CN114075528A - 一种大量产生稻瘟病菌有性世代的分生孢子涂布法 - Google Patents

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CN114075528A CN202111048403.XA CN202111048403A CN114075528A CN 114075528 A CN114075528 A CN 114075528A CN 202111048403 A CN202111048403 A CN 202111048403A CN 114075528 A CN114075528 A CN 114075528A
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Abstract

本发明提供了一种大量产生稻瘟病菌有性世代的分生孢子涂布法，包括1)制备稻瘟病菌不同交配型的分生孢子悬浮液；2)在燕麦培养基上按1∶1的比例涂布不同交配型的分生孢子悬浮液；3)在培养温度为12℃‑27℃、光照为5000lux‑15000lux的培养条件下培养5‑15天，获得大量稻瘟病菌子囊和子囊孢子。本发明解决了传统现有技术对峙培养法产生有性世代子囊壳和子囊孢子的总量少、不稳定、样品间差异大、有性后代成熟度不一致等缺点，可以在短时间内获得大量的稻瘟病菌有性世代，子囊壳和子囊孢子形成速度快，成熟度一致，得到的子囊壳和子囊孢子能够用于菌株有性生殖能力的量化比较、有性结构观察、核酸提取和基因表达定量分析。

Description

一种大量产生稻瘟病菌有性世代的分生孢子涂布法
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体地说是一种新的方法，是关于稻瘟病菌有性世代的培养制备方法，该制备方法为孢子涂布法(Spore coating，SC法)。
背景技术
稻瘟病是水稻上最重要的病害之一，严重影响水稻产量。稻瘟病菌，也称稻梨孢，拉丁名Pyricularia oryzae，属于真菌界Fungi，子囊菌门Ascomycota，粪壳菌纲Sordariomycetes，巨座壳目Magnaporthales，巨座壳科Pyriculariaceae，梨孢属Pyricularia。稻瘟病菌可以侵染水稻的叶片、茎节、枝梗、穗颈及谷粒，除了水稻，还能侵染大麦、小麦、稷等50多种禾本科植物。目前，筛选和培育抗病的水稻品种是稻瘟病防治的最重要措施。但由于田间稻瘟病菌不断变异，高致病力菌株的不断出现导致群体结构变化，从而使抗病品种种植3-5年就会丧失田间抗性。因此，稻瘟病菌的易变异性是稻瘟病难于防治的根本原因。
繁殖是具有种的全部典型性的新个体的形成，营养体生长一定时期产生的繁殖器官称繁殖体。真菌的繁殖，多由营养器官转变而来，有些真菌当生育到某一阶段，整个营养体转变为繁殖体，真菌繁殖时产生各种各样的孢子作为繁殖单位，繁殖形式分为无性和有性。
真菌无性繁殖指不经过两个性细胞或性器官的结合而进行繁殖产生新个体，这类无性孢子是直接在真菌的营养体及其分化的特殊结构上产生，本质上与高等植物的块茎、鳞茎相似。常见的无性孢子有游动孢子、孢囊孢子、分生孢子及厚垣孢子，子囊菌和担子菌的无性孢子的主要为分生孢子，是真菌中最常见的孢子形态。稻瘟病菌无性态为稻梨孢菌(Pyricularia oryzae)。自然条件下，稻瘟病菌的侵染过程主要由无性的分生孢子完成。近20年来，稻瘟病菌的无性孢子产生和侵染过程的分子机制研究取得了较大的进展，参与产孢、附着胞形成、侵染和扩展的大量基因得到了鉴定和分析。
真菌有性生殖是指通过两个性细胞或性器官的结合而进行生殖的一种方式。有性生殖产生的孢子称有性孢子。有性生殖过程以细胞核结合为特征，通过能动或不能动的配子、配子囊、菌体之间的结合来实现。配子囊接触交配是子囊菌的常见性细胞结合方式之一，配子囊是真菌的性器官，有同形或异形的。同形配子囊有“+、-”两型，异型配子囊有雌雄之别，交配时一方的细胞核通过授精管(丝)输入对方的配子囊内，其后前者迅速消解，子囊菌的授精管由雌性(雌配子囊)产生。子囊菌有性孢子的类型，主要是子囊孢子。子囊孢子由两个异型配子囊，雄器和产囊体相结合，在产囊体上长出许多丝状分枝的产囊丝，产囊丝顶端细胞伸长和弯曲形成钩状体，而后形成子囊母细胞，发育成子囊，子囊内的两性细胞核结合后分裂，一般形成8个或4个、2个内生的，细胞核为单倍体的子囊孢子。子囊孢子产生于子囊内，子囊被子囊壳包被，是子囊菌的主要特征。在实验室条件下，稻瘟病菌也可以进行有性生殖，其有性态为Magnaporthe oryzae。稻瘟病菌的有性生殖方式属于异宗配合，需要两个携带不同交配型基因(MAT1-1或MAT1-2)的单倍体菌株进行融合才能产生有性后代。1982年，Kato等首次在人工培养条件下成功实现稻瘟病菌菌株之间的交配并形成子囊壳。稻瘟病菌成熟的子囊壳呈球形，具有长的喙，球状部分含有大量的子囊。子囊呈长棒状，内含8个纵向排列的子囊孢子。对于多种生物而言，有性生殖比无性繁殖更容易产生变异，使后代具有遗传多样性和更强的适应力，是遗传重组的重要驱动力。现有技术认为，稻瘟病菌起源于东南亚，在东南亚某些地区可能存在有性生殖方式。但至目前，在自然条件下稻瘟病菌能否产生有性世代依然没有证实，稻瘟病菌有性世代对病菌遗传变异和群体致病力变异的贡献尚不清楚。因此，研究稻瘟病菌有性生殖的过程和机制对于全面了解病菌的生活史，解释病菌的变异来源具有重要的意义。然而，相对于侵染机制的研究，稻瘟病菌有性生殖研究少得多，也缺乏必要的研究方法。
建立稳定的可产生大量有性后代的方法，是研究有性生殖的必要前提。传统的稻瘟病菌有性生殖产生方法采用将具有相反交配型的菌株交叉接种于人工培养基上，待生长至菌落相接后，继续培养大约20天，可在菌株交汇处产生一条子囊壳带。该方法能产生成熟的子囊壳和子囊孢子，但子囊壳带宽仅2-3mm，子囊壳和子囊孢子的总量少，给进一步研究，尤其是分子生物学研究带来不便，因为这样获得的有性孢子量无法支持核酸测序、蛋白组分析等分子生物学研究所需要样本量。同时，上述方法还存在不稳定、样品间差异大、有性后代成熟度不一致等缺点。
发明内容
本发明提供一种新的稻瘟病菌有性世代培养的方法——分生孢子涂布法：包括以下步骤：
1)制备稻瘟病菌不同交配型的分生孢子悬浮液；
2)在燕麦培养基上按1∶1的比例涂布不同交配型的分生孢子悬浮液；
3)在培养温度为12℃-27℃、光照为5000lux-15000lux的培养条件下培养5-15天，获得大量稻瘟病菌子囊和子囊孢子。
进一步地，稻瘟病菌的分生孢子悬浮液浓度为5×103个/mL-1×105个/mL；更为优选地，稻瘟病菌的孢子悬浮液浓度为5×103个/mL、1×104个/mL、2×104个/mL、4×104个/mL、8×104个/mL或1×105个/mL。
优选的，稻瘟病菌不同交配型的分生孢子悬浮液浓度为相同。
优选的，步骤(3)中的培养温度为20℃。
优选的，步骤(3)中培养条件为全光照培养或6h/18h，12h/12h，18h/6h光暗交替培养。
本发明解决了传统现有技术对峙培养法产生有性世代子囊壳和子囊孢子的总量少、不稳定、样品间差异大、有性后代成熟度不一致等缺点，提供了一种新的稻瘟病菌有性世代培养的方法——分生孢子涂布法(SC法)，与现有技术相比，SC法可以在短时间内获得大量的稻瘟病菌有性世代，子囊壳和子囊孢子形成速度快，成熟度一致，得到的子囊壳和子囊孢子能够用于菌株有性生殖能力的量化比较、有性结构观察、核酸提取和基因表达定量分析。
附图说明
图1：不同交配型分生孢子涂布产生有性世代图。将不同菌株组合(Guy11+2539、Guy11+TH3、TH16+2539、TH16+TH3四种组合)的孢子(SC法)涂布于OMA平板，在20℃全光照条件下培养。孢子迅速萌发，第2天便可见新生的菌丝均匀分布于培养基表面，此时两个菌株的菌丝已开始接触；菌丝不断生长，至第5天将培养基表面完全遮盖；培养10d后，菌落表面可见分散的小点，即子囊壳；子囊壳逐渐增多变大，至15d，可密布于培养基表面。不同菌株组合形成子囊壳的速度略有差异，但都能在培养15d左右形成大量的子囊壳，布满培养基表面。
图2：分生孢子涂布法(SC法)和传统对峙法(TC法)形成的子囊壳比较图。分生孢子涂布法形成子囊壳在大小、形态和分布上均正常。
图3：分生孢子涂布法(SC法)培养15d、传统对峙法(TC法)培养25d形成的子囊壳数量统计图。
图4：分生孢子涂布法(SC法)培养15d、传统对峙法(TC法)培养25d形成的子囊孢子数量统计图。
图5：分生孢子涂布法(SC法)和传统对峙法(TC法)形成的子囊壳和子囊孢子形态比较图。在荧光显微镜下，可见培养15d形成的子囊壳中含有大量子囊，子囊内可见均匀排列、大小均一的8个子囊孢子(图5，A/B)，与报道的子囊壳结构一致。对子囊壳进行石蜡切片观察，可见子囊有规律的排布于子囊壳的内壁上(图5，C)。此外，石蜡切片观察还表明，子囊壳球状部分埋生于菌丝组织内，而并非埋生于培养基内部。进一步利用冷冻扫描电镜观察，可见密布于菌组织表面的子囊壳喙部(图5，D)。在子囊壳随机断裂的断面上，能观察到子囊孢子和子囊壁。通过透射电镜可以清晰地观察子囊孢子细胞的内部结构，以及细胞核、线粒体等细胞器。成熟的子囊孢子一般含有4个细胞，每个细胞往往含有一个巨大的油球(图5，E)。
图6：实时荧光定量PCR交配型基因检测图。以Guy11+TH3菌株SC法形成的子囊壳提取的RNA为模板，能有效的检测MAT1-1-1基因的表达，结果符合预期，MAT1-1-1基因存在于交配形成的子囊产物(右)中，不存在TH3(中)中，且在有性后代中的表达高于Guy11菌株营养生长样品(左)中的表达。
图7：选用Guy11+TH3两种交配型分生孢子悬浮液5×103个/mL，20℃，全光照为5000lux下产生有性世代图。
图8：选用Guy11+TH3两种交配型分生孢子悬浮液1×104个/mL，20℃，全光照为15000lux下产生有性世代图。
图9：选用Guy11+TH3两种交配型分生孢子悬浮液2×104个/mL，20℃，全光照为15000lux下产生有性世代图。
图10：选用Guy11+TH3两种交配型分生孢子悬浮液4×104个/mL，20℃，全光照为15000lux下产生有性世代图。
图11：选用Guy11+TH3两种交配型分生孢子悬浮液8×104个/mL，20℃，全光照为15000lux下产生有性世代图。
图12：选用Guy11+TH3两种交配型分生孢子悬浮液1×105个/mL，20℃，全光照为15000lux下产生有性世代图。
图13：两种交配型(Guy11+TH3)分生孢子悬浮液4×104个/mL，20℃，黑暗条件下产生有性世代图，结果为不产生有性世代。
图14：两种交配型(TH16+TH3)分生孢子悬浮液4×104个/mL，20℃，黑暗条件下产生有性世代图，结果为不产生有性世代。
图15：两种交配型(Guy11+TH3)分生孢子悬浮液4×104个/mL，20℃，12h光照12h黑暗条件下产生有性世代图，结果为产生有性世代。
图16：两种交配型(TH16+TH3)分生孢子悬浮液4×104个/mL，20℃，12h光照12h黑暗条件下产生有性世代图，结果为产生有性世代。
图17：两种交配型(Guy11+TH3)分生孢子悬浮液4×104个/mL，20℃，全光照条件下产生有性世代图，结果为产生有性世代。
图18：两种交配型(TH16+TH3)分生孢子悬浮液4×104个/mL，20℃，全光照条件下产生有性世代图，结果为产生有性世代。
图19：不同交配型(Guy11+TH3、TH16+TH3)分生孢子悬浮液4×104个/mL，不同温度，全光照条件下产生有性世代图。
具体实施方式
本发明所述的分生孢子涂布法，也称孢子涂布法(spore coating)，也简称SC法；传统对峙法(traditional cross)，简称TC法。
实施例一、4×104个/mL稻瘟病菌孢子悬浮液制备有性世代
1.菌株与培养条件
稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)菌株Guy11(MAT1-1)、TH16(MAT1-1)、2539(MAT1-2)、TH3(MAT1-2)的培养在完全培养基(complete medium，CM)上进行。燕麦培养基(oatmealagar medium，OMA)用于诱导不同交配型菌株产生有性世代。
CM培养基配方(1L)
Figure BDA0003251803530000051
以上试剂按照相应的量称好后定容到相应的体积，用NaOH将PH调制6.5，固体培养基每升加入15g琼脂粉，121℃高压蒸汽灭菌15min。
其中：
1000×Vitamin solution(100ml):
Figure BDA0003251803530000052
以上试剂加蒸馏水溶解后定容至100ml，4℃冰箱储存。
1000×Trace Elements(100ml):
Figure BDA0003251803530000061
以上试剂加蒸馏水溶解后定容至100ml，4℃冰箱避光储存。
燕麦培养基配方：
燕麦20g，蔗糖2.5g，琼脂粉10g，去离子水配置成500ml培养基。
2.有性世代的形成
孢子涂布法(SC法)步骤如下，所有操作均在超净工作台上进行：
(1)将稻瘟病菌各菌株(Guy11、TH16、2539、70-15、TH3)接种于9cm的CM平板上，28℃下光暗交替培养9d，光照为15000lux，备用。
(2)制备OMA培养基，高压灭菌，制备9cm平板。毛刷、过滤器、漏斗、滤纸、涂布器等进行高压灭菌。
(3)取培养9d的各菌株CM平板，利用毛刷刷取孢子，过滤收集，将孢子液浓度调到4×104/mL。
(4)按不同交配型组合(Guy11/2539、Guy11/TH3、TH16/2539、TH16/TH3)，吸取各菌株孢子液各100μL置于OMA板上，用无菌涂布器涂布均匀，置于20℃全光照下培养15d。每个交配型组合3个重复。
(5)15d后观察并统计OMA板上子囊壳的产生情况，并在显微镜下观察子囊壳内部的子囊和子囊孢子形成情况及结构。
将不同菌株组合的孢子(SC法)涂布于OMA平板，在20℃全光照条件下培养。孢子迅速萌发，第2天便可见新生的菌丝均匀分布于培养基表面，此时两个菌株的菌丝已开始接触；菌丝不断生长，至第5天将培养基表面完全遮盖；培养10d后，菌落表面可见分散的小点，即子囊壳；子囊壳逐渐增多变大，至15d，可密布于培养基表面。不同菌株组合形成子囊壳的速度略有差异，但都能在培养15d左右形成大量的子囊壳，布满培养基表面(图1)。继续培养至20d，子囊壳数量和大小不再发生显著的变化。在同样的培养条件下，利用TC法，两个交配型菌株需要25-30d才能产生成熟子囊壳。因此，SC法在子囊壳产生时间上更具优势。
SC法产生的子囊壳密布整个培养皿，而TC法只能在菌株交界线上产生带状分布的子囊壳带。对SC法培养15d、TC法培养25d形成的子囊壳和子囊孢子进行数量统计，结果表明利用SC法在每个培养皿上产生的子囊壳和子囊孢子数量是TC法的近100倍(图3和图4)。在体视镜下观察可见，SC法和TC法形成的子囊壳，在大小、形态分和布上均无明显差异(图2)。
3.子囊壳结构观察
为了验证SC法形成的子囊壳的结构和成熟度，我们利用卡氏白染色、显微观察、石蜡切片、扫描电镜和透射电镜等方法对SC法和TC法产生的子囊壳、子囊和子囊孢子的数量和结构进行了观察与比较。
卡氏白染色显微观察：挑取SC法和HC法产生的子囊壳，置于滴加了10μL卡氏白染色液(50μg/mL，溶于水)的载玻片上，盖上盖玻片后适当用力挤压子囊壳使其破碎释放出子囊或子囊孢子，避光染色5min，在荧光显微镜(激发波长405nm、发射波长410-480nm)下观察子囊壳、子囊和子囊孢子的形态，同时与传统对峙培养产生的子囊孢子进行比较。石蜡切片：从培养基上挑取适量的子囊壳，制备石蜡切片，观察子囊壳切片结构。
电镜观察：利用冷冻环境扫描电镜(型号)观察子囊壳表面及内部的形态及结构；利用透射电镜(型号)进一步观察子囊孢子内部的亚细胞结构。
利用卡氏白染色，在荧光显微镜下，可见培养15d形成的子囊壳中含有大量子囊，子囊内可见均匀排列、大小均一的8个子囊孢子(图5，A/B)，与报道的子囊壳结构一致。对子囊壳进行石蜡切片观察，可见子囊有规律的排布于子囊壳的内壁上(图5，C)。此外，石蜡切片观察还表明，子囊壳球状部分埋生于菌丝组织内，而并非埋生于培养基内部。进一步利用冷冻扫描电镜观察，可见密布于菌组织表面的子囊壳喙部(图5，D)。在子囊壳随机断裂的断面上，能观察到子囊孢子和子囊壁。通过透射电镜可以清晰地观察子囊孢子细胞的内部结构，以及细胞核、线粒体等细胞器。成熟的子囊孢子一般含有4个细胞，每个细胞往往含有一个巨大的油球(图5，E)。这些观察结果和方法为有性生殖的进一步研究提供了参考。
4.总RNA的提取与定量PCR检测
SC法在OMA培养基上培养15d后，产生大量的子囊壳。利用灭菌刀片，刮取收集子囊壳约100mg，利用试剂盒(TIANGEN公司)提取总RNA，通过电泳检测和吸光值测定检验RNA的质量与完整性。以提取的总RNA为模板进行反转录，然后进行实时荧光定量PCR分析。
为更好评估SC法可否得到高纯度的RNA，我们将SC法和TC法得到的子囊壳用相同的方法提取RNA后进行电泳验证。结果显示，不管是TC法还是SC法都能有效的提取稻瘟病菌交配产生的后代RNA。对提取的RNA逆转录为cDNA后，通过实时荧光定量PCR技术进一步验证SC法所得后代RNA的质量(图6)。结果显示，以Guy11+TH3菌株SC法形成的子囊壳提取的RNA为模板，能有效的检测MAT1-1-1基因的表达，结果符合预期(MAT1-1-1基因存在于Guy11中，不存在TH3中，且在有性后代中的表达高于Guy11菌株营养生长样品中的表达)。这些实验事实表明SC法能够产生数量足够多的有性后代，使之提供足够量的RNA，用于检测基因的表达，而且对有性时代相关基因的表达无不利影响。
因此，我们发明的SC法提供了一种大量产生稻瘟病菌有性后代的方法。利用该方法，能更加快速的产生大量、均一、稳定的有性后代；产生的有性后代量能提供足够的DNA或RNA样品，用于基因表达检测和进一步的分子生物学研究，弥补了稻瘟病菌有性生殖机制研究上方法的欠缺。
实施例二、5×103个/mL稻瘟病菌孢子悬浮液制备有性世代
选用Guy11+TH3，将实施例一中的稻瘟病菌孢子悬浮液调整到5×103个/mL，光照为5000lux，得到有性世代(图7)。
实施例三、5×103个/mL稻瘟病菌孢子悬浮液制备有性世代
选用Guy11+TH3，将实施例一中的稻瘟病菌孢子悬浮液调整到5×103个/mL，光照为10000lux，得到有性世代。
实施例四、5×103个/mL稻瘟病菌孢子悬浮液制备有性世代
选用Guy11+TH3，将实施例一中的稻瘟病菌孢子悬浮液调整到5×103个/mL，光照为15000lux，得到有性世代。
实施例五、1×104个/mL稻瘟病菌孢子悬浮液制备有性世代
选用Guy11+TH3，将实施例一中的稻瘟病菌孢子悬浮液调整到1×104个/mL，得到有性世代(图8)。
实施例六、2×104个/mL稻瘟病菌孢子悬浮液制备有性世代
选用Guy11+TH3，将实施例一中的稻瘟病菌孢子悬浮液调整到2×104个/mL，得到有性世代(图9)。
实施例七、4×104个/mL稻瘟病菌孢子悬浮液制备有性世代
选用Guy11+TH3，将实施例一中的稻瘟病菌孢子悬浮液调整到4×104个/mL，得到有性世代(图10)。
实施例八、8×104个/mL稻瘟病菌孢子悬浮液制备有性世代
选用Guy11+TH3，将实施例一中的稻瘟病菌孢子悬浮液调整到8×104个/mL，得到有性世代(图11)。
实施例九、1×105个/mL稻瘟病菌孢子悬浮液制备有性世代
选用Guy11+TH3，将实施例一中的稻瘟病菌孢子悬浮液调整到1×105个/mL，得到有性世代(图12)。
实施例十、1×105个/mL稻瘟病菌孢子悬浮液制备有性世代
选用Guy11+TH3，将实施例一中的稻瘟病菌孢子悬浮液调整到1×105个/mL，光照为10000lux，得到有性世代。
实施例十一、1×105个/mL稻瘟病菌孢子悬浮液制备有性世代
选用Guy11+TH3，将实施例一中的稻瘟病菌孢子悬浮液调整到1×105个/mL，光照为15000lux，得到有性世代。
实施例十二、4×104个/mL稻瘟病菌孢子悬浮液全黑暗制备有性世代
将实施例一中的稻瘟病菌(Guy11+TH3)孢子悬浮液涂板后置于全黑暗培养，无法得到有性世代(图13)。
实施例十三、4×104个/mL稻瘟病菌孢子悬浮液全黑暗制备有性世代
将实施例一中的稻瘟病菌(TH16+TH3)孢子悬浮液涂板后置于全黑暗培养，无法得到有性世代(图14)。
实施例十四、4×104个/mL稻瘟病菌孢子悬浮液12h光照-12h黑暗制备有性世代
将实施例一中的稻瘟病菌(Guy11+TH3)孢子悬浮液涂板后置于12h光照-12h黑暗培养，得到有性世代(图15)。
实施例十五、4×104个/mL稻瘟病菌孢子悬浮液12h光照-12h黑暗制备有性世代
将实施例一中的稻瘟病菌(TH16+TH3)孢子悬浮液涂板后置于12h光照-12h黑暗培养，得到有性世代(图16)。
实施例十六、4×104个/mL稻瘟病菌孢子悬浮液全光照制备有性世代
将实施例一中的稻瘟病菌(Guy11+TH3)孢子悬浮液涂板后置于全光照培养，得到有性世代(图17)。
实施例十七、4×104个/mL稻瘟病菌孢子悬浮液全光照制备有性世代
将实施例一中的稻瘟病菌(TH16+TH3)孢子悬浮液涂板后置于全光照培养，得到有性世代(图18)。
实施例十五、4×104个/mL稻瘟病菌孢子悬浮液不同温度制备有性世代
将实施例一中的稻瘟病菌孢子悬浮液涂板后置于12-27℃温度培养，得到有性世代。对于温度而言，不管是Guy11+TH3还是TH16+TH3，过低或过高的温度都不能形成足够数量的子囊壳，不过对于不同的稻瘟病菌交配其温度的耐受性是有差异的，但是最适温度维持在20℃(图19)。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种大量产生稻瘟病菌有性世代的分生孢子涂布法，其特征是：包括以下步骤：
1)制备稻瘟病菌不同交配型的分生孢子悬浮液；
2)在燕麦培养基上按1∶1的比例涂布不同交配型的分生孢子悬浮液；
3)在培养温度为12℃-27℃、光照为5000lux-15000lux的培养条件下培养5-15天，获得大量稻瘟病菌子囊和子囊孢子。
2.根据权利要求1所述的大量产生稻瘟病菌有性世代的分生孢子涂布法，其特征是：步骤(1)中稻瘟病菌的分生孢子悬浮液浓度为5×103个/mL-1×105个/mL。
3.根据权利要求2所述的大量产生稻瘟病菌有性世代的分生孢子涂布法，其特征是：分生孢子悬浮液浓度为5×103个/mL、1×104个/mL、2×104个/mL、4×104个/mL、8×104个/mL或1×105个/mL。
4.根据权利要求1所述的大量产生稻瘟病菌有性世代的分生孢子涂布法，其特征是：不同交配型的分生孢子悬浮液的浓度相同。
5.根据权利要求1所述的大量产生稻瘟病菌有性世代的分生孢子涂布法，其特征是：所述的培养温度为20℃。
6.根据权利要求1所述的大量产生稻瘟病菌有性世代的分生孢子涂布法，其特征是：步骤(3)中培养条件为全光照培养。
7.根据权利要求1所述的大量产生稻瘟病菌有性世代的分生孢子涂布法，其特征是：步骤(3)的培养条件为：6h/18h，12h/12h，18h/6h光暗交替培养。
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