CN114105796A - 一种稳定性同位素氘标记异亮氨酸的合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种稳定性同位素氘标记异亮氨酸的合成方法，先以二苯基亚甲基氨基乙腈和氘标记卤代烷基，加入相转移催化剂，进行取代反应制得异亮氨酸中间体，所得异亮氨酸中间体再经两步水解，即得到目标产物。与现有技术相比，本发明公开的合成方法简单，安全，可靠，产品经简单分离提纯后，化学纯度，同位素丰度均在99％以上，可用于蛋白质代谢示踪、食品安全检测、新生儿代谢病筛查等领域。

Description

一种稳定性同位素氘标记异亮氨酸的合成方法
技术领域
本发明属于氘标记异亮氨酸合成技术领域，涉及一种稳定性同位素氘标记异亮氨酸的合成方法。
背景技术
氨基酸(amino acid)是所有生命物质结构的基本构件分子(building-blockmolecule of lives)，其组成的蛋白质(protein)、多肽(polypeptide)以及体内的各种酶(enzyme)在人体内协同作用维持生命体的本质特征。
稳定性同位素标记氨基酸可作为示踪剂和内标物广泛应用于生命科学、药物动力学等诸多领域。合成稳定同位素标记多氨基酸的主要方法有生物合成法和化学合成法，其中生物合成法是在动物、植物、酶或者微生物生理代谢过程中对目标位点进行标记；化学合成法根据常规的化学反应原理，通过使用稳定同位素标记的常规试剂代替非标记的基础试剂，利用化学合成的方法制备标记目标化合物。化学合成法和生物法比较，标记位置可控，原料易得，是制备同位素标记氨基酸的主要方法。
目前标记氨基酸主要是以13C/15N/2H为原料，13C/15N标记氨基酸的原料价格较为昂贵，限制标记氨基酸的广泛使用。2H标记氨基酸原料廉价易得，标记位置可调、原子标记数增加容易。
国外以美国CIL、Sigma公司为代表的同位素公司在同位素标记试剂方面己形成较为完整的技术和产品链，但出于技术保密和产品垄断等原因，有关同位素内标试剂合成的各类技术文献和专利几乎未见完整的报道。异亮氨酸的氘标记同位素合成技术文献鲜有报道。
异亮氨酸属于一种α-氨基酸，其最大的特点是氨基与羧基的α位带有不同的侧链(R基)则为不同的α-氨基酸，常用的合成方法有：
方法一：Strecker法，用带R基的醛与氢氰酸和胺(或氢化铵)发生作用，得到α-氨基氰化物，再生成(±)-氨基酸：
Figure BDA0003405742650000021
方法二：Hell-Volhard-Zelinskyα-溴化法，首先对羧酸的α位进行溴化，然后再与胺进行亲核取代反应，生成氨基酸：
Figure BDA0003405742650000022
方法三：Gabriel法，用卤代酸酯和邻苯二甲酰亚胺钾反应，然后水解，可以生成氨基酸：
Figure BDA0003405742650000023
此三种常用的氨基酸化学合成方法若应用于同位素异亮氨酸的合成，均不易于引入氘原子，尤其是超过3个氘原子。
现有的氘标记的稳定性同位素异亮氨酸的合成技术如下：
英国皇家化学协会[The Royal Society of Chemistry,Perkin Trans.1,2000,3406-3416]。使用(4S,5R)-(-)-4-甲基-5-苯基-2-恶唑啉酮为母体，经过7步反应得到异亮氨酸-D3，过程中涉及强碱低温反应，使用到丁基锂、双氧水、臭氧等危险性高的物质，且合成的为3个氘元素标记的异亮氨酸，现阶段一般要3个以上氘标记才能更好的满足应用要求，具体见下方程式：
Figure BDA0003405742650000024
德国应用化学[Angew.Chem.Int.Ed.2015,54,10474-10477]。利用钌催化剂在重水、氘气体系下，取代异亮氨酸的α位活泼氢，使用化学交换法制取异亮氨酸-D1。此方法用到昂贵的催化剂，且α位氘原子容易稀释，只标记1个氘。见下方程式：
Figure BDA0003405742650000031
发明内容
本发明的目的就是为了提供一种稳定性同位素氘标记异亮氨酸的合成方法，以克服上述合成方法存在的反应条件苛刻、危险、氘标记数量不足、易造成同位素丰度稀释等技术问题中的至少一种。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种稳定性同位素氘标记异亮氨酸的合成方法，先以二苯基亚甲基氨基乙腈和氘标记卤代烷基，加入相转移催化剂，进行取代反应制得异亮氨酸中间体，所得异亮氨酸中间体再经两步水解，即得到目标产物。
进一步的，本发明的目标产物氘标记异亮氨酸的同位素标记位点可以如下结构所示：
Figure BDA0003405742650000032
进一步的，所述的氘标记卤代烷基为氘标记溴代烷基，其化学结构式为R-Br，其中，R基团为CH3CH(CD2CD3)-、CD3CH(CH2CH3)-或CD3CH(CD2CD3)-。
进一步的，氘标记卤代烷基与二苯基亚甲基氨基乙腈的摩尔比控制为0.9～0.97:1，当卤代烷基与二苯基亚甲基氨基乙腈摩尔比例超过1，产率会降低，相转移催化剂为二苯基亚甲基氨基乙腈摩尔用量的10～15％。
进一步的，相转移催化剂可选四丁基氯化铵、三乙基苄基氯化铵等中的至少一种。
进一步的，异亮氨酸中间体依次在浓度为1mol/L、6～8mol/L中的盐酸溶液中搅拌，即完成两步水解。具体的，水解完成后减压浓缩体积，将剩余体积的溶液加入乙醇与乙酸乙酯的混合溶剂中，慢慢析出白色固体即为氘标记的异亮氨酸。
进一步的，取代反应中，滴加完毕溴代烷烃后，先在-10～0℃下反应1～3h，接着在室温下搅拌16～22h。取代反应结束后，往体系中加入二氯甲烷和水，分层取有机相，柱层析获得异亮氨酸中间体。
进一步的，取代反应过程中还加入无机碱水溶液与甲苯的混合溶剂。此处，无机碱水溶液可以为50％的NaOH或KOH溶液，另外，使用的水与甲苯的体积比可大致约为1:1。
进一步的，所述氘标记卤代烷基通过以下方法制备而成：
(1)以乙醇为原料，滴加三卤化磷，控制滴加过程中温度不超过0℃，滴加完毕后室温下反应，所得反应产物分离后，得到卤乙烷；
(2)将镁屑投入装有乙醚的反应器中，再加入所得卤乙烷，氮气保护下，回流反应，得到乙基卤化镁；
(3)将步骤(2)所得到的乙基卤化镁加入乙腈的乙醚溶液中，反应，冷却，分离，得到氘标记的2-丁酮；
(4)氮气保护下，将LiAlH4溶入乙醚中，加入氘标记的2-丁酮的乙醚溶液，反应完成后猝灭反应，所得反应产物分离，得到氘标记的2-丁醇；
(5)往氘标记的2-丁醇中滴加三卤化磷，低温反应，即得到氘标记卤代烷基。
更进一步的，步骤(1)和步骤(2)中，所用乙醇和乙腈中的至少一种采用氘标记。具体的，根据标记的氘原子数量不同可选择为CD3CD2OH、CD3CN的一种或两种。
更进一步的，上述方法各步骤中，三卤化磷可以为PBr3，对应卤乙烷、乙基卤化镁、氘标记卤代烷基等分别对应的为溴乙烷、乙基溴化镁和氘标记溴代烷基。
更进一步的，步骤(2)和步骤(3)中，卤乙烷、镁屑、乙腈的摩尔比为1：(1～1.1)：(0.9～1.1)。另外，具体的，步骤(3)中，分离过程具体为：-10～0℃下，搅拌滴加入酸性水溶液分层，取有机相，蒸馏获得氘标记的2-丁酮。此时，所用酸性水溶液可以为饱和的氯化铵水溶液或3～5M的盐酸溶液，加入时温度不超过0℃。
更进一步的，步骤(4)中，LiAlH4与氘标记的2-丁酮的摩尔比为2～3:1。更具体的，氘标记的2-丁酮的乙醚溶液额度滴加速度不易过快，优选缓慢滴加进入，滴加速度可以不超过1滴/s。
更进一步的，步骤(4)中，猝灭过程所用猝灭试剂为Na2SO4·10H2O，淬灭温度为-10～0℃。
更进一步的，三溴化磷的滴加温度应在-20～0℃。
本发明的工艺路线如下所示：
Figure BDA0003405742650000051
其中，R为CH3CH(CD2CD3)-、CD3CH(CH2CH3)-或CD3CH(CD2CD3)-等。
本发明根据α-氨基酸的由氨基、羧基、取代基R组成的共性结构特点，可以采用乙腈-D3、乙醇-D5等为起始原料，先合成氘标记卤代烷基CH3CH(CD2CD3)Br、CD3CH(CH2CH3)Br、CD3CH(CD2CD3)Br，采用PTC-Alkylation(相转移烷基化)法，以二苯基亚甲基氨基乙腈为关键试剂，同时引入羧基与氨基前体，使用相转移催化剂，将合成的氘标记卤代烷基与其进行取代反应制取异亮氨酸中间体，中间体经两步水解获得标记的异亮氨酸。此方法反应步骤简单，反应条件温和，试剂和溶剂便宜安全，反应规模易于扩大。且此反应最后经水解获得相应氘标记异亮氨酸，无需有机溶剂。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明操作简单，反应条件温和，不涉及易造成丰度稀释的高温高压反应，适用于稳定性同位素的合成。
(2)本发明的技术途径选择先合成标记的氨基酸R基，标记位置氢氘化学环境稳定不易稀释、标记数量可控，满足质量数差3以上。
(3)本发明获得的异亮氨酸同位素产品的丰度、纯度均在99％以上，满足实际应用价值。
附图说明
图1为实施例1的工艺流程图；
图2为实施例2的工艺流程图；
图3为实施例3的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下各实施例中，如无特别说明的原料或处理技术，则表明其均为本领域的常规市售原料或常规处理技术。
实施例1：
异亮氨酸-D3的合成，其工艺路线参见图1所示，具体包括以下步骤：
(1.1)2-丁酮-D3的合成：取2.83g(120mmol)镁投放入事先装置好的三口烧瓶中，加入20mL的无水乙醚，氮气保护下，将12.9g(120mmol)的2-溴乙烷溶解在20mL的乙醚中，在室温条件下滴加进入反应瓶，约5min反应引发，溶液开始回流，使滴加液体速度刚好保持溶液回流，滴加完毕后回流6h，反应完毕生成EtMgBr。
氮气保护下，取10mL(19mmol)乙腈-D3投入50mL的干燥乙醚中，-5℃下，注射器缓缓将EtMgBr(20mmol)滴加入上述溶液，滴加完毕后33℃回流4h(回流即在溶剂沸腾温度下进行)，接着在-10℃下，缓缓加入饱和的氯化铵水溶液，分层，30mL乙醚萃取3次，收集有机相，干燥有机相，蒸馏获得6.9g 2-丁酮-D3，收率47％。
(1.2)2-丁醇-D3的合成：取4.25g(112mmol)LiAlH4-10℃下加入80mL的无水乙醚中，取3.75g(50mmol)的2-丁酮-D3溶解在30mL的乙醚中缓慢滴加到上述溶液，滴加完毕后保持反应6h，反应结束后投入Na2SO4·10H2O淬灭，抽滤，加入无水硫酸钠干燥，旋转蒸发得到产物，气质检测。获得2.2g 2-丁醇-D3，收率57％。
(1.3)2-溴丁烷-D3的合成：-10℃下，向装有2.85g的2-丁醇-D3(37.5mmol)中三口烧瓶(10mL乙醚)滴加10g PBr3(37.5mmol)，保持-10℃反应3h后转至室温反应20h，蒸馏获得1.6g产物，收率31％。
(1.4)异亮氨酸中间体合成：在100mL两口烧瓶中，加入6.25g(30mmol)二苯基亚甲基氨基乙腈和1.08g(4.5mmol)TEBAC(即三乙基苄基氯化铵)，然后加入15mL 50wt％NaOH溶液与12mL甲苯，置于-10℃中，滴加3.9g(28mmol)2-溴丁烷-D3和3mL甲苯的混合液。滴加完毕后-10℃反应2h，常温下搅拌反应18h，TLC确认原料完全反应完全后。反应液倒入60mLCH2Cl2与80mL水两相，分离有机相，无水Na2SO4干燥，过滤，旋干，乙酸乙酯/正己烷＝1/90柱层析，获得3.24g的异亮氨酸-D3中间体，收率41％。
(1.5)异亮氨酸-D3的合成：将3.24g(11.6mmol)的异亮氨酸-D3中间体投入60mL 1M的稀盐酸与30mL乙醚的混合溶液中，剧烈搅拌12h，取水相，乙醚萃取三次，水相中加入60mL浓盐酸调节其浓度为7M，100℃下回流12h，反应结束后，浓缩大量水，加入大量乙酸乙酯与少量甲醇溶液析出固体，抽滤。获得1.0g异亮氨酸-D3，收率58％。
实施例2：
异亮氨酸-D5的合成，其工艺路线参见图2所示，具体包括以下步骤：
(2.1)2-溴乙烷-D5的合成：-10℃下，向装有25.1g(500mmol)的乙醇-D5中三口烧瓶滴加135g PBr3(500mmol)，-10℃下反应3h后转至室温反应20h，蒸馏获得23g产物，收率41％。
(2.2)2-丁酮-D5的合成：取2.83g(120mmol)镁投放入事先装置好的三口烧瓶中，加入20mL的无水乙醚，氮气保护下，将13.6g(120mmol)的2-溴乙烷-D5溶解在20mL的乙醚中，在室温条件下滴加进入反应瓶，约5min反映引发，溶液开始回流，使滴加液体速度刚好保持溶液回流，滴加完毕后回流6h，反应结束得到EtMgBr-D5。
氮气保护下，取11mL(21mmol)乙腈投入50mL的干燥乙醚中，-10℃下，注射器缓缓将EtMgBr-D5(20mmol)滴加入上述溶液，滴加完毕后回流4h，-5℃下，缓缓加入3M的盐酸水溶液，分层，30mL乙醚萃取3次，收集有机相，干燥有机相，蒸馏获得7.4g 2-丁酮-D5，收率48％。
(2.3)2-丁醇-D5的合成：取4.25g(112mmol)LiAlH4-5℃下加入80mL的无水乙醚中，取3.85g(50mmol)的2-丁酮-D5溶解在30mL的乙醚中缓慢滴加到上述溶液，滴加完毕后保持反应6h，反应结束后Na2SO4·10H2O淬灭，抽滤，加入无数硫酸钠干燥，旋转蒸发得到产物，气质检测。获得1.9g 2-丁醇-D5，收率49％。
(2.4)2-溴丁烷-D5的合成：-10℃下，向装有2.9g的2-丁醇-D5(37.5mmol)中三口烧瓶(10mL乙醚)滴加10g PBr3(37.5mmol)，-10℃下反应3h后转至室温反应18h，蒸馏获得1.6g产物，收率30％。
(2.5)异亮氨酸中间体合成：在100mL两口烧瓶中，加入6.25g(30mmol)二苯基亚甲基氨基乙腈和0.834g(3mmol)四丁基氯化铵，然后加入15mL 50％(质量分数)的KOH溶液与12mL甲苯，置于-10℃中，滴加3.9g(28mmol)2-溴丁烷-D5和3mL甲苯的混合液。滴加完毕后反应2h，常温下搅拌反应18h，TLC确认原料完全反应完全后。反应液倒入60mL CH2Cl2与80mL水两相，分离有机相，无水Na2SO4干燥，过滤，旋干，乙酸乙酯/正己烷＝1/90柱层析，获得3.0g的异亮氨酸中间体，收率38％。
(2.6)异亮氨酸-D5的合成：将3.0g(11mmol)的异亮氨酸中间体投入60mL1M的稀盐酸与30mL乙醚的混合溶液中，剧烈搅拌12h，取水相，乙醚萃取三次，水相中加入60mL浓盐酸调节其浓度为6M，100℃下回流12h，反应结束后，浓缩大量水，加入大量乙酸乙酯与少量甲醇溶液析出固体，抽滤。获得1.3g异亮氨酸-D5，收率78％。
实施例3：
异亮氨酸-D8的合成，其工艺路线参见图3所示，具体包括以下步骤：
(3.1)2-溴乙烷-D5的合成：-10℃下，向装有25.1g(500mmol)的乙醇-D5中三口烧瓶滴加135g PBr3(500mmol)，-10℃下反应3h后转至室温反应20h，蒸馏获得23g产物，收率41％。
(3.2)2-丁酮-D8的合成：取2.83g(120mmol)镁投放入事先装置好的三口烧瓶中，加入20mL的无水乙醚，氮气保护下，将13.6g(120mmol)的2-溴乙烷-D5溶解在20mL的乙醚中，在室温条件下滴加进入反应瓶，约5min反映引发，溶液开始回流，使滴加液体速度刚好保持溶液回流，滴加完毕后回流6h，反应结束得到EtMgBr-D5。
氮气保护下，取10.5mL(20mmol)乙腈-D3投入50mL的干燥乙醚中，-10℃下，注射器缓缓将EtMgBr-D5(20mmol)滴加入上述溶液，滴加完毕后33℃回流4h，接着在-5℃下，缓缓加入饱和的氯化铵水溶液，分层，30mL乙醚萃取3次，收集有机相，干燥有机相，蒸馏获得6.9g 2-丁酮-D8，收率46％。
(3.3)2-丁醇-D8的合成：取4.25g(112mmol)LiAlH4-10℃下加入80mL的无水乙醚中，取4g(50mmol)的2-丁酮-D8溶解在30mL的乙醚中缓慢滴加到上述溶液，滴加完毕后保持反应6h，反应结束后Na2SO4·10H2O淬灭，抽滤，加入无数硫酸钠干燥，旋转蒸发得到产物，气质检测。获得2g 2-丁醇-D8，收率50％。
(3.4)2-溴丁烷-D8的合成：-10℃下，向装有3g的2-丁醇-D8(37.5mmol)中三口烧瓶(10mL乙醚)滴加10g PBr3(37.5mmol)，低温反应3h后转至室温反应20h，蒸馏获得1.8g产物，收率33％。
(3.5)异亮氨酸中间体合成：在100mL两口烧瓶中，加入6.25g(30mmol)二苯基亚甲基氨基乙腈和0.725g(3mmol)TEBAC，然后加入15mL 50％NaOH溶液与12mL甲苯，置于-10℃中，滴加4.0g(28mmol)2-溴丁烷-D8和3mL甲苯的混合液。滴加完毕后反应2h，常温下搅拌反应18h，TLC确认原料完全反应完全后。反应液倒入60mL CH2Cl2与80mL水两相，分离有机相，无水Na2SO4干燥，过滤，旋干，乙酸乙酯/正己烷＝1/90柱层析，获得3.04g的异亮氨酸中间体，收率38％。
(3.6)异亮氨酸的合成：将3.04g(11mmol)的异亮氨酸中间体投入60mL 1N的稀盐酸与30mL乙醚的混合溶液中，剧烈搅拌12h，取水相，乙醚萃取三次，水相中加入60mL浓盐酸，回流12h，反应结束后，浓缩大量水，加入大量乙酸乙酯与少量甲醇溶液析出固体，抽滤。获得1.2g异亮氨酸-D8，收率71％。
对比例1：
与实施例1相比，绝大部分都相同，除了将2-溴丁烷-D3与二苯基亚甲基氨基乙腈的摩尔用量改为1.1:1，氨基酸中间体收率明显下降(41％～33％)。
(1.1)2-丁酮-D3的合成：取2.83g(120mmol)镁投放入事先装置好的三口烧瓶中，加入20mL的无水乙醚，氮气保护下，将12.9g(120mmol)的2-溴乙烷溶解在20mL的乙醚中，在室温条件下滴加进入反应瓶，约5min反应引发，溶液开始回流，使滴加液体速度刚好保持溶液回流，滴加完毕后回流6h，反应完毕生成EtMgBr。
氮气保护下，取10mL(19mmol)乙腈-D3入50mL的干燥乙醚中，-5℃下，注射器缓缓将EtMgBr(20mmol)滴加入上述溶液，滴加完毕后33℃回流4h，接着在-10℃下，缓缓加入饱和的氯化铵水溶液，分层，30mL乙醚萃取3次，收集有机相，干燥有机相，蒸馏获得6.9g 2-丁酮-D3，收率47％。
(1.2)2-丁醇-D3的合成：取4.25g(112mmol)LiAlH4-10℃下加入80mL的无水乙醚中，取3.75g(50mmol)的2-丁酮-D3溶解在30mL的乙醚中缓慢滴加到上述溶液，滴加完毕后保持反应6h，反应结束后投入Na2SO4·10H2O淬灭，抽滤，加入无水硫酸钠干燥，旋转蒸发得到产物，气质检测。获得2.2g 2-丁醇-D3，收率57％。
(1.3)2-溴丁烷-D3的合成：-10℃下，向装有2.85g的2-丁醇-D3(37.5mmol)中三口烧瓶(10mL乙醚)滴加10g PBr3(37.5mmol)，保持-10℃反应3h后转至室温反应20h，蒸馏获得1.6g产物，收率31％。
(1.4)异亮氨酸中间体合成：在100mL两口烧瓶中，加入6.25g(30mmol)二苯基亚甲基氨基乙腈和1.08g(4.5mmol)TEBAC(即三乙基苄基氯化铵)，然后加入15mL 50wt％NaOH溶液与12mL甲苯，置于-10℃中，滴加4.6g(33mmol)2-溴丁烷-D3和3mL甲苯的混合液。滴加完毕后-10℃反应2h，常温下搅拌反应18h，TLC确认原料完全反应完全后。反应液倒入60mLCH2Cl2与80mL水两相，分离有机相，无水Na2SO4干燥，过滤，旋干，乙酸乙酯/正己烷＝1/90柱层析，获得2.6g的异亮氨酸-D3中间体，收率33％。
(1.5)异亮氨酸-D3的合成：将3.24g(11.6mmol)的异亮氨酸-D3中间体投入60mL 1M的稀盐酸与30mL乙醚的混合溶液中，剧烈搅拌12h，取水相，乙醚萃取三次，水相中加入60mL浓盐酸调节其浓度为7M，100℃下回流12h，反应结束后，浓缩大量水，加入大量乙酸乙酯与少量甲醇溶液析出固体，抽滤。获得1.0g异亮氨酸-D3，收率58％。
对比例2：
与实施例1相比，绝大部分都相同，除了调节LiAlH4的添加量，使得LiAlH4与氘标记的2-丁酮的摩尔比为1:1，产物收率明显下降(57％～34％)。
异亮氨酸-D3的合成，其工艺路线参见图1所示，具体包括以下步骤：
(2.1)2-丁酮-D3的合成：取2.83g(120mmol)镁投放入事先装置好的三口烧瓶中，加入20mL的无水乙醚，氮气保护下，将12.9g(120mmol)的2-溴乙烷溶解在20mL的乙醚中，在室温条件下滴加进入反应瓶，约5min反应引发，溶液开始回流，使滴加液体速度刚好保持溶液回流，滴加完毕后回流6h，反应完毕生成EtMgBr。
氮气保护下，取10mL(19mmol)乙腈-D3投入50mL的干燥乙醚中，-5℃下，注射器缓缓将EtMgBr(20mmol)滴加入上述溶液，滴加完毕后33℃回流4h，接着在-10℃下，缓缓加入饱和的氯化铵水溶液，分层，30mL乙醚萃取3次，收集有机相，干燥有机相，蒸馏获得6.9g 2-丁酮-D3，收率47％。
(2.2)2-丁醇-D3的合成：取1.9g(50mmol)LiAlH4-10℃下加入80mL的无水乙醚中，取3.75g(50mmol)的2-丁酮-D3溶解在30mL的乙醚中缓慢滴加到上述溶液，滴加完毕后保持反应6h，反应结束后投入Na2SO4·10H2O淬灭，抽滤，加入无水硫酸钠干燥，旋转蒸发得到产物，气质检测。获得1.3g 2-丁醇-D3，收率34％。
(2.3)2-溴丁烷-D3的合成：-10℃下，向装有2.85g的2-丁醇-D3(37.5mmol)中三口烧瓶(10mL乙醚)滴加10g PBr3(37.5mmol)，保持-10℃反应3h后转至室温反应20h，蒸馏获得1.6g产物，收率31％。
(2.4)异亮氨酸中间体合成：在100mL两口烧瓶中，加入6.25g(30mmol)二苯基亚甲基氨基乙腈和1.08g(4.5mmol)TEBAC(即三乙基苄基氯化铵)，然后加入15mL 50wt％NaOH溶液与12mL甲苯，置于-10℃中，滴加3.9g(28mmol)2-溴丁烷-D3和3mL甲苯的混合液。滴加完毕后-10℃反应2h，常温下搅拌反应18h，TLC确认原料完全反应完全后。反应液倒入60mLCH2Cl2与80mL水两相，分离有机相，无水Na2SO4干燥，过滤，旋干，乙酸乙酯/正己烷＝1/90柱层析，获得3.24g的异亮氨酸-D3中间体，收率41％。
(2.5)异亮氨酸-D3的合成：将3.24g(11.6mmol)的异亮氨酸-D3中间体投入60mL 1M的稀盐酸与30mL乙醚的混合溶液中，剧烈搅拌12h，取水相，乙醚萃取三次，水相中加入60mL浓盐酸调节其浓度为7M，100℃下回流12h，反应结束后，浓缩大量水，加入大量乙酸乙酯与少量甲醇溶液析出固体，抽滤。获得1.0g异亮氨酸-D3，收率58％。
实施例4：
异亮氨酸-D3的合成，其工艺路线参见图1所示，具体包括以下步骤：
(4.1)2-丁酮-D3的合成：取3.17g(132mmol)镁投放入事先装置好的三口烧瓶中，加入20mL的无水乙醚，氮气保护下，将12.9g(120mmol)的2-溴乙烷溶解在20mL的乙醚中，在室温条件下滴加进入反应瓶，约5min反应引发，溶液开始回流，使滴加液体速度刚好保持溶液回流，滴加完毕后回流6h，反应完毕生成EtMgBr。
氮气保护下，取10mL(19mmol)乙腈-D3投入50mL的干燥乙醚中，-5℃下，注射器缓缓将EtMgBr(21mmol)滴加入上述溶液，滴加完毕后33℃回流4h，接着在-10℃下，缓缓加入饱和的氯化铵水溶液，分层，30mL乙醚萃取3次，收集有机相，干燥有机相，蒸馏获得7.1g 2-丁酮-D3，收率48％。
(4.2)2-丁醇-D3的合成：取4.25g(112mmol)LiAlH4-10℃下加入80mL的无水乙醚中，取3.75g(50mmol)的2-丁酮-D3溶解在30mL的乙醚中缓慢滴加到上述溶液，滴加完毕后保持反应6h，反应结束后投入Na2SO4·10H2O淬灭，抽滤，加入无水硫酸钠干燥，旋转蒸发得到产物，气质检测。获得2.2g 2-丁醇-D3，收率57％。
(4.3)2-溴丁烷-D3的合成：-10℃下，向装有2.85g的2-丁醇-D3(37.5mmol)中三口烧瓶(10mL乙醚)滴加10g PBr3(37.5mmol)，保持-10℃反应3h后转至室温反应20h，蒸馏获得1.6g产物，收率31％。
(4.4)异亮氨酸中间体合成：在100mL两口烧瓶中，加入6.25g(30mmol)二苯基亚甲基氨基乙腈和1.08g(4.5mmol)TEBAC(即三乙基苄基氯化铵)，然后加入15mL 50wt％NaOH溶液与12mL甲苯，置于-10℃中，滴加3.9g(28mmol)2-溴丁烷-D3和3mL甲苯的混合液。滴加完毕后-10℃反应2h，常温下搅拌反应18h，TLC确认原料完全反应完全后。反应液倒入60mLCH2Cl2与80mL水两相，分离有机相，无水Na2SO4干燥，过滤，旋干，乙酸乙酯/正己烷＝1/90柱层析，获得3.20g的异亮氨酸-D3中间体，收率41％。
(4.5)异亮氨酸-D3的合成：将3.24g(11.6mmol)的异亮氨酸-D3中间体投入60mL 1M的稀盐酸与30mL乙醚的混合溶液中，剧烈搅拌12h，取水相，乙醚萃取三次，水相中加入60mL浓盐酸调节其浓度为7M，100℃下回流12h，反应结束后，浓缩大量水，加入大量乙酸乙酯与少量甲醇溶液析出固体，抽滤。获得1.1g异亮氨酸-D3，收率65％。
实施例5：
异亮氨酸-D3的合成，其工艺路线参见图1所示，具体包括以下步骤：
(5.1)2-丁酮-D3的合成：取2.83g(120mmol)镁投放入事先装置好的三口烧瓶中，加入20mL的无水乙醚，氮气保护下，将12.9g(120mmol)的2-溴乙烷溶解在20mL的乙醚中，在室温条件下滴加进入反应瓶，约5min反应引发，溶液开始回流，使滴加液体速度刚好保持溶液回流，滴加完毕后回流6h，反应完毕生成EtMgBr。
氮气保护下，取10mL(19mmol)乙腈-D3投入50mL的干燥乙醚中，-5℃下，注射器缓缓将EtMgBr(20mmol)滴加入上述溶液，滴加完毕后33℃回流4h，接着在-10℃下，缓缓加入饱和的氯化铵水溶液，分层，30mL乙醚萃取3次，收集有机相，干燥有机相，蒸馏获得7.0g 2-丁酮-D3，收率48％。
(5.2)2-丁醇-D3的合成：取5.70g(150mmol)LiAlH4-10℃下加入80mL的无水乙醚中，取3.75g(50mmol)的2-丁酮-D3溶解在30mL的乙醚中缓慢滴加到上述溶液，滴加完毕后保持反应6h，反应结束后投入Na2SO4·10H2O淬灭，抽滤，加入无水硫酸钠干燥，旋转蒸发得到产物，气质检测。获得2.4g 2-丁醇-D3，收率62％。
(5.3)2-溴丁烷-D3的合成：-10℃下，向装有2.85g的2-丁醇-D3(37.5mmol)中三口烧瓶(10mL乙醚)滴加10g PBr3(37.5mmol)，保持-10℃反应3h后转至室温反应20h，蒸馏获得1.65g产物，收率32％。
(5.4)异亮氨酸中间体合成：在100mL两口烧瓶中，加入6.25g(30mmol)二苯基亚甲基氨基乙腈和1.08g(4.5mmol)TEBAC(即三乙基苄基氯化铵)，然后加入15mL 50wt％NaOH溶液与12mL甲苯，置于-10℃中，滴加3.9g(28mmol)2-溴丁烷-D3和3mL甲苯的混合液。滴加完毕后-10℃反应2h，常温下搅拌反应18h，TLC确认原料完全反应完全后。反应液倒入60mLCH2Cl2与80mL水两相，分离有机相，无水Na2SO4干燥，过滤，旋干，乙酸乙酯/正己烷＝1/90柱层析，获得3.27g的异亮氨酸-D3中间体，收率42％。
(5.5)异亮氨酸-D3的合成：将3.24g(11.6mmol)的异亮氨酸-D3中间体投入60mL 1M的稀盐酸与30mL乙醚的混合溶液中，剧烈搅拌12h，取水相，乙醚萃取三次，水相中加入60mL浓盐酸调节其浓度为7M，100℃下回流12h，反应结束后，浓缩大量水，加入大量乙酸乙酯与少量甲醇溶液析出固体，抽滤。获得1.0g异亮氨酸-D3，收率58％。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种稳定性同位素氘标记异亮氨酸的合成方法，其特征在于，先以二苯基亚甲基氨基乙腈和氘标记卤代烷基，加入相转移催化剂，进行取代反应制得异亮氨酸中间体，所得异亮氨酸中间体再经两步水解，即得到目标产物。
2.根据权利要求1所述的一种稳定性同位素氘标记异亮氨酸的合成方法，其特征在于，所述的氘标记卤代烷基为氘标记溴代烷基，其化学结构式为R-Br，其中，R基团为CH3CH(CD2CD3)-、CD3CH(CH2CH3)-或CD3CH(CD2CD3)-；
所述相转移催化剂为四丁基氯化铵、三乙基苄基氯化铵中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的一种稳定性同位素氘标记异亮氨酸的合成方法，其特征在于，氘标记卤代烷基与二苯基亚甲基氨基乙腈的摩尔比控制为0.9～0.97:1，相转移催化剂为二苯基亚甲基氨基乙腈摩尔用量的10～15％。
4.根据权利要求1所述的一种稳定性同位素氘标记异亮氨酸的合成方法，其特征在于，异亮氨酸中间体依次在浓度为1mol/L、6～8mol/L中的盐酸溶液中搅拌，即完成两步水解。
5.根据权利要求1所述的一种稳定性同位素氘标记异亮氨酸的合成方法，其特征在于，取代反应中，先在-10～0℃下反应1～3h，接着在室温下搅拌16～22h。
6.根据权利要求1所述的一种稳定性同位素氘标记异亮氨酸的合成方法，其特征在于，取代反应过程中还加入无机碱水溶液与甲苯的混合溶剂。
7.根据权利要求1所述的一种稳定性同位素氘标记异亮氨酸的合成方法，其特征在于，所述氘标记卤代烷基通过以下方法制备而成：
(1)以乙醇为原料，滴加三卤化磷，控制滴加过程中温度不超过0℃，滴加完毕后室温下反应，所得反应产物分离后，得到卤乙烷；
(2)将镁屑投入装有乙醚的反应器中，再加入所得卤乙烷，氮气保护下，回流反应，得到乙基卤化镁；
(3)将步骤(2)所得到的乙基卤化镁加入乙腈的乙醚溶液中，反应，冷却，分离，得到氘标记的2-丁酮；
(4)氮气保护下，将LiAlH4溶入乙醚中，加入氘标记的2-丁酮的乙醚溶液，反应完成后猝灭反应，所得反应产物分离，得到氘标记的2-丁醇；
(5)往氘标记的2-丁醇中滴加三卤化磷，低温反应，即得到氘标记卤代烷基。
8.根据权利要求7所述的一种稳定性同位素氘标记异亮氨酸的合成方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中，所用乙醇和乙腈中的至少一种采用氘标记。
9.根据权利要求7所述的一种稳定性同位素氘标记异亮氨酸的合成方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中，卤乙烷、镁屑、乙腈的摩尔比为1：(1～1.1)：(0.9～1.1)。
10.根据权利要求7所述的一种稳定性同位素氘标记异亮氨酸的合成方法，其特征在于，步骤(4)中，LiAlH4与氘标记的2-丁酮的摩尔比为2～3:1；
猝灭过程所用猝灭试剂为Na2SO4·10H2O，淬灭温度为-10～0℃。
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