CN114106108A - 一种多肽-金纳米颗粒复合物、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种多肽‑金纳米颗粒复合物、其制备方法及应用，属于生物材料技术领域。本发明的多肽‑金纳米颗粒复合物是由多肽分子物CPIR28接枝在金纳米颗粒表面形成，其尺寸可控，粒径均一，而且，其在水溶液中具有良好的单分散性及稳定性，可长时间保存。本发明的多肽‑金纳米颗粒复合物具有良好的生物相容性，能够高效介导核酸分子凝聚并实现基因转染，因此适用于DNA的胞内递送。此外，本发明所述多肽‑金纳米颗粒复合物的制备方法简单、温和。

Description

一种多肽-金纳米颗粒复合物、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种多肽-金纳米颗粒复合物、其制备方法及应用。
背景技术
金纳米颗粒(AuNPs)具有良好的生物相容性、独特的光学性质以及易于修饰等特点，一直以来在生物医学领域有着广泛的应用。目前大量的研究致力于构建功能化的AuNPs偶联物，用于实现药物或基因在体内的高效递送。这主要利用了AuNPs表面易与硫醇和胺结合的特点，将生物分子作为表面修饰剂，固定在AuNPs表面，从而赋予AuNPs相应的生物活性，同时实现对其粒径、形貌及表面带电情况的精细调控。其中多肽是最有前景的修饰配体之一，可以通过胺或硫醇基团结合在AuNPs表面。
近年来，人们开发了众多肽-AuNPs偶联物系统，用于实现核酸分子在胞内的递送。例如，利用经典的细胞穿透肽(人免疫缺陷病毒转录激活因子，TAT)对AuNPs进行修饰，得到的TAT-AuNPs能够在非病毒载体很难实现穿透的干细胞中实现基因运输。同样，聚阳离子多肽(如聚赖氨酸)也可以被用于修饰AuNPs，使得AuNPs能够结合基因分子且易于被细胞内化；此外多肽分子中的靶向片段(如RGD)能够帮助复合物实现特异性运输。目前开发的一些体系虽然可以实现实验设计的目标，但是存在反应步骤多，步骤复杂的问题；或者仍需要添加额外的稳定剂，如聚乙烯亚胺(PEI)、柠檬酸钠、聚乙二醇(PEG)等才能确保其复合物体系的稳定性，而稳定剂的存在也可能会导致细胞毒性。因此，开发一种简便、温和的合成方法是十分必要的，使得制备的多肽-AuNPs复合物具有良好的稳定性、尺寸可控且粒径均一的同时，能够作为非病毒基因载体在基因的胞内递送方面发挥作用。
发明内容
本发明提供了一种多肽分子物CPIR28，结构如下所示：
Figure BDA0003373663580000011
多肽分子物CPIR28可以下述序列方式表示：
c(Cys-Arg-Gly-Asp-Lys-Gly-Pro-Asp-Cys)-Gly-Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Gly-Ile-Ile-Ile-Gly-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-NH2；
其中，Cys为半胱氨酸，Arg为精氨酸，Gly为甘氨酸，Asp为天冬氨酸，Lys为赖氨酸，Pro为脯氨酸，Leu为亮氨酸，Ala为丙氨酸，Ile为异亮氨酸。
上述多肽分子物CPIR28中，c(Cys-Arg-Gly-Asp-Lys-Gly-Pro-Asp-Cys)环肽片段具有肿瘤细胞靶向作用，Gly-Pro-Leu-Gly-Leu-Ala片段具有基质金属蛋白酶响应的作用，Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg片段与核酸分子具有高亲和力以及具有细胞膜穿透作用。
上述多肽分子物CPIR28可以作为金纳米颗粒的修饰剂与稳定剂，用于制备多肽-金纳米颗粒复合物。
本发明提供了一种多肽-金纳米颗粒复合物的制备方法，步骤如下：
将多肽分子物CPIR28溶解于水中，形成多肽溶液。加入四氯金酸溶液，搅拌均匀。然后加入硼氢化钠溶液，搅拌3～5min，获得酒红色溶液。将酒红色溶液进行冷冻干燥，获得多肽-金纳米颗粒复合物。
为了使多肽分子物CPIR28均匀修饰在金纳米颗粒表面，在获得酒红色溶液后，可将酒红色溶液置于室温下继续搅拌8～12h，从而获得多肽均匀修饰的酒红色溶液。
在本发明中，酒红色溶液即多肽-金纳米颗粒复合物的溶液。
上述多肽-金纳米颗粒复合物的制备方法中，在获得酒红色溶液后，可对其进行纯化。纯化方法优选地采用透析法。纯化的目的是为了除去未反应的游离的多肽分子物CPIR28。
上述透析法指的是，将酒红色溶液置于透析袋(Mw＝7kDa)中进行透析。透析条件为：室温下，在去离子水中透析48h，期间至少换水8次。为加速透析过程，可将透析过程放置于磁力搅拌器上进行。
上述多肽-金纳米颗粒复合物的制备方法中，水优选为去离子水。
上述多肽-金纳米颗粒复合物的制备方法中，多肽溶液的浓度为0.6～0.7mM。
上述多肽-金纳米颗粒复合物的制备方法中，四氯金酸溶液的浓度为10～50mM。
上述多肽-金纳米颗粒复合物的制备方法中，硼氢化钠溶液的浓度为10～50mM。
上述多肽-金纳米颗粒复合物的制备方法中，多肽溶液、四氯金酸溶液以及硼氢化钠溶液的体积比为1～5:1～5:3～15。
由上述方法制备的多肽-金纳米颗粒复合物是一种新型的基因载体。
多肽分子物CPIR28接枝在金纳米颗粒表面后，使得制备的多肽-金纳米颗粒复合物整体带有高密度正电荷，从而能够高效的与核酸分子结合并介导其凝聚，进而与细胞膜发生相互作用，实现基因分子的胞内递送。此外，该多肽-金纳米颗粒复合物具有良好的生物相容性，因此可以用作基因转染的载体，实现基因转染。
本法明的有益效果为：
本发明的多肽-金纳米颗粒复合物，其尺寸可控，粒径均一，而且，其在水溶液中具有良好的单分散性及稳定性，可长时间保存。本发明的多肽-金纳米颗粒复合物具有良好的生物相容性，能够高效介导核酸分子凝聚并实现基因转染，因此适用于DNA的胞内递送。此外，本发明所述多肽-金纳米颗粒复合物的制备方法简单、温和。
附图说明
图1为多肽-金纳米颗粒复合物的TEM图像；
图2为多肽-金纳米颗粒复合物的紫外吸收光谱；
图3为多肽-金纳米颗粒复合物的尺寸分布图；
图4为多肽-金纳米颗粒复合物的电荷分布图；
图5为多肽-金纳米颗粒复合物的元素分析图；
图6为多肽分子物CPIR28、金纳米颗粒、多肽-金纳米颗粒复合物的红外光谱；
图7为多肽-金纳米颗粒复合物的热重曲线；
图8为多肽-金纳米颗粒复合物介导λDNA凝聚(+/-＝1)的TEM图像；
图9为不同浓度的多肽-金纳米颗粒复合物与CHO细胞共孵育后的死活双染结果图；
图10为多肽-金纳米颗粒复合物的细胞转染图。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明所需试剂的配制：
四氯金酸溶液(HAuCl4，50mM)：用电子天平称取1g四氯金酸三水合物(AuCl4H7O3，99％，Mw＝393.83)，加入50.8mL去离子水，高速搅拌至完全溶解，4℃避光保存备用。其它浓度的四氯金酸溶液亦按照此方法通过改变溶质和溶剂比例来配制。
氢氧化钠溶液(NaOH，16.7mM)：用电子天平称取13.36mg NaOH，加入20mL去离子水溶解，4℃保存备用。其它浓度的氢氧化钠溶液亦按照此方法通过改变溶质和溶剂比例来配制。
硼氢化钠溶液(NaBH4，50mM)：将37.8mg NaBH4溶于20mL NaOH(16.7mM)溶液中，得到50mM NaBH4溶液，置于冰浴中，现用现配。其它浓度的硼氢化钠溶液亦按照此方法通过改变溶质和溶剂比例来配制。
磷酸盐缓冲液(1×PBS)：用电子天平分别称取8g氯化钠(NaCl),0.2g氯化钾(KCl)，2.9g十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O),0.24g磷酸二氢钾(KH2PO4)，置于1L烧杯中，加入800mL去离子水，充分搅拌溶解，加入适量浓盐酸将pH值调节至7.4，然后加入去离子水将溶液定容至1L，备用。
多肽粉末CPIR28(或称“多肽分子物CPIR28”)：购自上海淘普生物科技有限公司，纯度98％。
实施例1
将2mg多肽粉末CPIR28置于10mL干净的EP管中，随后加入1mL去离子水使之充分溶解。向多肽溶液中加入1mL HAuCl4溶液(10mM)，混合均匀。加入3mL的NaBH4溶液(10mM)，剧烈旋涡3min，得到酒红色溶液，表明有金纳米颗粒(AuNPs)的形成。为了获得多肽均匀修饰的多肽-金纳米颗粒复合物(CPIR28-AuNPs复合物)，将上述酒红色溶液置于旋转搅拌器上，在室温下搅拌反应12h，获得CPIR28-AuNPs复合物溶液。
将CPIR28-AuNPs复合物溶液转移至透析袋(Mw＝7kDa)中进行纯化，除去未反应的游离的多肽分子物CPIR28；透析条件为：室温下，在去离子水中透析48h，期间换水8次。将纯化后的多肽-金纳米颗粒复合物溶液进行冷冻干燥，获得CPIR28-AuNPs复合物。
实施例2
多肽-金纳米颗粒复合物的制备：
将10mg多肽粉末CPIR28置于10mL干净的EP管中，随后加入5mL去离子水使之充分溶解。向多肽溶液中加入1mL HAuCl4溶液(50mM)，混合均匀。加入3mL的NaBH4溶液(50mM)，剧烈旋涡3min，得到酒红色溶液，表明有金纳米颗粒(AuNPs)的形成。为了获得多肽均匀修饰的多肽-金纳米颗粒复合物(CPIR28-AuNPs复合物)，将上述酒红色溶液置于旋转搅拌器上，在室温下搅拌反应12h，获得CPIR28-AuNPs复合物溶液。
将CPIR28-AuNPs复合物溶液转移至透析袋(Mw＝7kDa)中进行纯化，除去未反应的游离的多肽分子物CPIR28；透析条件为：室温下，在去离子水中透析48h，期间换水8次。将纯化后的CPIR28-AuNPs复合物溶液储藏于4℃冰箱中，避光保存，作为样品溶液备用。
多肽-金纳米颗粒复合物的鉴定
(1)在干净的封口膜上沉积10μL样品溶液，将碳支持膜置于其上吸附6min，然后用滤纸仔细地擦去膜上多余的液体，利用透射电子显微镜(TEM)对制备的样品进行成像。
多肽-金纳米颗粒复合物的TEM图像如图1所示。由图1可知，多肽-金纳米颗粒复合物的形貌为球型，平均尺寸为4.5±2nm，粒径均一且具有良好的单分散性。
(2)用去离子水将样品溶液稀释10倍进行紫外吸收光谱的测定；并通过ImageJ软件对TEM图像中纳米粒子的粒径进行统计(至少测量100个)。
多肽-金纳米颗粒复合物的紫外吸收光谱如图2所示。由图2可知，在528nm出现了AuNPs的表面等离子体共振(SPR)峰。
多肽-金纳米颗粒复合物的粒径统计结果如图3所示。由图3可知，CPIR28-AuNPs复合物的直径为4.5±2.0nm。
多肽-金纳米颗粒复合物的电荷分布如图4所示。由图4可知，复合物表面带有高密度的正电荷，约为+30.5mV。
综上所述，经过多肽分子物CPIR28的修饰，使得AuNPs具有可控的尺寸，良好的水溶性和单分散性，且表面带有高密度的正电荷，使溶液具有长期稳定性。
(3)将样品溶液均匀地沉积在硅片(1×1cm)上，于60℃烘箱中干燥以加速水分蒸发，反复沉积6次使之在硅片上形成一定厚度，随即利用X射线电子能谱(XPS)仪对样品中元素组成和化学状态进行测试。
元素分析结果如图5所示，其中，图5(a)是XPS元素全谱图，图5(b)是Au4f特征峰谱图，图5(c)是S2p特征峰谱图，图5(d)是N1s特征峰谱图，图5(e)是C1s特征峰谱图，图5(f)是O1s特征峰谱图。由图5可知，结合Au与S元素的光谱，可以证实硫-金键的形成，这表明多肽分子通过巯基吸附在AuNPs表面。
(4)利用真空冷冻干燥法将样品溶液冻干，收集得到的粉末，利用溴化钾压片法测定复合物的红外光谱；同时测定多肽分子物CPIR28和AuNPs的红外光谱。
多肽分子物CPIR28、金纳米颗粒、多肽-金纳米颗粒复合物的红外光谱对比结果如图6所示，由图6可知，多肽-金纳米颗粒复合物的红外光谱中同时出现了两种物质的红外特征峰，这证明了金纳米颗粒表面有多肽分子物的存在。
(5)为确定金纳米颗粒表面的接枝肽数量，将冻干得到的复合物粉末置于氧化铝坩埚中，在流动的氮气气氛下，以10℃/min的升温速率加热(温度范围：40～800℃)，绘制热重曲线。
多肽-金纳米颗粒复合物的热重曲线如图7所示，由图7可知，第二阶段的失重(-17.98％)是由样品中多肽分子的分解导致的，由此计算得出金纳米颗粒表面多肽的含量；通过减去偶联肽分子的质量，进一步计算得出，多肽分子物CPIR28在金纳米颗粒表面的接枝量约为3.3％。
多肽-金纳米颗粒复合物介导λDNA凝聚
将样品溶液与λ-DNA溶液等体积混合，其中，λ-DNA的浓度为10μg/mL，用去离子水稀释样品溶液(依据接枝肽的浓度计算，溶液浓度为13μg/mL)，使其正电荷数目与λ-DNA溶液中负电荷数目的比值(+/-)在0～1范围内。将混合溶液于室温下孵育30min。通过透射电子显微镜对其形貌和粒径进行分析。
试验结果如图8所示。由图8所示的TEM图像可知，多肽-金纳米颗粒复合物介导λDNA发生高效凝聚，形成了CPIR28-AuNPs/λDNA三元复合物，该三元复合物呈纳米颗粒状，尺寸约为52±5nm。
多肽-金纳米颗粒复合物的细胞毒性试验
预先在96孔板中接种100μL中国仓鼠卵巢细胞(CHO)悬液(密度为1×105个/mL),于恒温培养箱(37℃，5％CO2)中培养12h，待细胞贴壁后，移去孔板中的培养基，随后每孔中加入80μL新鲜的培养基(无血清、无双抗)和20μL不同浓度的多肽-金纳米颗粒复合物溶液(0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、20μg/mL)，置于培养箱中继续培养8h。与细胞共孵结束后，移去每孔原有的培养基，每孔加入100μL PBS冲洗细胞三次，最后一次洗涤后不移去PBS；
随后按照吖啶橙/嗅化乙锭(AO/EB)染色试剂盒的说明书，将AO和EB溶液混合，配制染色工作液，之后在每孔中加入适量工作液(按照每毫升PBS中加入20μL工作液)。室温放置10min，用PBS洗去染料，随后于倒置荧光显微镜下观察(AO、EB激发波长：488nm、520nm)。
试验结果如图9所示。由图9可知，与对照组相比，在样品浓度为0.1～10μg/mL之间，绝大部分细胞被吖啶橙(AO)着绿色并呈正常结构，表明材料的细胞相容性良好；仅在浓度为20μg/mL的条件下，少部分细胞被溴乙锭(EB)着色，呈橘红色，表明在较高浓度的处理条件下，该材料才会表现出轻微的细胞毒性。由此可见，多肽-金纳米颗粒复合物对CHO细胞无明显毒性。
多肽-金纳米颗粒复合物的细胞转染实验
预先在96孔板中接种100μL人胚肾细胞(293E)悬液(密度为1×105个/mL)，过夜培养使细胞贴壁；用DMEM分别将pEGFP-N2(0.2μg)和多肽-金纳米颗粒复合物稀释至25μL，室温静置5min。通过设置不同的多肽-金纳米颗粒复合物浓度(依据接枝肽的浓度计算)，使其所带正电荷与质粒所带负电荷比值位于0～1.4之间。将上述两种溶液混合，室温孵育20min，形成CPIR28-AuNPs/pEGFP-N2三元复合物溶液。移去旧培养基，每孔加入100μL DMEM和50μL CPIR28-AuNPs/pEGFP-N2三元复合物溶液，继续孵育4h；小心移去旧培养基，每孔加入100μL含胎牛血清的新鲜培养基，培养24h，在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况(激发波长：488nm)。
试验结果如图10所示；图10展示了在四种电荷比条件下，CPIR28-AuNPs/pEGFP-N2复合物转染HEK293细胞的荧光显微镜图像。其中，图10(a)的电荷比(+/-)为0.2:1，图10(b)的电荷比(+/-)为0.5:1，图10(c)的电荷比(+/-)为0.7:1，图10(d)的电荷比(+/-)为1.4:1。
由图10可知，采用CPIR28-AuNPs/pEGFP-N2三元复合物处理的实验组表现出了有效的基因转染效果，且实验组的转染效果与CPIR28-AuNPs/pEGFP-N2间电荷比呈正相关，随着电荷比的升高，转染效果进一步有所加强。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.多肽分子物CPIR28在金纳米颗粒表面修饰中的应用；其中，所述多肽分子物CPIR28的结构式如下：
Figure FDA0003373663570000011
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，用于制备多肽-金纳米颗粒复合物。
3.一种多肽-金纳米颗粒复合物的制备方法，其特征在于，步骤如下：
将多肽分子物CPIR28溶解于水中，形成多肽溶液；加入四氯金酸溶液，搅拌均匀；然后加入硼氢化钠溶液，搅拌3～5min，获得酒红色溶液；将酒红色溶液进行冷冻干燥，获得多肽-金纳米颗粒复合物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，为了使多肽分子物CPIR28均匀修饰在金纳米颗粒表面，在获得酒红色溶液后，将酒红色溶液置于室温下继续搅拌8～12h，从而获得多肽均匀修饰的酒红色溶液。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，在冷冻干燥之前，对酒红色溶液进行纯化，去除未反应的多肽分子物CPIR28。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述纯化为透析纯化。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，多肽溶液的浓度为0.6～0.7mM；优选地，四氯金酸溶液的浓度为10～50mM；优选地，硼氢化钠溶液的浓度为10～50mM。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，多肽溶液、四氯金酸溶液以及硼氢化钠溶液的体积比为1～5:1～5:3～15。
9.权利要求3～8任一项所述方法制备的多肽-金纳米颗粒复合物。
10.权利要求9所述多肽-金纳米颗粒复合物在基因转染中的应用。
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