CN114085780A - 一种米曲霉hks017及其在制备预消化后的饲料中的应用 - Google Patents

一种米曲霉hks017及其在制备预消化后的饲料中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及米曲霉HKS017及其在制备预消化后的饲料中的应用，可有效解决预消化后的饲料制备，满足畜牧养殖业对饲料的需要，促进动物免疫和健康生长及改善生态环境的问题，方法是，无菌操作将米曲霉HKS017菌株接种于查氏斜面培养基上，28℃恒温培养，直到斜面上长满绿褐色孢子，再接种于种子培养基中，直到麸皮面上长满绿褐色孢子，得种子；无菌操作将种子接种于预消化饲料培养基中，28‑30℃培养25h‑31h，得预消化饲料原料，烘干，粉碎；本发明的菌株HKS017是新筛选的一株米曲霉（Aspergillus oryzae）HKS017，充分利用现有的饲料原料玉米—豆粕型日粮中的玉米、豆粕，原料丰富，易生产制备，成本低，消除抗营养因子，提高吸收率，促进动物免疫和健康生长，改善生态环境。

Description

一种米曲霉HKS017及其在制备预消化后的饲料中的应用
技术领域
本发明涉及微生物，特别是一种米曲霉HKS017及其在制备预消化后的饲料中的应用。
背景技术
人口用粮与饲料用粮之争日益激烈，粮食总产量40%用于饲料生产（王子强，2010），随着我国居民消费进一步升级，我国饲料量需求还将保持刚想增长，保障粮食安全，主要压力在饲料粮，我国玉米-豆粕型配合饲料中平均蛋白质水平在18%左右，但实际利用效率只有50%左右，另外饲料资源短缺长期制约着我国畜牧业发展，节能减排、降本增效，减少人畜争粮，发展高效饲料工业，充分消除我国养殖业常用的玉米—豆粕型日粮中的玉米、豆粕等饲料原料粮食中抗营养因子提高其营养价值，减轻动物消化负担，提高饲料量玉米、豆粕等的饲料利用率，提高饲料用粮食向畜牧产品转化效率是节约粮食资源的一种有效途径，也是满足畜牧业健康发展的有效途径。特别是我国2020年饲料端禁抗以来，无抗生素饲料开始实施，更需要高消化率无抗营养因子的饲料原料以减少动物对饲料原料难消化应激而产生的疾病。
抗营养因子主要指一些对养分的消化、吸收和利用产生不利影响到物质以及影响畜禽健康和生产性能的物质统称，主要存在于蛋白饲料豆粕和能量饲料玉米中，这些抗营养因子的存在，不仅降低了饲料的营养价值和利用率，而且畜禽动物都生产性能，使动物胰腺肿大、引起腹泻、生长受阻等，当前饲料原料预消化技术是一种有效的去除饲料原料中大分子物质、抗营养因子的方法，是一种对饲料进行特定前消化处理的新型饲料加工技术，可以减少饲料中抗营养因子的含量，增加畜禽对饲料的消化吸收，提高饲料的转化效率，是根据不同原料的具体特性模拟动物的消化过程，进行特定前消化处理的新型饲料加工工艺，可缓解畜禽的消化压力，提高饲料的转化效率，进而改善畜禽的生长性能，减少饲料原料的浪费和排泄物对环境的污染，对畜牧业的可持续发展有巨大的优势，在饲料行业具有广阔的应用前景（乔鹏飞，2019）。预消化饲料原料指以降低动物消化负担，提高饲料原料利用率为目的，在体外预先加工处理消化的饲料原料。预消化饲料原料是无抗饲料时代首选预消化原料，因为可以减少体内处理的能耗和不确定性，增强对疾病的抵抗力，从而减少抗生素的使用。目前预消化饲料原料目前有3种方法：（1）物理方法，如膨化等；（2）化学方法，如通过酸碱处理等；（3）生物方法，如发酵或酶水解等，物理方法需要高温高压能耗高且降解不完全；化学方法易造成环境污染，营养成分损失大，对环境污染大；生物方法中酶水解法（酶解过程水解度不易控制）、发酵法（利用菌株发酵过程产生的多种酶类能将大分子纤维、蛋白质等降解为小分子物质如小肽等，生产成本低），固态发酵法操作简便，低能耗低污染是饲料原料预消化首选方法，微生物发酵饲料不仅使部分抗营养因子分解，而且可以把饲料中大分子营养物质分解为大量易于消化的小分子物质，还能产生特殊的香味，提高畜禽的采食量。微生物固态发酵，在微生物的作用下可降解饲料原料中的纤维素、蛋白质等大分子物质，将饲料原料中的抗营养因子分解和转化，产生能被畜禽采食、消化、吸收，养分更高且无毒害的饲料原料，发酵饲料是目前较好的替代抗生素的新型饲料（吕航，2019）。
目前饲料原料预消化生物菌种筛选主要有3个方向：一是改变饲料原料的理化性质，包括提高消化吸收率、延长贮存时间和解毒脱毒等；二是获得微生物中间代谢产物，包括酶制剂、氨基酸和维生素等，三是培养繁殖饲用的微生物体，用于制备活菌制剂（罗玲，2016）。常选用的菌种有乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌和丝状真菌等（李北，2020），米曲霉是我国农业农村部《饲料添加剂品种目录（2013）》相关法规允许在饲料中添加使用的有益菌种，也是美国食品与药物管理局和美国饲料工业协会1989年公布的40余种安全菌种之一，米曲霉是粮食食品酿造和酿酒的主要菌种之一，在药品制造、工业酶制剂和饲料生产上均有重要而广泛的应用，被美国食品药品监督管理局列为公认安全的生物体（generallyrecognized as safe，GRAS）。应用米曲霉对常规玉米—豆粕型日粮中玉米、豆粕进行预消化可消除抗营养因子，提高吸收转化，促进动物免疫和健康生长及改善生态环境，但至今未见有公开报导。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种米曲霉HKS017及其在制备预消化后的饲料中的应用，可有效解决预消化后的饲料制备，满足畜牧养殖业对饲料的需要，促进动物免疫和健康生长及改善生态环境的问题。
本发明解决的技术方案是，一种米曲霉HKS017，分类命名为米曲霉（Aspergillus oryzae），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.22414，保藏日期：2021年04月22日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
所述的米曲霉HKS017在制备预消化后的饲料中的应用，包括以下步骤：
（1）制备查氏斜面培养基：方法是，将硝酸钠3.0g、氯化钾0.5g、七水硫酸亚铁0.01g、磷酸氢二钾1.0g、七水硫酸镁0.5g、蔗糖20.0g、琼脂20.0g和水1000mL混匀，调pH6.7（常规技术），装于容器中，密封，于121℃下灭菌20min，摆斜面，得查氏斜面培养基；
（2）制备斜面菌种：用接种环无菌操作将米曲霉HKS017菌株接种于查氏斜面培养基上，28℃恒温培养，直到斜面上长满绿褐色孢子，得斜面菌种；
（3）制备种子：用接种环无菌操作将斜面菌种接种于种子培养基中，接种量为种子培养基重量的0.30-0.50%，混匀，培养温度为28-30℃，直到麸皮面上长满绿褐色孢子，孢子数为1-3×109个/g，得种子；
所述的种子培养基：豆粕粉5g、玉米粉5g过40目筛后与麸皮90g混匀，加水90mL，装于容器中，密封，于121℃下灭菌25min，得种子培养基；
（4）饲料原料预消化：无菌操作将步骤（3）制备的种子接种于预消化饲料培养基中，接种量为预消化饲料原料重量的0.4-0.6%，混匀，培养温度为28-30℃，培养25h-31h，得预消化饲料原料；
所述的预消化饲料培养基：玉米粉60g，豆粕粉40g，豆粕粉与玉米粉过40目筛后混匀，加水100mL，混匀，装于容器中，密封，于121℃下灭菌25min，得预消化饲料培养基；
（5）预后处理：将经步骤（4）制备的预消化饲料原料50℃恒温烘干，粉碎过40目筛，得预消化后的饲料。
本发明的菌株HKS017是新筛选的一株米曲霉HKS017，分类命名为米曲霉（Aspergillus oryzae），可有效用于制备预消化后的饲料，充分利用现有的饲料原料玉米—豆粕型日粮中的玉米、豆粕，原料丰富，易生产制备，成本低，所得产品可有效满足对畜禽养殖业对饲料的需要，可消除抗营养因子，提高吸收率，促进动物免疫和健康生长，改善生态环境，有显著的经济和社会效益。
具体实施方式
以下结合具体情况和实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明一种米曲霉HKS017，分类命名为米曲霉（Aspergillus oryzae），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.22414，保藏日期：2021年04月22日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
所述的米曲霉HKS017在制备预消化后的饲料中的应用，可由以下实施例给出。
实施例1
本发明一种米曲霉HKS017在制备预消化后的饲料中的应用，包括以下步骤：
（1）制备查氏斜面培养基：方法是，将硝酸钠3.0g、氯化钾0.5g、七水硫酸亚铁0.01g、磷酸氢二钾1.0g、七水硫酸镁0.5g、蔗糖20.0g、琼脂20.0g和水1000mL混匀，调pH6.7（常规技术），装于容器中，密封，于121℃下灭菌20min，摆斜面，得查氏斜面培养基；
（2）制备斜面菌种：用接种环无菌操作将米曲霉HKS017菌株接种于查氏斜面培养基上，28℃恒温培养，直到斜面上长满绿褐色孢子，得斜面菌种；
（3）制备种子：用接种环无菌操作将斜面菌种接种于种子培养基中，接种量为种子培养基重量的0.40%，混匀，培养温度为29℃，直到麸皮面上长满绿褐色孢子，孢子数为2×109个/g，得种子；
（4）饲料原料预消化：无菌操作将步骤（3）制备的种子接种于预消化饲料培养基中，接种量为预消化饲料原料重量的0.5%，混匀，培养温度为29℃，培养28h，得预消化饲料原料；
（5）预后处理：将经步骤（4）制备的预消化饲料原料50℃恒温烘干，粉碎过40目筛，得预消化后的饲料。
实施例2
本发明一种米曲霉HKS017在制备预消化后的饲料中的应用，包括以下步骤：
（1）制备查氏斜面培养基：方法是，将硝酸钠3.0g、氯化钾0.5g、七水硫酸亚铁0.01g、磷酸氢二钾1.0g、七水硫酸镁0.5g、蔗糖20.0g、琼脂20.0g和水1000mL混匀，调pH6.7（常规技术），装于容器中，密封，于121℃下灭菌20min，摆斜面，得查氏斜面培养基；
（2）制备斜面菌种：用接种环无菌操作将米曲霉HKS017菌株接种于查氏斜面培养基上，28℃恒温培养，直到斜面上长满绿褐色孢子，得斜面菌种；
（3）制备种子：用接种环无菌操作将斜面菌种接种于种子培养基中，接种量为种子培养基重量的0.30%，混匀，培养温度为30℃，直到麸皮面上长满绿褐色孢子，孢子数为1×109个/g，得种子；
（4）饲料原料预消化：无菌操作将步骤（3）制备的种子接种于预消化饲料培养基中，接种量为预消化饲料原料重量的0.4%，混匀，培养温度为30℃，培养26h，得预消化饲料原料；
（5）预后处理：将经步骤（4）制备的预消化饲料原料50℃恒温烘干，粉碎过40目筛，得预消化后的饲料。
实施例3
本发明一种米曲霉HKS017在制备预消化后的饲料中的应用，包括以下步骤：
（1）制备查氏斜面培养基：方法是，将硝酸钠3.0g、氯化钾0.5g、七水硫酸亚铁0.01g、磷酸氢二钾1.0g、七水硫酸镁0.5g、蔗糖20.0g、琼脂20.0g和水1000mL混匀，调pH6.7（常规技术），装于容器中，密封，于121℃下灭菌20min，摆斜面，得查氏斜面培养基；
（2）制备斜面菌种：用接种环无菌操作将米曲霉HKS017菌株接种于查氏斜面培养基上，28℃恒温培养，直到斜面上长满绿褐色孢子，得斜面菌种；
（3）制备种子：用接种环无菌操作将斜面菌种接种于种子培养基中，接种量为种子培养基重量的0.50%，混匀，培养温度为28℃，直到麸皮面上长满绿褐色孢子，孢子数为3×109个/g，得种子；
（4）饲料原料预消化：无菌操作将步骤（3）制备的种子接种于预消化饲料培养基中，接种量为预消化饲料原料重量的0.6%，混匀，培养温度为28℃，培养30h，得预消化饲料原料；
（5）预后处理：将经步骤（4）制备的预消化饲料原料50℃恒温烘干，粉碎过40目筛，得预消化后的饲料。
本发明的菌株HKS017是新筛选的一株米曲霉HKS017，分类命名为米曲霉（Aspergillus oryzae），可有效用于制备预消化后的饲料，所得产品可有效满足对畜禽养殖业对饲料的需要，并经实验效果非常好，有关资料如下：
一、菌株的筛选和鉴定
采集的河南南阳西峡土壤样品为实验材料，分离平板初筛分离纯化，得到一株真菌菌株HKS017，具体是：
（1）筛选：多点取样四分法处理后，无菌操作条件下称取土壤样品样品5.0g于250mL三角瓶中，加入100mL灭菌蒸馏水，震荡混匀10～15min，然后取2.0mL土壤悬浊液加入到盛有富集培养基的三角瓶中，30℃，180 r/min的摇床培养1d左右。培养好的富集培养液1.0mL分别稀释到10-3、10-4、10-5 ，分别吸取10-3、10-4和10-5稀释度的稀释液0.1mL，于菌株分离培养基马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上，每个稀释梯度设置3个平行，立即用无菌玻璃刮板进行平板涂布，然后倒置在恒温培养箱中进行培养，于28～30℃下培养3～5d，挑取一株长势较好的孢子为绿褐色的真菌菌落采用平板涂布稀释法重复以上操作，直至平板上出现单菌落，转接入查氏斜面培养基培养3～5d，得到一株真菌菌株HKS017，4℃保藏备用；
所述的富集培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0 g，KH2PO4 1.0g，MgSO4·7H2O 1.0 g，蒸馏水1000mL，pH7.0，加入链霉素100µg/ mL；
（2）鉴定：
菌株HKS017的形态特征：在查氏琼脂培养基上25℃培养7天上直径可达到60mm，质地丝绒状至厚絮状，菌落初为白色、浅黄绿色，后为绿褐色，背面无色或淡粉色，可见辐射状沟纹。
菌株HKS017显微特征：在显微镜下观察，菌丝无色，有隔膜，分生孢子头放射状，分生孢子梗粗糙且顶端膨大顶囊近球形，顶囊直径通常50~70μm，基部有厚膜足细胞。小梗有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。分生孢子近球形，成熟的分生孢子粗糙4~6μm，近于光滑。
根据魏景超上海科学技术出版社出版的《真菌鉴定手册》（1979），初步将菌株HKS017鉴定为米曲霉菌（Aspergillusoryzae）；
菌株HKS017的ITS基因的序列分析：
用真菌基因组DNA提取试剂盒（D2300），按照试剂盒说明书操作流程提取菌株HKS017的基因组DNA。以其为模板，采用真菌通用引物，上游引物ITS1：5，-TCCG TAGG TGAACCTG CGG-3，和下游引物ITS4：5，- TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC -3，，进行菌株HKS017基因的PCR扩增。
在50µLPCR反应体系中依次加入以下试剂： 2×ES Taq Master Mix（Dye）25µL；ITS1上游引物1 µL；ITS4下游引物1 µL；提取的真菌模板基因组DNA 1µL，ddh2o22µL；反应总体积为50µL。
PCR扩增条件：94℃预变性4min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s， 30个循环，最后72℃m末端·延伸10min。
基因的PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测出现明显电泳条带后，将PCR纯化目的片段送至华大基因科技股份有限公司进行测序，其ITS序列片段长度为582bp，具体序列见表1，将测序得到的ITS结果基因序列分别提交到美国国立生物技术中心（nationalcenter for biotechnology information，NCBI）的GenBank数据库进行BALST比对分析，其测序片段与数据库模式菌株Aspergillusoryzae（登录号HQ285580）具有99.83%的相似性，将菌株HKS017鉴定为米曲霉（Aspergillusoryzae）。
HKS017菌株ITS序列
ITS基因序列长度（582bp）
1 cctgcggaag gatcattacc gagtgtaggg ttcctagcga gcccaacctc ccacccgtgt
61 ttactgtacc ttagttgctt cggcgggccc gccattcatg gccgccgggg gctctcagcc
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541 gtagggatac ccgctgaact taagcatatc <u>aaaagccgga</u> <u>gg</u>
根据菌株HKS017的形态特征、显微特征及分子生物学序列分析基因的比对分析，将菌株HKS017鉴定为曲霉属（Aspergillus）米曲霉（Aspergillusoryzae），分类命名为米曲霉（Aspergillusoryzae），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.22414，保藏日期：2021年04月22日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；。
二、预消化后饲料效果试验（以实施例1为例）
1.1试验材料：玉米粉购自丹尼斯超市，含水量11.68%；麸皮、豆粕粉购自市场，麸皮含水量9.78%，豆粕含水量9.31%。饲料原料配比：其中玉米粉60g，豆粕粉40g。
1.2饲料原料预消化试验结果分析
测定方法：水分按照GB/T 6435-2014的方法进行测定；粗脂肪按照标准方法GB/T6433-2006进行测定；粗纤维按照标准方法GB/T 6434-2006进行测定；粗蛋白质按照GB/T6432-2018饲料中粗蛋白测定方法；小肽含量、游离氨基酸含量及酸溶蛋白含量按照GB/T22492-2008；饲料中抗营养因子大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子的测定、大豆凝集素，采用ELISA法（酶联免疫法），试剂盒由天津龙科方舟生物工程技术有限公司、国家饲料工程技术研究中心检测技术研发中心研发提供，分析方法和操作要求按照ELISA试剂盒说明进行；棉籽糖和水苏糖含量的测定采用高效液相法；脲酶含量按照GB/T 8622-2006。
饲料体外消化率的测定：饲料蛋白质体外消化率是指在体外模拟胃肠道消化环境，对饲料蛋白质进行体外模拟消化，其值为消化掉的蛋白质与消化前蛋白质的比值，（1）消化前蛋白质含量按照GB/T6432饲料中粗蛋白质测定方法进行测定，粗蛋白质含量为A1；（2）消化后粗蛋白质含量的测定方法：称取1g样品于100mL具塞烧瓶中，加入10mL（1mol/L，pH2.0）胃蛋白酶溶液，120r/min，37℃震荡水解6h，取出用50%NaOH溶液调整pH至中性，再加入0.5mg/mL，pH7.6胰蛋白酶溶液50mL，120r/min，37℃震荡水解18h，取出后以1:4体积比加入5%TCA沉淀未消化的大分子蛋白质，4℃，120r/min,离心20min，去上清液，沉淀，测定粗蛋白质含量A2；（3）计算：体外消化率（%）＝（A1－A2）×100/ A1
经多批次结果分析如下：
预消化后饲料原料组（平均值）较预消化前饲料原料组（平均值）（其中玉米粉60g，豆粕粉40g）比较：预消化前饲料原料组游离氨基酸见表1：
表1预消化前饲料原料组游离氨基酸（g/Kg）
编号 检测项目 检测结果（g/kg）
1 天冬氨酸 0.32
2 苏氨酸 0.15
3 丝氨酸 0.05
4 谷氨酸 0.62
5 甘氨酸 0.07
6 丙氨酸 0.23
7 胱氨酸 0.12
8 缬氨酸 0.14
9 蛋氨酸 0.02
10 异亮氨酸 0.03
11 亮氨酸 0.04
12 酪氨酸 0.03
13 苯丙氨酸 0.13
14 赖氨酸 0.16
15 组氨酸 0.08
16 精氨酸 0.54
17 脯氨酸 未检出
18 总和 2.73
由表1可知，游离氨基酸总和2.73 g/Kg。
预消化后饲料组游离氨基酸表2：
表2预消化后饲料原料组游离氨基酸（g/Kg）
编号 检测项目 检测结果（g/kg）
1 天冬氨酸 0.38
2 苏氨酸 0.28
3 丝氨酸 0.12
4 谷氨酸 1.44
5 甘氨酸 0.08
6 丙氨酸 0.3
7 胱氨酸 0.24
8 缬氨酸 0.34
9 蛋氨酸 0.06
10 异亮氨酸 0.09
11 亮氨酸 0.26
12 酪氨酸 0.39
13 苯丙氨酸 0.53
14 赖氨酸 0.56
15 组氨酸 0.18
16 精氨酸 1.16
17 脯氨酸 未检出
18 总和 6.41
由表2可知，游离氨基酸总和6.41 g/Kg，较预消化前提高了135%；预消化前饲料组与预消化后饲料组成分比较见表3：
表3 预消化前饲料原料组与预消化后饲料原料组成分比较
项目 预消化前 预消化后
粗蛋白质（%） 27.04 31.08
粗脂肪（g/kg） 19 15.5
粗纤维(%) 4.2 3.6
酸溶蛋白质（mg/g） 13 40.8
氨基酸(g/kg) 2.73 6.41
小肽含量（mg/g） 10.27 34.39
水苏糖（mg/g） 38.91 1.78
棉子糖（mg/g） 13.22 0.79
尿酶（U/g） 0.09 未检出
大豆球蛋白（mg/g） 91.13 2.13
β-伴大豆球蛋白（mg/g） 86.65 5.61
胰蛋白酶抑制因子（mg/g） 10.37 0.62
大豆凝集素（mg/g） 1.03 未检出
饲料体外消化率（%） 81.2 97.7
由表3可知，预消化后饲料较预消化前饲料粗蛋白质含量提高14.9%；粗脂肪降低了18%；粗纤维降低了14.3%；游离氨基酸总和提高了135.0%；酸溶蛋白质提高了213.8%；肽含量提高了234.9%。抗营养因子水苏糖降低了95%，棉子糖降低了94%，尿酶预消化后未检出，大豆球蛋白降低了97.6%，β-伴大豆球蛋白降低了93.5%，胰蛋白酶抑制因子降低了94%，大豆凝集素预消化后未检出，饲料体外消化率提高了20.3%。
预消化后饲料玉米、豆粕中大分子物质被降解，抗营养因子、抗原蛋白及大分子蛋白被有效降解，饲料体外消化率大幅度提高，蛋白质被分解消化水解成氨基酸和小肽，被动物吸收利用，提高动物机体免疫力，预消化饲料原料是解决畜牧业可持续发展的重要途径，对于改善动物生产性能、降低养殖成本、实现无抗养殖、减排环保以及应对大豆供应危机等具有重要意义。
三、预消化后的饲料在养猪的应用实验
（1）试验动物：选择体重28kg左右保育猪（品种：杜×长×大），随机分为2个处理，每个处理设3个重复，每个重复7头仔猪。
试验周期：30天。
保育猪饲料基础配方：玉米55%，豆粕27%，预消化后的饲料8%，预混料10%。
对照组饲喂饲料基础配方日粮，实验组饲喂经本发明预消化后的饲料，其它管理措施一样。
对保育猪生产性能的影响
项目 对照组 实验组
平均初重/kg 28.13±0.29 28.69±0.77
平均末重/kg 53.09±0.19 56.35±0.56
平均日增重/g 832±0.87a 922±0.51b
平均日采食量/g 1722.3±0.17 1799±0.66
料重比 2.06±0.17 1.95±0.36
腹泻率/% 7.99±0.27 6.09±0.39
试验结果：实验组较对照组，试验组保育猪的日采食量较对照组略有提高，平均提高77g，提高4.47%，但差异不显著（P>0.05）；试验组保育猪平均日增重著提高（P<0.05），平均提高90g，提高10.8%；试验组保育猪料重比降低0.11，降低5.33%，但差异不显著（P>0.05）；试验组保育猪料腹泻率显著降低（P<0.05），降低了23.7%。表明养殖中应用预消化后的饲料后可以显著降低断奶仔猪腹泻率，同时显著改善生产性能。
在对实施例1试验的同时，还对其他实施例进行了类似的试验，均取得了相同和相近似的结果，同时还对其他畜禽，如鸡、鸭、牛，也做了类似的试验，也取得了非常好的有益技术效果，可满足畜禽饲养对饲料的需要。
总之，以上述可以清楚的看出，本发明的菌株HKS017是新筛选的一株米曲霉HKS017，分类命名为米曲霉（Aspergillus oryzae），可有效用于制备预消化后的饲料，充分利用现有的饲料原料玉米—豆粕型日粮中的玉米、豆粕，原料丰富，易生产制备，成本低，所得产品可有效满足对畜禽养殖业对饲料的需要，可消除抗营养因子，提高吸收率，促进动物免疫和健康生长，改善生态环境，特别适于养猪业，猪日重平均提高90g，比常规饲料提高10.8%，猪腹泻率降低23.7%，保证保育猪的健康免疫，促进健康生长，而且有利于改善生态环境，有显著的经济和社会效益。
序列表
<110> 河南省科学院生物研究所有限责任公司
<120> 一种米曲霉HKS017及其在制备预消化后的饲料中的应用
<130> 2021
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 582
<212> DNA
<213> 米曲霉(Aspergillus oryzae)
<400> 1
cctgcggaag gatcattacc gagtgtaggg ttcctagcga gcccaacctc ccacccgtgt 60
ttactgtacc ttagttgctt cggcgggccc gccattcatg gccgccgggg gctctcagcc 120
ccgggcccgc gcccgccgga gacaccacga actctgtctg atctagtgaa gtctgagttg 180
attgtatcgc aatcagttaa aactttcaac aatggatctc ttggttccgg catcgatgaa 240
gaacgcagcg aaatgcgata actagtgtga attgcagaat tccgtgaatc atcgagtctt 300
tgaacgcaca ttgcgccccc tggtattccg gggggcatgc ctgtccgagc gtcattgctg 360
cccatcaagc acggcttgtg tgttgggtcg tcgtcccctc tccggggggg acgggcccca 420
aaggcagcgg cggcaccgcg tccgatcctc gagcgtatgg ggctttgtca cccgctctgt 480
aggcccggcc ggcgcttgcc gaacgcaaat caatcttttt ccaggttgac ctcggatcag 540
gtagggatac ccgctgaact taagcatatc aaaagccgga gg 582

Claims (6)

1.一种米曲霉HKS017，分类命名为米曲霉（Aspergillus oryzae），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.22414，保藏日期：2021年04月22日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.权利要求1所述的米曲霉HKS017在制备预消化后的饲料中的应用，方法是：
（1）制备查氏斜面培养基：方法是，将硝酸钠3.0g、氯化钾0.5g、七水硫酸亚铁0.01g、磷酸氢二钾1.0g、七水硫酸镁0.5g、蔗糖20.0g、琼脂20.0g和水1000mL混匀，调pH6.7，装于容器中，密封，于121℃下灭菌20min，摆斜面，得查氏斜面培养基；
（2）制备斜面菌种：用接种环无菌操作将米曲霉HKS017菌株接种于查氏斜面培养基上，28℃恒温培养，直到斜面上长满绿褐色孢子，得斜面菌种；
（3）制备种子：用接种环无菌操作将斜面菌种接种于种子培养基中，接种量为种子培养基重量的0.30-0.50%，混匀，培养温度为28-30℃，直到麸皮面上长满绿褐色孢子，孢子数为1-3×109个/g，得种子；
所述的种子培养基：豆粕粉5g、玉米粉5g过40目筛后与麸皮90g混匀，加水90mL，装于容器中，密封，于121℃下灭菌25min，得种子培养基；
（4）饲料原料预消化：无菌操作将步骤（3）制备的种子接种于预消化饲料培养基中，接种量为预消化饲料原料重量的0.4-0.6%，混匀，培养温度为28-30℃，培养25h-31h，得预消化饲料原料；
所述的预消化饲料培养基：玉米粉60g，豆粕粉40g，豆粕粉与玉米粉过40目筛后混匀，加水100mL，混匀，装于容器中，密封，于121℃下灭菌25min，得预消化饲料培养基；
（5）预后处理：将经步骤（4）制备的预消化饲料原料50℃恒温烘干，粉碎过40目筛，得预消化后的饲料。
3.根据权利要求2所述的米曲霉HKS017在制备预消化后的饲料中的应用，其特征在于，所述的步骤（3）制备种子是：用接种环无菌操作将斜面菌种接种于种子培养基中，接种量为种子培养基重量的0.40%，混匀，培养温度为29℃，直到麸皮面上长满绿褐色孢子，孢子数为2×109个/g，得种子；
步骤（4）所述的饲料原料预消化是：无菌操作将种子接种于预消化饲料培养基中，接种量为预消化饲料原料重量的0.5%，混匀，培养温度为29℃，培养28h，得预消化饲料原料。
4.根据权利要求2所述的米曲霉HKS017在制备预消化后的饲料中的应用，其特征在于，所述的步骤（3）制备种子是：用接种环无菌操作将斜面菌种接种于种子培养基中，接种量为种子培养基重量的0.30%，混匀，培养温度为30℃，直到麸皮面上长满绿褐色孢子，孢子数为1×109个/g，得种子；
步骤（4）饲料原料预消化是：无菌操作将步骤（3）制备的种子接种于预消化饲料培养基中，接种量为预消化饲料原料重量的0.4%，混匀，培养温度为30℃，培养26h，得预消化饲料原料。
5.根据权利要求2所述的米曲霉HKS017在制备预消化后的饲料中的应用，其特征在于，所述的步骤（3）制备种子是：用接种环无菌操作将斜面菌种接种于种子培养基中，接种量为种子培养基重量的0.50%，混匀，培养温度为28℃，直到麸皮面上长满绿褐色孢子，孢子数为3×109个/g，得种子；
步骤（4）饲料原料预消化是：无菌操作将步骤（3）制备的种子接种于预消化饲料培养基中，接种量为预消化饲料原料重量的0.6%，混匀，培养温度为28℃，培养30h，得预消化饲料原料。
6.权利要求2-5任一项所述的米曲霉HKS017在制备预消化后的饲料中的应用为在养猪业中的应用。
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