CN114106198A - 一种pd1抗体与ccl7融合蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种PD1抗体与CCL7融合蛋白及其制备方法与应用，所述PD1与CCL7融合蛋白为PD‑1抗体蛋白和趋化因子CCL7蛋白融合后的蛋白；其中，所述PD‑1抗体蛋白包括PD‑1的单链抗体或PD‑1的单克隆抗体；所述趋化因子CCL7的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述PD‑1抗体蛋白和所述趋化因子CCL7之间采用接头连接。本发明将CCL7融合到PD1抗体上，各组分可发挥协同作用，使融合蛋白的生物学活性较各单体大大增强，具体地，CCL7可以募集活化T细胞到肿瘤区域，从而打破之前的局限，也进一步加强PD1抗体的抗肿瘤免疫。

Description

一种PD1抗体与CCL7融合蛋白及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种PD1抗体与CCL7融合蛋白及其制备方法与在制备用于预防、诊断和治疗肿瘤产品中的应用。
背景技术
癌症是严重影响人类健康的疾病，也是人类死亡的主要原因。肺癌是发病率和死亡率增长最快，多年高居各种癌症的榜首，已成为对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤。吸烟、长期暴露于污染的空气中与所在工作场所暴露于致癌原是患肺癌风险增加的主要原因。基于肺癌的生物学特征、治疗和预后，世界卫生组织(WHO)将其分为两大类：非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)。NSCLC占所有肺癌病例的85％以上，主要包括腺癌和鳞癌。
在研究肿瘤发生机制与肿瘤微环境方法中，常常使用动物模型来模拟肿瘤在机体内的生长状况。其中由带Cre重组酶的腺病毒(以下简称Ade-Cre)诱导的Krasfl/+Trp53fl/fl(以下简称KP)小鼠模型是研究非小细胞肺癌的主要经典模型之一。正常kras基因可以抑制肿瘤细胞生长，一旦发生突变，例如第十二位甘氨酸(G)突变为天冬氨酸(D)，会持续刺激细胞生长。Trp53是研究最为广泛的也是最重要的肿瘤抑制基因，p53缺失突变也会导致肿瘤的发生。Kras与Trp53突变常见于非小细胞肺癌中，在小鼠模型中，将Kras突变和p53缺失是理想的非小细胞肺腺癌的研究模型。但由于Kras与Trp53在小鼠生长发育早期发挥重要作用，突变或者缺失都会致死，固需要使用借助Cre-Loxp系统的条件性敲除小鼠来实现在小鼠肺部原发癌的发生。
PD-1是一种重要的免疫抑制分子，是一个268氨基酸残基的膜蛋白，表达于活化T细胞。在机体免疫系统通过免疫杀伤肿瘤时，活化T细胞通过抗原呈递至肿瘤生长部位，但由于肿瘤细胞表面表达PD-L1分子，能与PD-1结合，抑制T细胞的杀伤功能，达到免疫逃逸。目前对于肿瘤的免疫疗法中，大多使用PD-1抗体结合封闭PD-1，来保证T细胞活性，达到杀伤肿瘤细胞的目的。但是该疗法也面临着诸多局限与挑战，效率偏低和复发率高是主要的问题。其中有关如何募集活化T细胞到肿瘤区域的使用方法也是该疗法的局限。
因此，如何开发一种用于预防、诊断和治疗肿瘤产品，能够募集活化T细胞到肿瘤区域，成为亟待解决的技术问题。
发明内容
为了解决所述技术问题，本发明提供了一种PD1抗体与CCL7融合蛋白及其制备方法与在制备用于预防、诊断和治疗肿瘤产品中的应用，将CCL7融合到PD1抗体上，可以募集活化T细胞到肿瘤区域，从而打破之前的局限，也进一步加强PD1抗体的抗肿瘤免疫。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
在本发明的第一方面，提供了一种PD1抗体与CCL7融合蛋白，所述PD1抗体与CCL7融合蛋白为抗PD-1抗体蛋白和趋化因子CCL7蛋白融合后的蛋白；其中，
所述PD-1抗体蛋白包括PD-1的单链抗体或PD-1的单克隆抗体；
所述趋化因子CCL7的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，
所述PD-1抗体蛋白和所述趋化因子CCL7之间采用第一接头蛋白连接。
进一步地，所述第一接头蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
进一步地，所述抗PD-1的单链抗体包括重链可变区和轻链可变区：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
进一步地，所述重链可变区和所述轻链可变区采用第二接头蛋白连接，所述第二接头蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段与编码另外一种蛋白质如抗体恒定区或柔性连接体的另一个DNA片段有效连接。如本文使用的术语“有效连接”意思是两个DNA片段连接在一起，使得这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持符合阅读框。
进一步地，所述PD-1的单链抗体还包括：
所述单克隆抗体的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的抗体；
或者包括具有与所述重链可变区具有至少80％的同源性的氨基酸序列的重链可变区；和与所述轻链可变区具有至少80％的同源性的氨基酸序列的轻链可变区；
或者所述单克隆抗体的N端和/或C端连接标签得到的抗体。
在另外一些实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以与上述序列85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。具有与上述序列的VH和VL区高度(即80％或更高)同源的VH和VL区的抗体可以如下获得：诱变(例如定点诱变或PCR介导的诱变)后用此处所述的功能试验检测编码的被改变抗体的保留的功能。
所述单克隆抗体包括：人抗体、人源化或嵌合抗体。
进一步地，所述PD-1的单克隆抗体包括重链可变区、轻链可变区和Fc区，所述Fc区的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。在其他实施方式中，一旦获得编码VH和VL片段的DNA片段，即可通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种编码所述单克隆抗体的核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
在本发明的第三方面，提供了一种包含所述核酸的表达载体，所述表达载体能够在原核或者真核宿主细胞中表达所述核酸。
所述载体可以是常规的载体；具体可以为质粒载体、噬菌体载体、病毒载体；
作为一种具体的实施方式，所述表达载体的制备方法包括：
从GenBank数据库中检索鼠CCL7基因序列，以鼠CCL7基因为模板通过PCR扩增出CCL基因片段，并通过重叠延伸PCR的方式扩增出包含PD-1单链抗体和CCL7的目的基因，并在两端加上酶切位点PmeⅠ和HindⅢ；
使用内切酶PmeⅠ和HindⅢ酶切pTT3载体和目的片段，用T4连接酶将片段与载体连接，获得重组质粒PD-1Ab-CCL7/pTT3。
在本发明的第四方面，提供了一种包含所述的表达载体的工程菌或真核宿主细胞。
在本发明的第六方面，提供了所述的PD1与CCL7融合蛋白或所述的表达载体或所述的工程菌或真核宿主细胞在制备用于预防、诊断和治疗肿瘤产品中的应用。
所述对象为哺乳动物，例如灵长类动物、啮齿类动物、家畜、宠物等，优选人、大鼠、小鼠、犬、马、牛、兔或猴。
所述肿瘤可包括但不限于：肺癌、肝癌、鳞癌、乳腺癌、子宫颈癌、结直肠癌、腺癌；优选肺癌。
所述用于预防、诊断和治疗肿瘤产品选自：药物、保健品、试剂盒、医疗设备、或它们的组合。
本发明揭示了PD-1Ab-CCL7可作为肿瘤抑制的一个融合蛋白，可以应用于制备抗肺癌、结肠癌等肿瘤的药物。具体地：
本发明在非小细胞肺癌KP模型中，建立了慢病毒滴鼻感染诱导小鼠肺癌的方法，腹腔注射融合蛋白PD-1Ab-CCL7，证实了通过上述方法可以促进小鼠肺部CD11c+DC细胞的募集，促进肺部和肺淋巴结免疫细胞浸润，进而抑制肿瘤发生和生长，延长肺癌小鼠的生存时间。
在小鼠B16细胞皮下荷瘤模型中，在野生型小鼠皮下注射B16黑色素瘤细胞，一周后在小鼠腹腔注射融合蛋白PD-1Ab-CCL7，并用PD-1Ab和PBS作为对照，我们发现融合蛋白PD-1Ab-CCL7处理组相较于PD-1Ab和PBS组，可以明显抑制皮下黑色素瘤生长，激活IFNγ+T细胞来促进肿瘤免疫过程。
在小鼠MC38细胞皮下荷瘤模型中，在野生型小鼠皮下注射MC38鼠结肠癌细胞，10天后在小鼠腹腔注射融合蛋白PD-1Ab-CCL7，并用PD-1Ab和PBS作为对照，我们发现融合蛋白PD-1Ab-CCL7处理组相较于PD-1Ab和PBS组，可以明显抑制皮下结肠癌细胞的生长，激活IFNγ+T细胞来促进肿瘤免疫过程。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明提供的一种PD1与CCL7融合蛋白及其制备方法与在制备用于预防、诊断和治疗肿瘤产品中的应用，将CCL7融合到PD1抗体上，各组分可发挥协同作用，使融合蛋白的生物学活性较各单体大大增强，具体地，CCL7可以募集活化T细胞到肿瘤区域，从而打破之前的局限，也进一步加强PD1抗体的抗肿瘤免疫；
并且广泛认为，趋化因子的半衰期都比较短，在体内很容易降解，而我们将趋化因子CCL7与PD1抗体融合以后，也会延长CCL7的半衰期，实验结果证明该融合蛋白是以二聚体形式存在的，延长了蛋白半衰期，从而达到更好的治疗效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为融合蛋白PD-1Ab-CCL7的理化性质；其中图1a为融合蛋白PD-1Ab-CCL7结构示意图，图1b为纯化后的融合蛋白PD-1Ab-CCL7以及对照蛋白PD-1Ab通过聚丙烯酰胺凝胶电泳后，经过考马斯亮蓝染色示意图。融合蛋白PD-1Ab-CCL7大小约为45kDa，对照蛋白PD-1Ab大小约为30kDa；其中图1c为融合蛋白PD-1Ab-CCL7通过分子筛层析示意图，显示融合蛋白PD-1Ab-CCL7为二聚体形式；
图2为融合蛋白PD-1Ab-CCL7治疗肺癌KP模型小鼠效果的实验结果图；其中图2a为KP模型小鼠诱导方式以及使用融合蛋白PD-1Ab-CCL7治疗模式图，图2b为使用融合蛋白PD-1Ab-CCL7治疗KP肺癌小鼠的生存期示意图，使用融合蛋白PD-1Ab-CCL7治疗相较于对照组可以显著延长肺癌小鼠生存期；
图3为融合蛋白PD-1Ab-CCL7治疗B16细胞皮下瘤模型小鼠效果的实验结果图；其中图3a为融合蛋白PD-1Ab-CCL7治疗B16细胞皮下瘤模型模式图，以及使用融合蛋白PD-1Ab-CCL7治疗(或对照组)后小鼠皮下黑色素瘤体积大小对比图，图3b为使用融合蛋白PD-1Ab-CCL7治疗(或对照组)后小鼠皮下黑色素瘤实拍图；图3c为使用融合蛋白PD-1Ab-CCL7(或对照组)治疗后每只小鼠皮下黑色素瘤生长曲线。
图4为融合蛋白PD-1Ab-CCL7治疗MC38细胞皮下瘤模型小鼠效果的实验结果图；其中图4a为融合蛋白PD-1Ab-CCL7治疗MC38细胞皮下瘤模型模式图，以及使用融合蛋白PD-1Ab-CCL7治疗(或对照组)后小鼠皮下瘤体积大小对比图，图4b为使用融合蛋白PD-1Ab-CCL7治疗(或对照组)后小鼠皮下荷瘤实拍图；图4c为使用融合蛋白PD-1Ab-CCL7(或对照组)治疗后每只小鼠皮下荷瘤生长曲线。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的单克隆抗体及其制备方法与应用效果进行详细说明。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南等书中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 PD1单链抗体与CCL7融合蛋白及其制备方法
1、准备PD-1的单链抗体
PD-1的单链抗体包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明实施例中，所述重链可变区和所述轻链可变区采用接头蛋白连接，所述接头蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2、PD1抗体与CCL7融合蛋白
PD-1单链抗体蛋白和趋化因子CCL7蛋白之间通过108个氨基酸的接头蛋白连接在一起。(如图1a所示)
3、克隆构建
重组质粒PD-1Ab-CCL7/pTT3的构建和提取的具体步骤为：
(1)以实验室现有的PD-1Ab-scFv质粒为模板，设计引物F1和R2扩增出目的片段1，以实验室现有的鼠CCL7质粒为模板，设计引物F2和R1扩增出目的片段2，再以目的片段1和目的片段2为模板，使用引物F1和R1扩增出PD-1Ab-CCL7全长基因。其中PD-1Ab-scFv质粒参考文献“Li,Y.,Cong,Y.,Jia,M.,He,Q.,Zhong,H.,Zhao,Y.,…Wang,S.(2021).TargetingIL-21to tumor-reactive T cells enhances memory T cell responses and anti-PD-1antibody therapy.Nature Communications,12(1).doi:10.1038/s41467-021-21241-0”
表1
Figure BDA0003349947420000061
(2)使用内切酶PmeⅠ和HindⅢ酶切pTT3载体和PD-1Ab-CCL7全长基因，用T4连接酶将片段与载体连接，获得重组质粒PD-1Ab-CCL7/pTT3。
4、融合蛋白的表达与纯化
将所述重组质粒PD-1Ab-CCL7/pTT3瞬时转染293T细胞，PD-1Ab-CCL7融合蛋白在细胞内表达并分泌至胞外，后进行PD-1Ab-CCL7蛋白的纯化，具体步骤为：将细胞培养基中的融合蛋白与镍柱相结合，通过梯度浓度的咪溶液将融合蛋白洗脱下来。
纯化后所得的融合蛋白PD-1Ab-CCL7，通过SDS-PAGE电泳，使用考马斯亮蓝染色后，大小约为45kDa，对照蛋白PD-1Ab大小为30kDa。(如图1a所示)；
将制备得到的融合蛋白PD-1Ab-CCL7通过分子筛层析示，结果图1c所示，可知融合蛋白PD-1Ab-CCL7为二聚体形式，证明该融合蛋白是以二聚体形式存在的，表明趋化因子CCL7与PD1抗体融合以后，也会延长CCL7的半衰期。
实施例2、PD1抗体与CCL7融合蛋白及其制备方法
1、所述PD-1的单克隆抗体包括重链可变区(同实施例1)、轻链可变区(同实施例1)和Fc区，所述Fc区的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
2、PD1与CCL7融合蛋白
PD-1抗体蛋白和趋化因子CCL7蛋白之间通过108个氨基酸的接头蛋白连接在一起。
(如图1a所示)
3、克隆构建
(1)以现有的PD-1Ab质粒为模板，设计引物F1和R2扩增出目的片段1，以实验室现有的鼠CCL7质粒为模板，设计引物F2和R1扩增出目的片段2，再以目的片段1和目的片段2为模板，使用引物F1和R1扩增出PD-1Ab-CCL7全长基因。
表2
Figure BDA0003349947420000071
(2)使用内切酶PmeⅠ和HindⅢ酶切pTT3载体和目的片段，用T4连接酶将片段与载体连接。
4、融合蛋白的表达与纯化
将上述重组质粒转染293T细胞，在细胞内表达PD-1Ab-CCL7融合蛋白并分泌至胞外，后进行蛋白的纯化。
对比例1
该对比例为没有融合的抗PD-1的单链抗体(见实施例1的步骤1)。
应用例1、PD1与CCL7融合蛋白在制备用于预防、诊断和治疗肿瘤产品中的应用
1、融合蛋白PD-1Ab-CCL7治疗肺癌KP模型小鼠效果的实验结果图
本实验先将Krasfl/+Trp53fl/fl(图中KP)小鼠生长至8周龄时，通过将小鼠麻醉滴鼻加入带Cre基因的腺病毒(每只小鼠2×106pfu病毒溶于60ul PBS)，可以实现对小鼠肺部肿瘤诱导，5周后腹腔注射融合蛋白PD-1Ab-CCL7(实施例1)，并用PD-1Ab(对比例1)和PBS作为对照(每只小鼠每次注射66.7g融合蛋白或者40g PD-1Ab，均溶于200ul PBS)，每三天注射一次，连续注射5周，然后可以观察小鼠的生存期。
结果如图2a与2b所示，在诱导了肿瘤的小鼠中，融合蛋白PD-1Ab-CCL7治疗的小鼠存活时间更久，说明融合蛋白PD-1Ab-CCL7的存在具有延长肺癌小鼠的生存期的作用，PD-1Ab-CCL7能够在肿瘤发生和生长过程中起到抑制肿瘤的作用。
2、融合蛋白PD-1Ab-CCL7治疗B16细胞皮下瘤模型小鼠效果的实验结果图
在小鼠B16细胞皮下荷瘤模型中，首先在野生型小鼠右侧腹部皮下注射200微升PBS稀释的B16黑色素瘤细胞，细胞量为2×105/只。8天后在小鼠腹腔注射融合蛋白PD-1Ab-CCL7(实施例1)，并用PD-1Ab(对比例1)和PBS作为对照，具体每只小鼠每次注射66.7g融合蛋白或者40g PD-1Ab，均溶于200ul PBS，每3天注射一次，连续注射5次。(如图3a所示)
结果如图3a与3c所示，结果表明实施例1的融合蛋白PD-1Ab-CCL7处理组相较于PD-1Ab(对比例1)和PBS组，可以明显抑制皮下黑色素瘤生长，肿瘤的体积更小。
3、融合蛋白PD-1Ab-CCL7治疗MC38细胞皮下瘤模型小鼠效果的实验结果图
在小鼠MC38细胞皮下荷瘤模型中，首先在野生型小鼠右侧腹部皮下注射200微升PBS稀释的MC38结肠癌细胞，细胞量为5×105/只。9天后在小鼠腹腔注射融合蛋白PD-1Ab-CCL7，并用PD-1Ab和PBS作为对照(每只小鼠每次注射66.7g融合蛋白或者40g PD-1Ab，均溶于200ul PBS)，每3天注射一次，连续注射7次。(如图4a所示)
结果如图4b与4c所示，结果表明融合蛋白PD-1Ab-CCL7处理组相较于PD-1Ab(对比例1)和PBS组，可以明显抑制皮下结肠癌细胞生长，肿瘤的体积更小。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 武汉大学
<120> PD1与CCL7融合蛋白及其制备方法与在制备用于预防、诊断和治疗肿瘤产品中的应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 423
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaactcag gactcaaatt ggttttcttt gtccttattc taaaaggtgt ccagtgtgag 60
gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gcacaacctg gaaagtccct gaaactctcc 120
tgtgaggcct ctggattcac cttcagtgac tatggcatga actggttccg tcaggctcca 180
gggaaggggc tggagtgggt cgcatatatt agtagtggta gtaataagat cacatatgcc 240
gacactgtga agggccggtt caccgtctcc agagacaacg gcaagaacca actgttcctg 300
caaatgaaca atctcaagtc tgaggacaca gccatttatt actgtgtgga tagcggattt 360
aattcttact ctgatgtctg gggccaggga atccaggtca ccgtctcctc aaccacaaca 420
aca 423
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggtccagtg gcggt 15
<210> 3
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagtttgtgc taactcagcc aaagactgtg tcagagtctc tggggagaac agtcaccatc 60
tcctgcaaac gcagcagtgg cagcgttggg gactactatg tcagctggca ccagcagcgc 120
tttggaagct ctcccaaaac tgtgatctat cttgatgatg agagaccatc tggggttcct 180
aaaaggttct ctggctccat tgacagctca tccaactcag cctcactgac catcactgat 240
ctgcagactg acgatgaggc tgactacttt tgtctctctt atgatagtaa caatcacttt 300
gtttttggca gcggaaccca cctcaccgtc ctaggtggac ccaagtcttc tcccaaagtc 360
aca 363
<210> 4
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtggttctg gcggcggttc tgaaggtggc ggctccgaag gcggcggcag cgagggcggt 60
ggtagcgaag gtggtggctc cgagggtggc ggttccggcg gcggtagc 108
<210> 5
<211> 264
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caaccagatg ggcccaatgc atccacatgc tgctatgtca agaaacaaaa gatccccaag 60
aggaatctca agagctacag aaggatcacc agtagtcggt gtccctggga agctgttatc 120
ttcaagacaa agaagggcat ggaagtctgc gctgaagccc atcagaagtg ggtcgaggag 180
gctatagcat acttagacat gaaaacccca actccaaagc ctgaaaacct gtacttccaa 240
ggacatcatc accatcacca ttag 264
<210> 6
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu
1 5 10 15
Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr
20 25 30
Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys
35 40 45
Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val
50 55 60
His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe
65 70 75 80
Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu
145 150 155 160
Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro
165 170 175
Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val
180 185 190
Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu
195 200 205
His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 7
<211> 1187
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtttaaacat gaactcagga ctcaaattgg ttttctttgt ccttattcta aaaggtgtcc 60
agtgtgaggt gcagctggtg gagtctgggg gaggcttagc acaacctgga aagtccctga 120
aactctcctg tgaggcctct ggattcacct tcagtgacta tggcatgaac tggttccgtc 180
aggctccagg gaaggggctg gagtgggtcg catatattag tagtggtagt aataagatca 240
catatgccga cactgtgaag ggccggttca ccgtctccag agacaacggc aagaaccaac 300
tgttcctgca aatgaacaat ctcaagtctg aggacacagc catttattac tgtgtggata 360
gcggatttaa ttcttactct gatgtctggg gccagggaat ccaggtcacc gtctcctcaa 420
ccacaacaac agggtccagt ggcggtcagt ttgtgctaac tcagccaaag actgtgtcag 480
agtctctggg gagaacagtc accatctcct gcaaacgcag cagtggcagc gttggggact 540
actatgtcag ctggcaccag cagcgctttg gaagctctcc caaaactgtg atctatcttg 600
atgatgagag accatctggg gttcctaaaa ggttctctgg ctccattgac agctcatcca 660
actcagcctc actgaccatc actgatctgc agactgacga tgaggctgac tacttttgtc 720
tctcttatga tagtaacaat cactttgttt ttggcagcgg aacccacctc accgtcctag 780
gtggacccaa gtcttctccc aaagtcacag gtggttctgg cggcggttct gaaggtggcg 840
gctccgaagg cggcggcagc gagggcggtg gtagcgaagg tggtggctcc gagggtggcg 900
gttccggcgg cggtagccaa ccagatgggc ccaatgcatc cacatgctgc tatgtcaaga 960
aacaaaagat ccccaagagg aatctcaaga gctacagaag gatcaccagt agtcggtgtc 1020
cctgggaagc tgttatcttc aagacaaaga agggcatgga agtctgcgct gaagcccatc 1080
agaagtgggt cgaggaggct atagcatact tagacatgaa aaccccaact ccaaagcctg 1140
aaaacctgta cttccaagga catcatcacc atcaccatta gaagctt 1187
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gggtttaaac atgaactcag gactcaaatt gg 32
<210> 9
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cccaagcttc taatggtgat ggtgatgatg tccttggaag tacaggtttt caggctttgg 60
agttggggtt tt 72
<210> 10
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaggtggtgg ctccgagggt ggcggttccg gcggcggtag ccaaccagat gggcccaatg 60
c 61
<210> 11
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcattgggcc catctggttg gctaccgccg ccggaaccgc caccctcgga gccaccacct 60
t 61
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gggtttaaac atggtgccgc gcgattgcgg ct 32
<210> 13
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cccaagcttc taatggtgat ggtgatgatg tccttggaag tacaggtttt caggctttgg 60
agttggggtt tt 72
<210> 14
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaggtggtgg ctccgagggt ggcggttccg gcggcggtag ccaaccagat gggcccaatg 60
c 61
<210> 15
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gcattgggcc catctggttg gctaccgccg ccggaaccgc caccctcgga gccaccacct 60
t 61

Claims (10)

1.一种PD1抗体与CCL7融合蛋白，其特征在于，所述PD1抗体与CCL7融合蛋白为PD-1抗体蛋白和趋化因子CCL7蛋白融合后的蛋白；其中，
所述PD-1抗体蛋白包括PD-1的单链抗体或PD-1的单克隆抗体；
所述趋化因子CCL7的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，
所述PD-1抗体蛋白和所述趋化因子CCL7之间采用第一接头蛋白连接。
2.根据权利要求1所述的一种PD1抗体与CCL7融合蛋白，其特征在于，所述抗PD-1的单链抗体包括重链可变区和轻链可变区：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
3.根据权利要求2所述的一种PD1抗体与CCL7融合蛋白，其特征在于，所述重链可变区和所述轻链可变区采用第二接头蛋白连接，所述第二接头蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
4.根据权利要求1所述的一种PD1抗体与CCL7融合蛋白，其特征在于，所述第一接头蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
5.根据权利要求1所述的一种PD1抗体与CCL7融合蛋白，其特征在于，所述PD-1的单克隆抗体包括重链可变区、轻链可变区和Fc区，所述Fc区的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
6.根据权利要求1-5任一项所述的一种PD1抗体与CCL7融合蛋白，其特征在于，所述PD-1的单链抗体还包括：
所述单克隆抗体的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的抗体；
或者包括具有与所述重链可变区具有至少80％的同源性的氨基酸序列的重链可变区；和与所述轻链可变区具有至少80％的同源性的氨基酸序列的轻链可变区；
或者所述单克隆抗体的N端和/或C端连接标签得到的抗体。
7.一种编码权利要求1-6任一所述PD1抗体与CCL7融合蛋白的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
8.一种包含权利要求7所述核酸分子的表达载体，其特征在于，所述表达载体能够在原核或者真核宿主细胞中表达所述核酸。
9.一种包含权利要求8所述的表达载体的工程菌或真核宿主细胞。
10.权利要求1-6任一所述的PD1抗体与CCL7融合蛋白或权利要求8所述的表达载体或权利要求9所述的工程菌或真核宿主细胞在制备用于预防、诊断和治疗肿瘤产品中的应用。
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