CN114085317B - 一种反应性ucst共聚物及其制备方法 - Google Patents

一种反应性ucst共聚物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种反应性UCST共聚物及其制备方法，属于温敏聚合物技术领域。本发明共聚物的侧链结构包括：丙烯酰胺类单体和反应性单体，其中丙烯酰胺类单体与反应性单体的摩尔比为1.7:1～20:1。该共聚物的UCST性质体现为：可以在水中发生低温不溶，高温溶解的可逆相转变，相转变温度为15～90℃；该共聚物的反应性体现为：可以与含氨基或巯基的小分子或高分子发生共价反应，可与蛋白质发生共组装，形成聚合物‑蛋白质纳米粒子，并且蛋白质在共组装过程中能够维持原有的二级结构和生物活性，该反应性UCST共聚物在纳米递送、生物传感器及分子纯化和富集等领域均具有潜在应用价值。

Description

一种反应性UCST共聚物及其制备方法
技术领域
本发明涉及温敏聚合物技术领域，特别是涉及一种反应性UCST共聚物及其制备方法。
背景技术
温敏聚合物是一类重要的刺激响应性聚合物，它们可以根据温度改变而显示出溶解或不溶的可逆相转变，由于它们可以被用于催化剂、生物医药、传感器、分离技术等领域，在过去二十年间引起了极大的研究兴趣。温敏聚合物可以被分为两大类：具有最低临界溶解温度(LCST)和最高临界溶解温度(UCST)的聚合物。LCST聚合物在温度大于LCST时从溶解态转变为不溶态，而UCST的相转变性质相反。这两类聚合物中，LCST聚合物的种类和应用更加成熟丰富，而UCST聚合物由于其制备困难，研究和应用相对较少，目前仅有少量结构的UCST聚合物被开发。此外，在聚合物主链中引入反应性官能团可以增强聚合物的物理化学性质，并为进一步的后修饰和功能化提供机会。
目前被开发的反应性温敏聚合物仍然集中于LCST类型，而UCST类型的反应性聚合物更加匮乏。直接将几种单体(包括反应性单体在内)共聚是获得反应性UCST聚合物最简单明了的方式，但共聚单体的选择是个挑战，过强的疏水性或极性有可能导致聚合物发生不可逆的聚集，从而失去温敏性，而较弱的疏水性或极性可能使聚合物始终保持溶解状态，不能产生UCST性质。因此，开发反应性UCST聚合物能够扩展温敏聚合物的应用范围，同时也为其新的应用创造了机会，具有重要意义。
发明内容
本发明针对反应性UCST共聚物制备困难，种类和数量有限的问题，提供一种反应性UCST共聚物及其制备方法。该方法选择适合的单体组合，通过将单体直接共聚的方式，能够简单方便的获得反应性UCST共聚物，其在纳米递送、生物传感器及分子纯化和富集等领域具有潜在应用价值。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明目的之一是提供一种反应性UCST共聚物，侧链结构包括：丙烯酰胺类单体和反应性单体，反应性单体具备一定的极性或疏水性，两种单体均为必要组分，其中丙烯酰胺类单体与反应性单体的摩尔比为1.7:1～20:1。
进一步地，所述丙烯酰胺类单体为丙烯酰胺(AAm)或N-丙烯酰甘氨酰胺(NAGA)；
所述反应性单体为含有琥珀酰亚胺(NHSM)或二硫吡啶基团(PDSM)的烯基单体，可以为N-丙烯氧基琥珀酰亚胺(NAS)、N-甲基丙烯氧基琥珀酰亚胺(MAS)、二硫吡啶基乙基丙烯酰胺(PDSAm)、二硫吡啶基乙基甲基丙烯酰胺(PDSMAm)、二硫吡啶基乙基丙烯酸酯(PDSA)和二硫吡啶基乙基甲基丙烯酸酯(PDSMA)中的一种或多种，反应性单体的通用结构及结构举例包括但不局限于下述结构：
Figure BDA0003426595680000031
进一步地，所述反应性UCST共聚物的构筑结构为线性、支化或交联结构。
进一步地，所述反应性UCST共聚物为线性或支化结构时，共聚物的分子量分布指数为1.1～3.0，重均分子量为1～20万，在纯水中能发生低温不溶-高温溶解的可逆相转变，相转变温度为15～90℃；
所述反应性UCST共聚物为交联结构时，结构中还包括交联单体，交联度<10％，吸水倍数>60％，在纯水中能发生低温失水收缩-高温溶胀的可逆转变，转变温度为15～90℃。
进一步的，所述交联单体为任意多烯基单体，如N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)、N,N'-双(丙烯酰)胱胺(BAC)、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)、双(2-甲基丙烯酰基)氧乙基二硫化物(DSDMA)等；多烯基交联剂，其通用结构及结构举例包括但不局限于下述结构：
Figure BDA0003426595680000041
本发明目的之二是提供一种所述的反应性UCST共聚物的制备方法，以丙烯酰胺类单体和反应性单体为原料，通过自由基聚合法、可逆加成-断裂链转移聚合法(RAFT)或原子转移自由基聚合法(ATRP)制备。
采用普通自由基聚合、RAFT、ATRP等方法均可，不影响共聚物的UCST性质及反应性，使用RAFT方法时，体系中还应包括一定比例的链转移剂；使用ATRP方法时，体系中还应包括一定比例的催化剂。
进一步地，当反应性UCST共聚物为线性共聚物时，采用自由基聚合法制备，步骤包括：将引发剂和单体溶于溶剂中，排除氧气后，聚合，除去未反应单体，干燥得到反应性UCST共聚物；
当反应性UCST共聚物为线性共聚物时，采用可逆加成-断裂链转移聚合法制备，步骤包括：将单体、链转移剂与引发剂溶于溶剂中，溶液经液氮冷冻-抽真空-通氩气-化冻循环3次排除氧气后，聚合，除去未反应单体，干燥得到反应性UCST共聚物；
当反应性UCST共聚物为线性共聚物时，采用原子转移自由基聚合法制备，步骤包括：将单体、引发剂与铜催化剂溶于溶剂中，溶液经液氮冷冻-抽真空-通氩气-化冻循环3次排除氧气后，聚合，除去铜催化剂和未反应单体，干燥得到反应性UCST共聚物；
当反应性UCST共聚物为支化共聚物时，采用可逆加成-断裂链转移聚合法制备，步骤包括：将单体、支化结构的链转移剂与引发剂溶于溶剂中，溶液经液氮冷冻-抽真空-通氩气-化冻循环3次排除氧气后，聚合，除去未反应单体，干燥得到反应性UCST共聚物；
当反应性UCST共聚物为支化共聚物时，采用原子转移自由基聚合法制备，步骤包括：将单体、支化结构的引发剂与铜催化剂溶于溶剂中，溶液经液氮冷冻-抽真空-通氩气-化冻循环3次排除氧气后，聚合，除去铜催化剂和未反应单体，干燥得到反应性UCST共聚物；
当反应性UCST共聚物为交联共聚物时，采用自由基聚合法制备，步骤包括：将引发剂和单体及交联剂单体溶于溶剂中，排除氧气后，聚合，除去未反应单体，干燥得到交联反应性UCST共聚物。
进一步地，所述溶剂为二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二氧六环和水中的一种或多种。
进一步地，所述单体在溶剂中的浓度为0.01～0.5g/mL，丙烯酰胺类单体和反应性单体的摩尔比为1.7:1～20:1；所述除去未反应单体具体为将反应液沉淀至沉淀剂中、将反应液过柱分离、将反应液用蒸馏水透析等方法的一种或几种组合；所述干燥为真空干燥或冷冻干燥。
进一步地，所述引发剂的加入量为单体摩尔数的0.01～0.5％；
所述自由基聚合法，聚合温度60～70℃，聚合时间5～24h；
所述可逆加成-断裂链转移聚合法，聚合温度50～70℃，聚合时间10～72h；
所述原子转移自由基聚合法，聚合温度60～90℃，聚合时间10～72h。
本发明目的之三是提供一种组装体，通过所述的反应性UCST共聚物与含氨基或巯基的高分子发生共价反应，得到功能化的组装体。
进一步地，含有氨基或巯基的高分子包括但不限于天然生物高分子，如蛋白质、DNA等，当其为蛋白质时，共聚物与蛋白质可以发生共组装形成生物杂化纳米粒子，并且蛋白质能够在共组装后保持其二级结构和生物活性。
本发明公开了以下技术效果：
本发明提供了一种反应性UCST共聚物及其制备方法，以解决反应性UCST聚合物制备困难，种类和数量有限等问题。该反应性UCST共聚物由两类单体组成：丙烯酰胺类单体和反应性单体，直接共聚两种单体，并控制单体比例在一定范围内，可以直接获得反应性UCST共聚物，该共聚物的UCST性质体现为：可以在水中发生低温不溶，高温溶解的可逆相转变，相转变温度又称浊点温度(Tcp)为15～90℃；该共聚物的反应性体现为：可以与含氨基或巯基的小分子或高分子发生共价反应，可与蛋白质发生共组装，形成稳定的聚合物-蛋白质纳米粒子，并且蛋白质在共组装过程中能够维持原有的二级结构和生物活性，该反应性UCST共聚物在纳米递送、生物传感器及分子纯化和富集等领域均具有潜在应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为共聚物的1H NMR谱图，其中，A为共聚物一的1H NMR谱图，B为共聚物二的1HNMR谱图，C为共聚物十二的1H NMR谱图；
图2为共聚物一和共聚物二的溶液透射率随温度的变化；
图3为共聚物十二的粒径随温度的变化曲线；
图4为生物杂化纳米粒子的原子力显微镜照片，其中，A为生物杂化纳米粒子一的原子力显微镜照片，B为生物杂化纳米粒子二的原子力显微镜照片；
图5为牛血清白蛋白和生物杂化纳米粒子一的圆二色性对比谱图；
图6为牛血清白蛋白和生物杂化纳米粒子一的蛋白质活性对比图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
在本发明中，所有原料均为常规市售原料。
实施例1
采用RAFT聚合法，首先将氰甲基十二烷基三硫代碳酸酯(CMDT)(链转移剂)、2,2'-偶氮双(2-甲基丙脒)二盐酸盐(V-50)(引发剂)、N-丙烯酰甘氨酰胺(NAGA)、N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)、溶解于无水DMSO中，单体总浓度为0.1g/mL，使CMDT:V-50:NAGA:NAS的摩尔比例为1:0.1:117:67，反应液经过液氮冷冻-抽真空-充氩气-化冻循环3次，以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应24h，然后将反应液沉淀于10倍体积无水乙醇中，洗涤3次，干燥得到线性共聚物一，反应方程式为：
Figure BDA0003426595680000081
将该共聚物进行凝胶渗透色谱表征得到聚合物重均分子量为20200，分子量分布为1.25。图1A为该聚合物的1H NMR谱图，化学位移为6.8～8.9ppm的峰为NAGA的酰胺氮上的氢(a和c)；化学位移3.3～4.2ppm的峰为NAGA的侧链亚甲基上的氢(b)；化学位移2.9ppm的峰是NAS的琥珀酰亚胺次甲基氢(d)，表明聚合物为NAGA和NAS的共聚物，共聚物中NAGA和NAS的摩尔比例为1.7:1。
实施例2
采用RAFT聚合法，首先将2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸(DDMAT)(链转移剂)、偶氮二异丁腈(AIBN)(引发剂)、丙烯酰胺(AAm)与N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)溶解于无水DMSO中，单体总浓度为0.3g/mL，使DDMAT:AIBN:AAm:NAS的摩尔比例为1:0.2:400:80，反应液经过液氮冷冻-抽真空-充氩气-化冻循环3次，以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应20h。然后将反应液沉淀于10倍体积无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性共聚物二。反应方程式为：
Figure BDA0003426595680000091
将该共聚物进行凝胶渗透色谱表征得到聚合物重均分子量为35400，分子量分布为1.19。图1B化学位移为6.6～7.7ppm的峰是AAm的酰胺氮上的氢(a)；化学位移2.9ppm是NAS的琥珀酰亚胺次甲基氢(b)；化学位移10.6ppm处为NAS部分发生水解后的丙烯酸(AAc)的羧基氢。共聚物中AAm:NAS:AAc的摩尔比例为77:5:18。
实施例3
采用自由基聚合法，首先将偶氮二异丁腈(AIBN)(引发剂)、N-丙烯酰甘氨酰胺(NAGA)、N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)溶解于无水DMSO中，单体总浓度为0.5g/mL，使AIBN:NAGA:NAS的摩尔比例为1:120:70。反应液经氩气鼓泡30min以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应6h。然后将反应液沉淀于10倍体积的无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性共聚物三。反应方程式为：
Figure BDA0003426595680000101
实施例4
采用自由基聚合法，首先将偶氮二异丁腈(AIBN)(引发剂)、丙烯酰胺(AAm)、N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)溶解于无水DMSO中，单体总浓度为0.3g/mL，使AIBN:AAm:NAS的摩尔比例为1:400:80，反应液经氩气鼓泡30min以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应6h。然后将反应液沉淀于10倍体积的无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性共聚物四。反应方程式为：
Figure BDA0003426595680000102
实施例5
使用ATRP聚合法，将2-溴-2-甲基丙酸乙酯(EBriB)(引发剂)、氯化亚铜(CuCl)、N,N,N′,N″,N″-五甲基二乙烯三胺(PMDETA)(CuCl与PMDETA络合后成为催化剂体系)、N-丙烯酰甘氨酰胺(NAGA)与N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)溶解于无水DMSO中，使EBriB:CuCl:PMDETA:NAGA:NAS的比例为1:1:2:120:70，单体总浓度为0.2g/mL。反应液经过液氮冷冻-抽真空-充氩气-化冻循环3次，以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应24h。将聚合物过硅胶柱进行纯化，随后沉淀于无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性共聚物五。反应方程式为：
Figure BDA0003426595680000111
实施例6
使用ATRP聚合法，将2-溴-2-甲基丙酸乙酯(EBriB)(引发剂)、氯化亚铜(CuCl)、N,N,N′,N″,N″-五甲基二乙烯三胺(PMDETA)(CuCl与PMDETA络合后成为催化剂体系)、丙烯酰胺(AAm)与N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)溶解于无水DMSO中，使EBriB:CuCl:PMDETA:AAm:NAS的比例为1:1:2:378:79，单体总浓度为0.5g/mL。反应液经过液氮冷冻-抽真空-充氩气-化冻循环3次，以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应24h。将聚合物过硅胶柱进行纯化，随后沉淀于无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性共聚物六。反应方程式为：
Figure BDA0003426595680000112
实施例7
使用ATRP聚合法，将溴代环糊精(CD-Br，每个环糊精有17个Br，即为17个ATRP引发位点)(引发剂)、氯化亚铜(CuCl)、N,N,N′,N″,N″-五甲基二乙烯三胺(PMDETA)(CuCl与PMDETA络合后成为催化剂体系)、N-丙烯酰甘氨酰胺(NAGA)与N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)溶解于无水DMSO中，使Br:CuCl:PMDETA:NAGA:NAS的比例为1:1:2:120:70，单体总浓度为0.1g/mL。反应液经过液氮冷冻-抽真空-充氩气-化冻循环3次，以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应48h。将聚合物过硅胶柱进行纯化，随后沉淀于无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到支化共聚物七。反应方程式为：
Figure BDA0003426595680000121
实施例8
使用ATRP聚合法，将溴代环糊精(CD-Br，每个环糊精有17个Br，即为17个ATRP引发位点)(引发剂)、氯化亚铜(CuCl)、N,N,N′,N″,N″-五甲基二乙烯三胺(PMDETA)(CuCl与PMDETA络合后成为催化剂体系)、丙烯酰胺(AAm)与N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)溶解于无水DMSO中，使Br:CuCl:PMDETA:AAm:NAS的比例为1:1:2:378:79，单体总浓度为0.1g/mL。反应液经过液氮冷冻-抽真空-充氩气-化冻循环3次，以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应48h。将聚合物过硅胶柱进行纯化，随后沉淀于无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到支化共聚物八。反应方程式为：
Figure BDA0003426595680000131
实施例9
采用RAFT聚合法，首先将氰甲基十二烷基三硫代碳酸酯(CMDT)(链转移剂)、2,2'-偶氮双(2-甲基丙脒)二盐酸盐(V-50)(引发剂)、N-丙烯酰甘氨酰胺(NAGA)、二甲基二硫吡啶基丙烯酰胺(PDSAm)溶解于无水DMSO中，单体总浓度为0.2g/mL，使CMDT:V-50:NAGA:PDSAm的摩尔比例为1:0.2:350:88，反应液经过液氮冷冻-抽真空-充氩气-化冻循环3次，以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应48h，然后将反应液沉淀于10倍体积无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性共聚物九。反应方程式为：
Figure BDA0003426595680000132
实施例10
采用RAFT聚合法，首先将2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸(DDMAT)(链转移剂)、偶氮二异丁腈(AIBN)(引发剂)、丙烯酰胺(AAm)、二甲基二硫吡啶基丙烯酰胺(PDSAm)溶解于无水DMSO中，单体总浓度为0.3g/mL，使DDMAT:AIBN:AAm:PDSAm的摩尔比例为1:0.1:400:60，反应液经过液氮冷冻-抽真空-充氩气-化冻循环3次，以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应72h，然后将反应液沉淀于10倍体积无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性共聚物十。反应方程式为：
Figure BDA0003426595680000141
实施例11
采用自由基聚合法，首先将偶氮二异丁腈(AIBN)(引发剂)、N-丙烯酰甘氨酰胺(NAGA)、二甲基二硫吡啶基丙烯酰胺(PDSAm)溶解于无水DMSO中，单体总浓度为0.5g/mL，使AIBN:NAGA:PDSAm的摩尔比例为1:120:30。反应液经氩气鼓泡30min以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应24h。然后将反应液沉淀于10倍体积的无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性共聚物十一。反应方程式为：
Figure BDA0003426595680000142
实施例12
采用自由基聚合法，首先将偶氮二异丁腈(AIBN)(引发剂)、丙烯酰胺(AAm)、二甲基二硫吡啶基丙烯酰胺(PDSAm)溶解于无水DMSO中，单体总浓度为0.3g/mL，使AIBN:AAm:PDSAm的摩尔比例为1:400:60，反应液经氩气鼓泡30min以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应24h。然后将反应液沉淀于10倍体积的无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性共聚物十二，反应方程式如下：
Figure BDA0003426595680000151
图1C核磁表征结果显示，化学位移在6.6～8.5ppm之间出现了AAm的酰胺氢以及二硫吡啶环上的氢，2.9ppm和3.4ppm为PDSAm侧链亚甲基氢，表明聚合物为AAm和PDSAm的共聚物，共聚物中AAm和PDSAm的摩尔比为7.1:1。
实施例13
使用自由基聚合法，将偶氮二异丁腈(AIBN)(引发剂)、N-丙烯酰甘氨酰胺(NAGA)与N-甲基丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(MAS)溶解于无水DMSO中，使AIBN:NAGA:MAS的比例为1:400:40，单体总浓度为0.3g/mL。反应液经氩气鼓泡30min以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应6h。然后将反应物沉淀于无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性共聚物十三。反应方程式为：
Figure BDA0003426595680000152
实施例14
使用自由基聚合法，将偶氮二异丁腈(AIBN)(引发剂)、丙烯酰胺(AAm)与N-甲基丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(MAS)溶解于无水DMSO中，使AIBN:AAm:MAS的比例为1:400:30，单体总浓度为0.5g/mL。反应液经氩气鼓泡30min以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应6h。然后将反应物沉淀于无水乙醇中，洗涤3次，真空干燥得到线性共聚物十四。反应方程式为：
Figure BDA0003426595680000161
实施例15
使用自由基聚合法，将偶氮二异丁腈(AIBN)(引发剂)、N-丙烯酰甘氨酰胺(NAGA)、N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)与N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)(交联剂)溶解于无水DMSO中，使AIBN:NAGA:NAS:BIS的比例为1:200:30:5，单体总浓度为0.03g/mL。反应液经氩气鼓泡30min以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应6h。得到交联共聚物，将上述交联共聚物置于新鲜DMSO中浸泡以除去未反应的单体，然后转移至无水乙醇中置换DMSO溶剂，真空干燥后得到交联共聚物十五。反应方程式为：
Figure BDA0003426595680000162
实施例16
使用自由基聚合法，将偶氮二异丁腈(AIBN)(引发剂)、丙烯酰胺(AAm)、N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)与N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)(交联剂)溶解于无水DMSO中，使AIBN:AAm:NAS:BIS的比例为1:378:79:9，单体总浓度为0.03g/mL。反应液经氩气鼓泡30min以除去反应体系中的氧气。然后将反应液密闭，置于60℃的水浴中反应6h。得到交联共聚物，将上述交联共聚物置于新鲜DMSO中浸泡以除去未反应的单体，然后转移至无水乙醇中置换DMSO溶剂，真空干燥后得到交联共聚物十六。反应方程式为：
Figure BDA0003426595680000171
反应性UCST共聚物的UCST测定
实施例17
采用紫外可见分光光度计(UV-vis)检测溶液透射率：将浓度为2mg/mL的共聚物一和二溶于热水中，使用UV-vis检测聚合物溶液的透射率(T％)随温度的变化，变温速率0.5-2℃/min，将所得曲线的一阶导数对应的峰值定义为浊点温度(Tcp)。
分别称取上述共聚物一和共聚物二2mg至1mL去离子水中，加热使其完全溶解，使用紫外分光光度计在600nm波长下检测溶液的透射率(T％)随温度(T)的变化，得到如附图2所示的曲线，表明聚合物具有UCST性质，对上述两条曲线进行一阶导数分析，将峰值定义为Tcp，测得共聚物一的Tcp为57℃，共聚物二的Tcp为83℃。
实施例18
采用粒度分析仪检测共聚物的UCST性质：将共聚物十二配置成浓度为0.5mg/mL的水溶液，然后用粒径分析仪检测共聚物十二的粒径随温度的变化，每个温度下平衡5min，每隔5℃检测一次。然后绘制粒径随温度变化曲线，如附图3所示，将粒径变化50％时对应的温度定义为浊点温度(Tcp)，测得共聚物十二的Tcp为51℃。
反应性UCST共聚物的反应性——蛋白捕获与共组装
实施例19
将2mg/mL的共聚物二与10mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)等体积混合，并于室温孵育5h。然后采用超滤管(截留分子量10万)离心分离(4000rpm，2min)，除去未结合的BSA，收集浓缩液得到生物杂化纳米粒子一。
使用原子力显微镜观察得到的纳米粒子形貌，附图4A显示该粒子呈球形结构，粒径约为30-60nm。
实施例20
将2mg/mL的共聚物二的水溶液与10mg/mL的卵清蛋白(OVA)水溶液等体积混合，并于室温孵育5h。然后采用超滤管(截留分子量10万)离心分离(4000rpm，2min)，除去未结合的OVA，收集浓缩液得到生物杂化纳米粒子二。
使用原子力显微镜观察得到的纳米粒子形貌。附图4B显示该粒子呈球形结构，粒径约为30-60nm。
实施例21
将2mg/mL的共聚物一的水溶液与2mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)水溶液等体积混合，并于室温孵育5h。然后采用超滤管(截留分子量10万)离心分离(4000rpm，2min)，除去未结合的BSA，收集浓缩液得到生物杂化纳米粒子三。
实施例22
将2mg/mL的共聚物十二的水溶液与12mg/mL的卵清蛋白(OVA)水溶液等体积混合，并于室温孵育5h。然后采用超滤管(截留分子量10万)离心分离(4000rpm，2min)，除去未结合的OVA，收集浓缩液得到生物杂化纳米粒子四。
实施例23
将2mg/mL的共聚物十一的水溶液与12mg/mL的卵清蛋白(OVA)水溶液等体积混合，并于室温孵育5h。然后采用超滤管(截留分子量10万)离心分离(4000rpm，2min)，除去未结合的OVA，收集浓缩液得到生物杂化纳米粒子五。
实施例24
生物杂化纳米粒子中的蛋白质的二级结构检测：使用圆二色谱仪检测生物杂化纳米粒子一中的蛋白质活性，并与游离BSA进行对比，如附图5所示，两个样品的圆二色性几乎一致，表明BSA与共聚物发生反应后仍然维持了原有的二级结构。
实施例25
生物杂化纳米粒子中的蛋白质的生物活性的测定：乙酸对硝基苯酯可在BSA的催化下，在水溶液中水解为对硝基苯酚，利用紫外分光光度计检测产物对硝基苯酚在400nm处的吸光度，可以测定BSA的生物活性。具体的，配置BSA浓度为1mg/mL的生物杂化纳米粒子一，同时以1mg/mL的游离BSA为对照组，配置4mg/mL的乙酸对硝基苯酯的乙腈溶液，将10μL的乙酸对硝基苯酯的乙腈溶液加入至1mL生物杂化纳米粒子一或游离BSA溶液中，37℃孵育4h，然后以紫外分光光度计检测上述样品在400nm处的吸光度，将游离BSA的生物活性作为100％，进而折算生物杂化纳米粒子一相对于游离BSA的活性，结果如附图6所示，BSA在杂化纳米粒子中仍然能够保持95％以上的活性，表明共聚物与BSA的反应和共组装过程，几乎没有影响BSA原有的生物活性。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种反应性UCST共聚物，其特征在于，侧链结构由两类单体组成：丙烯酰胺类单体和反应性单体，其中丙烯酰胺类单体与反应性单体的摩尔比为1.7:1～20:1；
所述丙烯酰胺类单体为丙烯酰胺或N-丙烯酰甘氨酰胺；所述反应性单体为二硫吡啶基乙基丙烯酰胺、二硫吡啶基乙基甲基丙烯酰胺、二硫吡啶基乙基丙烯酸酯和二硫吡啶基乙基甲基丙烯酸酯中的一种或多种；
所述共聚物可与蛋白质发生共组装，形成稳定的聚合物-蛋白质纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的一种反应性UCST共聚物，其特征在于，所述反应性UCST共聚物的构筑结构为线性、支化或交联结构。
3.根据权利要求2所述的一种反应性UCST共聚物，其特征在于，所述反应性UCST共聚物为线性或支化结构时，共聚物的分子量分布指数为1.1～3.0，重均分子量为1～20万；
所述反应性UCST共聚物为交联结构时，结构中还包括交联单体，交联度<10％，吸水倍数>60％。
4.一种如权利要求1～3任一项所述的反应性UCST共聚物的制备方法，其特征在于，以丙烯酰胺类单体和反应性单体为原料，通过自由基聚合法、可逆加成-断裂链转移聚合法或原子转移自由基聚合法制备。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，当反应性UCST共聚物为线性共聚物时，采用自由基聚合法制备，步骤包括：将引发剂和单体溶于溶剂中，排除氧气后，聚合，除去未反应单体，干燥得到反应性UCST共聚物；
当反应性UCST共聚物为线性共聚物时，采用可逆加成-断裂链转移聚合法制备，步骤包括：将单体、链转移剂与引发剂溶于溶剂中，溶液经液氮冷冻-抽真空-通氩气-化冻循环排除氧气后，聚合，除去未反应单体，干燥得到反应性UCST共聚物；
当反应性UCST共聚物为线性共聚物时，采用原子转移自由基聚合法制备，步骤包括：将单体、引发剂与铜催化剂溶于溶剂中，溶液经液氮冷冻-抽真空-通氩气-化冻循环排除氧气后，聚合，除去铜催化剂和未反应单体，干燥得到反应性UCST共聚物；
当反应性UCST共聚物为支化共聚物时，采用可逆加成-断裂链转移聚合法制备，步骤包括：将单体、支化结构的链转移剂与引发剂溶于溶剂中，溶液经液氮冷冻-抽真空-通氩气-化冻循环排除氧气后，聚合，除去未反应单体，干燥得到反应性UCST共聚物；
当反应性UCST共聚物为支化共聚物时，采用原子转移自由基聚合法制备，步骤包括：将单体、支化结构的引发剂与铜催化剂溶于溶剂中，溶液经液氮冷冻-抽真空-通氩气-化冻循环排除氧气后，聚合，除去铜催化剂和未反应单体，干燥得到反应性UCST共聚物；
当反应性UCST共聚物为交联共聚物时，采用自由基聚合法制备，步骤包括：将引发剂和单体及交联剂单体溶于溶剂中，排除氧气后，聚合，除去未反应单体，干燥得到交联反应性UCST共聚物。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二氧六环和水中的一种或多种。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述单体在溶剂中的浓度为0.01～0.5g/mL，丙烯酰胺类单体和反应性单体的摩尔比为1.7:1～20:1；所述除去未反应单体具体为将反应液沉淀至沉淀剂中纯化；所述干燥为真空干燥或冷冻干燥。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述引发剂的加入量为单体摩尔数的0.01～0.5％；
所述自由基聚合法，聚合温度60～70℃，聚合时间5～24h；
所述可逆加成-断裂链转移聚合法，聚合温度50～70℃，聚合时间10～72h；
所述原子转移自由基聚合法，聚合温度60～90℃，聚合时间10～72h。
9.一种组装体，其特征在于，通过权利要求1～3任一项所述的反应性UCST共聚物与含氨基或巯基的高分子进行反应得到。
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