CN114113591A - 一种灵敏检测大肠杆菌o157:h7的酶联免疫方法 - Google Patents

一种灵敏检测大肠杆菌o157:h7的酶联免疫方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种灵敏检测大肠杆菌O157:H7的酶联免疫方法。该方法利用聚电解质纳米胶囊固定化酶代替常规的酶载体与大肠杆菌O157:H7抗体结合，偶联复合物作为标记抗体执行双抗夹心ELISA，建立了基于capsule@HRP的酶联免疫吸附试验检测大肠杆菌O157:H7的方法，通过纳米胶囊包埋大量的游离酶，因此具有更高的显色信号，可有效提高检测灵敏度。本发明不仅完成了纳米胶囊对酶固定化和增强生物传感器性能的精细评价，也为其他酶固定化平台的评价提供了模板。

Description

一种灵敏检测大肠杆菌O157:H7的酶联免疫方法
技术领域
本发明涉及抗原检测技术领域，具体涉及一种灵敏检测大肠杆菌O157H7的酶联免疫 方法。
背景技术
大肠埃希氏菌(Escherichia coli，E.coli)，又称大肠杆菌，是一种杆状的兼性厌氧革兰 氏阴性菌。大部分大肠杆菌是存在于人和动物肠道内的正常菌群，其中一小部分是致病性的， 人感染后会引起腹泻甚至溶血性尿毒症综合征。危害最大的是能产生志贺毒素的出血性大肠 杆菌，它会导致恶心、呕吐甚至出血性肠炎等，相关的亚型有O26:H11、O91:H21、O111:H8、 O157:NM和O157:H7。
食源性致病菌的检测方法多种多样，传统的检测方法主要分为三类：培养和菌落计数 法、免疫分析法和分子生物学方法。分子生物学以及免疫学检测方法因其简单快速已广泛 替代传统培养法用于食源性致病菌的早期筛查与监测。然而，由于分子生物学的前处理较 复杂、操作过程技术要求较高，需要专业的技术人员且仪器设备昂贵，较难在大量食品样 品的筛查检测中应用。免疫学检测方法因其简单快速、结果判读简单、无需昂贵设备、操 作简便以及技术难度小等优点而倍受研究者的亲睐。
其中酶联免疫吸附试验(ELISA)是检测分析的重要手段之一，广泛应用于食品安全、 环境监测和临床诊断。酶作为限制常规ELISA灵敏度的关键因素而备受关注。酶是一种具 有催化效率高、成本低、化学选择性等优点的生物催化剂。但是酶的应用仍然受到操作和 储存稳定性不理想、对环境条件敏感性高等阻碍。因此，迫切需要探索在有限空间内获得 最佳酶性能的新平台以应对这些挑战。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种灵敏检测大肠杆菌O157:H7的方法， 以解决现有技术中针对大肠杆菌O157:H7的检测方法灵敏度较低的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是现有技术中针对大肠杆菌O157:H7的双抗夹心ELISA 法因显色底物发光性能不佳而导致检测灵敏度较低。
本发明要解决的再一技术问题是以期通过制备酶包裹效率高的聚电解质纳米胶囊替代 酶载体来执行双抗夹心ELISA、以检测大肠杆菌O157:H7含量的方法中，提高发光信号和 检测灵敏度。
本发明的第一个目的是提供一种负载酶的聚电解质纳米胶囊，所述的负载酶的聚电解 质纳米胶囊是通过以下方法制备得到：
(1)通过共沉淀法将酶封装在可溶解的碳酸钙纳米颗粒中：将氯化钙溶液和聚苯乙烯 磺酸钠溶液混合，搅拌下进行反应，然后加入碳酸钠溶液和酶溶液，搅拌下继续反应，反 应结束后，离心，将沉淀用超纯水重悬，加入聚丙烯胺盐酸盐溶液，超声，震荡反应，离心，将沉淀用超纯水洗涤，得到沉淀；
(2)将步骤(1)得到的沉淀复溶于乙二胺四乙酸二钠溶液，溶解去除碳酸钙核，离心，将沉淀复溶于PBS溶液中制得负载酶的聚电解质胶囊。
进一步的，步骤(1)中，所述的氯化钙溶液、聚苯乙烯磺酸钠溶液、碳酸钠溶液、酶溶液和聚丙烯胺盐酸盐溶液的体积比为1:0.5:1:1:0.2；所述的氯化钙溶液浓度为4.44mg/mL， 聚苯乙烯磺酸钠溶液浓度为50mg/mL，碳酸钠溶液浓度为4.24mg/mL，酶溶液浓度为2mg/mL，聚丙烯胺盐酸盐溶液浓度为30mg/mL；
上述氯化钙溶液、聚苯乙烯磺酸钠溶液、碳酸钠溶液、酶溶液和聚丙烯胺盐酸盐溶液 配制所用的溶剂均为乙二醇和水混合溶液(体积比为1:4)。
步骤(1)和(2)的离心条件为15000rpm离心10min。
步骤(2)中，所述的乙二胺四乙酸二钠溶液浓度为0.2mol/L；
步骤(2)中，PBS溶液为pH 7.4，0.01M的PBS溶液。
进一步的，所述的酶为辣根过氧化物酶(HRP)。
本发明的第二个目的是提供上述的负载酶的聚电解质纳米胶囊在制备大肠杆菌O157:H7检测试剂盒中的应用。具体的，是以链霉亲和素修饰的负载酶的聚电解质纳米胶囊检测大肠杆菌O157:H7。
进一步的，所述的链霉亲和素修饰的负载酶的聚电解质纳米胶囊是通过以下方法制备 得到：将链霉亲和素滴加到负载酶的聚电解质纳米胶囊溶液，室温下反应，然后加入BSA 溶液，继续反应，离心，将沉淀溶于PBS溶液，即得。
具体的，所述的链霉亲和素修饰的负载酶的聚电解质纳米胶囊是通过以下方法制备得 到：将链霉亲和素滴加到1mL负载酶的聚电解质纳米胶囊溶液(pH 7.4，0.01M的PBS复溶)中至终浓度10μg/mL，室温反应60min；反应结束后，加入100μL 1％质量分数的BSA 溶液反应30min，10000rpm离心10分钟，将沉淀溶于500μL PBS(pH 7.4，0.01M)溶液 中，得到链霉亲和素修饰的负载酶的聚电解质纳米胶囊。
本发明的第三个目的是提供一种检测大肠杆菌O157:H7的试剂盒，所述的试剂盒含有 链霉亲和素修饰的负载酶的聚电解质纳米胶囊。
本发明的第四个目的是提供一种灵敏检测大肠杆菌O157:H7的酶联免疫方法，该方法 是使用双抗夹心酶联免疫吸附法进行检测，其中，与生物素化的大肠杆菌O157:H7抗体结 合的是链霉亲和素修饰的负载酶的聚电解质纳米胶囊。
进一步的，所述的灵敏检测大肠杆菌O157:H7的酶联免疫方法，包括以下步骤：
(1)在酶标板上包被大肠杆菌O157:H7捕获抗体，反应结束后，用缓冲液洗去多余液 体；
(2)加入封闭液反应后，用缓冲液洗去多余液体；
(3)将待测溶液加至步骤2)包被有抗体的酶标板上，反应结束后，用缓冲液洗去多余液体；
(4)加入生物素修饰的大肠杆菌O157:H7抗体，反应结束后，用缓冲液洗去多余液体；
(5)将链霉亲和素修饰的负载酶的聚电解质纳米胶囊加入至步骤4)包被有抗体-抗原 -抗体复合物的酶标板中，反应结束后，用缓冲液洗去多余液体；
(6)加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺反应后，用酶标仪测定吸光度值。
进一步的，步骤(1)中，包被抗体用量为100μL，浓度为5μg/mL，反应条件为4℃ 反应过夜，其中包被抗体溶于pH 7.4，0.01M的PBS缓冲液中；
步骤(2)中，封闭液为10mg/mL的BSA，用量为300μL，反应条件为37℃下反应2 小时；
步骤(3)中，大肠杆菌O157:H7菌液用量为100μL，反应条件为37℃下反应1小时；
步骤(4)中，生物素化的大肠杆菌O157:H7抗体用量为100μL，浓度为1.25μg/mL，反应条件为37℃下反应1小时；
步骤(5)中，链霉亲和素修饰的聚电解质纳米胶囊用量为100μL，浓度为15μg/mL，反应条件为37℃下反应0.5小时；
步骤(6)中，3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色液用量为100μL，反应条件为37℃下反应0.5 小时，酶标仪检测波长为650nm；
所述步骤(1)、(2)、(3)、(4)、(5)中的清洗缓冲液是PBST，具体配方为pH 7.4，0.01M PBS缓冲液加入0.5‰的吐温20。
本发明的有益效果为：
(1)本发明获得的负载酶的聚电解质纳米胶囊粒径均一、稳定性好以及酶包裹效率 高；
(2)该负载酶的聚电解质纳米胶囊制备方法简单、条件温和、酶包裹率高以及酶活性 保留率高；
(3)基于聚电解质纳米胶囊良好的理化和生物性质，从而利用聚电解质纳米胶囊包裹 辣根过氧化物酶，并通过静电吸附法和生物素-链霉亲和素系统，设计基于胶囊的高效生物 催化剂与ELISA平台相结合的分析方法，实现了对大肠杆菌O157:H7的高灵敏度检测。
附图说明
图1为本发明方法原理示意图。
图2为capsule@HRP和游离HRP的酶稳定性。(A)不同温度对游离HRP和固定化 HRP(capsule@HRP)的活性影响；(B)游离HRP和固定化HRP(capsule@HRP)在不同 pH值下的酶活性；(C)不同NaCl浓度对游离HRP和固定化HRP(capsule@HRP)活性的 影响；(D)固定化HRP(capsule@HRP)和游离HRP在4℃条件下保存一个月的稳定性。 每条曲线的最大OD650值设为相对活度的100％，根据相对活度的100％计算不同条件下 capsule@HRP和HRP的相对活度。
图3为基于辣根过氧化物酶的传统ELISA检测不同浓度大肠杆菌O157:H7(5×103CFU/mL至5×107CFU/mL)的校准曲线。
图4为基于capsule@HRP的ELISA检测不同浓度大肠杆菌O157:H7(5×100CFU/mL至5×107CFU/mL)的校准曲线(A)和照片(B)。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
本发明基于capsule@HRP的酶联免疫吸附试验检测大肠杆菌O157:H7方法的原理示意 图见图1所示。
实施例1：capsule@HRP的制备
500μL氯化钙溶液(4.44mg/mL)和250μL聚苯乙烯磺酸钠(PSS)溶液(50mg/mL) 混合，在550rpm条件下搅拌反应2min后快速加入500μL碳酸钠溶液(4.24mg/mL)和500μL辣根过氧化酶HRP溶液(2mg/mL)，550rpm条件下搅拌反应30min后，15000rpm 离心10min，沉淀用超纯水洗涤两次。随后用800μL的超纯水重悬沉淀，加入100μL的聚 丙烯胺盐酸盐(PAH)溶液(30mg/mL)超声5min后，震荡反应15min，相同转速离心， 将沉淀用超纯水洗涤两次以后复溶于500μL EDTA·2Na水溶液(0.2mol/L)中反应2小时 溶解去除碳酸钙核，相同转速离心，将沉淀复溶于100μL PBS(0.01M，pH 7.4)溶液中制 得载酶聚电解质纳米胶囊，即为capsule@HRP。
实施例2：链霉亲和素包被的capsule@HRP的制备
将链霉亲和素滴加到1mL载酶聚电解质纳米胶囊溶液(PBS,pH 7.4,0.01M)中至终浓度10μg/mL，室温反应60min；反应结束后，加入100μL 1％质量分数BSA溶液反应30 min，10000rpm离心10分钟，将沉淀溶于500μL PBS(pH 7.4,0.01M)溶液中，得到链霉 亲和素包被的capsule@HRP。
实施例3：capsule@HRP的酶学性质研究
(1)热稳定性
将游离HRP和固定化过氧化物酶(capsule@HRP)分别在30-70℃的恒温水浴中孵化1 h，然后在最适条件下测定酶活力，考察HRP的热稳定性。以最大的HRP酶活力作为100％计算相对酶活力。
(2)pH稳定性
将游离HRP和固定化过氧化物酶(capsule@HRP)分别在pH 3.0-9.0的缓冲液中孵化2 h，然后在最适条件下测定酶活力，考察HRP的pH稳定性。以最大的HRP酶活力作为100％计算相对酶活力。
(3)盐离子稳定性
将游离HRP和固定化过氧化物酶(capsule@HRP)分别在0mM、100mM、200mM、 300mM、400mM、500mM NaCl浓度的缓冲液中孵化2h，然后在最适条件下测定酶活力， 考察HRP的盐离子稳定性。以最大的HRP酶活力作为100％计算相对酶活力。
(4)保存稳定性
将游离HRP和固定化过氧化物酶(capsule@HRP)分别在4℃冰箱中放置三十天，然后在最适条件下测定酶活力，考察HRP的保存稳定性。以最大的HRP酶活力作为100％计 算相对酶活力。
不同温度(30-70℃)和不同pH(3.0-9.0)对游离HRP和固定化过氧化物酶(capsule@HRP)的影响见图2A和2B所示。由图2A可见，固定化酶(capsule@HRP)和 游离酶HRP表现出相似的酶活力曲线，二者都在30℃时酶活力最高。在相同的存储温度下， 固定化酶(capsule@HRP)与游离酶HRP相比表现出较高的相对酶活力。固定化酶 (capsule@HRP)与游离酶HRP的最适存储pH为7.0(图2B)。在pH 3.0条件下，游离 酶HRP仅保持了10％的相对酶活力，而固定化酶(capsule@HRP)仍保持40％以上的相对 酶活力。在不同盐离子下孵育的游离酶HRP和固定化酶(capsule@HRP)的相对酶活力如 图2C所示。固定化酶(capsule@HRP)的酶活力几乎无影响，而游离酶HRP在盐离子浓 度0mM时酶活力最高。随着盐离子浓度提高，游离酶HRP的酶活力急剧降低，但其相对 酶活力仍保持40％以上。游离酶HRP和固定化酶(capsule@HRP)在4℃下的储存稳定性 如图2D所示。辣根过氧化物酶固定化后储存稳定性得到了显著提高。经过30天的储存， 游离酶HRP丧失了近50％的初始酶活力，而固定化酶(capsule@HRP)仍保持大于80％的 初始酶活力。由此可见，固定化酶(capsule@HRP)比游离酶HRP具有更好的储存稳定性。
实施例4：以辣根过氧化物酶为标记，以TMB为显色底物的牛奶中大肠杆菌O157:H7双抗夹心酶联免疫吸附法
传统酶联免疫吸附法试剂盒用于检测牛奶中的大肠杆菌O157:H7残留物时，通过以下 步骤实施：样品前处理、用传统酶联免疫吸附法试剂盒进行检测、分析结果。
1)样品前处理
样品前处理按国标进行。
2)用传统ELISA方法进行检测牛奶中大肠杆菌O157:H7残留物
首先在包被有捕获抗体的96孔酶标板中，加入100μL的待检标品或样品于37℃反应 1小时。反应结束后，用PBST(配方为pH 7.4,0.01M PBS缓冲液加入0.5‰的吐温20)洗板3次，加入100μL标记抗体于37℃反应1小时。反应结束后，用PBST清洗3次，加入 100μL二抗于37℃反应1h。反应结束后，用PBST清洗2次、PBS清洗2次及超纯水清洗 1次，加入100μL3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色液(购于上海麦克林生化科技有限公 司，货号T820901)于37℃反应15分钟，后用酶标仪测定650nm处的吸光度值并用相机 拍照。
3)分析结果
以大肠杆菌O157:H7标准品或样品浓度为X轴，用所获得的每个浓度的标准品或样品 溶液的吸光度平均值(OD)为Y轴，绘制标准曲线，如图3所示。
实施例5：基于capsule@HRP的免疫学实验步骤
首先在96孔酶标板中加入100μL的包被抗体(5μg/mL)于4℃反应过夜，其中包被抗体溶于PBS缓冲液(0.01M,pH 7.4)中。反应结束后，用PBST洗板3次，加入300μL BSA(10mg/mL)于37℃下反应2小时。反应结束后，用PBST洗板3次，加入100μL 的不同浓度的大肠杆菌O157:H7菌液(5×100，5×101，5×102，5×103，5×104，5×105，5×106， 5×107CFU/mL)于37℃反应1小时。反应结束后，用PBST洗板3次，加入100μL生物素 化的大肠杆菌O157:H7抗体(10μg/mL)于37℃反应1小时。反应结束后，用PBST清洗 3次，加入100μL链霉亲和素修饰的聚电解质纳米胶囊(15μg/mL)于37℃反应30分钟。 反应结束后，用PBST清洗2次、PBS清洗2次及超纯水清洗1次，加入100μL TMB显 色液于37℃反应30分钟后，用酶标仪测定650nm处的吸光度值并用相机拍照。
结果如图4A所示，可以看出大肠杆菌O157:H7浓度和吸光度之间呈现很好的指数关 系。基于capsule@HRP的ELISA线性检测范围为5×101-5×105CFU/mL，最低检测限为2.95×101CFU/mL。即使在5×101CFU/mL条件下，孔也呈现出明显的蓝色，阴性样品孔的颜色 没有变化(图4B)。
实施例6：实际样品的检测实验步骤
采用大肠杆菌O157:H7加标回收实验评价基于capsule@HRP的ELISA的准确性。分别在牛奶样本中添加终浓度为1×105，5×104，1×104，5×103，1×103，5×102，1×102，5×101 CFU/mL的大肠杆菌O157:H7标准品，经过样本前处理之后，用本研究提出的双抗体夹心ELISA方法检测样本提取液。每一浓度在同一天内重复测定三次，每隔三天测定一次，重 复测定三个批次，得出每个浓度的加标回收率以及批内批间差异。
结果见表1。大肠杆菌O157:H7在牛奶样品中的回收率(recovery)介于82.28％-116.27％， 变异系数(CV)均小于20％，表明本研究建立的方法有着良好的准确性和精密度，可以满 足实际应用。
表1以capsule@HRP为基础的ELISA检测添加到牛奶中的大肠杆菌O157:H7的回收率
Figure BDA0003360097110000111
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发 明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通 技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进 和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种负载酶的聚电解质纳米胶囊，其特征在于，通过以下方法制备得到：
(1)通过共沉淀法将酶封装在可溶解的碳酸钙纳米颗粒中：将氯化钙溶液和聚苯乙烯磺酸钠溶液混合，搅拌下进行反应，然后加入碳酸钠溶液和酶溶液，搅拌下继续反应，反应结束后，离心，将沉淀用超纯水重悬，加入聚丙烯胺盐酸盐溶液，超声，震荡反应，离心，将沉淀用超纯水洗涤，得到沉淀；
(2)将步骤(1)得到的沉淀复溶于乙二胺四乙酸二钠溶液，溶解去除碳酸钙核，离心，将沉淀复溶于PBS溶液中制得负载酶的聚电解质胶囊。
2.根据权利要求1所述的负载酶的聚电解质纳米胶囊，其特征在于，步骤(1)中，所述的氯化钙溶液、聚苯乙烯磺酸钠溶液、碳酸钠溶液、酶溶液和聚丙烯胺盐酸盐溶液的体积比为1:0.5:1:1:0.2；所述的氯化钙溶液浓度为4.44mg/mL，聚苯乙烯磺酸钠溶液浓度为50mg/mL，碳酸钠溶液浓度为4.24mg/mL，酶溶液浓度为2mg/mL，聚丙烯胺盐酸盐溶液浓度为30mg/mL；
步骤(2)中，所述的乙二胺四乙酸二钠溶液浓度为0.2mol/L；
步骤(1)和(2)的离心条件为15000rpm离心10min。
3.根据权利要求1或2所述的负载酶的聚电解质纳米胶囊，其特征在于，所述的酶为辣根过氧化物酶。
4.权利要求1-3任一所述的负载酶的聚电解质纳米胶囊在制备大肠杆菌O157:H7检测试剂盒中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，是以链霉亲和素修饰的负载酶的聚电解质纳米胶囊检测大肠杆菌O157:H7。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的链霉亲和素修饰的负载酶的聚电解质纳米胶囊是通过以下方法制备得到：将链霉亲和素滴加到负载酶的聚电解质纳米胶囊溶液，室温下反应，然后加入BSA溶液，继续反应，离心，将沉淀溶于PBS溶液，即得。
7.一种检测大肠杆菌O157:H7的试剂盒，其特征在于，含有链霉亲和素修饰的负载酶的聚电解质纳米胶囊，所述的负载酶的聚电解质纳米胶囊如权利要求1所示。
8.一种灵敏检测大肠杆菌O157:H7的酶联免疫方法，是使用双抗夹心酶联免疫吸附法进行检测，其特征在于，与生物素化的大肠杆菌O157:H7抗体结合的是链霉亲和素修饰的负载酶的聚电解质纳米胶囊，所述的负载酶的聚电解质纳米胶囊如权利要求1所示。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在酶标板上包被大肠杆菌O157:H7捕获抗体，反应结束后，用缓冲液洗去多余液体；
(2)加入封闭液反应后，用缓冲液洗去多余液体；
(3)将待测溶液加至步骤2)包被有抗体的酶标板上，反应结束后，用缓冲液洗去多余液体；
(4)加入生物素修饰的大肠杆菌O157:H7抗体，反应结束后，用缓冲液洗去多余液体；
(5)将链霉亲和素修饰的负载酶的聚电解质纳米胶囊加入至步骤4)包被有抗体-抗原-抗体复合物的酶标板中，反应结束后，用缓冲液洗去多余液体；
(6)加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺反应后，用酶标仪测定吸光度值。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，包被抗体用量为100μL，浓度为5μg/mL，反应条件为4℃反应过夜，其中包被抗体溶于pH 7.4，0.01M的PBS缓冲液中；
步骤(2)中，封闭液为10mg/mL的BSA，用量为300μL，反应条件为37℃下反应2小时；
步骤(3)中，大肠杆菌O157:H7菌液用量为100μL，反应条件为37℃下反应1小时；
步骤(4)中，生物素化的大肠杆菌O157:H7抗体用量为100μL，浓度为10μg/mL，反应条件为37℃下反应1小时；
步骤(5)中，链霉亲和素修饰的聚电解质纳米胶囊用量为100μL，浓度为15μg/mL，反应条件为37℃下反应0.5小时；
步骤(6)中，3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色液用量为100μL，反应条件为37℃下反应0.5小时，酶标仪检测波长为650nm；
所述步骤(1)、(2)、(3)、(4)、(5)中的清洗缓冲液是PBST，具体配方为pH 7.4，0.01MPBS缓冲液加入0.5‰的吐温20。
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