CN114097618A - 一种西瓜小对叶组培一步成苗培养基及一步成苗方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物培养技术领域，具体涉及一种西瓜小对叶组培一步成苗培养基及一步成苗方法。培养基包括如下组分：基本培养基、6‑苄氨基嘌呤(6‑BA)、1‑萘乙酸(NAA)、小球藻生长因子。本发明采用含有小球藻生长因子的培养基对西瓜小对叶组培一步成苗，可以促进无菌外植体继代苗茎叶生长，提高增殖系数，长势良好，缩短育苗周期。

Description

一种西瓜小对叶组培一步成苗培养基及一步成苗方法
技术领域
本发明涉及植物培养技术领域，具体涉及一种西瓜小对叶组培一步成苗培养基及一步成苗方法。
背景技术
西瓜小对叶(Bacopa monnieri)，分布于非洲、亚洲、澳洲、美国等热带或亚热带地区，茎为绿色至咖啡色变化，茎节上会长出十字对生的卵形叶，卵形叶为深绿色，且叶质地较厚属于挺水性类中后景类水草水草。其常见的繁殖方式为侧芽插枝方式，这些常规的繁殖方法繁殖系数低，培养周期较长，而且不易获得大量的植株。采用组织培养的方式可以快速繁殖种苗，且繁殖的种苗具有不带病毒、生长一致等优点，从而使种苗生产达到规模化、标准化和工厂化的目标。
小球藻(Chlorella)是一种常见的单细胞绿藻，是产业化生产的主要微藻种类，拥有重要经济价值和巨大的开发前景。小球藻每20h能增殖4倍，主要是由于小球藻的生长因子决定的。小球藻生长因子(Chlorella Growth Factor)简写CGF，它可以促进小球藻细胞的生长、分裂和繁殖，是小球藻的独有细胞内生物活性成分。包括多糖、多肽、蛋白质、维生素、植物激素等，被称为“类荷尔蒙”。有实验表明，适宜浓度的小球藻生长因子提取物能显著地促进几种蔬菜种子的萌发。将小球藻提取物液稀释后喷洒在果蔬叶片上能以增强光合作用并促进根系生长，并已在实验室和大田种植方面获得了广泛的研究。以西瓜小对叶为研究对象，探讨小球藻活性提取物对西瓜小对叶组培苗组培快繁的影响，为小球藻生长因子在西瓜小对叶组织培养中的推广应用提供新的思路。
发明内容
针对现有技术的西瓜小对叶繁殖周期长等问题，本发明提供一种西瓜小对叶组培一步成苗培养基及一步成苗方法，采用含小球藻生长因子的培养基培养可促进西瓜小对叶组培苗生长，缩短繁殖周期。
第一方面，本发明提供一种西瓜小对叶组培一步成苗培养基，包括如下组分：基本培养基、6-苄氨基嘌呤(6-BA)、1-萘乙酸(NAA)、小球藻生长因子。
进一步的，基本培养基为1/2MS培养基。
进一步的，6-苄氨基嘌呤在培养基中的浓度为0.2mg/L，1-萘乙酸在培养基中的浓度为0.1mg/L，小球藻生长因子在培养基中的体积浓度为1％-5％。
进一步的，小球藻生长因子的制备方法如下：
(1)按1：10比例接种蛋白核小球藻至锥形瓶中，所用的培养基为BG11培养基，28℃光照连续培养，每天在显微镜下血球板计数，直至达到密度≥107CFU/ml；
(2)取生长状态良好的藻液20ml在4000r/min离心10min，收集藻泥沉淀，弃去上清，用无菌水离心洗涤沉淀；
(3)沉淀用无菌水100ml稀释置于高压锅中，120℃加热萃取20min，取出后在室温下自然冷却，过滤沉淀留上清液，得到含小球藻生长因子的提取液。
进一步的，步骤(2)藻液中血球板计数为3.5×107个/ml。
第二方面，本发明提供西瓜小对叶组培一步成苗方法，具体为：将西瓜小对叶外植体接种到权利要求1所述的一步成苗培养基上进行增殖培养。
进一步的，西瓜小对叶外植体通过以下方法得到：选用0.5-1cm的茎段，用洗洁精水浸泡10-15min，流水下冲洗，然后在超净工作台上用75％酒精消毒15s，再用0.1％HgCl2表面灭菌2.5min，无菌水冲洗4-5次，即得。
进一步的，增殖培养方法如下：培养温度为25±1℃，每天光照时间12h，光照强度在1500lx-2000lx。
本发明的原理为：传统的组织培养的步骤一般是先诱导出愈伤组织，通过继代，建立能传代的愈伤组织体系，然后诱导生芽、生根，形成完整幼苗。本发明所述的西瓜小对叶组培一步成苗法为外植体在形成愈伤组织后，不需要转移到分化培养基上，而是直接在原培养基上分化，分化的顺序通常是先根后芽，直至形成健壮的全苗，可在本发明所述培养基上直接分化出可移栽苗，小球藻生长因子可以促进无菌草莓继代苗茎叶生长，提高增殖系数，长势良好，缩短育苗周期，简化了育苗程序，提高了培养效率。
本发明采用小球藻生长因子可促进西瓜小对叶组培苗生长，作用机制来源于小球藻生长因子内含有多肽、多糖等生物活性物质，具有活化细胞，促进细胞生长和分裂的作用，可见其在组培领域具有良好的开发前景。
本发明的有益效果在于，本发明采用含有小球藻生长因子的培养基对西瓜小对叶组培一步成苗，可以促进无菌外植体继代苗茎叶生长，提高增殖系数，长势良好，缩短育苗周期。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1-5中，西瓜小对叶组培一步成苗培养基包括如下浓度的组分，基本培养基为1/2MS培养基，6-苄氨基嘌呤在培养基中的浓度为0.2mg/L，1-萘乙酸在培养基中的浓度为0.1mg/L，小球藻生长因子在培养基中的体积浓度如表1所示。
其中实施例1-5中，小球藻生长因子制备方法如下：
(1)按1：10比例接种蛋白核小球藻至锥形瓶中，所用的培养基为BG11培养基，28℃光照连续培养，每天在显微镜下血球板计数，直至密度≥107CFU/ml；
(2)取生长状态良好的藻液20ml在4000r/min离心10min，藻液中血球板计数为3.5×107个/ml，收集藻泥沉淀，弃去上清，用无菌水离心洗涤沉淀；
(3)沉淀用无菌水100ml稀释置于高压锅中，120℃加热萃取20min，取出后在室温下自然冷却，过滤沉淀留上清液，得到含小球藻生长因子的提取液。
实施例1-5中，西瓜小对叶组培一步成苗方法，具体为：将西瓜小对叶外植体接种对应实施例制备的一步成苗培养基上进行增殖培养。西瓜小对叶外植体通过以下方法得到：选用0.5-1cm的茎段，用洗洁精水浸泡10-15min，流水下冲洗，然后在超净工作台上用75％酒精消毒15s，再用0.1％HgCl2表面灭菌2.5min，无菌水冲洗4-5次，即得。增殖培养方法如下：培养温度为25±1℃，每天光照时间12h，光照强度在1800lx。
对比例
对比例与实施例1-5不同的是，所述一步成苗培养基中，小球藻生长因子在培养基中的体积浓度为0％。
实施例及对比例对西瓜小对叶组培增殖效果如表1所示。
表1实施例及对比例小球藻生长因子对西瓜小对叶组培继代结果。
Figure BDA0003413078830000041
Figure BDA0003413078830000051
由表1可以看出，添加小球藻生长因子的培养基对西瓜小对叶组培苗的增殖效果均明显优于对比例，其中浓度为3％时增殖效果比1％、2％更好，浓度为4％、5％的增殖系数虽然继续增大但与3％的培养基相差不大，继续提高小球藻生长因子浓度对增殖系数的增加不明显。对比例没有添加小球藻生长因子，没有生根。
添加小球藻生长因子处理的整体长势较对照更旺盛，叶片大而厚，茎粗壮。在浓度1％-5％的范围内，随着生长因子的浓度提高，组培苗的高度也随之增加，叶片颜色逐渐加重，茎段越来越粗壮。但是浓度超过4％时，茎段过于粗壮，叶片数量增多且有变小成团成簇的趋势，因此综合茎叶均匀、生长正常方面，最优选浓度为3％。
尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种西瓜小对叶组培一步成苗培养基，其特征在于，包括如下组分：基本培养基、6-苄氨基嘌呤、1-萘乙酸、小球藻生长因子。
2.如权利要求1所述西瓜小对叶组培一步成苗培养基，其特征在于，基本培养基为1/2MS培养基。
3.如权利要求1所述西瓜小对叶组培一步成苗培养基，其特征在于，6-苄氨基嘌呤在培养基中的浓度为0.2mg/L，1-萘乙酸在培养基中的浓度为0.1mg/L，小球藻生长因子在培养基中的体积浓度为1％-5％。
4.如权利要求1所述西瓜小对叶组培一步成苗培养基，其特征在于，小球藻生长因子的制备方法如下：
(1)按1：10比例接种蛋白核小球藻至锥形瓶中，所用的培养基为BG11培养基，28℃光照连续培养，每天在显微镜下血球板计数，直至密度≥107CFU/ml；
(2)取生长状态良好的藻液20ml在4000r/min离心10min，收集藻泥沉淀，弃去上清，用无菌水离心洗涤沉淀；
(3)沉淀用无菌水100ml稀释置于高压锅中，120℃加热萃取20min，取出后在室温下自然冷却，过滤沉淀留上清液，得到含小球藻生长因子的提取液。
5.如权利要求4所述西瓜小对叶组培一步成苗培养基，其特征在于，步骤(2)藻液中血球板计数为3.5×107个/ml。
6.一种西瓜小对叶组培一步成苗方法，其特征在于，将西瓜小对叶外植体接种到权利要求1所述的培养基上进行增殖培养。
7.如权利要求6所述的西瓜小对叶组培一步成苗方法，其特征在于，西瓜小对叶外植体通过以下方法得到：选用0.5-1cm的茎段，用洗洁精水浸泡10-15min，流水下冲洗，然后在超净工作台上用75％酒精消毒15s，再用0.1％HgCl2表面灭菌2.5min，无菌水冲洗4-5次，即得。
8.如权利要求6所述的西瓜小对叶组培一步成苗方法，其特征在于，增殖培养方法如下：培养温度为25±1℃，每天光照时间12h，光照强度1500lx-2000lx。
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