定艰难梭菌菌株的权利要求1中所述类别1、类别2或类别3中至少两个类别中每个类别中的至少一个SNP标记位点的碱基信息；以及，根据所述碱基信息判断所述艰难梭菌菌株属于所述类别1、类别2或类别3中的类别。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法通过使用用于特异性扩增所述SNP标记位点所在基因组区域的引物扩增所述区域，并通过测序获取所述SNP标记位点的碱基信息。
6.一种诊断艰难梭菌感染的患者中菌株类别的方法，其特征在于，所述方法包括：获取来自于所述患者的所述艰难梭菌的权利要求1中SNP标记中至少一个SNP标记位点的碱基信息；以及，根据所述碱基信息判断所述艰难梭菌菌株类别。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括：获取来自于所述患者的所述艰难梭菌的权利要求1中所述类别1、类别2或类别3中至少一个SNP标记位点的碱基信息；以及，根据所述碱基信息判断所述艰难梭菌菌株是否属于所述类别1、类别2或类别3。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括：获取来自于所述患者的所述艰难梭菌的权利要求1中所述类别1、类别2或类别3中至少两个类别中每个类别中的至少一个SNP标记位点的碱基信息；以及，根据所述碱基信息判断所述艰难梭菌菌株属于所述类别1、类别2或类别3中的类别。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法通过使用用于特异性扩增所述SNP标记位点所在基因组区域的引物扩增所述区域，并通过测序获取所述SNP标记位点的碱基信息。
10.一种治疗艰难梭菌感染的患者的方法，其特征在于，所述方法包括：获取来自于所述患者的所述艰难梭菌的权利要求1中SNP标记中至少一个SNP标记位点的碱基信息；根据所述碱基信息判断所述艰难梭菌菌株类别；以及，在所述艰难梭菌菌株类别包括所述类别2时，向所述患者施用莫西沙星和/或甲硝哒唑；任选地，在所述艰难梭菌菌株类别包括所述类别2和/或类别3时，向所述患者施用万古霉素。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法通过使用用于特异性扩增所述SNP标记位点所在基因组区域的引物扩增所述区域，并通过测序获取所述SNP标记位点的碱基信息。
12.一种用于特异性扩增权利要求1中所述SNP标记所在基因组区域的引物，其特征在于，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物分别特异性结合所述SNP标记两侧的基因组正反链。
13.根据权利要求12所述的引物，其特征在于，所述引物上带有荧光标签，所述引物用于荧光定量PCR。
14.根据权利要求12所述的引物，其特征在于，所述引物作为杂交探针，用于固定于芯片上以捕获所述SNP标记所在基因组区域的序列。
15.权利要求12至14任一项所述的引物在艰难梭菌菌株类别鉴定或诊断艰难梭菌感染的患者中菌株类别中的用途。
16.权利要求1所述的SNP标记在艰难梭菌菌株类别鉴定或诊断艰难梭菌感染的患者中菌株类别中的用途。
17.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物分别特异性结合权利要求1中所述SNP标记两侧的基因组正反链，用于特异性扩增所述SNP标记所在基因组区域；
任选地，所述试剂盒还包括所述引物以外的PCR扩增组分。
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