CN114075266A - 一种用于光热治疗的多肽组装单体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于光热治疗的多肽组装单体及其制备方法和应用，所述多肽组装单体包括依次连接的靶向多肽序列、响应多肽序列和组装多肽序列；所述组装多肽序列的两端侧链上分别连接有光热治疗剂X1和X2。所述多肽组装单体通过多肽序列的特殊设计及其与光热治疗剂的相互配合，使其能够通过分子识别的主动靶向方式递送到病灶部位、特异性与靶点结合，实现原位的分子剪切和自组装，形成的组装体对光热治疗剂具有保护和稳定的功能，同时大大提高了光热治疗剂的分子递送效率和光热转化效率，增强病灶部位滞留时间，提高光热治疗剂在肿瘤部位的富集效率、稳定性和光热转化效率，为进一步发展纳米光热治疗体系提供了新的策略。
Description
技术领域
本发明属于生物纳米材料技术领域，具体涉及一种用于光热治疗的多肽组装单体及其制备方法和应用。
背景技术
光热治疗(Photo-thermal therapy，PTT)是近年来发展的一种非侵入性热消融治疗技术，该技术主要以具有光吸收能力的物质充当光热治疗剂，在激光照射下使其局部温度升高来杀伤肿瘤细胞。由于肿瘤部位血管的不均质特性，肿瘤对42～45℃的高温比正常组织更加敏感，因此，光热治疗技术最显著的特征在于无创性或微创性，使患者在治疗过程中的痛苦程度降低；而且，光热治疗过程产生的热量不会引发系统反应，副作用显著降低。因此，与传统的化疗手段相比，光热治疗对肿瘤的治疗更加有效，且对正常组织的损害极低，引起了研究人员的广泛关注。
光热治疗剂具有提高光热治疗的效率、范围、深度和肿瘤选择性的作用，光热治疗剂吸收近红外(NIR)光，并将其高效转换为热能。随着纳米技术和纳米材料快速发展，在近红外光区具有强吸收的无机纳米材料，例如金纳米材料、钯纳米片、碳纳米材料或硫化铜纳米材料等已被作为光热治疗剂应用于光热治疗的研究中。然而，无机纳米材料在体内不易降解，具有一定的潜在长期毒性的问题，因此限制了他们的进一步应用。
目前比较常见的光热治疗剂是有机小分子光热治疗剂，基于有机材料的光热治疗剂相比无机材料，生物相容性更高，在临床应用更加容易，但是目前仅有一种有机近红外染料吲哚菁绿被美国食品药物管理局批准用于临床。原因在于，近红外染料虽然光热转化效率较高，但是其在水中不稳定，进入体内后会被快速地排出，且容易发生光漂白，这些缺点限制了其在光热治疗领域的运用。为了提升光热治疗剂的结构稳定性和光稳定性，研究人员从材料的组分和组装结构入手进行了一系列研究工作。
CN105457026A公开了一种类聚苯胺基可注射光热水凝胶，该水凝胶为α-环糊精与水溶性高分子光热材料构成的二元体系水凝胶，所述水溶性高分子光热材料为聚乙二醇接枝聚N-苯基甘氨酸，包括主链和侧链，其中主链为聚N-苯基甘氨酸，所述侧链为聚乙二醇。此种水凝胶具有很好的光热转换能力，可用于光热治疗。
CN108815524A公开了一种透明质酸修饰聚吡咯包裹载药相变材料光热治疗剂，所述光热治疗剂包括载药相变材料核心、聚吡咯外壳以及吸附在聚吡咯壳层表面的透明质酸；所述光热治疗剂的粒径分布均匀，可靶向作用于肿瘤部位，具有良好的光热转换效率和光声显影效果。
CN109793710A公开了一种光热化疗联合治疗微环境响应的载药纳米胶束，所述纳米胶束包括噻吩异靛蓝苯并噻二唑、药物活性成分和两亲性嵌段聚合物；其中，两亲性嵌段聚合物为聚乙二醇-聚天冬氨酸。该载药纳米胶束通过将近红外染料和化疗药物同时负载在纳米胶束上，使其能够同时发挥光热治疗和化疗的效果。
然而，现有技术中公开的聚合物纳米粒子、纳米胶束等虽然可以在一定程度上提高光热治疗剂的光稳定性，但多次高功率激光照射仍会对其结构造成破坏，其在生理环境下的稳定性仍然具有很大的提升空间。而且，包括上述材料在内的光热治疗剂普遍没有在肿瘤组织中的靶向富集功能，无法发挥定向治疗的效果。
因此，开发一种兼具高稳定性、高光热转换效率和良好靶向性的光热治疗剂，是本领域的研究重点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于光热治疗的多肽组装单体及其制备方法和应用，通过多肽序列的特殊设计及其与光热治疗剂的相互配合，使所述多肽组装单体能够主动靶向递送到病灶部位并实现原位的分子裁剪和组装，形成的组装体具有优异的稳定性和高效的光热转换性能，能够发挥出良好的肿瘤光热治疗效果。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于光热治疗的多肽组装单体，所述多肽组装单体包括依次连接的靶向多肽序列、响应多肽序列和组装多肽序列；所述组装多肽序列的两端侧链上分别连接有光热治疗剂X1和X2。
本发明提供的多肽组装单体是基于“活体自组装”理念设计出的一种特殊多肽单体，其精髓在于能够将所述多肽组装单体主动靶向递送到病灶部位并实现原位的分子裁剪和组装，形成的组装体可以具有不同于小分子的特殊生物功能。所述多肽组装单体包括依次连接的靶向多肽序列、响应多肽序列和组装多肽序列，所述组装多肽序列的两端侧链上分别连接有光热治疗剂X1和X2，其结构示意图如图1所示；所述多肽组装单体可以靶向递送到病灶部位后产生特异性响应，在病灶部位通过高表达的酶对分子进行剪切从而实现高效的原位自组装，具有独特的组装诱导聚集效应，自组装可能会导致光热治疗剂之间的荧光自猝灭，其吸收的近红外光能量将主要转换为热能，使形成的组装体的光热转换效率显著提高；最后，组装体将长期滞留于病灶部位，能更有效地发挥光热治疗剂的治疗功能。
本发明中，所述靶向多肽序列包括多肽序列MARSGL、RGDLATLRQL、GGVSCMQTSPVCENNL或AVPI中的任意一种。
优选地，所述多肽序列MARSGL对应的识别蛋白为ErbB2，所述多肽序列RGDLATLRQL对应的识别蛋白为αvβ6，所述多肽序列GGVSCMQTSPVCENNL对应的识别蛋白为TAG-72，所述AVPI对应的识别蛋白为X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)。
本发明中，所述响应多肽序列为含有功能酶底物的多肽序列。
优选地，所述响应多肽序列包括MMP-7响应序列VPLSLTM、Caspase-3/7响应序列DEVD或Furin响应序列RVRRCK中的任意一种。
优选地，所述响应多肽序列的响应序列长度为3～10个氨基酸，例如3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸。
优选地，所述响应多肽序列被酶切后连接在组装多肽序列一端的氨基酸数目≤3个，例如1个或2个。
本发明中，所述组装多肽序列为具有α-螺旋(α-helix)组装、β-折叠(β-sheet)组装或β-转角(β-hairpin)组装功能的多肽序列；优选为具有β-折叠(β-sheet)组装功能的多肽序列。
优选地，所述具有α-螺旋组装功能的多肽序列包括AAAAAAD、VVVVVVD或LLKK中的任意一种。
优选地，所述具有β-折叠组装功能的多肽序列包括XAAA、AEAKAEAK或KLVFFAE中的任意一种，进一步优选为KLVFFAE。
优选地，所述具有β-转角组装功能的多肽序列包括YPGDV或VKVKVKVKDPPTKVKVKVKV。
优选地，所述组装多肽序列的两端侧链上含有巯基。
本发明中，所述多肽组装单体主动靶向递送到病灶部位并实现原位的分子裁剪和自组装，组装驱动力可以为氢键、范德华力或π-π相互作用等，组装过程为成核生长过程；自组装形成的组装体具有纳米纤维结构，具有长效滞留的特点，最终可以通过蛋白酶的降解被清除。
本发明中，所述靶向多肽序列、响应多肽序列和组装多肽序列通过酰胺键依次连接。
本发明中，所述X1、X2均为650～950nm范围内具有吸收和光热转换效应的光热治疗剂。
优选地，所述X1、X2各自独立地选自吲哚箐绿、花菁染料、卟啉、亚甲基蓝或Bodipy类荧光染料中的任意一种。
优选地，所述X1、X2各自独立地选自如下结构中的任意一种：
其中，R1选自
中的任意一种；
m选自1～11的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11；
R2选自F、Cl、Br或I中的任意一种；
n选自0、1或2。
优选地，所述X1、X2通过不可水解的化学键与所述组装多肽序列相连。
示例性的，所述X1、X2上含有卤素，所述组装多肽序列的侧链上含有巯基，卤素和巯基发生化学反应，使所述X1、X2与组装多肽序列相连。
优选地，所述X1、X2为相同的光热治疗剂。
优选地，所述多肽组装单体包括通过酰胺键依次连接的靶向多肽序列AVPIAQK、响应多肽序列DEVD和组装多肽序列GCKLVFFAECG；所述组装多肽序列GCKLVFFAECG两端侧链上分别连接有光热治疗剂X1和X2；所述X1和X2均为花菁染料Cy7-Cl。
其中，Cy7-Cl的结构式为：
另一方面，本发明提供一种如上所述的多肽组装单体的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)通过固相合成法合成靶向多肽序列、响应多肽序列和组装多肽序列并连接，得到多肽片段；
(2)将步骤(1)得到的多肽片段与光热治疗剂X1和X2进行连接反应，得到所述多肽组装单体。
优选地，步骤(2)所述多肽片段与光热治疗剂X1的摩尔比为1:(1.0～1.2)，例如1:1.02、1:1.04、1:1.06、1:1.08、1:1.10、1:1.11、1:1.13、1:1.15、1:1.17或1:1.19等。
优选地，步骤(2)所述多肽片段与光热治疗剂X2的摩尔比为1:(1.0～1.2)，例如1:1.02、1:1.04、1:1.06、1:1.08、1:1.10、1:1.11、1:1.13、1:1.15、1:1.17或1:1.19等。
优选地，步骤(2)所述连接反应的温度为15～40℃，例如16℃、18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃或38℃等。
优选地，步骤(2)所述连接反应的时间为0.5～5h，例如1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h或4.5h等。
优选地，步骤(2)所述连接反应在缓冲液中进行。
优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液(PBS)。
优选地，步骤(2)所述连接反应完成后还包括产物的纯化处理；
优选地，所述纯化处理的方法为：用有机溶剂清洗反应液，除去未反应的光热治疗剂X1和X2，而后将水相加入到透析袋中用水透析纯化，冻干，得到所述多肽组装单体。
优选地，所述有机溶剂包括二氯甲烷。
优选地，步骤(1)所述固相合成法具体包括：将第一个氨基酸的C端固定于树脂上，N端用Fmoc保护基进行保护；脱去第一个氨基酸的Fmoc保护基，而后与下一个氨基酸进行缩合反应，直到将所有氨基酸通过缩合反应进行连接，得到固定于树脂的多肽片段；脱除树脂和侧链保护基，得到所述多肽片段。
优选地，所述树脂为0.35mM修饰密度的Wang树脂。
优选地，所述脱去第一个氨基酸的Fmoc保护基的试剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和六氢吡啶的混合溶液。
优选地，所述脱去第一个氨基酸的Fmoc保护基的检测试剂为茚三酮。
优选地，所述缩合反应的方法为：将待连接的氨基酸的羧基用N-甲基吗啉(NMM)和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)的DMF溶液活化，然后加入到脱去保护的树脂中进行反应。
优选地，所述反应的时间为0.75～3h，例如0.8h、1h、1.25h、1.5h、1.75h、2h、2.25h、2.5h或2.75h等。
优选地，所述脱除树脂和侧链保护基的试剂为水、乙二硫醇、三异丙基硅烷和三氟乙酸的混合溶液。
另一方面，本发明提供一种如上所述的多肽组装单体在制备光热治疗药物中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的多肽组装单体通过多肽序列的特殊设计及其与光热治疗剂的相互配合，使所述多肽组装单体能够通过分子识别的主动靶向方式递送到病灶部位、特异性与靶点结合，实现原位的分子剪切和自组装，形成的组装体对光热治疗剂具有保护和稳定的功能，同时大大提高了光热治疗剂的分子递送效率和光热转化效率，增强病灶部位滞留时间。所述多肽组装单体在病灶部位之外的器官中表现出快速清除和低药物毒性的小分子行为，在病灶部位经过原位的分子剪切和组装，形成的组装体具有纳米纤维结构，表现出长效滞留和缓慢的药物清除等纳米材料行为。所述多肽组装单体可以提高光热治疗剂在肿瘤部位的富集效率，提高其稳定性和光热转化效率，为进一步发展纳米光热治疗体系提供了新的策略。
附图说明
图1为本发明所述多肽组装单体的结构示意图；
图2为实施例1所述多肽组装单体的质谱图；
图3为实施例1所述多肽组装单体被剪切后组装体的圆二色光谱图；
图4为实施例1所述多肽组装单体被剪切后组装体的傅里叶红外光谱图；
图5为实施例1所述多肽组装单体被剪切后组装体的透射电镜图；
图6为实施例1所述多肽组装单体被剪切后组装体的透射电镜局部放大图；
图7为实施例1所述多肽组装单体被剪切前后的紫外光谱对比图；
图8为实施例1所述多肽组装单体被剪切前后的荧光光谱对比图；
图9为实施例1所述多肽组装单体在不同浓度下的光热转化结果图；
图10为实施例1所述多肽组装单体对体外肿瘤细胞的光热治疗结果图；
图11为实施例1所述多肽组装单体在小鼠体内的肿瘤光热治疗结果图；
图12为实施例1、对比例1所述多肽组装单体的被酶剪切前后的荧光光谱对比图；
图13为实施例1、对比例1所述多肽组装单体在肿瘤细胞中的荧光成像结果图；
图14为实施例1、对比例1所述多肽组装单体对体外肿瘤细胞的光热治疗结果对比图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
一种用于光热治疗的多肽组装单体，包括通过酰胺键依次连接的靶向多肽序列AVPIAQK、响应多肽序列DEVD和组装多肽序列GCKLVFFAECG；所述组装多肽序列GCKLVFFAECG两端侧链上分别连接有光热治疗剂X1和X2；所述X1和X2均为花菁染料Cy7-Cl。所述多肽组装单体的结构式如式I所示：
其中，X1、X2的结构为
*代表与式I中-S-的连接位点。
所述多肽组装单体记为AVPIAQKDEVDGC(Cy)KLVFFAEC(Cy)G，制备方法包括如下步骤：
(1)选用修饰密度为0.35mM的Wang树脂(甘氨酸的C端被固定于树脂上，N端被Fmoc保护)，用六氢吡啶和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)体积比为1:4的混合溶液脱去N端的Fmoc保护基，用茚三酮测试法检测脱保护是否成功；然后按照第一个氨基酸摩尔质量的10倍来称量下一个氨基酸和HBTU，加入偶联剂(N-甲基吗啉和DMF体积比为5:95)，用搅拌器搅拌使其充分溶解，然后将溶液转移至多肽合成管中，反应45min；按此方法将剩余的氨基酸都通过缩合反应连接上去，形成固定于树脂的多肽；用含有2.5％水、2.5％乙二硫醇和2.5％三异丙基硅烷的三氟乙酸溶液将合成好的多肽从树脂上脱除，同时脱除氨基酸的侧链保护；旋蒸除去三氟乙酸，然后多肽的粗产物用无水乙醚沉淀，洗涤并干燥，得到多肽片段AVPIAQKDEVDGCKLVFFAECG。
(2)将步骤(1)得到多肽片段和Cy7-Cl以摩尔比为1:2进行投料，将二者溶解在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，在室温下反应2h；反应液用二氯甲烷洗3次除去未反应的Cy7-Cl分子，将水相加入到透析袋中用去离子水透析纯化，最后冻干，得到所述多肽组装单体。
本实施例提供的多肽组装单体的质谱图如图2所示，根据质谱检测结果可知，所述多肽组装单体的分子式为C188H265N29O40S2 +；[M+3H]3+：1212.0；[M+4H]4+：909.2；[M+5H]5+：727.6；m/z 1211.9，909.3，727.7。
所述多肽组装单体通过小分子扩散途径进入细胞，随后在细胞质中特异性地与X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)结合，激活Caspase-3/7；激活的Caspase-3/7对分子进行剪切，使光热治疗多肽分子在原位自组装形成纳米纤维的结构；形成的纳米纤维具有β-sheet结构，可以稳定光热治疗剂Cy7分子。
所述多肽组装单体被Caspase-3剪切后，剩余的分子部分会快速实现纤维化组装，组装结构的表征结果如图3和图4所示；其中，图3为所述多肽组装单体被剪切后组装体的圆二色光谱(CD)图，图4为所述多肽组装单体被剪切后组装体的傅里叶红外光谱(FTIR)图，结合图3和图4可知，剪切后的多肽组装单体表现为典型的反平行β-sheet组装结构。
随后通过透射电子显微镜(TEM，Tecnai G2 20S-TWIN)观察所述多肽组装单体被剪切后组装体的微观形貌，得到的透射电镜图如图5所示，对图5中的方框区域进行放大，其局部放大图如图6所示；结合图5和图6可知，本实施例所述多肽组装单体被剪切后发生自组装，形成的组装体(纳米纤维)的直径为5.4±0.6nm。
测试本实施例所述多肽组装单体被酶剪切前后的光学性质，得到的紫外光谱对比图如图7所示，图中显示：所述多肽组装单体和被酶剪切后组装形成聚集体的吸收峰位置不同。
图8为所述多肽组装单体被酶剪切前后的荧光光谱对比图，图中显示：所述多肽组装单体具有荧光，而被酶剪切后组装形成的聚集体无荧光；由此可知，当多肽组装单体到达靶点位置后被酶剪切，自组装形成聚集体而发生荧光猝灭，使光热转化效率增加。
将本实施例所述多肽组装单体溶于200μL的HEPES-CHAPS缓冲液(pH值为7.5)中，使其浓度为100μM；然后向其中加入Caspase-3使底物与酶的比例为1μM/U，在37℃下孵育2h。接着将未被酶(Caspase-3)处理过的多肽组装单体溶液和被酶处理过形成聚集体的溶液稀释为100μL、20μM的溶液。最后用功率密度为1.5W/cm2的808nm激光分别照射溶液2min，用热成像仪记录温度变化情况，得到的光热转化结果图如图9所示，从图9中可知，本发明提供的多肽组装单体在与酶(Caspase-3)作用后形成的聚集体显示出比单体更好的光热转化效果。
将密度为1×104细胞/孔的H460细胞接种到96孔板中，在培养箱中培养24h；然后用不同终浓度(0、5μM、10μM、20μM、40μM)的本实施例所述多肽组装单体孵育2h，去除原1640培养基，每孔加入100μL新的1640培养基。后续处理时设置不施加激光组和施加激光组，不施加激光组不进行激光照射，施加激光组用功率密度为1.5W/cm2的808nm激光照射细胞5min，然后两组均放于培养箱中培养，24h后培养终止，小心吸弃孔内含有药物的培养基，并用PBS润洗2遍，药物去除干净后加入提前用培养基稀释好的CCK-8试剂(CCK-8与培养基的体积比为1:9)，每孔100μL。最后在加入CCK-8试剂的2h后，在酶标仪上测定各孔450nm处吸光度，设定650nm吸收为参比；根据吸光度值计算细胞存活率。细胞存活率(％)＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％；其中，As为实验孔(含有细胞的培养基、CCK-8试剂和药物)的吸光度值，Ac为对照孔(含有细胞的培养基和CCK-8试剂，没有药物)的吸光度值，Ab为调零孔(不含有细胞和药物的培养基、CCK-8试剂)的吸光度值；所有实验均在三个平行组中进行。上述实验得到的体外肿瘤细胞的光热治疗结果图如图10所示，结果表明，本发明所述多肽组装单体用于光热治疗，在施加激光的情况下，具有显著的肿瘤细胞杀伤效果。
雌性Balb/c裸鼠(6～8周龄，18～22g)，将H460细胞皮下植入小鼠右侧。当肿瘤体积达到50mm3时，将小鼠随机分为两组(每组n＝5)，分别静脉注射PBS和本实施例所述多肽组装单体，剂量为2.0mg/kg。肿瘤在注射药物12h后接受808nm激光照射(10min，1.0w/cm2)。然后每隔一天监测每只小鼠的肿瘤体积和体重。15天后，从小鼠体内提取肿瘤并拍照记录。肿瘤体积(V)按以下公式计算：V＝LW2/2，其中L为长径，W为短径(mm)。在小鼠体内的肿瘤光热治疗结果图如图11所示，相较于PBS对照组，所述多肽组装单体能够抑制肿瘤体积的增长，实现对肿瘤的光热治疗。
对比例1
一种多肽组装单体，包括通过酰胺键依次连接的靶向多肽序列AVPIAQK、响应多肽序列DEVD和组装多肽序列KLVFFAECG；所述组装多肽序列KLVFFAECG的一端侧链上连接有光热治疗剂Cy7-Cl。所述多肽组装单体的结构式如式II所示：
其中，X1的结构为
*代表与式II中-S-的连接位点。
所述多肽组装单体记为AVPIAQKDEVDKLVFFAEC(Cy)G，制备方法包括主体多肽的合成和Cy7的修饰；其中，主体多肽的合成方法与实施例1相同，得到多肽片段AVPIAQKDEVDKLVFFAECG；然后将上述多肽片段与Cy7-Cl以摩尔比为1:1进行投料，按照实施例1中的步骤(2)进行反应，得到单侧连接有Cy7的多肽组装单体。
图12为实施例1、对比例1所述多肽组装单体被酶剪切后的荧光光谱对比图，荧光测试时保证荧光分子(Cy7)的浓度相同，从图12中可知：对比例1提供的单侧修饰Cy7的多肽组装单体的荧光强度远远大于实施例1提供的双侧修饰Cy7的多肽组装单体，进一步证明了本发明提供的多肽组装单体被酶剪切后自组装形成的聚集体具有特殊的堆积效果，会发生荧光猝灭，而对比例1提供的单侧修饰的多肽组装单体不具有上述性质。
将1×105细胞/孔的XIAP过表达的肿瘤细胞H460细胞接种于共聚焦显微镜培养皿中，在恒温箱(Thermo Scientific)中培养12h后完全贴壁。具体培养条件为37℃，相对湿度95％，二氧化碳浓度5％。然后用含有50μM荧光分子(Cy7)的对比例1提供的多肽组装单体和实施例1提供的多肽组装单体与H460细胞孵育1h，然后用PBS洗涤3次，加入新鲜培养基。最后用共焦激光扫描显微镜(UltraVIEW VOX)进行荧光成像。图13为实施例1、对比例1提供的多肽组装单体在肿瘤细胞中的荧光成像结果图，从图13中可知，对比例1提供的单侧修饰的多肽组装单体到达靶点位置后被酶剪切具有荧光信号，而实施例1提供的双侧修饰的多肽组装单体到达靶点位置后被酶剪切，自组装形成聚集体发生荧光猝灭。
将密度为1×104细胞/孔的H460细胞接种到96孔板中，在培养箱中培养24小时。然后用不同终浓度(0、5μM、10μM、20μM、40μM)的实施例1、对比例1提供的多肽组装单体孵育2h(浓度为荧光分子的浓度)，去除原1640培养基，每孔加入100μL新的1640培养基。后续处理时设置不施加激光组和施加激光组，不施加激光组不进行激光照射，施加激光组用功率密度为1.5W/cm2的808nm激光照射细胞5min，然后两组均放于培养箱中培养24h。然后小心吸弃孔内含有药物的培养基，并用PBS润洗2遍，药物去除干净后加入提前用培养基稀释好的CCK-8试剂(CCK-8与培养基的体积比为1:9)，每孔100μL。最后在加入CCK-8试剂的2h时后，在酶标仪上测定各孔450nm处吸光度，设定650nm吸收为参比；根据吸光度值计算细胞存活率，细胞存活率的计算方法与实施例1中相同，所有实验均在三个平行组中进行。上述实验得到的实施例1、对比例1所述多肽组装单体对体外肿瘤细胞的光热治疗结果对比图如图14所示，从图14中可知，实施例1提供的双侧修饰的多肽组装单体的光热治疗效果显著优于对比例1提供的单侧修饰的多肽组装单体的光热治疗效果；尤其当多肽组装单体(荧光分子)的浓度达到10～40μM时，光热治疗效果的差异更加显著，其中10μM时实施例1的细胞存活率为58.80±3.86％，而对比例1的细胞存活率为85.89±3.89％，20μM时实施例1的细胞存活率为37.16±2.57％，对比例1的细胞存活率为75.46±3.25％，40μM时实施例1的细胞存活率仅为6.11±3.29％，对比例1的细胞存活率为66.52±2.90％，实施例1对于肿瘤细胞的光热治疗效果能够达到对比例1的10.9倍之多，进一步证明了本发明提供的多肽组装单体通过光热治疗剂的特异性修饰，使其在被酶剪切后能够自组装形成具有特殊堆积效果的聚集体，进而在激光照射下产生优异的光热治疗效果。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的用于光热治疗的多肽组装单体及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种用于光热治疗的多肽组装单体，其特征在于，所述多肽组装单体包括依次连接的靶向多肽序列、响应多肽序列和组装多肽序列；所述组装多肽序列的两端侧链上分别连接有光热治疗剂X1和X2。
2.根据权利要求1所述的多肽组装单体，其特征在于，所述靶向多肽序列包括多肽序列MARSGL、RGDLATLRQL、GGVSCMQTSPVCENNL或AVPI中的任意一种；
优选地，所述多肽序列MARSGL对应的识别蛋白为ErbB2，所述多肽序列RGDLATLRQL对应的识别蛋白为αvβ6，所述多肽序列GGVSCMQTSPVCENNL对应的识别蛋白为TAG-72，所述AVPI对应的识别蛋白为X连锁凋亡抑制蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的多肽组装单体，其特征在于，所述响应多肽序列为含有功能酶底物的多肽序列；
优选地，所述响应多肽序列包括MMP-7响应序列VPLSLTM、Caspase-3/7响应序列DEVD或Furin响应序列RVRRCK中的任意一种；
优选地，所述响应多肽序列的响应序列长度为3～10个氨基酸；
优选地，所述响应多肽序列被酶切后连接在组装多肽序列一端的氨基酸数目≤3个。
4.根据权利要求1～3任一项所述的多肽组装单体，其特征在于，所述组装多肽序列为具有α-螺旋组装、β-折叠组装或β-转角组装功能的多肽序列；优选为具有β-折叠组装功能的多肽序列；
优选地，所述具有α-螺旋组装功能的多肽序列包括AAAAAAD、VVVVVVD或LLKK中的任意一种；
优选地，所述具有β-折叠组装功能的多肽序列包括XAAA、AEAKAEAK或KLVFFAE中的任意一种，进一步优选为KLVFFAE；
优选地，所述具有β-转角组装功能的多肽序列包括YPGDV或VKVKVKVKDPPTKVKVKVKV；
优选地，所述组装多肽序列的两端侧链上含有巯基。
5.根据权利要求1～4任一项所述的多肽组装单体，其特征在于，所述靶向多肽序列、响应多肽序列和组装多肽序列通过酰胺键依次连接。
6.根据权利要求1～5任一项所述的多肽组装单体，其特征在于，所述X1、X2均为650～950nm范围内具有吸收和光热转换效应的光热治疗剂；
优选地，所述X1、X2各自独立地选自吲哚箐绿、花菁染料、卟啉、亚甲基蓝或Bodipy类荧光染料中的任意一种；
优选地，所述X1、X2通过不可水解的化学键与所述组装多肽序列相连；
优选地，所述X1、X2为相同的光热治疗剂。
7.根据权利要求1～6任一项所述的多肽组装单体，其特征在于，所述多肽组装单体包括通过酰胺键依次连接的靶向多肽序列AVPIAQK、响应多肽序列DEVD和组装多肽序列GCKLVFFAECG；所述组装多肽序列GCKLVFFAECG两端侧链上分别连接有光热治疗剂X1和X2；所述X1和X2均为花菁染料Cy7-Cl。
8.一种如权利要求1～7任一项所述的多肽组装单体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)通过固相合成法合成靶向多肽序列、响应多肽序列和组装多肽序列并连接，得到多肽片段；
(2)将步骤(1)得到的多肽片段与光热治疗剂X1和X2进行连接反应，得到所述多肽组装单体。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述多肽片段与光热治疗剂X1的摩尔比为1:(1.0～1.2)；
优选地，步骤(2)所述多肽片段与光热治疗剂X2的摩尔比为1:(1.0～1.2)；
优选地，步骤(2)所述连接反应的温度为15～40℃；
优选地，步骤(2)所述连接反应的时间为0.5～5h；
优选地，步骤(2)所述连接反应在缓冲液中进行。
10.一种如权利要求1～7任一项所述的多肽组装单体在制备光热治疗药物中的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN114533894A (zh) * | 2022-02-28 | 2022-05-27 | 郑州大学 | 一种具有线粒体靶向功能的自组装多肽药物及其制备方法和应用 |
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| CN107648618A (zh) * | 2017-09-27 | 2018-02-02 | 国家纳米科学中心 | 一种药物递送体系及其制备方法与应用 |
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| HONG-WEI AN ET AL: "A tumour-selective cascade activatable self-detained system for drug delivery and cancer imaging", NATURE COMMUNICATIONS, vol. 10, 24 October 2019 (2019-10-24), pages 1 - 15 * |
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