CN114113223A - 一种基于纳米吸管的单细胞胞内pH传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于纳米吸管的单细胞胞内pH传感器的制备方法，通过将石英毛细管拉制成内径为80～320nm的纳米吸管，将配置的三氯化钛溶液注入纳米吸管中，倒置纳米吸管，经避光静置、加热反应、在纳米吸管尖端生成二氧化钛后，用超纯水冲洗纳米吸管后放入缓冲液中进行保存。本发明公开的一种基于纳米吸管的单细胞胞内pH传感器的制备方法，通过在纳米吸管尖端生长二氧化钛的形式制备了纳米吸管胞内pH传感器，将三氯化钛的水溶液注入到纳米吸管尖端，通过加热的方式即可制得纳米吸管pH传感器。该方法简单、高效、对设备依赖度低、副产物少，且成功率高、重复性好，制备纳米吸管pH传感器对pH响应灵敏，分辨率高，可实时监控单细胞胞内pH的动态变化。
Description
技术领域
本发明涉及纳米材料技术领域，尤其涉及一种基于纳米吸管的单细胞胞内pH传感器的制备方法。
背景技术
细胞是生物体生命活动的基本单位，其胞内pH在蛋白质功能、细胞代谢、生长、增殖、迁移和其他细胞过程中都起着重要作用；而胞内pH值的改变往往是病理变化的标志，如癌变，凋亡，心肌缺血，阿尔茨海默氏症等；同时有报道指出外源性化合物(如药物和酒精)可以改变细胞内pH。因此胞内pH是癌症研究、神经科学、代谢、细胞生物学和药理学中重要的生物标志物，胞内pH的感测对细胞的病理生理研究、疾病的早期诊断及药物筛选和药物作用动力学等研究具有重要意义。
过去二十年，几种分析技术的发展让单细胞胞内pH感测成为可能，如基于荧光的光谱/显微镜，等离子体/表面增强拉曼光谱，纳米孔/纳米吸管感测等。其中基于荧光的pH荧光探针由于胞内分布不均且分布不可控等问题，无法提供可靠的高空间分辨率的胞内pH感测，基于表面增强拉曼光谱的等离子体纳米尖端其pH响应和数据采集时间过长会带来时间分辨率不足的问题，而基于纳米孔/纳米吸管胞内感测具有明显的优势，它既具有电化学检测灵敏度高、响应速度快、可进行实时动态监测等优点，同时它纳米尺度的尖端(可小于10nm)可以探入到微小区域(如细胞器内)进行感测，因此可以对单细胞实现高时空分辨率的胞内感测。
纳米吸管是指尖端开口在纳米尺度具有的中空结构的管状物，通常是由玻璃毛细管经过微电极拉制仪拉制而成。不同于传统吸管用于转移液体的用途，纳米吸管由于其纳米尺寸的尖端、中空的结构和可对外界刺激响应的离子传输行为等特点，而被广泛的应用于胞内注射、细胞活检和胞内传感等单细胞实验中。纳米吸管尖端纳米孔的离子传输行为对目标信号的响应是其进行胞内传感的基础。为了实现纳米吸管对pH的有效响应，研究者们通过向纳米吸管内壁引入化学基团，实现了纳米吸管pH响应的增强。在包括但不限于纳米吸管的纳米孔上取得了一系列成果：多种内壁基团皆成功的引入到纳米吸管内壁，并实现了纳米吸管pH响应的增强。尽管前景看好，但纳米吸管pH传感器的研发仍处于早期阶段，尤其在纳米吸管功能化修饰方面依然存在着很大挑战，如对pH响应不够灵敏、分辨率不足、成功率不高及重复性差等。
发明内容
本发明提供一种基于纳米吸管的单细胞胞内pH传感器的制备方法，以解决纳米吸管pH传感器灵敏度低、分辨率不足、成功率低及重复性差的问题。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种基于纳米吸管的单细胞胞内pH传感器的制备方法，包括以下步骤：
S1：将石英毛细管拉制成内径为80-320nm的纳米吸管；
S2：将配置的三氯化钛溶液注入步骤S1制得的纳米吸管中，随后倒置纳米吸管，经避光静置、加热反应后，用超纯水冲洗纳米吸管后放入缓冲液中进行保存。
进一步地，所述步骤S1中，所述的石英毛细管的内径为0.7mm，外径为1.0mm。
进一步地，所述步骤S1中，拉制的参数为Heat＝700，Fil＝4，Vel＝60，Del＝170，Pull＝70-180；
在误差允许的范围内，当拉制的参数为Heat＝700，Fil＝4，Vel＝60，Del＝170，Pull＝180时，制得的纳米吸管内径为80nm；当拉制的参数为Heat＝700，Fil＝4，Vel＝60，Del＝170，Pull＝150，制得的纳米吸管内径为130nm；当拉制的参数为Heat＝700，Fil＝4，Vel＝60，Del＝170，Pull＝100，制得的纳米吸管内径为180nm；当拉制的参数为Heat＝700，Fil＝4，Vel＝60，Del＝170，Pull＝80，制得的纳米吸管内径为250nm；当拉制的参数为Heat＝700，Fil＝4，Vel＝60，Del＝170，Pull＝70，制得的纳米吸管内径为320nm。
进一步地，所述步骤S2中，所述的三氯化钛溶液的浓度为5～100mM。
进一步地，所述步骤S2中，所述的三氯化钛溶液的添加量为15-30uL。
进一步地，所述步骤S2中，所述的避光静置的时间为10～120min。
进一步地，所述步骤S2中，所述的反应温度为75～98℃，时间为10～120min。
进一步地，所述步骤S2中，所述的缓冲液为磷酸缓冲盐溶液。
进一步地，所述的磷酸盐缓冲盐溶液经8mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、137mM NaCl和2.7mM KCl配制成pH值为7.2的溶液。
本发明公开的一种基于纳米吸管的单细胞胞内pH传感器的制备方法，通过一步反应制备了纳米吸管胞内pH传感器，将三氯化钛的水溶液注入到纳米吸管尖端，通过加热的方式即可制得纳米吸管pH传感器。该方法简单、高效、对设备依赖度低、副产物少，且成功率高、重复性好，制备纳米吸管pH传感器对pH响应灵敏，分辨率高，且可实时监控单细胞胞内pH的动态变化。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明反应前纳米吸管的光镜图；
图2为本发明反应后纳米吸管的光镜图；
图3为反应后纳米吸管的扫描电镜图；
图4为生长二氧化钛的纳米吸管(180nm)对pH的电流响应；
图5为生长二氧化钛的纳米吸管(180nm)对pH的高分辨率电流响应，插图虚线方框内为放大图；
图6为生长二氧化钛的纳米吸管(180nm)的离子电流与pH的线性关系(n＝6)；
图7为生长二氧化钛的纳米吸管(180nm)的离子电流对pH的可逆响应(n＝6)；
图8为不同直径的纳米吸管生长二氧化钛后对pH响应的灵敏度(n＝6)；
图9为不同三氯化钛浓度下纳米吸管生长二氧化钛后对pH响应的灵敏度(n＝6)；
图10为不同温度下纳米吸管生长二氧化钛后对pH响应的灵敏度(n＝6)；
图11为不同反应时间下纳米吸管生长二氧化钛后对pH响应的灵敏度(n＝6)；
图12为生长二氧化钛的纳米吸管刺入人乳腺癌细胞(MCF-7)进行pH监测的显微图片；
图13为生长二氧化钛的纳米吸管监控奥美拉唑作用下MCF-7细胞胞内的pH变化。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图1-13，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
将外径为1.0mm内径为0.7mm的石英毛细管通过P-2000微电极激光拉制仪拉制成内径为180nm的纳米吸管，拉直参数为Heat＝700，Fil＝4，Vel＝60，Del＝170，Pull＝100。
用超纯水配置50mM的三氯化钛溶液，尔后通过微量移液器移取20uL的三氯化钛溶液注入拉制成内径为180nm的纳米吸管中，随后将纳米吸管倒置并放入离心管避光静置1h后放入90℃烘箱，1h后使用超纯水彻底冲洗纳米吸管后放入盛有pH值为7.2的磷酸缓冲盐溶液(PBS)的离心管中保存。
性能检测试验：
为了规避PBS的pH缓冲能力，用盐溶液(137mM NaCl、2.7mM KCl)替换纳米吸管管腔内的磷酸缓冲盐溶液。用一根直径为0.35mm的Ag/AgCl参比电极插入纳米吸管尾端，尔后纳米吸管与另一Ag/AgCl参比电极同时插入电解池的PBS缓冲液中。使用CHI 660A电化学工作站连接两根参比电极记录实验过程中产生的数据，用计时电流法(-1V)记录产生的离子电流。其中，电解池中初始的电解质溶液为pH值为8的PBS，用含有137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM H3PO4的磷酸盐缓冲液调节电解池中PBS溶液的pH。
取处于对数增长期的MCF-7细胞弃掉培养基，用1×PBS润洗3遍后，用胰蛋白酶消化后加入1×PBS中，用显微镜、微超系统(MPC365)和电化学工作站(CHI 660A)做单细胞细胞内离子电流的检测(整个装置放置在光学平板上，光学平板下面垫上气囊减震)。用36mm的细胞培养皿取4.5mL悬浮有MCF-7细胞的培养基(细胞数目约1×104)，待微米玻璃管靠近细胞后缓缓拉动注射器活塞制造微米毛细管腔内的低压环境，细胞被吸附到微米玻璃管的前端。右臂固定石英纳米吸管做细胞的穿刺，加药时缓慢加入500μL的1mM奥美拉唑(OM)，使OM的浓度为100μM，对照组加500μL不含药的同比例稀释的二甲基亚砜(DMSO)。将一根银/氯化银电极(0.35mm)放入培养皿溶液中，另一根银/氯化银电极从石英纳米孔的后端插入管腔内，用I-t(-1V)记录的离子电流来监测添加药物组及对照组MCF-7细胞胞内pH的变化。
如图1-3所示，从图1中可以看出，裸的纳米吸管尖端未观察到堵塞物。从图2中可以看出，溶液中的三氯化钛加热生成固体二氧化钛，堵塞在纳米吸管尖端，生长二氧化钛后，在纳米吸管的尖端能够观察到明显的堵塞物。从图3中可以看出纳米吸管尖端内径约180nm，外径262nm，二氧化钛生长并塞满了纳米吸管的尖端的孔腔，外壁有部分的二氧化钛附着。
图4中，从图中可以看出，随着pH值的变化，生长二氧化钛的纳米吸管有着阶跃式的电流响应，不同的pH值对应不同的电流值，当溶液pH值从8降低至3时，响应电流从-11.75nA阶跃式升高到-2.95nA，该变化值是pH值3时响应电流值的5.85倍，说明该电极对pH有着灵敏性的响应。
图5中，从图中可以看出，连续三次调节溶液的pH值使之每次下降0.05，生长二氧化钛的纳米吸管均有阶跃式的电流响应，表明纳米吸管可有效分辨pH值0.05的差异，对pH值感测的分辨率高。
图6中，为了避免纳米吸管初始电流之间的差异，进行归一化数据处理；即设定溶液pH值为8时纳米吸管的响应电流值为100％，其它pH值下的响应电流与该电流值相比获得百分值代表该响应电流值，从图中可以看出，在pH值3～8的范围内，归一化的电流值随pH值增加而增大，其对pH响应的灵敏度为15.04％pH-1。使用置信水平为99％的ANOVA检验，p＜0.01，说明pH值与归一化的电流值之间有些显著的线性关系。图7中，从图中可以看出，反复在pH值分别为4和8的酸碱溶液中测试，纳米吸管均表现出很好的pH响应的可逆性和重复性，反复测试8次后，离子电流依然没有明显的变化，表明该pH传感器具有良好的稳定性。
图8～10为纳米吸管在不同条件下生长二氧化钛后对pH响应的灵敏度；测试(当溶液pH值从8降低至3时)纳米吸管响应电流的变化值，并将该值与pH值为8时的响应电流值相比获得响应电流比，用响应电流比来表示纳米吸管对pH响应的灵敏度。
图8中，从图中可以看出，内径分别为80±5nm、130±5nm、180±5nm、250±5nm、320±5nm的纳米吸管生长二氧化钛后皆可实现对pH的响应，当溶液pH值从8降至3时，其响应电流的变化比分别为57.2％±0.022、72.60％±0.017、75.22％±0.017、69.09％±0.014、67.99％±0.015。其中，180±5nm的纳米吸管对pH的响应最为灵敏性。
图9中，从图中可以看出，随着底物中三氯化钛浓度的升高，纳米吸管的pH响应灵敏度先上升后下降，其在50mM处的优化效果最好。
图10中，从图中可以看出，随着反应时间的增加，纳米吸管的pH响应灵敏度先上升后略微下降且保持稳定，当反应时间在10分钟以上时皆可成功制备出对pH有效响应的纳米吸管pH传感器。
图11中，从图中可以看出，当反应温度在75℃以上时纳米吸管对pH有显著的响应，且90℃为最优的反应温度。
图12中，从图中可以看出，微米毛细管在低压吸附MCF-7细胞后，纳米吸管成功刺入到细胞内进行实时感测。
从图13中可以看出，不做处理的对照组，纳米吸管的感应电流保持稳定，提示细胞胞内pH维持稳定；只添加二甲基亚砜(奥美拉唑溶剂)的细胞，纳米吸管pH传感器也未监测到明显的电流变化，添加点的电流扰动被认为是添加溶液导致的电场干扰，引起了感应电流波动，液面稳定后感应电流消失；添加质子泵抑制剂奥美拉唑的细胞，2分钟后，由于质子泵被抑制，导致细胞酸化，随后由于细胞的适应性，胞内酸化程度降低，但仍维持且平衡在一个酸化的程度。纳米吸管pH传感器通过感应电流清晰的观察并记录了这一过程。
本发明公开的一种基于纳米吸管的单细胞胞内pH传感器的制备方法，通过在纳米吸管尖端生长二氧化钛的形式制备了纳米吸管胞内pH传感器，将三氯化钛的水溶液注入到纳米吸管尖端，通过加热的方式即可制得纳米吸管pH传感器。该方法简单、高效、对设备依赖度低、副产物少，且成功率高、重复性好，制备纳米吸管pH传感器对pH响应灵敏，分辨率高，且可实时监控单细胞胞内pH的动态变化。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (9)
1.一种基于纳米吸管的单细胞胞内pH传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将石英毛细管拉制成内径为80-320nm的纳米吸管；
S2：将配置的三氯化钛溶液注入步骤S1制得的纳米吸管中，随后倒置纳米吸管，经避光静置、加热反应后，用超纯水冲洗纳米吸管后放入缓冲液中进行保存。
2.根据权利要求1所述的一种基于纳米吸管的单细胞胞内pH传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述的石英毛细管的内径为0.7mm，外径为1.0mm。
3.根据权利要求1所述的一种基于纳米吸管的单细胞胞内pH传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，拉制的参数为Heat＝700，Fil＝4，Vel＝60，Del＝170，Pull＝70-180。
4.根据权利要求1所述的一种基于纳米吸管的单细胞胞内pH传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述的三氯化钛溶液的浓度为5～100mM。
5.根据权利要求1所述的一种基于纳米吸管的单细胞胞内pH传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述的三氯化钛溶液的添加量为15-30uL。
6.根据权利求1所述的一种基于纳米吸管的单细胞胞内pH传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述的避光静置的时间为10～120min。
7.根据权利求1所述的一种基于纳米吸管的单细胞胞内pH传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述的反应温度为75～98℃，时间为10～120min。
8.根据权利求1所述的一种基于纳米吸管的单细胞胞内pH传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述的缓冲液为磷酸缓冲盐溶液。
9.根据权利求8所述的一种基于纳米吸管的单细胞胞内pH传感器的制备方法，其特征在于，所述的磷酸缓冲盐溶液经8mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、137mM NaCl和2.7mM KCl配制成pH值为7.2的溶液。
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