CN114127033A - 方法和分子 - Google Patents

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CN114127033A CN202080048807.6A CN202080048807A CN114127033A CN 114127033 A CN114127033 A CN 114127033A CN 202080048807 A CN202080048807 A CN 202080048807A CN 114127033 A CN114127033 A CN 114127033A
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Abstract

本发明提供了第一多肽和第二多肽的缀合物，其中该第一多肽与该第二多肽之间的连接部包含以下部分。
Figure DDA0003451987560000011

Description

方法和分子
本披露涉及一种缀合两种多肽的方法和通过所述方法制备的分子。
背景技术
在WO 2018/218093中描述了使用二烯与亲二烯体之间的狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应将生物分子缀合到有效负载上。该方法被认为能够在温和的条件下进行，有时在不存在额外试剂的情况下进行。
令人惊讶地发现，通过使用WO 2018/218093中所披露的可以充当二烯和亲二烯体两者的某些部分，可以发生接近度驱动的反应，这些反应可以用于将两种多肽连接在一起。
还描述了在蛋白质中实现非天然的接近度依赖性反应性的几种策略，它们利用规范和非常规氨基酸的互补对将蛋白质单元共价连接在一起。这些对包括携带以下基团的非常规氨基酸：硫醇反应性溴、氟或氟苯官能团(Cigler 2017，Xiang2013，Embaby 2018)；赖氨酸反应性氨基甲酸芳酯基团(Xuan 2017)；以及赖氨酸、组氨酸和酪氨酸反应性氟代硫酸酯基团(Wang 2018)。在这些系统中采用的一般偶联策略是将单个非常规氨基酸与适当的常规氨基酸反应配偶体一起引入蛋白质序列中，使它们在折叠或组装的蛋白质结构中紧邻。
发明内容
本发明的第一方面提供了第一多肽和第二多肽的缀合物，其中第一多肽与第二多肽之间的连接部包含以下部分：
Figure BDA0003451987540000021
本发明的第二方面提供了一种缀合第一多肽和第二多肽的方法，其中第一多肽和第二多肽各自包含以下部分：
Figure BDA0003451987540000022
(环戊二烯基，CP)，其中该缀合涉及环戊二烯基部分之间的狄尔斯-阿尔德反应。
本文所用的狄尔斯-阿尔德反应是指形成环己烯环(其是稠环体系的一部分)的4加2环加成反应。
令人惊讶的是，诸位发明人已经确定，两个环戊二烯基基团在温和条件下接近时会发生这种狄尔斯-阿尔德反应。在其他情况下，生物缀合反应可以一步进行，而不需要除两种多肽和溶剂之外的额外试剂。
此外，反应性交联剂和包含环戊二烯基基团的非天然氨基酸可合成获得，并且可以通过简单且直接的路线以高产率产生，如WO 2018/218093中所述。
将环戊二烯基基团并入多肽中
可经由添加接头或通过将非天然氨基酸并入多肽序列中来将环戊二烯基基团并入第一多肽和第二多肽中，如WO 2018/218093中所述。
在一个实施例中，环戊二烯基基团中的至少一个包含在非天然氨基酸中，例如衍生自赖氨酸、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸和酪氨酸的非天然氨基酸中。
在一个实施例中，环戊二烯基基团中的至少一个在氨基酸的侧链中。
在一个实施例中，非天然氨基具有式(I)：
RX-X1-O0-1C(O)-氨基酸-残基 (I)
其中：
Rx表示
Figure BDA0003451987540000031
并且
X1表示
i)饱和或不饱和的支链或非支链C1-8亚烷基链，其中至少一个碳(例如，1、2或3个碳)被选自O、N、S(O)0-3的杂原子替换，其中所述链任选地被一个或多个独立地选自氧代、卤素、氨基、-C1-3亚烷基-N3或-C2-5炔基的基团取代；或者
ii)与来自碳环基或杂环基的碳一起表示与饱和或不饱和(特别是饱和)的支链或非支链C1-6亚烷基链连接的环丙烷环，其中至少一个碳(例如，1、2或3个碳)被选自O、N、S(O)0-3的杂原子替换，其中所述链任选地被一个或多个独立地选自氧代、卤素、氨基、-C1-3亚烷基-N3或-C2-5炔基的基团取代；并且
-O0-1C(O)-通过氨基酸的侧链连接。
在一个实施例中，非天然氨基酸是具有式(II)的结构的残基：
Figure BDA0003451987540000032
其中Ra表示：
i)饱和或不饱和的支链或非支链C1-8亚烷基链，其中至少一个碳(例如，1、2或3个碳)被选自O、N、S(O)0-3的杂原子替换，其中所述链任选地被一个或多个独立地选自氧代、卤素、氨基的基团取代；或者
ii)与来自5元环的碳一起表示与饱和或不饱和(特别是饱和)的支链或非支链C1-6亚烷基链连接的环丙烷环，其中至少一个碳(例如，1、2或3个碳)被选自O、N、S(O)0-3的杂原子替换，其中所述链任选地被一个或多个独立地选自氧代、卤素、氨基的基团取代；
Re表示H、饱和或不饱和(特别是饱和)的支链或非支链C1-8亚烷基链，其中一个或多个碳任选地被-O-替换，并且该链任选地被一个或多个卤素原子(诸如碘)、N3或-C2-5炔基取代。
在一个实施例中，Ra是-(CH2)mC(O)-、-CH2(CH3)C(O)-、-(CH2)mCH2OC(O)-、-CHCHCH2OC(O)-或-OCH2CH2COC(O)-，并且m表示0或1。
在一个实施例中，Re表示H或-CH2OCH2CH2N3。
在一个实施例中，非天然氨基酸是具有式(IIa)的结构的残基：
Figure BDA0003451987540000041
其中Ra、Re和X2如上所定义。
在一个实施例中，非天然氨基酸具有式(IIb)的结构：
Figure BDA0003451987540000042
其中Ra、Re和X2如上所定义。
通常，化合物例如式(I)、(II)、(IIa)和(IIb)将至多仅含有一个叠氮化物基团。
在一个实施例中，非天然氨基酸选自包括以下的组：
Figure BDA0003451987540000051
因此，在一个实施例中，基团CPD与多肽之间的至少一个连接部可具有式(I＊)：
CPD＊-X1-O0-1C(O)-＊PP(I＊)
其中：
CPD＊表示该连接部结合到CPD的位置；
＊PP表示该连接部结合到该多肽的位置；并且
X1和-O0-1C(O)-如针对式I所定义。
因此，在一个实施例中，基团CPD与多肽之间的至少一个连接部可具有式(II＊)：
Figure BDA0003451987540000052
CPD＊表示该连接部结合到CPD的位置；
＊PP表示该连接部结合到该多肽的位置；并且
Ra和Re如针对式(II)所定义。
在一个实施例中，CPD和连接部可具有式(IIa-CPD)：
Figure BDA0003451987540000053
其中Ra和Re如上所定义。
在一个实施例中，CPD和连接部可具有式(IIb-CPD)：
Figure BDA0003451987540000061
其中Ra和Re如上所定义。
通常，式(I＊)、(II＊)、(IIa-CPD)和(IIb-CPD)的基团将至多仅含有一个叠氮化物基团。
在一个实施例中，CPD和多肽的连接部选自包含以下的组：
Figure BDA0003451987540000062
在一个实施例中，经由向第一多肽和/或第二多肽中的氨基酸残基添加接头将环戊二烯基基团并入第一多肽和/或第二多肽中，例如其中氨基酸是半胱氨酸或赖氨酸。
在一个实施例中，含环戊二烯基基团的分子在向多肽中的所述氨基酸残基添加之前具有式(III)的结构：
RX-Bn-X3 m-Yp-Z (III)
其中
n表示0或1；
m表示0或1；
p表示0或1；
RX表示
Figure BDA0003451987540000071
并且
B表示C1-6亚烷基、-C3-4环烷基C1-6亚烷基-；其中任选地糖残基(诸如葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、半乳糖胺、乳糖、甘露糖和果糖)包含在其中任一种的亚烷基链中，并且其中针对B所定义的所述变量中的任一个的亚烷基链任选地携带一个或两个独立地选自N-和O-连接的糖残基(诸如葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、半乳糖胺、乳糖、甘露糖和果糖)的取代基：
X3表示-(R1)NC(O)-、-C(O)N(R1)-、-OC(O)-、-OC(O)N-；
R1表示H或-CH2OCH2CH2R2；
R2表示-N3、C2-5炔基或卤素诸如碘；
Y表示-(OCH2)qC2-6亚烷基或任选地被-NR3R4取代的-C2-6亚烷基，
其中q是1至7000；
R3和R4独立地表示H或C1-3烷基；
Z表示-C(O)OR5、R5′、-NC(O)R6、-C2-5亚烷基、CH2-O-NH2或卤素诸如碘；
R5表示C1-6烷基、琥珀酰亚胺、C6F4H(四氟己基)或H；
R5′表示硫桥连基团，例如二溴马来酰亚胺、二氯丙酮、二乙烯基吡啶或其中任一种的衍生物，
R6表示：
Figure BDA0003451987540000072
其中
R7是任选地携带一个或多个(诸如一个、两个或三个)选自羟基、磺基、氨基和-(OCH2)vC2-6亚烷基的基团的C1-6亚烷基，以及任选地携带一个或多个(诸如一个、两个或三个)选自羟基、磺基、氨基和-(OCH2)vC2-6亚烷基的基团的苯基；
v是整数1、2、3、4或5
Figure BDA0003451987540000081
表示片段与分子其余部分连接的位置。
在一个实施例中，含环戊二烯基基团的分子具有以下结构：
Figure BDA0003451987540000082
因此，在一个实施例中，基团CPD与多肽之间的至少一个连接部可具有式(III＊)：
CPD＊-Bn-X3 m-Yp-Z＊-＊PP(III＊)
其中：
CPD＊表示该连接部结合到CPD的位置；
＊PP表示该连接部结合到该多肽的位置；并且
B、X3、Y、n、m和p如针对式III所定义，并且Z＊是Z与多肽反应时的残基。因此，在一些实施例中，Z＊可以是例如-C(O)O-、-NC(O)-、三唑基、-S-或-NHC(O)-。
在一个实施例中，基团III＊具有以下结构：
Figure BDA0003451987540000083
在一些实施例中，基团CPD与第一多肽之间的连接部以及基团CPD与第二多肽之间的连接部可具有相同的性质，例如可具有相同的通式。在这些实施例中的一些中，两个连接部可以是相同的。
在该方法的一个实施例中，反应在0℃至70℃范围内的温度下进行。该方法的最低温度可为0℃、5℃、10℃、15℃或20℃。该方法的最高温度可为70℃、60℃、50℃、40℃、30℃或25℃。在一些实施例中，该方法可在环境温度下进行。
在该方法的一个实施例中，使多肽经受冻融循环。
在一个实施例中，反应在水性溶剂(例如，水性有机溶剂体系)、任选包含极性非质子溶剂(诸如DMSO)或表面活性剂(诸如聚山梨醇酯80)的缓冲液(诸如PBS)或它们的组合中进行。
附图说明
图1.在人IgG1抗体Fc区中并入环戊二烯的抗体的产生。图1A.CP1 nnAA(也称为CpK)的结构和用于证明CP1 nnAA并入的1C1抗体。图1B.用于抗体表达的过程。图1C.组装的抗体结构中氨基酸α-碳之间的距离以及位置S239和K274处丝氨酸和赖氨酸侧链的取向。氨基酸α-碳被示为彩色球体，并且天然赖氨酸和丝氨酸侧链的大致取向被示为黄色箭头。未示出抗体Fab区。仅示出2-取代的环戊二烯。
图2.通过SDS-PAGE表征携带CpK的还原单克隆抗体(mAb)产物。图2A.在图例中指定的位置处携带CpK的1C1抗体的还原SDS-PAGE分析。图2B.在位置S239(1)或K274(2)处携带CpK的1C1抗体的还原SDS-PAGE分析的更详细视图。WT-野生型1C1mAb。
图3.抗体产物的去糖基化质谱分析。图3A.1C1野生型mAb，完整的。图3B.1C1.S239CP1 mAb，完整的。图3C.1C1.K274CP1 mAb，完整的。图3D.1C1野生型mAb，还原的。图3E.1C1.S239CP1 mAb，还原的。图3F.1C1.K274CP1 mAb，还原的。图3G.1C1.P232CP1mAb的去糖基化质谱分析。
图4.在位置S239(1)处携带CpK的1C1抗体中的CpK狄尔斯-阿尔德加合物的评价。图4A.酶消化1以产生含S239CpK的肽片段。图4B.消化产物的反相高效液相色谱分析(RP-HPLC)显示了在肽片段的m/z处的提取离子色谱图。图4C-D.具有所示电离状态的单体和二聚体肽片段的质谱(MS)分析。图4E-F.单体和二聚体肽片段共有的497amu峰的放大质谱。图4G.肽二聚体片段的串联质谱(MS/MS)分析。注意，CpK的氨基甲酸酯在这些条件下裂解回赖氨酸。含有降解的赖氨酸和提出的狄尔斯-阿尔德加合物的肽用*表示。
图5A.通过用IdeS和胰蛋白酶消化产生的1的单体肽片段的MS/MS谱。注意，CpK的氨基甲酸酯在这些条件下裂解回赖氨酸。含有降解的赖氨酸和提出的狄尔斯-阿尔德加合物的完整肽用*表示。
图5B.通过用IdeS和胰蛋白酶消化产生的1的二聚体肽片段的MS/MS谱。注意，CpK的氨基甲酸酯在这些条件下裂解回赖氨酸。含有降解的赖氨酸和提出的狄尔斯-阿尔德加合物的完整肽用*表示。
图6.用于筛选氨基酸位置形成狄尔斯-阿尔德交联的能力的MAB1VV.K409R抗体构建体的概述。MAB1VV.K409R是单价单特异性IgG1抗体。
图7.在指定位置处携带CP1 nnAA的MAB1VV.K409R抗体的还原SDS-PAGE分析。
图8.产生包含通过在CP1 nnAA之间形成的狄尔斯-阿尔德加合物共价连接的重链异源二聚体的MAB2+MAB1单价双特异性抗体的工程化特征的概述。
图9.产生包含通过狄尔斯-阿尔德加合物共价连接的异源重链的抗体的方法的概述。图9A.共转染方法。图9B.共培养方法。
图10.用KappaSelect珠和LambdaSelect珠连续纯化后双特异性抗体产物的还原SDS-PAGE分析。通过共转染方法产生异源二聚体重链抗体。
图11.通过蛋白A珠纯化后抗体产物的还原去糖基化质谱分析。图11A.MAB2RR.S239CP1.F405R抗体。图11B.MAB1EE.S239CP1.F405L抗体。图11C.通过共转染方法产生的MAB2RR.S239CP1.F405R+MAB1EE.S239CP1.F405L双特异性抗体。图11D.通过共培养方法产生的MAB2RR.S239CP1.F405R+MAB1EE.S239CP1.F405L双特异性抗体。光谱显示了轻链(LC)、重链(HC)和重链二聚体区域(约20-100KDa)。
图12.抗体重链二聚体产物的还原去糖基化质谱分析。图12A.MAB2RR.S239CP1.F405R抗体。图12B.MAB1EE.S239CP1.F405L抗体。图12C.通过共转染方法产生的MAB2RR.S239CP1.F405R+MAB1EE.S239CP1.F405L双特异性抗体。图12D.通过共培养方法产生的MAB2RR.S239CP1.F405R+MAB1EE.S239CP1.F405L双特异性抗体。放大光谱以显示重链二聚体区域(约100KDa)。
图13.抗体产物的还原RP-HPLC分析，表明CP1 nnAA重链二聚体形成。实线表示同源二聚体抗体，并且虚线表示通过共转染方法产生的双特异性异源二聚体抗体。
图14.通过Octet测量分析抗原结合，信号在第一次抗原结合之前归一化，证明第一次抗原结合在用CP1 nnAA产生的双特异性抗体中得以维持。A)MAB1EE.S239CP1.F405L抗体，B)MAB2RR.S239CP1.K409R抗体，C)通过共转染产生并通过LambdaSelect珠纯化的MAB1EE.S239CP1.F405L+MAB2RR.S239CP1.K409R双特异性抗体，D)通过共培养产生并通过LambdaSelect珠纯化的MAB1EE.S239CP1.F405L+MAB2RR.S239CP1.K409R双特异性抗体，E)通过共转染产生并先后通过LambdaSelect珠和KappaSelect珠纯化的MAB1EE.S239CP1.F405L+MAB2RR.S239CP1.K409R双特异性抗体，F)通过共培养产生并先后通过LambdaSelect珠和KappaSelect珠纯化的MAB1EE.S239CP1.F405L+MAB2RR.S239CP1.K409R双特异性抗体，G)阳性对照抗体，H)非结合同种型对照抗体。
图15.通过Octet测量分析抗原结合，信号在第二次抗原结合之前归一化，证明第二次抗原结合在用CP1 nnAA产生的双特异性抗体中得以维持。A)MAB1EE.S239CP1.F405L抗体，B)MAB2RR.S239CP1.K409R抗体，C)通过共转染产生并通过LambdaSelect珠纯化的MAB1EE.S239CP1.F405L+MAB2RR.S239CP1.K409R双特异性抗体，D)通过共培养产生并通过LambdaSelect珠纯化的MAB1EE.S239CP1.F405L+MAB2RR.S239CP1.K409R双特异性抗体，E)通过共转染产生并先后通过LambdaSelect珠和KappaSelect珠纯化的MAB1EE.S239CP1.F405L+MAB2RR.S239CP1.K409R双特异性抗体，F)通过共培养产生并先后通过LambdaSelect珠和KappaSelect珠纯化的MAB1EE.S239CP1.F405L+MAB2RR.S239CP1.K409R双特异性抗体，G)阳性对照双特异性抗体，H)非结合同种型对照抗体。
具体实施方式
如本文所用的缀合(反应)只是将分子与另一个实体连接的反应。在本说明书的上下文中，与第二多肽缀合的第一多肽是由缀合反应获得的产物。
如本文所用的氨基酸残基是指经由氨基酸的N和/或C末端与例如另一种氨基酸连接的天然或非天然氨基酸，特别是其中至少一个连接部是肽键。
如本文所用的非天然氨基酸是指不同于二十一种天然存在的氨基酸中一种的氨基酸。例如，非天然氨基酸可包含环戊二烯基基团，并且在天然氨基酸特有的相对位置中还含有氨基和羧基官能团。某些非天然氨基酸及其制备方法在WO 2015/019192中披露，该文献通过援引并入本文。
非天然氨基酸通常衍生自天然氨基酸。衍生自天然氨基酸是指非天然氨基酸基于(或并入)或类似于天然氨基酸的结构这一事实，例如可缩短赖氨酸中的亚烷基链以提供3碳链而不是天然4碳链，但与赖氨酸的结构关系或相似性仍然存在。因此，天然氨基酸的衍生物包括修饰，诸如并入二烯或亲二烯体，延长或缩短亚烷基链，向侧链中的氮、氧、硫中添加一个或多个取代基，或者将氮、氧或硫转化为不同的官能团，或其中任一种的组合。通常，大多数修饰是在非天然氨基酸中添加结构。然而，修饰可包括去除或替换氨基酸中天然存在的原子。
如本文所用的天然氨基酸是指21种蛋白质氨基酸(即精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)。
在一个实施例中，例如在重组多肽的表达过程中将包含环戊二烯基基团的非天然氨基酸并入第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中。这是有利的，因为它精确定位氨基酸的位置，从而促进第一多肽与第二多肽之间的非常特异的缀合。
在一个实施例中，可经由接头和缀合反应将非天然氨基酸附加到第一多肽和/或第二多肽。
在一个实施例中，本披露的非天然氨基酸衍生自赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸和酪氨酸。
在一个实施例中，将多肽工程化为从原始或天然序列中去除一个或多个赖氨酸残基。
当经由接头将环戊二烯基基团引入多肽中时，可以使官能团诸如N3、卤基、琥珀酰亚胺或炔烃与多肽的氨基酸序列中的例如赖氨酸反应。
如本文所用的烷基是指直链或支链烷基，诸如但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、正丁基和叔丁基。在一个实施例中，烷基是指直链烷基。
如本文所用的氨基是指-NH2，C1-4单酰基或二酰基氨基旨在分别是指-NHC(O)C1-3烷基和(-NC(O)C1-3烷基)C(O)C1-3烷基)。
C1-4单烷基或二烷基氨基旨在分别是指-NHC1-4烷基和-N(C1-4烷基)(C1-4烷基)。
卤素或卤基包括氟、氯、溴或碘，特别是氟、氯或溴，尤其是氟或氯。
如本文所用的氧代是指C＝O，并通常表示为C(O)。
如本文所用的亚烷基是指支链或非支链碳原子团，诸如亚甲基(-CH2-)或其链。
如本文所用的C2-5炔烃是指在直链或支链排列中含有三键和2-5个碳原子的基团或原子团。在一个实施例中，仅分子或片段中的取代基包含炔烃。
关于饱和或不饱和的支链或非支链C1-8烷基链，其中至少一个碳(例如，1、2或3个碳，合适地1或2个，特别是1个)被选自O、N、S(O)0-3的杂原子替换，其中所述链任选地被一个或多个独立地选自氧代、卤素的基团取代，本领域技术人员将清楚，如果技术上合适，该杂原子可替换伯碳、仲碳或叔碳，即CH3、-CH2-或-CH-或者支链碳基团。
如本文所用的N3是指叠氮化物。
如本文所用的磺基是指与一个、两个或三个氧原子键合的硫原子。
用于添加到式(III)化合物中的合适的糖包括葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、半乳糖胺、甘露糖、果糖、半乳糖、麦芽糖和乳糖。有利地，添加糖分子可增加溶解度。
用于本披露的多肽
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已经被天然修饰或通过以下干预修饰的氨基酸聚合物：例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或者任何其他操纵或修饰(诸如与标记组分缀合)。该定义还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。这是可以理解的，因为本披露的多肽可基于抗体，诸如是其片段。
如本文所用的多肽是指具有或不具有二级结构或三级结构的5个或更多个氨基酸的序列。因此，在本披露中，术语“多肽”包括肽、多肽和蛋白质。除非另有说明，否则这些术语可互换使用。
在一个实施例中，多肽是蛋白质。蛋白质通常含有二级结构和/或三级结构，并且可以是单体或多体形式。在一个实施例中，第一多肽和第二多肽是相同的，即两者包含相同的氨基酸序列，使得第一多肽和第二多肽形成同源二聚体。在一个实施例中，第一多肽和第二多肽是不同的，即两者包含彼此不同的氨基酸序列，使得第一多肽和第二多肽形成异源二聚体。
设想用于本披露的第一多肽和第二多肽没有特别限制，并且可以是旨在共价连接在一起的任何多肽对。在一个实施例中，已知或认为第一多肽和第二多肽非共价或共价缔合，并且这种缔合使第一多肽和第二多肽上存在的CP部分结合在一起，使得CP部分发生狄尔斯-阿尔德(DA)反应并形成包含CPD部分的共价键。
CP部分可位于第一多肽中的第一氨基酸残基处和第二多肽中的第二氨基酸残基处，其中第一氨基酸残基和第二氨基酸残基在组装的蛋白质结构中足够接近。组装的蛋白质结构包含共价或非共价缔合的第一多肽和第二多肽，并且通常不含有包含CPD部分的连接部。可以由与第二多肽缔合的第一多肽的三维结构(例如，X-射线晶体结构或NMR结构)计算第一氨基酸α-碳与第二氨基酸α-碳之间的距离以及组装的蛋白质结构氨基酸α-碳中侧链的取向。例如，可以使用如实例中所述的PyMOL软件来估计距离和取向。当第一多肽和第二多肽形成抗体分子或抗体分子的一部分时，组装的蛋白质结构可以是来自PDB条目1FC1(版本1.2)的晶体结构。
替代性地或另外，CP部分可位于第一多肽中的第一氨基酸残基处和第二多肽中的第二氨基酸残基处，其中这些位置处天然氨基酸的侧链在组装的蛋白质结构中朝向彼此取向。本上下文中天然氨基酸的侧链是指在引入CP部分之前存在于氨基酸位置的侧链。例如，当通过向赖氨酸或半胱氨酸中添加接头而并入CP部分时，天然氨基酸的侧链可以是赖氨酸或半胱氨酸。作为另一个实例，当CP部分包含在非天然氨基酸中时，天然氨基酸的侧链可以是存在于并入非天然氨基酸的位置处的天然氨基酸。如上所述，可以使用如实施例中所述的PyMOL软件来确定侧链的取向。
如果第一氨基酸和第二氨基酸的氨基酸α-碳之间的距离在组装的蛋白质结构中小于
Figure BDA0003451987540000161
小于
Figure BDA0003451987540000162
小于
Figure BDA0003451987540000163
小于
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小于
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小于
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小于
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小于
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小于
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小于
Figure BDA00034519875400001610
或小于
Figure BDA00034519875400001611
任选地其中组装的蛋白质结构是晶体结构，则可认为氨基酸足够接近。
如果第一氨基酸和第二氨基酸的氨基酸α-碳之间的距离在组装的蛋白质结构中大于
Figure BDA00034519875400001612
大于
Figure BDA00034519875400001613
大于
Figure BDA00034519875400001614
大于
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大于
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大于
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大于
Figure BDA00034519875400001620
大于
Figure BDA00034519875400001621
或大于
Figure BDA00034519875400001622
任选地其中组装的蛋白质结构是晶体结构，则可以认为氨基酸足够接近。
如果第一氨基酸和第二氨基酸的α-碳之间的距离在组装的蛋白质结构中介于
Figure BDA0003451987540000171
与
Figure BDA0003451987540000172
之间、介于
Figure BDA0003451987540000173
与
Figure BDA0003451987540000174
之间、介于
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与
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之间、介于
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与
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与
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之间、介于
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与
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与
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之间、介于
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与
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与
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与
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与
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与
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与
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与
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与
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之间、介于
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与
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与
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之间、介于
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与
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之间、介于
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与
Figure BDA000345198754000017146
之间、介于
Figure BDA000345198754000017147
与
Figure BDA000345198754000017148
之间、介于
Figure BDA000345198754000017149
与
Figure BDA000345198754000017150
之间、介于
Figure BDA000345198754000017151
与
Figure BDA000345198754000017152
之间、介于
Figure BDA000345198754000017153
与
Figure BDA000345198754000017154
之间、介于
Figure BDA000345198754000017155
与
Figure BDA000345198754000017156
或介于
Figure BDA000345198754000017157
与
Figure BDA0003451987540000181
之间，任选地其中组装的蛋白质结构是晶体结构，则可以认为氨基酸足够接近。
在第一多肽和第二多肽不同的一些实施例中，CP部分位于第一多肽和/或第二多肽中预计不会发生狄尔斯-阿尔德反应以在第一多肽的两个拷贝或第二多肽的两个拷贝之间形成同源二聚体缀合物的位置。换句话说，CP部分的位置可能阻碍同源二聚体缀合物的形成。例如，CP部分可位于第一多肽中的氨基酸残基处，使得在包含第一多肽的两个拷贝的组装的蛋白质结构中，这些位置处天然氨基酸的侧链远离彼此取向和/或α-碳不够接近。类似地，CP部分可位于第二多肽中的氨基酸残基处，使得在包含第二多肽的两个拷贝的组装的蛋白质结构中，这些位置处天然氨基酸的侧链远离彼此取向和/或α-碳不够接近。
下文描述了设想用于本披露的多肽的具体实例。
在一个实施例中，第一多肽或第二多肽是或包含结合成员。在另一个实施例中，第一多肽和第二多肽在缀合时形成结合成员或结合成员的一部分。在本上下文中，“结合成员”是特异性结合靶分子的多肽或蛋白质。术语“特异性”可指结合成员不会表现出与其特异靶分子以外的分子的任何显著结合的情况。此类分子被称为“非靶分子”。
在一些实施例中，如果与非靶分子的结合程度小于结合分子与靶标的结合的约10％，如例如通过ELISA、SPR、生物膜干涉技术(BLI)、微量热泳动(MST)或通过放射免疫测定法(RIA)所测量，则认为结合成员未表现出与非靶分子的任何显著结合。替代性地，结合特异性可根据结合亲和力反映，其中本文所述的结合成员以比对另一种非靶分子的亲和力大至少0.1个数量级的亲和力与其靶分子结合。在一些实施例中，结合成员以比对另一种非靶分子的亲和力大至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5或2.0个数量级的亲和力与其靶分子结合。
结合成员包括例如抗体分子、工程化的蛋白结构域诸如支架、适体和设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)。
在一个实施例中，结合成员是抗体分子。
如本文所用的抗体分子是指抗体、抗体结合片段和抗体形式(诸如包含所述抗体或其结合片段的双特异性或多特异性抗体)的通用术语。抗体分子可以是人的或人源化的。抗体分子可以是多克隆或单克隆抗体分子。
如本文所用，术语“抗体分子”涵盖完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、抗体片段(诸如Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段)、单链抗体片段(scFv和二硫化物稳定的scFv(dsFv))、多特异性抗体(诸如由至少两种不同抗体产生的双特异性抗体或由抗体片段形成的多特异性抗体(参见例如PCT公布WO 96/27011、WO 2007/024715、WO 2009018386、WO 2009/080251、WO 2013006544、WO 2013/070565和WO 2013/096291))、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原结合片段的融合蛋白(诸如scFv-Fc融合体)以及包含抗原结合片段的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要抗体分子表现出所需生物活性即可。
抗体分子及其构建和使用方法是本领域熟知的，并且在例如Holliger 2005中描述。可以采用单克隆和其他抗体分子并使用重组DNA技术来产生保留原始抗体的特异性的其他抗体或嵌合分子。此类技术可以涉及将一种抗体分子的CDR或可变区引入不同的抗体分子中(EP-A-184187、GB 2188638A和EP-A-239400)。
典型的抗体包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。将两条重链彼此连接并将重链与轻链连接的二硫键被称为“链间”二硫键。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH、VH区或VH结构域)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个或四个恒定结构域CH1、CH2、CH3和CH4构成。铰链区位于CH1与CH2结构域之间。Fc区包括包含抗体除第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的恒定区的多肽及其片段。因此，对于IgG，“Fc区”是指CH2和CH3，以及任选地这些结构域的N-末端的全部或部分柔性铰链区。术语“Fc区”可以指分离的该区域，或者抗体、抗体片段或Fc融合蛋白的上下文中的该区域。
恒定域的位置可以根据EU编号(Edelman 1969)定义。CH1结构域可位于位置114-215之间，铰链区位于位置216-230之间，CH2结构域位于位置231-340之间，并且CH3结构域位于位置341-447之间，其中氨基酸残基位置根据EU编号进行编号。
在一些实施例中，CH区是人免疫球蛋白G1恒定区(IGHG1；UniProt：P01857-1，v1)或其片段。P01857的位置1至98形成CH1结构域。P01857的位置99至110形成CH1与CH2结构域之间的铰链区。P01857的位置111至223形成CH2结构域。P01857的位置224至330形成CH3结构域。
每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL、VL区或VL结构域)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。
除非另有说明，否则可变区中的氨基酸残基位置(包括本文所述的氨基酸序列、取代、缺失和插入的位置)根据Kabat编号(Kabat1991)进行编号。
除非另有说明，否则恒定区中的氨基酸残基位置(包括本文所述的氨基酸序列、取代、缺失和插入的位置)根据EU编号(Edelman 1969)进行编号。
VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其间插入更保守的称为框架区(FW)的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FW构成，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4。框架区可以根据它们各自的VH和VL区指定。因此，例如，VH-FW1将指VH的第一框架区。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。
如本文所用，术语“重链区”意指包含CH1、CH2、CH3、CH4和VH结构域中的至少一个的多肽。在一个实施例中，重链区包含重链恒定区，其包含CH1、CH2和CH3，任选地还包含CH4。在一个实施例中，重链区包含重链恒定区和重链可变区。
如本文所用，术语“轻链区”意指包含CL和VL结构域中的至少一个的多肽。
术语“抗体”意指通过免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点(也称为结合位点)识别并特异性结合靶标(诸如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述的组合)的免疫球蛋白分子。
抗体可以是以下五大类别的免疫球蛋白中的任一种：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)，或同种异型(例如Gm，例如G1m(f、z、a或x)、G2m(n)、G3m(g、b或c)、Am、Em和Km(1、2或3))。不同类别的免疫球蛋白具有不同的和熟知的亚基结构和三维构型。抗体可源自任何哺乳动物，包括但不限于人、猴、猪、马、兔、狗、猫、小鼠等，或其他动物，诸如鸟类(例如鸡)。
术语“抗原结合片段”是指包含完整抗体的抗原性决定可变区的片段。本领域已知，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段进行。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段、scFv、线性抗体、单链抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。
因此，在一个实施例中，本发明中使用的抗体分子可包含具有全长重链和轻链或其片段的完整抗体分子，并且可以是但不限于Fab、修饰的Fab、Fab′、修饰的Fab′、F(ab’)2、Fv、单结构域抗体(例如，VH或VL或VHH)、scFv、双价、三价或四价抗体、双scFv、双抗体、三抗体、四抗体、它们的组合以及上述任一种的表位结合片段。
特别设想的其他抗体分子是“寡克隆”抗体，其是不同单克隆抗体的预定混合物。参见例如PCT公布WO 95/20401；美国专利号5,789,208和6,335,163。优选地，寡克隆抗体由针对在单个细胞中产生的一个或多个表位的抗体的预定混合物组成。更优选地，寡克隆抗体包含能够与共同轻链配对以产生具有多种特异性的抗体的多个重链(例如，PCT公布WO04/009618)。当需要靶向单个靶分子上的多个表位时，寡克隆抗体是特别有用的。本领域技术人员将知道或可以确定哪种类型的抗体或抗体混合物适用于预期目的和所希望的需要。
包含至少两个抗原结合结构域(其中每个抗原结合结构域能够结合不同的靶标)的抗体分子可被称为“双特异性抗体分子”。在一个实施例中，抗体分子是双特异性抗体分子。
双特异性抗体分子可以任何合适的形式提供。本文所述的双特异性抗体分子的合适形式及其产生方法在Kontermann 2012和Kontermann 2015中描述，这两篇参考文献均通过援引以其全文并入本文。具体参见Kontermann 2012的图2。
也可以通过化学缀合由现有抗体产生双特异性抗体分子。例如，可以使用同源或异源双功能偶联试剂偶联(例如，如Graziano 2004中所述)偶联两个IgG分子或两个Fab′片段。
在一些实施例中，双特异性抗体分子可以是免疫球蛋白G样(IgG样)双特异性抗体分子。IgG样双特异性抗体分子可包含对一种抗原特异的Fv区、Fab区或sVD，对另一种抗原特异的Fv/Fab/sVD，以及Fc区。IgG样双特异性抗体分子可以是同源二聚体(对称的)或异源二聚体(不对称的)。
同源二聚体IgG样双特异性抗体分子通常含有与IgG分子的重链或轻链的N或C末端融合的例如scFv片段或可变单结构域的形式的抗原结合结构域。这些同源二聚体IgG样双特异性抗体分子的特有性能是它们含有两条相同的重链。此外，同源二聚体IgG样双特异性抗体分子对于每个表位通常是二价的。如本文所用的化合价是指抗体分子中能够结合单个表位的抗原结合区的数量。单克隆单特异性IgG抗体分子对于单个表位是二价的-其含有两个抗原结合结构域，每个结构域能够结合单个靶分子上的表位。同源二聚体IgG样双特异性抗体分子对于每个表位是二价的-其通常含有四个抗原结合结构域，其中两个结构域能够结合靶分子上的第一表位，并且其中两个结构域能够结合靶分子上的第二表位。
同源二聚体IgG样双特异性抗体分子的实例包括DVD-IgG、IgG-scFv、scFv-IgG、scFv4-Ig、IgG-scFab、scFab-IgG、IgG-sVD、sVD-IgG、2in 1-IgG、mAb2、tandemab共同LC。这些可以通过本领域已知的方法形成，例如化学交联、体细胞杂交或氧化还原方法。
在一个实施例中，同源二聚体抗体分子包含去除链间二硫化物的第一重链区和第二重链区。链间二硫化物可位于抗体分子中第一重链区和第二重链区的位置226和229处，其中这些氨基酸残基位置根据EU编号进行编号。在一个实施例中，抗体分子包含第一重链区和第二重链区，其中第一重链区和第二重链区中的一者具有C226和C229修饰，例如C226V和C229V修饰，其中这些氨基酸残基位置根据EU编号进行编号。
相比之下，异源二聚体IgG样双特异性抗体分子对于每个靶标通常是单价的。如例如Klein 2012中所述，单价双特异性IgG的概念被认为具有独特的治疗优势，因为它们(i)不会引起受体同源二聚化，(ii)由于对每种抗原的亲合力丧失而潜在地具有对非靶组织降低的毒性，并且(iii)当两种抗原都被选择性地限制或在靶细胞上大量表达时具有更好的选择性。因此，在一些实施例中，抗体分子是异源二聚体IgG样双特异性抗体分子。
异源二聚体IgG样双特异性抗体分子涉及两条不同重链的异源二聚化以及同源轻链与重链的正确配对。重链的异源二聚化可以通过几种技术来解决，诸如旋钮入孔(knobs-into-holes)、CH3的静电转向、CH3链交换的工程化结构域和亮氨酸拉链。可以通过使用这些重链异源二聚化技术中的一种连同使用共同的轻链、CH1与CL之间的结构域交叉、重链和轻链与接头的偶联、来自两个单独的单克隆的重链-轻链二聚体的离体组装、整个Fab结构域的界面工程化或CH1/CL界面的二硫化物工程化来确保轻链与重链的正确配对。
异源二聚体IgG样双特异性抗体分子的实例包括DuetMab、kih IgG、kih IgG共同LC、CrossMab、kih IgG-scFab、mAb-Fv、电荷对和SEED体。异源二聚体IgG样双特异性抗体分子的具体例示形式称为“DuetMab”。DuetMab抗体分子使用KIH技术用于2个不同重链的异源二聚化，并通过用工程化的二硫键替换CH1-CL界面之一中的天然二硫键来增加同源重链和轻链配对的效力。与DuetMab相关的披露内容可以在例如美国专利号9,527,927和Mazor2015中找到，这两篇参考文献通过援引以其全文并入本文。
在一个实施例中，抗体分子在CH1、CH2和CH3结构域中的一者或多者中包含一个或多个促进异源二聚体抗体分子的形成的修饰。例如，上述双特异性抗体分子还可在CH1、CH2和CH3结构域中包含一个或多个使同源二聚体抗体分子的形成不稳定和/或促进异源二聚体抗体分子的形成的修饰。例如，抗体分子可包含一个或多个使同源二聚体Fc界面不稳定的修饰。
使同源二聚体Fc界面不稳定的修饰的一个实例是一条重链的位置405和另一条重链的位置409处的修饰。这种修改在Labrijn等人2013中更详细地描述。在一个实施例中，抗体分子包含第一重链区和第二重链区，其中第一重链区和第二重链区中的一者具有F405修饰，例如F405L修饰，而另一个重链区具有K409修饰，例如K409R修饰，其中这些氨基酸残基位置根据EU编号进行编号。
设想的其他修饰包括Ridgway 1996中描述的基于CH3结构域中促进重链异源二聚化的单个氨基酸取代的旋钮入孔(KiH)策略。旋钮变体重链CH3的小氨基酸已被较大氨基酸替换，而孔变体的大氨基酸已被较小氨基酸替换。也可引入另外的修饰以稳定重链之间的缔合。
特别设想用于本披露的其他结合分子是较小的工程化蛋白质结构域，诸如支架(参见例如美国专利公布号2003/0082630和2003/0157561)。支架基于已知的天然存在的非抗体结构域家族，特别是蛋白质细胞外结构域，其尺寸通常较小(约100AA至约300AA)并且含有与具有允许插入、缺失或其他取代的高构象耐受性的可变结构域缔合的高度结构化核心。这些可变结构域可以为任何靶蛋白创建推定的结合界面。一般来讲，通用蛋白支架的设计包括两个主要步骤：(i)选择具有所需特征的合适核心蛋白质，以及(ii)通过诱变接受高结构变异性的部分或全部结构域产生复杂的组合文库，以适当的形式展示这些文库(即噬菌体、核糖体、细菌或酵母)，并且筛选文库中具有所需结合特征(例如，靶特异性和/或亲和力)的诱变支架。亲本支架的结构可以是高度多样化的并且包括高度结构化的蛋白质结构域，包括但不限于FnIII结构域(例如AdNectin，参见例如Parker 2005、US 2008/00139791和WO 2005/056764；TN3，参见例如WO 2009/058379和WO 2011/130324)；蛋白质A的Z结构域(Affibody，参见例如Wikman 2004和EP1641818A1)；来自LDL受体的结构域A(Avimer，参见例如Silverman 2005和Braddock 2007)；锚蛋白重复结构域(DARPin，Binz 2003，Kohl2003和WO 02/20565)；C型凝集素结构域(Tetranectin，参见例如WO 02/48189)。如果需要，可以将两个或更多个此类工程化支架结构域连接在一起，以形成多价结合蛋白。根据用途/疾病适应症，单独的结构域可以靶向单一类型的蛋白质或若干类型的蛋白质。
几乎任何分子(或其部分，例如亚基、结构域、基序或表位)可被结合成员靶向和/或并入结合成员中，该结合成员包括但不限于：整合膜蛋白，包括离子通道、离子泵、G蛋白偶联受体、结构蛋白；粘附蛋白，诸如整联蛋白；转运蛋白；参与信号转导的蛋白质和脂质锚定蛋白质，包括G蛋白、酶(诸如激酶(包括膜锚定激酶)、膜结合酶、蛋白酶、脂肪酶、磷酸酶、脂肪酸合成酶、消化酶(诸如胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)、溶菌酶、聚合酶)；受体，诸如激素受体、淋巴因子受体、单核因子受体、生长因子受体、细胞因子受体；细胞因子；等等。
在一些方面，本披露中所用的结合分子靶向和/或并入选自以下的生长因子、细胞因子、细胞因子相关蛋白、生长因子、受体配体或受体的全部或部分(例如，亚基、结构域、基序或表位)：例如BMP1、BMP2、BMP3B(GDF10)、BMP4、BMP6、BMP8、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(G-CSF)、EPO、FGF1(αFGF)、FGF2(βFGF)、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、FGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGFRL1、FGFR6、IGF1、IGF2、IGF1R、IGF2R、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNAR1、IFNAR2、IFNB1、IFNG、IFNW1、FIL1、FIL1(ε)、FIL1(ζ)、IL1A、IL1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、ILl2A、IL12B、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL17B、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、IL2RA、IL1R1、IL1R2、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17R、IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RD、IL18R1、IL20RA、IL20RB、IL21R、IL22R、IL22RA1、IL23R、IL27RA、IL28RA、PDGFA、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、ACVRL1、GFRA1、LTA(TNF-β)、LTB、TNF(TNF-α)、TNFSF4(OX40配体)、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(APO3L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF10A(Trail受体)、TNFRSF10B(Trail受体2)、TNFRSF10C(Trail受体3)、TNFRSF10D(Trail受体4)、FIGF(VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、KDR、FLT1、FLT4、NRP1、IL1HY1、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RN、IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、AIF1、HGF、LEP(瘦素)、PTN、ALK和THPO。
在一些方面，本披露中所用的结合分子靶向和/或并入选自以下的趋化因子、趋化因子受体或趋化因子相关蛋白的全部或部分(例如，亚基、结构域、基序或表位)：例如CCL1(I-309)、CCL2(MCP-1/MCAF)、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCL11(嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin))、CCL13(MCP-4)、CCL15(MIP-1d)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MIP-3b)、CCL20(MIP-3a)、CCL21(SLC/exodus-2)、CCL22(MDC/STC-1)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/嗜酸细胞活化趋化因子-2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜酸细胞活化趋化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CXCL1(GRO1)、CXCL2(GRO2)、CXCL3(GRO3)、CXCL5(ENA-78)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP 10)、CXCL11(I-TAC)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、PF4(CXCL4)、PPBP(CXCL7)、CX3CL1(SCYD1)、SCYE1、XCL1(淋巴细胞趋化因子)、XCL2(SCM-1b)、BLR1(MDR15)、CCBP2(D6/JAB61)、CCR1(CKR1/HM145)、CCR2(mcp-1RB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBI1)、CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、XCR1(GPR5/CCXCR1)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CX3CR1(V28)、CXCR4、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR81(FKSG80)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、IL8RA(IL8Ra)、IL8RB(IL8Rb)、LTB4R(GPR16)、TCP10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、C5R1、CSF3、GRCC10(C10)、EPO、FY(DARC)、GDF5、HIF1A、IL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、TREM2和VHL。
在一些方面，本披露中所用的结合分子靶向和/或并入选自以下的蛋白质的全部或部分(例如，亚基、结构域、基序或表位)：例如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子，诸如因子VII、因子VIIIC、因子IX、组织因子(TF)和血管性血友病因子；抗凝血因子，诸如蛋白C；心房钠尿因子；肺表面活性物质；纤溶酶原激活剂，诸如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；脑啡肽酶；RANTES(调控激活正常T细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，诸如人血清白蛋白；缪勒管激素(Muellerian)-抑制物质；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原(prorelaxin)；小鼠促性腺激素关联肽；微生物蛋白质，诸如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原(CTLA)，诸如CTLA-4；抑制素；激活素；蛋白质A或D；类风湿因子；神经营养因子，诸如骨源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神经生长因子；表皮生长因子(EGF)；胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，诸如CD2、CD3、CD4、CD 8、CD11a、CD14、CD18、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD33、CD34、CD40、CD40L、CD52、CD63、CD64、CD80和CD147；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，诸如AIDS包膜的一部分，例如gp120；运输蛋白；归巢受体；地址素；调控蛋白；细胞粘附分子，诸如LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、ICAM-3和VCAM、a4/p7整联蛋白和Xv/p3整联蛋白，包括α或其亚基、整联蛋白α亚基，诸如CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、α7、α8、α9、αD、CD11a、CD11b、CD51、CD11c、CD41、αIIb、αIELb；整联蛋白β亚基，诸如CD29、CD18、CD61、CD104、β5、β6、β7和β8；整联蛋白亚基组合，包括但不限于αVβ3、αVβ5和α4β7；凋亡途径的成员；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖症(OB)受体；mp1受体；CTLA-4；蛋白C；Eph受体，诸如EphA2、EphA4、EphB2等；人白细胞抗原(HLA)，诸如HLA-DR；补体蛋白，诸如补体受体CR1、C1Rq和其他补体因子诸如C3和C5；糖蛋白受体，诸如GpIbα、GPIIb/IIIa和CD200。
还设想了特异性结合和/或包含癌抗原的结合分子，包括但不限于ALK受体(多效素受体)、多效素、KS 1/4泛癌抗原；卵巢癌抗原(CA125)；前列腺酸磷酸盐；前列腺特异性抗原(PSA)；黑色素瘤相关抗原p97；黑色素瘤抗原gp75；高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)；前列腺特异性膜抗原；癌胚抗原(CEA)；多形上皮粘蛋白抗原；人乳脂肪球抗原；结直肠肿瘤相关抗原，诸如：CEA、TAG-72、CO17-1A、GICA 19-9、CTA-1和LEA；伯基特淋巴瘤抗原-38.13；CD19；人B-淋巴瘤抗原-CD20；CD33；黑色素瘤特异性抗原，诸如神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、神经节苷脂GM2和神经节苷脂GM3；肿瘤特异性移植型细胞表面抗原(TSTA)；病毒诱导的肿瘤抗原包括T-抗原、DNA肿瘤病毒和RNA肿瘤病毒的包膜抗原；肿瘤胚胎抗原-甲胎蛋白如结肠CEA、5T4肿瘤胚胎滋养细胞糖蛋白和膀胱肿瘤肿瘤胚胎抗原；分化抗原如人肺癌抗原L6和L20；纤维肉瘤抗原；人白血病T细胞抗原-Gp37；拟糖蛋白；鞘脂；乳腺癌抗原，诸如EGFR(表皮生长因子受体)；NY-BR-16、NY-BR-16、HER2抗原(p185HER2)和HER3；多形上皮粘蛋白(PEM)；恶性人淋巴细胞抗原-APO-1；分化抗原，诸如发现于胎儿红细胞中的I抗原；发现于成人红细胞中的原内胚层I抗原；植入前胚胎；发现于胃腺癌中的I(Ma)；发现于乳腺上皮中的M18、M39；发现于骨髓细胞中的SSEA-1；VEP8；VEP9；Myl；VIM-D5；发现于结直肠癌中的D156-22；TRA-1-85(血型H)；发现于睾丸和卵巢癌中的SCP-1；发现于结肠腺癌中的C14；发现于肺腺癌中的F3；发现于胃癌中的AH6；Y半抗原；发现于胚胎癌细胞中的Ley；TL5(血型A)；发现于A431细胞中的EGF受体；发现于胰腺癌中的E1系列(血型B)；发现于胚胎癌细胞中的FC10.2；胃腺癌抗原；发现于腺癌中的CO-514(血型Lea)；发现于腺癌中的NS-10；CO-43(血型Leb)；发现于A431细胞的EGF受体中的G49；发现于结肠腺癌中的MH2(血型ALeb/Ley)；发现于结肠癌中的19.9；胃癌黏蛋白；发现于骨髓细胞中的T5A7；发现于黑色素瘤中的R24；发现于胚胎癌细胞中的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2和M1：22：25：8，以及发现于4至8细胞期胚胎的SSEA-3和SSEA-4；皮肤T细胞淋巴瘤抗原；MART-1抗原；Sialy Tn(STn)抗原；结肠癌抗原NY-CO-45；肺癌抗原NY-LU-12变体A；腺癌抗原ART1；副肿瘤相关脑-睾丸-癌抗原(副肿瘤性抗原MA2；副肿瘤神经元抗原)；神经肿瘤腹抗原2(NOVA2)；肝细胞癌抗原基因520；肿瘤相关抗原CO-029；肿瘤相关抗原MAGE-C1(癌/睾丸抗原CT7)、MAGE-B1(MAGE-XP抗原)、MAGE-B2(DAM6)、MAGE-2、MAGE-4a、MAGE-4b和MAGE-X2；癌症-睾丸抗原(NY-EOS-1)和任何以上列出的多肽的片段。
在一个实施例中，使用的多肽是重组的。“重组”多肽或蛋白质是指经由重组DNA技术产生的多肽或蛋白质。如同已经通过任何合适的技术分离、分级或部分纯化或基本上纯化的天然或重组多肽一样，出于本披露的目的，在工程化宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质也被视为是分离的。本文所披露的多肽可以使用本领域已知的方法重组产生。替代性地，本文所披露的蛋白质和肽可以化学合成。
在一个实施例中，第一多肽是或包含结合分子，诸如抗体分子，并且第二多肽是或包含合成的IgG结合结构域。IgG结合结构域的实例包括Nilsson 1987中描述的蛋白Z(也称为“ZZ标签”)。在一个实施例中，第一多肽是或包含抗体分子，并且第二多肽是或包含蛋白Z。
第一多肽和第二多肽可以是分裂蛋白(split protein)的第一组分多肽和第二组分多肽，使得第一组分多肽和第二组分多肽在二聚化时形成分裂蛋白。分裂蛋白的实例包括分裂嵌合抗原受体(CAR；例如，如Wu 2015中所述)、分裂激酶(例如，如Camacho-Soto2014中所述)、分裂转录因子(例如，如Taylor 2010中所述)和分裂半胱天冬酶(例如，如Chelur 2007中所述)。通常，分裂蛋白的组分多肽含有同源或异源二聚化结构域，这些结构域在结合小分子时条件性地相互作用。在一个实施例中，分裂蛋白在第一组分多肽和第二组分多肽二聚化时具有增加的活性。这些第一组分多肽和第二组分多肽可以包括CP部分，使得在例如通过小分子二聚化时，第一多肽和第二多肽共价连接并因此锁定在二聚化状态。
在一个实施例中，第一组分多肽和第二组分多肽的缀合物形成能够激活T细胞的分裂嵌合抗原受体，并且其中第一组分多肽和第二组分多肽的二聚化使T细胞激活增加。在本上下文中，激活T细胞可意指能够刺激T细胞的增殖。分裂嵌合抗原受体可存在于T细胞(CAR-T)中，并且可离体修饰CAR-T细胞以在第一组分多肽和/或第二组分多肽上包括CP部分。
在一个实施例中，第一组分多肽和第二组分多肽的缀合物形成能够诱导半胱天冬酶活性的分裂半胱天冬酶，并且其中第一组分多肽和第二组分多肽的二聚化使半胱天冬酶活性增加。本上下文中的半胱天冬酶活性可意指半胱天冬酶诱导细胞死亡的可能性。分裂半胱天冬酶可存在于细胞(例如，T细胞)中，并且可离体修饰细胞以在第一组分多肽和/或第二组分多肽上包括CP部分。
在一个实施例中，第一组分多肽和第二组分多肽的缀合物形成能够具有转录活性的分裂转录因子，并且其中第一组分多肽和第二组分多肽的二聚化使转录活性增加。本上下文中的转录活性可意指能够激活或抑制转录。分裂转录因子受体可存在于细胞中，并且可离体修饰细胞以在第一组分多肽和/或第二组分多肽上包括CP部分。
在一个实施例中，抗体分子包含第一多肽和第二多肽的缀合物。
如上所述，抗体分子中的抗体亚基(例如，重链和轻链)通常通过链间二硫键(例如，抗体的两条重链之间以及抗体的重链与轻链之间)互连。诸位发明人发现，作为二硫键的补充或替代，CPD部分可以用于共价连接抗体亚基以产生具有独特组装和稳定性能的同源二聚体和/或异源二聚体抗体分子。狄尔斯-阿尔德加合物一旦形成就不易还原，但可以通过加热(＞70℃)或施加电场来逆转。这些稳定性能不同于天然二硫化物，天然二硫化物可以通过还原和/或酶活性破坏。此外，自身反应可以与其他突变组合使用，从而以所需方式操纵蛋白质结构和功能。另外，可以包括CPD部分而不改变天然存在的二硫化物。
形成CPD部分的CP部分可位于抗体分子中的重链和/或轻链上。在一个实施例中，抗体分子包含第一多肽和第二多肽的缀合物，其中第一多肽包含第一重链区，并且第二多肽包含第二重链区，并且其中第一重链区与第二重链区之间的连接部包含CPD部分。抗体分子可以是双特异性抗体分子。
在一个实施例中，抗体分子包含第一多肽和第二多肽的缀合物，其中第一多肽包含第一重链，并且第二多肽包含第一轻链区，其中第一重链区与第一轻链区之间的连接部包含CPD部分。抗体分子可以是scFV。抗体分子可进一步包含Fc区，例如抗体分子可以是scFv-Fc融合体。
CP部分可位于抗体分子中重链和/或轻链上的任何位置，条件是当抗体分子完全折叠和组装时，CP部分被认为可能能够相互作用并能够进行狄尔斯-阿尔德(DA)二聚化。如别处所述，可以通过利用包含第一多肽(例如，第一重链区)和第二多肽(例如，第二重链区或轻链区)的分子结构(例如，晶体结构)来确定CP部分是否可能能够相互作用并能够进行DA二聚化。如实例中所述，对于抗体分子，这可以使用来自PDB条目1FC1(版本1.2)的晶体结构和PyMol软件来完成。
在一个实施例中，第一重链区与第二重链区之间的包含CPD部分的连接部位于CH1、CH2、CH3和铰链区中的一者或多者中的氨基酸之间。在一个实施例中，第一重链区与第二重链区之间的包含CPD部分的连接部位于CH3区中。在一个实施例中，第一重链区与第二重链区之间的包含CPD部分的连接部位于第一重链区和第二重链区的铰链区或CH2结构域中的氨基酸之间。
在一个实施例中，第一重链区与第二重链区之间的包含CPD部分的连接部位于第一重链区和第二重链区的位置227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240和241中的任一者处，其中这些氨基酸残基位置根据EU编号进行编号。在一个实施例中，第一重链区与第二重链区之间的包含CPD部分的连接部位于第一重链区和第二重链区的位置232、233、234、235、236、237和239中的任一者处，其中这些氨基酸残基位置根据EU编号进行编号。在一个实施例中，第一重链区与第二重链区之间的包含CPD部分的连接部位于第一重链区和第二重链区的位置232或239处，其中这些氨基酸残基位置根据EU编号进行编号。在一个实施例中，第一重链区与第二重链区之间的包含CPD部分的连接部位于第一重链区和第二重链区的位置239处，其中该氨基酸残基位置根据EU编号进行编号。在一个实施例中，第一重链区与第二重链区之间的包含CPD部分的连接部位于第一重链区和第二重链区的位置232处，其中该氨基酸残基位置根据EU编号进行编号。
如上所述，CPD部分可以代替二硫键用于共价连接抗体亚基以产生具有独特组装和稳定性能的同源二聚体和/或异源二聚体抗体分子。在一个实施例中，抗体分子包含去除链间二硫化物的第一重链区和第二重链区。链间二硫化物通常位于抗体分子(例如，IgG1)中第一重链区和第二重链区的位置226和229处，其中这些氨基酸残基位置根据EU编号进行编号。在一个实施例中，抗体分子包含第一重链区和第二重链区，其中第一重链区和第二重链区中的一者或两者在位置226和229处具有除半胱氨酸之外的残基。在一个实施例中，抗体分子是同源二聚体抗体分子，其中第一重链区和第二重链区在位置226和229处具有缬氨酸(V)残基，其中这些氨基酸残基位置根据EU编号进行编号。
异源二聚体抗体分子中的链间二硫化物可以被带电对替换。如Brinkmann和Kontermann，2017所述，带电对已被用于促进双特异性抗体分子的异源二聚体组装。在一个实施例中，异源二聚体抗体分子包含第一重链区和第二重链区，其中第一重链区和第二重链区中的一者在位置226和/或229处包含带正电荷的氨基酸(赖氨酸(K)、组氨酸(H)或精氨酸(R))，而另一个重链区在位置226和/或229处包含带负电荷的氨基酸(天冬氨酸(D)或谷氨酸(E))。在一个实施例中，第一重链区和第二重链区中的一者在位置226和229处包含谷氨酸(E)残基，而另一条重链在位置226和229处包含精氨酸(R)残基，其中这些氨基酸残基位置根据EU编号进行编号。
异源二聚体抗体分子可另外包含一个或多个促进如上所述的异源二聚体抗体分子的形成的修饰。例如，异源二聚体抗体分子可包含一个或多个使同源二聚体抗体分子的形成不稳定的修饰。在一个实施例中，第一重链区和第二重链区中的一者在位置226和229处包含谷氨酸(E)残基并且在位置405处包含亮氨酸(L)残基，而另一条重链在位置226、229和409处包含精氨酸(R)残基，其中这些氨基酸残基位置根据EU编号进行编号。
在一个实施例中，第一重链区与第二轻链区之间的包含CPD部分的连接部位于第一重链区的VH结构域中的氨基酸与第二轻链区的VL区中的氨基酸之间。在一个实施例中，第一重链区与第二轻链区之间的包含CPD部分的连接部位于重链可变区中的位置39处和轻链可变区中的位置42处，其中这些氨基酸残基位置根据Kabat编号进行编号。
方法
在一个实施例中，缀合第一多肽和第二多肽的方法包括在一种或多种宿主细胞中表达编码第一多肽和第二多肽的一种或多种核酸，在足以将CP部分并入第一多肽和第二多肽的条件下将包含CP部分的非天然氨基酸添加到一种或多种宿主细胞中，在允许在CP部分之间发生狄尔斯-阿尔德反应的条件下培养一种或多种宿主细胞以产生第一多肽与第二多肽之间的缀合物，以及任选地分离和/或纯化缀合物。
一种或多种分离的核酸分子可用于表达本文所述的第一多肽和第二多肽。核酸通常将以用于表达的重组载体的形式提供。可以选择或构建合适的载体，这些载体含有适当的调控序列，包括启动子序列、终止子片段、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标志基因和其他适当的序列。优选地，载体含有适当的调控序列以驱动核酸在宿主细胞中的表达。载体可以是质粒、病毒(例如噬菌体)或适当的噬菌粒。
在一个实施例中，第一多肽和第二多肽由单独的核酸(例如，单独的载体)表达。也就是说，该方法包括在宿主细胞中表达编码第一多肽的第一核酸以及在相同宿主细胞或不同宿主细胞中表达编码第二多肽的第二核酸。在另一个实施例中，第一多肽和第二多肽由相同的核酸(例如，相同的载体)表达。
将核酸或载体引入宿主细胞的技术在本领域中已充分确立，并且可采用任何合适的技术。适于产生重组多肽的一系列宿主细胞是本领域已知的，包括细菌、酵母、昆虫或哺乳动物宿主细胞。优选的宿主细胞是哺乳动物细胞，诸如CHO、NS0或HEK细胞，例如HEK293细胞。
将非天然氨基酸并入多肽序列的方法在实例和WO 2018/218093中描述。如本文所述，当CP部分在第一多肽和第二多肽中位于在组装的蛋白质结构中足够接近的氨基酸位置时，在培养宿主细胞的过程中可发生狄尔斯-阿尔德反应。组装的蛋白质结构可以是第一多肽与第二多肽之间的异源二聚体。可将细胞培养至少1、3、7或11天。培养宿主细胞的方法是本领域熟知的。第一多肽和第二多肽可由宿主细胞分泌到细胞培养液中。
在一个实施例中，该方法包括在同一宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中表达一种或多种编码第一多肽和第二多肽的核酸。在这种情况下，第一多肽和第二多肽的表达发生在同一细胞中。这种方法在本文中称为“共转染”方法。第一多肽与第二多肽之间的狄尔斯-阿尔德反应可发生在宿主细胞中或宿主细胞外，例如细胞培养液中。
在一个实施例中，该方法包括在第一宿主细胞中表达编码第一多肽的第一核酸以及在第二宿主细胞中表达编码第二多肽的第二核酸。在这种情况下，第一多肽的表达发生在第一细胞中，并且第二多肽的表达发生在第二细胞中。这种方法在本文中称为“共培养”方法。第一多肽与第二多肽之间的狄尔斯-阿尔德反应将发生在宿主细胞外，例如细胞培养液中。
所产生的缀合物可以是抗体分子。抗体分子可以是如本文所述的异源二聚体抗体分子，其中第一多肽包含第一重链区，并且第二多肽包含在氨基酸序列上不同于第一重链区的第二重链区。第一重链区和第二重链区可含有促进本文所述的异源二聚体抗体分子的形成的任何修饰，例如去除重链之间的链间二硫键的修饰和/或使同源二聚体抗体分子的形成不稳定的修饰。如实例中所述，“共转染”方法和“共培养”方法均可以用于有效产生双特异性抗体分子。
例如，当该方法包括使用“共培养”方法产生异源二聚体抗体分子时，第一多肽可在第一细胞中形成由第一多肽的两个拷贝组成的第一同源二聚体，并且第二多肽在第二细胞中形成由第二多肽的两个拷贝组成的第二同源二聚体。不希望受理论束缚，据信CH3结构域之间的非共价相互作用允许重链彼此缔合以形成第一同源二聚体和第二同源二聚体，并且这甚至在存在使同源二聚体抗体分子的形成不稳定的修饰的情况下发生。
第一同源二聚体和第二同源二聚体均可分泌到细胞培养液中，在该细胞培养液中，可发生细胞外重链交换以产生包含第一多肽和第二多肽的异源二聚体抗体分子，并且发生狄尔斯-阿尔德反应以产生通过CPD部分共价连接的缀合物。促进本文所述的异源二聚体抗体分子的形成的修饰可促使重链交换以产生异源二聚体抗体分子而不是同源二聚体抗体分子。如实例所示，该“共培养”方法用于产生双特异性抗体分子，其中形成的主要产物是异源二聚体抗体分子。
该方法可进一步包括分离和/或纯化缀合物。纯化重组多肽的技术是本领域熟知的，包括例如HPLC、FPLC或亲和色谱法，例如使用蛋白A或蛋白L。当产生的缀合物是异源二聚体抗体分子时，该方法可进一步包括从通过该方法产生的同源二聚体抗体分子中分离或纯化异源二聚体抗体分子。
其他定义
在详细描述所提供的实施例之前，应当理解，本披露并不限于特定的组合物或工艺步骤，因此这些组合物或工艺步骤可以改变。如在本说明书和随附权利要求书中所使用，除非上下文另外明确说明，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“该/所述(the)”包括复数参考对象。术语“一个”(或“一种”)、连同术语“一个或多个/一种或多种”和“至少一个/一种”在文中可以互换地使用。
此外，“和/或”在本文使用时被认为是两个所指定的特征或组分中每一者与或不与另一者一起的具体披露。因此，如文中短语如“A和/或B”中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)、以及“B”(单独)。同样，术语“和/或”如在词组如“A、B和/或C”中使用时是旨在涵盖以下方面中的每一者：A、B、和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有如本披露所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。例如，Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology[简明生物医学和分子生物学词典]，Juo，Pei-Show，第2版，2002，CRC出版社(CRC Press)；Dictionary of Cell and Molecular Biology[细胞和分子生物学词典]，第3版，1999，学术出版社(Academic Press)；以及Oxford Dictionary OfBiochemistry And Molecular Biology[生物化学和分子生物学牛津词典]，修订版，2000，牛津大学出版社(Oxford University Press)为技术人员提供了在本披露中使用的许多术语的通用词典注释。
单位、前缀和符号是以它们的国际单位系统(Système International deUnites)(SI)接受的形式表示。数值范围包括限定该范围的数字。除非另外说明，否则氨基酸序列是以氨基至羧基取向从左向右书写。本文提供的标题不是对不同方面的限制，其可以通过参考作为整体的说明书而得到。因此，通过以其全文参考说明书，更充分地定义了紧接着在下文中定义的术语。
氨基酸在本文中通过其通常已知的三字母符号抑或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，核苷酸通过它们的普遍公认的单字母代码来提及。
词语“标记”在本文使用时是指直接或间接缀合到本文所披露的工程化抗体或其片段(例如，半胱氨酸工程化抗体或其片段)以便产生“标记的”缀合化合物的可检测化合物或组合物。该标记可以是本身可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶标记的情况下，可以催化可检测底物化合物或组合物的化学改变。
术语“多核苷酸”或“核酸”在本文可互换使用，并且是指具有任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基，和/或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶并入聚合物的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和它们的类似物。
如本文所用，术语“载体”是指一种构建体，该构建体能够在宿主细胞中递送以及在一些方面中表达一个或多个目的基因或序列。载体的实例包括但不限于：病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体，以及某些真核细胞(如生产细胞)。
如本文所用，在本说明书的上下文中的术语“包含”应解释为“包括”。
如本文所用的“在本披露中所用的”是指在本文所披露的方法中所用的、在本文所披露的包括中间体的分子中所用的或这两者，视所用术语的上下文而定。
应当理解，无论在什么情况下本文用语言“包含”描述方面时，也提供了用“由......组成”和/或“主要由......组成”描述的其他类似方面。
本文描述的任何肯定实施例或其组合可以是否定排除的基础，即免责声明。
在本说明书的上下文中，“包含”应解释为“包括”。
包含某些特征/元件的本发明的实施例也旨在延伸到“由相关元件/特征组成”或“基本上由相关元件/特征组成”的替代实施例。
在技术上合适的情况下，可以将本发明的实施例组合。
诸如专利和申请的技术参考文献通过援引并入本文。
本文具体和明确地叙述的任何实施例可单独或与一个或多个其他实施例组合形成免责声明的基础。
缩写
ADC 抗体药物缀合物
mAb 单克隆抗体
MS 质谱
MS/MS 串联质谱
NNAA 非天然氨基酸
RP-HPLC 反相高效液相色谱分析
SEC 尺寸排阻色谱法
WT 野生型
在以下实例中仅通过举例说明进一步描述本发明，这些实例参考附图，其中：
实例
实例1-材料和方法
化学材料和方法
如WO 2018/218093的实例2中所述合成CpK(也称为CP1 nnAA)。CpK在WO 2018/218093中表示为4。
生物分析方法
抗体和ADC的质谱(MS)分析
使用配备有RP-HPLC柱(ZORBAX 300 Diphenyl RRHD，1.8微米，2.1mm×50mm)的Agilent 6520B Q-TOF质谱仪进行质谱分析。高效液相色谱法(HPLC)参数如下：流速，0.5ml/min；流动相A为0.1％(v/v)甲酸的HPLC级H2O溶液，而流动相B为0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液。将柱在90％A/10％B(也用于使mAb样品脱盐)中平衡，然后在20％A/80％B中洗脱。收集100-3000m/z、正极性、350℃的气体温度、48lb/in2的雾化器压力和5,000V的毛细管电压下的质谱数据。使用供应商提供的(Agilent v.B.04.00)MassHunter定性分析软件分析数据，并使用解卷积光谱的峰强度来推导出每个样品中物质的相对比例，如前所述(Valliere-Douglass等人2012)。对于去糖基化mAb分析，将EndoS(5μL Remove-iT EndoS(在PBS中按1：10稀释，20，000个单位/mL，新英格兰生物实验室(New England BioLabs))与50μL样品(1mg/mL mAb)和5μL glyco缓冲液1(新英格兰生物实验室)合并，然后在37℃下温育1小时。通过添加5μL Bond-Breaker TCEP溶液(0.5M，赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))并在37℃下温育10min来制备还原样品。
尺寸排阻色谱法(SEC)
使用配备有三重检测器阵列的Agilent 1100毛细管LC系统(Viscotek 301，德克萨斯州霍森市的维斯科泰克公司(Viscotek，Houson，TX))进行SEC分析；将波长设定为280nm，并使用100mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)以1mL/min的流速在TSK-GEL G3000SWXL柱(宾夕法尼亚州蒙哥马利维尔的托索生物科学有限公司(Toso Bioscience LLC，Montgomeryville，PA))上运行样品。通常在磷酸盐缓冲液中以1mg/mL制备抗体溶液，并将50-100uL进样到仪器中用于每次分析。使用来自色谱图的积分峰面积测定单体百分比。
反相高效液相色谱分析(RP-HPLC)
对于每次分析，将8-12μg抗体样品上样到PLRP-S
Figure BDA0003451987540000411
柱(2.1×50mm，Agilent)上并在25分钟内用5％B至100％B的梯度以0.5mL/min的流速在80℃下洗脱(流动相A：0.1％三氟乙酸的水溶液，流动相B：0.1％三氟乙酸的乙腈溶液)。
抗体肽片段的产生和RP-HPLC/MS分析
首先通过以1∶3的比率(质量/质量)添加IdeS随后在室温下温育过夜来裂解抗体。在1mL MabSelect Sure柱(通用电气医疗集团(GE Healthcare))上从酶中纯化裂解的Fc部分，并用0.1M甘氨酸(pH 2.8)洗脱。在对Fc部分进行完整质量分析(如上)后，然后用8M胍使这些蛋白质变性，用25mM DTT和50mM碘乙酰胺还原和烷基化，然后在缓冲液更换为2M尿素后用胰蛋白酶消化4小时。使用OASIS HLB脱盐板(沃特世(Water))使消化的肽脱盐。肽样品的串联质谱分析在以正极性运行并与Dionex 3000 nanoRSLC系统连接的Orbitrap FusionTribrid(赛默飞世尔科技公司)MS上进行。使用捕获柱(2cm×75μm ReproSil-Pur 120C18-AQ，尺寸为5μm)捕获肽，并在分析柱(20cm×75μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ，尺寸为1.9μm)上分离肽，两种柱均填充。反相溶剂梯度由0.1％甲酸与增加量的溶剂B(0.1％甲酸中的80％乙腈)组成，时间为60分钟。使用溶剂B的线性梯度分离肽，5％-25％持续26min，25％-32％持续8min，32％-45％持续5min，45％-95％持续3min，并在95％停留2min。
抗体设计
通过将基因序列中的天然氨基酸密码子突变为TAG密码子，产生在所需位置处包含CP1 nnAA(也称为“CpK”)的抗体。通用注释：AXCP1用于表示CP1的氨基酸突变，其中A＝天然氨基酸单字母代码，X＝氨基酸编号，CP1＝CP1 nnAA。在一些实例中，将CP1 nnAA并入具有所指示的另外的天然氨基酸突变的抗体中。
抗体表达
将在所需Fc位置处具有琥珀突变(TAG)的IgG1抗体基因克隆到专有的pOE抗体表达载体中。通过PEImax(1.5L G22细胞)将该构建体连同编码PylRS双突变体(Y306A/Y384F)的质粒和含有tRNA表达盒的串联重复的质粒(pORIP 9X tRNA)转染到CHO-G22中。转染后4小时，将3.5％补料(专有)溶液添加到细胞中，并在34℃下进一步温育细胞。第二天将CpK以0.5mM的最终浓度(来自0.2MNaOH中的260mM原液)添加到经转染的细胞中。在第3天和第7天用7％的补料溶液再次给细胞补料。在第11天将细胞离心沉淀并收集上清液。使用IgSelect亲和柱(GE医疗生命科学(GE Health Care Life Science))从上清液中纯化抗体，并用50mM甘氨酸、30mM NaCl、pH 3.5缓冲液洗脱，然后用1M Tris缓冲液pH 7.5中和，最后透析到PBS(pH 7.2)中。通过280nm处的吸光度测量结果确定抗体浓度，并基于最终回收的抗体和所用细胞培养基的总体积反算表达滴度。使用标准方法通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析回收的抗体。还通过质谱法(MS)、还原反相高效液相色谱法(rRP-HPLC)和尺寸排阻色谱法(SEC)分析抗体。
实例2一将CpK并入抗体中并通过狄尔斯-阿尔德交联进行抗体二聚化
1C1抗体包含具有结合EphA2受体的可变结构域的人IgG1框架。1C1抗体的产生在US20090304721A1中描述。将重链中的天然氨基酸突变为CpK以确定二聚化效率。重链铰链半胱氨酸未经修饰，1C1抗体含有天然链间二硫化物。如实例1所述表达和表征抗体。
选择抗体重链位置P232、S239、K274、N297和S375(EU编号)用于并入CpK，随后使用PyMOL(薛定谔有限公司(Schrodinger LLC))和来自PDB条目1FC1]的晶体结构分析人IgG1抗体Fc片段的已知晶体结构，以估计氨基酸α-碳之间的距离和侧链的取向(Deisenhofer1981)。例如，在完全折叠和组装的抗体分子中，位置S239CpK(1)处氨基酸的重链氨基酸α-碳彼此相距约
Figure BDA0003451987540000432
并且侧链可能能够相互作用并使得能够进行狄尔斯-阿尔德(DA)二聚化，而在重链位置K274CpK(2)处的氨基酸α-碳彼此相距约
Figure BDA0003451987540000433
并且侧链可能背离，从而防止二聚化并使得能够与马来酰亚胺反应用于生物缀合(图1)。位置K274处的生物缀合在WO 2018/218093中描述。在指定位置并入CpK的IC1 mAba性能的总结在下表1中示出。
表1：
Figure BDA0003451987540000431
a.1C1 mAb是标准IgG1抗体，唯一的突变是在指定位置处的nnAA。
b.通过使用晶体结构数据测量氨基酸α碳之间的距离来测定。
c.通过尺寸排阻色谱法来测定。
用蛋白A纯化后的抗体回收率高于使用类似的瞬时表达系统表达叠氮化物或环丙烯ncAA(大约40-80mg/L)报道的滴度(Oller-Salvia 2018；Vanbrunt 2015)。高ncAA滴度也与高CHO细胞活力(在收获时测量＞80％)相关。CpK本身具有良好的耐受性、稳定性和生物相容性，如通过在整个表达过程中的高细胞活力、没有与天然代谢物形成DA加合物或通过质谱(MS)确定的二烯单元降解所证明。这些结果证明CpK官能团是稳健的，适用于需要长时间暴露于复杂生物环境和代谢过程的应用。
通过还原SDS-PAGE进行抗体分析(图2)表明S239CpK和P232CpK抗体存在约100KDa的高分子量物质，这在WT mAb中或对于K274CpK、N296CpK或S375CpK是不存在的。该结果表明S239CpK和P232CpK分子已经通过二聚化形成共价DA加合物。
通过MS对完整mAb产物进行表征表明，对于1C1 S239CpK和1C1 K274CpK获得单一物质(图3B和图C)，对应于丝氨酸或赖氨酸突变为CpK后的预期分子量。通过MS对还原抗体产物进行分析表明，mAb 1C1 S239CpK和1C1 K274CpK根本不同(图3E和图3F)。具体地，野生型(WT)抗体和1C1 K274CpK在用TCEP还原后变性成重链和轻链(图3D和图3F)，而1C1S239CpK变性成轻链和约100kDa的较高分子量物质(图2和图3E)。MS分析证实了较高分子量物质为100,708.78Da，对应于含两个CpK氨基酸的重链二聚体。
图3G表明1C1 P232CpK形成单体和二聚体物质的混合物。不希望受理论束缚，这可表明位置232处的二聚化不如位置239处的二聚化有效。
通过质谱法进一步评价抗体产物1C1 S239CpK，以证实作为DA加合物形成的二聚化的机制。首先，用IdeS消化抗体，以通过位置236处的蛋白水解裂解去除抗体的Fd区。接着，用胰蛋白酶进一步消化含位置239的Fc片段，以产生含S239CpK的12个氨基酸的片段(图4a)。HPLC分析显示两种物质均含有97.3％(二聚体)和2.7％(单体)的相对丰度的预期肽片段。通过总质量和电荷状态将二聚化肽与单体肽区分开。例如，约497amu处的共同峰代表+3离子，对于单体肽片段具有0.333Da的同位素间距，而对于二聚体肽片段，这是+6离子，具有0.167Da的同位素间距。对单体和二聚体物质的MS/MS图谱进行评估揭示了185.133amu处的物质是二聚体肽特有的。二聚体肽特有的这种物质的质量对应于由CpK在氨基甲酸酯键处断裂而释放的DA加合物(图4g和图5)，因此提供了二聚体形成的直接证据。
CpK通过二聚化形成共价DA加合物的能力似乎是接近度驱动的，原因有三个：1)没有检测到游离的未并入CpK与抗体偶联；2)由于抗体-抗体分子间DA反应，含CpK的抗体未显示高水平的聚集；以及3)二聚化发生在位置S239CPK和P232CpK处，但不发生在位置K274CpK处。基于CpK接近度的自反应提供了生物正交、自发和不受常规氨基酸影响的优点。
本发明表明经典的DA反应可以实现新的蛋白质工程化策略。评估抗体内的CpK可以深入了解这种二烯的生物相容性、稳定性和二聚化特性。CpK使我们能够评价ncAA平台尚未开发的独特性能：以接近度依赖性方式二聚化的能力。在这方面，CpK在其反应特性(即，二聚化)方面类似于半胱氨酸，并具有额外的好处，即DA反应产物在生理条件下是不可逆的。通过接近度驱动的DA反应进行的CpK的二聚化能够实现由折叠蛋白质中的二烯位置控制的独特的生物正交缝合策略。
实例3-使用CP1 nnAA形成重链二聚体的抗体铰链区位置
将MAB1VV抗体的铰链区中的重链氨基酸突变为CpK，并通过SDS-PAGE评价所得构建体的重链二聚化。MAB1抗体包含以下另外的突变：1)重链中的C226V和C229V突变以及2)重链中的K409R突变。MAB1VV抗体不含有将重链连接在一起的天然二硫化物。
使用PyMOL(薛定谔有限公司)和来自PDB条目1FC1的晶体结构评估抗体的肽骨架中氨基酸α碳之间的距离。这在下表2中示出。
表2：
Figure BDA0003451987540000461
a.根据晶体结构数据估计。
在还原SDS-PAGE中观察到的大约100KDa的条带表明CP1 nnAA使抗体重链二聚化(图7)。结果表明CP1二聚化可以发生在多个位置。这些结果在下表3中汇总。
表3：
Figure BDA0003451987540000471
a.+＝轻度，++＝中度，+++＝重度，+/-＝低度和/或不确定
实例4-使用CP1 nnAA制备重链异源二聚体抗体并在同一细胞培养物中共表达。
使用MAB1EE.F405L和MAB2RR.K409R抗体制备重链异源二聚体抗体(即单价双特异性抗体)。MAB1抗体结合第一种人抗原，而MAB2抗体结合第二种不同的人抗原。对于MAB1构建体，通过C226和C229突变为谷氨酸(E)来消除重链二硫化物，并且重链位置F405突变为亮氨酸(L)。在MAB2构建体中，重链氨基酸C226和C229突变为精氨酸(R)，并且重链位置K409突变为精氨酸。这些突变促进重链交换并且非共价地稳定异源二聚体。MAB1和MAB2抗体均含有S239CP1突变以在交换后将重链共价锁定在一起(图8)。
通过以下两种方法制备双特异性抗体：1)在同一细胞培养瓶中转染和表达两种抗体质粒(共转染)，以及2)将每种抗体转染到不同培养瓶中的细胞中，然后混合经转染的细胞并进一步温育以完成表达过程(共培养)(图9)。用所需转染过程处理细胞后，如实例1所述进行抗体表达。通过蛋白A珠粒或在KappaSelect和LambdaSelect珠粒上连续捕获和洗脱从表达培养基中纯化抗体。如实例1所述通过MS和还原RP-HPLC表征抗体。在Octet384仪器(佛特比奥(FortBio))上进行第一抗原蛋白和第二抗原蛋白的同时结合研究。在抗人IgGFc捕获(AHC)生物传感器(佛特比奥)上捕获在PBS pH 7.2、3mg/ml BSA、0.1％(v/v)Tween20(测定缓冲液)中浓度为10μg/ml的抗体。用测定缓冲液洗涤上样的生物传感器以去除任何未结合的蛋白质。使生物传感器进行顺序缔合，首先与4μg/ml的第一抗原缔合，然后与4μg/ml的第二抗原温育。每次缔合后通过在测定缓冲液中温育进行解离。
双特异性抗体产率与单特异性抗体产率相似。双特异性抗体的还原SDS-PAGE分析表明形成了所需重链二聚体(图10)，还表明存在预期的两种轻链。还原质谱分析证实了在双特异性抗体构建体中形成了异源二聚体，还证明了存在具有MAB1和MAB2轻链的预期质量的两种不同轻链(图11和图12)。通过还原质谱分析中重链二聚体的相对峰高确定的异源二聚体含量在下表4中示出。
表4：
Figure BDA0003451987540000481
a.通过还原质谱中重链二聚体的相对峰高确定。
通过还原RP-HPLC分析双特异性抗体产物表明形成了保留时间介于MAB1与MAB2抗体峰之间的重链物质，这与在两条重链之间形成重链异源二聚体一致(图13)。同源二聚体(单特异性)和异源二聚体(双特异性)抗体的还原RP-HPLC洗脱时间的总结在下表5中提供。
表5：
Figure BDA0003451987540000491
通过抗原结合Octet测量证实了含CP1 nnAA的构建体的双特异性抗体功能(图14和图15)。双特异性抗体产生方法(共培养或共转染)不影响抗原结合，两种方法产生的双特异性抗体与不用CP1 nnAA制备的对照双特异性抗体具有相似的结合行为。
参考文献
Figure BDA0003451987540000492
Figure BDA0003451987540000501

Claims (44)

1.一种第一多肽和第二多肽的缀合物，其中该第一多肽与该第二多肽之间的连接部包含以下部分：
Figure FDA0003451987530000011
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中基团CPD与该多肽之间的至少一个连接部具有式(I＊)：
CPD＊-X1-O0-1C(O)-＊PP(I＊)
其中：
CPD＊表示该连接部结合到CPD的位置；
＊PP表示该连接部结合到该多肽的位置；
X1表示
i)饱和或不饱和的支链或非支链C1-8亚烷基链，其中至少一个碳(例如，1、2或3个碳)被选自O、N、S(O)0-3的杂原子替换，其中所述链任选地被一个或多个独立地选自氧代、卤素、氨基、-C1-3亚烷基-N3或-C2-5炔基的基团取代；或者
ii)与来自碳环基或杂环基的碳一起表示与饱和或不饱和(特别是饱和)的支链或非支链C1-6亚烷基链连接的环丙烷环，其中至少一个碳(例如，1、2或3个碳)被选自O、N、S(O)0-3的杂原子替换，其中所述链任选地被一个或多个独立地选自氧代、卤素、氨基、-C1-3亚烷基-N3或-C2-5炔基的基团取代；并且
-O0-1C(O)-通过氨基酸的侧链连接。
3.根据权利要求1所述的缀合物，其中基团CPD与该多肽之间的至少一个连接部具有式(II＊)：
Figure FDA0003451987530000021
CPD＊表示该连接部结合到CPD的位置；
＊PP表示该连接部结合到该多肽的位置；
Ra表示：
i)饱和或不饱和的支链或非支链C1-8亚烷基链，其中至少一个碳(例如，1、2或3个碳)被选自O、N、S(O)0-3的杂原子替换，其中所述链任选地被一个或多个独立地选自氧代、卤素、氨基的基团取代；或者
ii)与来自5元环的碳一起表示与饱和或不饱和的支链或非支链C1-6亚烷基链连接的环丙烷环，其中至少一个碳被选自O、N、S(O)0-3的杂原子替换，其中所述链任选地被一个或多个独立地选自氧代、卤素、氨基的基团取代；并且
Re表示H、饱和或不饱和的支链或非支链C1-8亚烷基链，其中一个或多个碳任选地被-O-替换，并且该链任选地被一个或多个卤素原子、N3或-C2-5炔基取代。
4.根据权利要求3所述的缀合物，其中Ra是-(CH2)mC(O)-、-CH2(CH3)C(O)-、-(CH2)mCH2OC(O)-、-CHCHCH2OC(O)-或-OCH2CH2COC(O)-，并且m表示0或1。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的缀合物，其中Re表示H或-CH2OCH2CH2N3。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的缀合物，其中CPD和该连接部具有式(IIa-CPD)：
Figure FDA0003451987530000022
7.根据权利要求3至5中任一项所述的缀合物，其中CPD和该连接部具有式(IIb-CPD)：
Figure FDA0003451987530000031
8.根据权利要求3所述的缀合物，其中CPD和该多肽的该连接部选自包含以下的组：
Figure FDA0003451987530000032
9.根据权利要求1所述的缀合物，其中基团CPD与该多肽之间的至少一个连接部具有式(III＊)：
CPD＊-Bn-X3 m-Yp-Z＊-＊PP (III＊)
其中：
CPD＊表示该连接部结合到CPD的位置；
＊PP表示该连接部结合到该多肽的位置；
n表示0或1；
m表示0或1；
p表示0或1；
B表示C1-6亚烷基、-C3-4环烷基C1-6亚烷基-；其中任选地糖残基(诸如葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、半乳糖胺、乳糖、甘露糖和果糖)包含在其中任一种的亚烷基链中，并且其中针对B所定义的所述变量中的任一个的亚烷基链任选地携带一个或两个独立地选自N-和O-连接的糖残基(诸如葡萄糖、葡糖胺、半乳糖、半乳糖胺、乳糖、甘露糖和果糖)的取代基；
X3表示-(R1)NC(O)-、-C(O)N(R1)-、-OC(O)-、-OC(O)N-；
R1表示H或-CH2OCH2CH2R2；
R2表示-N3、C2-5炔基或卤素诸如碘；
Y表示-(OCH2)qC2-6亚烷基或任选地被-NR3R4取代的-C2-6亚烷基；
其中q是1至7000；
Z＊是-C(O)O-、-NC(O)-、三唑基、-S-或-NHC(O)-。
10.根据权利要求1所述的缀合物，其中基团CPD与该多肽之间的至少一个连接部选自：
Figure FDA0003451987530000041
11.根据权利要求1至10中任一项所述的缀合物，其中该基团CPD与该第一多肽之间的该连接部以及该基团CPD与该第二多肽之间的该连接部是相同的。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的缀合物，其中该CPD部分通过该第一多肽上的第一氨基酸侧链和该第二多肽上的第二氨基酸侧链与该第一多肽和该第二多肽连接。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的缀合物，其中该第一多肽和该第二多肽是不同的。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的缀合物，其中该第一多肽和该第二多肽是相同的。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的缀合物，其中该第一多肽或该第二多肽是或包含结合成员。
16.根据权利要求15所述的缀合物，其中该结合成员是抗体分子。
17.根据权利要求15或16所述的缀合物，其中该第一多肽是或包含结合分子，并且该第二多肽是或包含合成的IgG结合结构域。
18.根据权利要求1至14中任一项所述的缀合物，其中该缀合物是分裂蛋白。
19.根据权利要求18所述的缀合物，其中该分裂蛋白选自由分裂嵌合抗原受体、分裂激酶、分裂转录因子和分裂半胱天冬酶组成的组。
20.一种抗体分子，该抗体分子包含根据权利要求1至14中任一项所述的缀合物。
21.根据权利要求20所述的抗体分子，其中该第一多肽包含第一重链区，并且该第二多肽包含第二重链区，并且其中该第一重链区与该第二重链区之间的连接部包含CPD部分。
22.根据权利要求21所述的抗体分子，其中该第一重链区与该第二重链区之间的包含该CPD部分的该连接部位于该第一重链区和该第二重链区的位置227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240和241中的任一者处，其中这些氨基酸残基位置根据EU编号进行编号。
23.根据权利要求22所述的抗体分子，其中该第一重链区与该第二重链区之间的包含该CPD部分的该连接部位于该第一重链区和该第二重链区的位置239处，其中该氨基酸残基位置根据EU编号进行编号。
24.根据权利要求23所述的抗体分子，其中该抗体分子包含第一重链区和第二重链区，其中该第一重链区和该第二重链区中的一者或两者在位置226和229处具有除半胱氨酸之外的残基，其中该氨基酸残基位置根据EU编号进行编号。
25.根据权利要求24所述的抗体分子，其中该第一重链区和该第二重链区中的一者在位置226和229处包含带正电荷的氨基酸，而另一个重链区在位置226和229处包含带负电荷的氨基酸，其中该氨基酸残基位置根据EU编号进行编号。
26.根据权利要求25所述的抗体分子，其中该抗体分子包含一个或多个使同源二聚体抗体分子的形成不稳定的突变。
27.根据权利要求26所述的抗体分子，其中该第一重链区和该第二重链区中的一者在位置226和229处包含谷氨酸(E)残基并且在位置405处包含亮氨酸(L)残基，而另一条重链在位置226、229和409处包含精氨酸(R)残基，其中这些氨基酸残基位置根据EU编号进行编号。
28.根据权利要求20所述的抗体分子，其中该第一多肽包含第一重链，并且该第二多肽包含第一轻链区，其中该第一重链区与该第一轻链区之间的连接部包含该CPD部分。
29.根据权利要求28所述的抗体分子，其中该第一重链区与该第二轻链区之间的包含该CPD部分的该连接部位于该第一重链区的VH结构域中的氨基酸与该第二轻链区的VL区中的氨基酸之间。
30.根据权利要求29所述的抗体分子，其中该第一重链区与该第二轻链区之间的包含该CPD部分的该连接部位于该重链可变区中的位置39处和该轻链可变区中的位置42处，其中这些氨基酸残基位置根据Kabat编号进行编号。
31.一种缀合第一多肽和第二多肽的方法，其中该第一多肽和该第二多肽各自包含以下部分：
Figure FDA0003451987530000071
(环戊二烯基，CP)，其中该缀合涉及环戊二烯基部分之间的狄尔斯-阿尔德反应。
32.根据权利要求31所述的方法，其中经由向该第一多肽和/或该第二多肽中的氨基酸残基添加接头将环戊二烯基基团并入该第一多肽和/或该第二多肽中，例如其中该氨基酸是半胱氨酸或赖氨酸。
33.根据权利要求31或权利要求32所述的方法，其中该反应在0℃至70℃范围内的温度下进行。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的方法，其中该反应在水性溶剂中进行。
35.根据权利要求31所述的方法，其中这些环戊二烯基基团中的至少一个包含在非天然氨基酸中，例如衍生自赖氨酸、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸和酪氨酸的非天然氨基酸中。
36.根据权利要求35所述的方法，其中该环戊二烯基基团在该氨基酸的侧链中。
37.根据权利要求35或权利要求36所述的方法，其中该方法包括在一种或多种宿主细胞中表达编码该第一多肽和该第二多肽的一种或多种核酸，在足以将CP部分并入该第一多肽和该第二多肽的条件下将包含该CP部分的该非天然氨基酸添加到该一种或多种宿主细胞中，在允许在这些CP部分之间发生狄尔斯-阿尔德反应的条件下培养该一种或多种宿主细胞以产生该第一多肽与该第二多肽之间的缀合物，以及任选地分离和/或纯化该缀合物。
38.根据权利要求37所述的方法，其中该方法包括在同一宿主细胞中表达编码该第一多肽和该第二多肽的该一种或多种核酸。
39.根据权利要求38所述的方法，其中该方法包括在第一宿主细胞中表达编码该第一多肽的第一核酸以及在第二宿主细胞中表达编码该第二多肽的第二核酸，并且其中在这些宿主细胞外在这些CP部分之间发生狄尔斯-阿尔德反应。
40.根据权利要求31至39中任一项所述的方法，其中该缀合物是抗体分子。
41.根据权利要求32至40中任一项所述的方法，其中环戊二烯基基团位于该第一多肽中的第一氨基酸残基处，并且环戊二烯基基团位于该第二多肽中的第二氨基酸残基处，使得组装的蛋白质结构中该第一氨基酸和该第二氨基酸的α-碳之间的距离：
a)小于
Figure FDA0003451987530000081
b)小于
Figure FDA0003451987530000082
或者
c)小于
Figure FDA0003451987530000083
其中该组装的蛋白质结构是包含共价或非共价缔合的该第一多肽、和该第二多肽但不含该CPD部分的晶体结构。
42.根据权利要求32至41中任一项所述的方法，其中环戊二烯基基团位于该第一多肽中的第一氨基酸残基处，并且环戊二烯基基团位于该第二多肽中的第二氨基酸残基处，使得组装的蛋白质结构中该第一氨基酸和该第二氨基酸的α-碳之间的距离：
a)大于
Figure FDA0003451987530000084
b)大于
Figure FDA0003451987530000085
或者
c)大于
Figure FDA0003451987530000086
其中该组装的蛋白质结构是包含共价或非共价缔合的该第一多肽、和该第二多肽但不含该CPD部分的晶体结构。
43.根据权利要求32至42中任一项所述的方法，其中环戊二烯基基团位于该第一多肽中的第一氨基酸残基处，并且环戊二烯基基团位于该第二多肽中的第二氨基酸残基处，使得该第一氨基酸残基的天然侧链和该第二氨基酸残基的天然侧链在该组装的蛋白质结构中朝向彼此取向，并且其中该组装的蛋白质结构是包含共价或非共价缔合的该第一多肽、和该第二多肽但不含该CPD部分的晶体结构。
44.一种缀合物，其通过根据权利要求31至43中任一项所述的方法形成。
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