CN114072676A - 调节治疗方案的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在患有癌症的患者中确定、调节或调整使用化疗药剂的治疗方案的方法。

Description

调节治疗方案的方法

技术领域

本发明涉及在患有癌症的患者中确定、调节或调整使用化疗药剂的治疗方案的方法。

背景技术

正如Galon等人所详细说明的(使用免疫评分进行癌症分类：全球工作组(Cancerclassification using the Immunoscore:a worldwide task force)J TranslMed.2012；10：205)，癌症临床结局的预测通常是通过对手术切除原发肿瘤期间获得的组织样本进行组织病理学评估来实现的。传统的肿瘤分期(AJCC/UICC-TNM分类)总结了关于肿瘤负荷(T)、引流淋巴结和区域淋巴结中癌细胞的存在(N)和转移证据(M)的数据。Galon等人已经表明，与细胞毒性和记忆T细胞、Th1细胞和干扰素-γ(IFN-γ)特征有关的免疫活性或免疫沉默肿瘤分别与长期存活或快速复发相关(Galon等人，Science，2006；313(5795):1960–4；Camus等人，Cancer Res.2009；69(6):2685–93).对炎症和非炎症型肿瘤进行分类的共识免疫评分

最近在全球得到验证，具有深远的临床意义(Pages等人，Lancet.2018；391(10135):2128–39)。

虽然已经提出了确定患者对于抗肿瘤疗法的敏感性的方法，但仍然需要会帮助医生以最有效的方式来调节疗法的工具。

发明内容

本文提供了一种在患有癌症的患者中确定、调节或调整使用化疗药剂的治疗方案的方法，其中所述药剂能够优选通过引起免疫性细胞死亡(ICD)来影响或促进肿瘤靶向免疫应答，所述方法包括对来自患者的肿瘤样本中的至少两个生物标志物、即CD8和CD3进行定量。

更特别地，所述方法可有利地包括对肿瘤中心(CT)的CD3+细胞密度、肿瘤中心(CT)的CD8+细胞密度、浸润边缘(IM)的CD3+细胞密度、以及浸润边缘(IM)的CD8+细胞密度进行定量。

所述方法通常可包括a)对来自患者的肿瘤样本中的至少两个生物标志物、即CD8和CD3进行定量，b)将a)中获得的值与预定参考值进行比较，以及c)当a)中获得的值优于预定参考值时，通过增加剂量、治疗持续时间和/或施用频率来增加患者对化疗药剂的暴露。

在一个优选的实施方式中，步骤b)还包括将患者分类为如下的组(低、中等、或高免疫评分(IS))：

低IS对应于平均百分位数低于25％，

中等IS对应于平均百分位数在25％和70％之间，

高IS对应于平均百分位数超过70％；

其中平均百分位数是指对应于CT区和IM区的CD3细胞密度以及CT区和IM区的CD8细胞密度的4个标志物(CD3ct，CD8ct，CD3im，CD8im)的4个独立百分位数的平均百分位数。

根据本发明，IS越高，长期化疗、例如化疗6个月的临床效益越重大。

本发明的方法在体外进行，优选在给患者施用化疗药剂之前进行。

附图说明

图1.

计算方法。(A)使用专用的Immunoscore Analyzer软件来定量肿瘤中心(CT)和浸润边缘(IM)的CD3和CD8密度(CD3ct，CD8ct，CD3im，CD8im)。密度以预先界定的百分位数标度报告，并计算所述4个标志物的平均百分位数以界定百分位数免疫评分(从0到100)。由所述软件确定的CT区和IM区的示例示于左图。IHC染色(CD3)和阳性细胞检测的实例示于右图。对于该实例，患者具有中等的免疫评分(60％)。

图2.

在III期癌症患者中的预后价值(DFS的Kaplan Meier评估)(A)在依据IS分层为两类(低与中等+高)的患者组之中，IS低和IS中等+高的3年DFS率分别为66.80％[95％CI62.23-70.95]和77.14％[95％CI 73.50-80.35](p＝0.0001)。(B)将IS分为3类，高IS的患者的3年DFS率为85％，对比之下低IS的患者为67％(p＝0.0001)。特别注意：IS作为连续变量也与3年DFS显著相关(p<0.001)。(C)在DFS方面，低IS的有害效应在T1-3肿瘤患者中高于T4肿瘤患者(p＝0.0212)。

图3.根据

状态，3个月对比6个月mFOLFOX6疗法的功效。(A)在CD8CD3(中等+高)状态的患者(所有患者，见上图)中观察到6个月与3个月的FOLFOX6方案相比的有益效果。(B，C)对于这些患者，在低危肿瘤(T1-T3和N1)和高危肿瘤(T4和/或N2肿瘤)中均保留了这种效益(见上图)。相反，对于CD8 CD3(低)状态的患者，无论该患者是高危还是低危，6个月FOLFOX6方案均未观察到显著效益(见下图)。对于所述患者，前3年观察到6个月FOLFOX6方案的适度效益，但此后消除。

具体实施方式

癌症

通常，本发明的方法适用于各种癌症起源器官(例如乳腺、结肠、直肠、肺、头颈、膀胱、卵巢、前列腺)，也适用于各种癌细胞类型(腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌、黑色素瘤等)。

通常，接受上述方法的患者可患有选自下列的实体癌：肾上腺皮质癌，肛门癌，胆管癌(例如门周癌、远端胆管癌、肝内胆管癌)，膀胱癌，骨癌(例如成骨细胞瘤、骨软骨瘤、血管瘤、软骨粘液样纤维瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、骨巨细胞瘤、脊索瘤，多发性骨髓瘤)，脑和中枢神经系统癌症(例如脑膜瘤、星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、神经节胶质瘤、神经鞘瘤、生殖细胞瘤、颅咽管瘤)，乳腺癌(例如导管原位癌、浸润性导管癌、浸润性小叶癌、小叶原位癌、男性乳房发育症)，宫颈癌，结直肠癌，子宫内膜癌(例如子宫内膜腺癌、腺棘癌、乳头状浆液性腺癌、透明细胞癌)，食道癌，胆囊癌(粘液腺癌、小细胞癌)，胃肠道类癌瘤(例如绒毛膜癌、破坏性卵巢绒毛膜腺瘤)，卡波西氏肉瘤，肾癌(例如肾细胞癌)，喉和下咽癌，肝癌(例如血管瘤、肝腺瘤、局灶性结节状增生、肝细胞癌)，肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌)，间皮瘤，浆细胞瘤，鼻腔和鼻窦癌(例如嗅神经母细胞瘤、中线肉芽肿)，鼻咽癌，神经母细胞瘤，口腔和口咽癌，卵巢癌，胰腺癌，阴茎癌，垂体癌，前列腺癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤(例如胚胎性横纹肌肉瘤、腺泡状横纹肌肉瘤、多形性横纹肌肉瘤)，唾液腺癌，皮肤癌(例如黑色素瘤、非黑色素瘤皮肤癌)，胃癌，睾丸癌(例如精原细胞瘤、非精原细胞瘤生殖细胞癌)，胸腺癌，甲状腺癌(例如滤泡癌、未分化癌、低分化癌、甲状腺髓样癌)，阴道癌，外阴癌，以及子宫癌(例如子宫平滑肌肉瘤)。

在一个优选的实施方式中，癌症是结直肠癌。

样本

如本文所用的术语“肿瘤组织样本”是指源自于患者的任何组织肿瘤样本。所述组织样本是为了体外评价的目的而获得的。在一些实施方式中，肿瘤样本可来自从患者切除的肿瘤。在一些实施方式中，肿瘤样本可来自在患者原发肿瘤中进行的活检或在远离患者原发肿瘤的转移样本中进行的活检。例如，在罹患结直肠癌的患者的肠道中进行内窥镜活检。通常将肿瘤组织样本固定在福尔马林中并包埋在硬质固定剂、例如石蜡(蜡)或环氧树脂中，将其置于模具中，然后硬化以产生易于切割的块。然后可以使用切片机制备薄的材料切片，放置在载玻片上并进行例如免疫组织化学(使用IHC自动化设备例如

XT，以获得染色的载玻片)。所述肿瘤组织样本可用于微阵列，称为组织微阵列(TMA)。TMA由石蜡块组成，其中多达1000个单独的组织芯以阵列方式组装，允许进行多重组织学分析。该技术允许一次快速可视化组织标本中的分子靶标，无论是在DNA、RNA还是蛋白质水平上。TMA技术描述于WO2004000992，US8068988，Olli等人2001Human Molecular Genetics，Tzankov等人2005，Elsevier；Kononen等人1198；Nature Medicine。

在一些实施方式中，肿瘤组织样本包括(i)整个的原发肿瘤(作为一个整体)，(ii)来自肿瘤中心的组织样本，(iii)来自直接包围肿瘤的组织的组织样本，该组织可更具体地称为肿瘤的“浸润边缘”，(iv)紧邻肿瘤的淋巴样岛，(v)位于最紧邻肿瘤位置的淋巴结，(vi)手术前采集的肿瘤组织样本(例如用于治疗后患者的随访)，以及(vii)远处转移。

如本文所用的“浸润边缘”具有其在本领域中一般含义并且是指肿瘤周围的细胞环境。在一些实施方式中，肿瘤组织样本，无论是源自于肿瘤中心、肿瘤的浸润边缘还是最接近的淋巴结，包括从肿瘤中心或从肿瘤周围的浸润边缘切除的组织块或组织切片，包括外科肿瘤切除术后或采集用于活检的组织样本后切除的组织块或组织切片，以进一步定量一个或几个生物标志物，特别是通过组织学或免疫组织化学方法、通过流式细胞术方法、和通过基因或蛋白质表达分析的方法，包括基因组和蛋白质组分析。当然，肿瘤组织样本可以经受多种众所周知的采集后制备和储存技术(例如，固定、储存、冷冻等)。所述样本可以是新鲜的、冷冻的、固定的(例如福尔马林固定的)或包埋的(例如石蜡包埋的)。在一些实施方式中，当在切除的肿瘤中定量肿瘤引流淋巴结数目时，肿瘤组织样本来自所述切除的肿瘤并且包括肿瘤的中心，并任选包括肿瘤的浸润边缘。在所述实施方式中，适应性免疫应答的标志物的定量通常通过后述的免疫组织化学(IHC)进行。在一些实施方式中，当通过成像来确定所进行的肿瘤引流淋巴结数量的定量时，肿瘤组织样本来自活检。在所述实施方式中，适应性免疫应答的标志物的定量通常通过确定至少一个基因的表达水平来进行。

通常，肿瘤样本可选自(i)整个的原发肿瘤(作为一个整体)，(ii)来自肿瘤中心的组织样本，(iii)来自直接包围肿瘤的组织的组织样本，该组织可更具体地称为肿瘤的“浸润边缘”，(iv)位于最紧邻肿瘤位置的淋巴结或由肿瘤诱导的三级淋巴结构，(v)在任何时间并且通常是手术前进行的肿瘤活检，以及(vi)远处转移。

在一个优选的实施方式中，在肿瘤中心和/或在肿瘤浸润边缘定量所述两个或更多个生物标志物。

在一个优选的实施方式中，在肿瘤中心和/或在肿瘤浸润边缘定量所述两个或更多个生物标志物。

所述样本可以是新鲜的、冷冻的、固定的(例如福尔马林固定的)或包埋的(例如石蜡包埋的)。在一个特定实施方式中，肿瘤样本来自在患者的肿瘤中进行的活检。

一个实例是在患有结直肠癌或怀疑患有结直肠癌的患者的肠道中进行的内窥镜活检。

生物标志物

根据本发明，所述方法包括对T细胞或T细胞亚群表达的CD3和CD8进行定量。

CD3抗原的表达，或其mRNA的表达，指示了患者涉及所有T淋巴细胞和NKT细胞的适应性免疫应答的水平。CD8抗原的表达，或其mRNA的表达，指示了患者涉及细胞毒性T淋巴细胞的适应性免疫应答的水平。

本发明的方法可进一步包括定量至少另一个生物标志物；然而，仅定量CD3和CD8就可足以实现本发明的用于确定、调节或调整治疗方案的方法。

如本文所指的，“生物标志物”由指示癌症患者针对肿瘤的免疫应答状态的任何可检测、可测量和可量化的参数组成。

生物标志物包括肿瘤部位处免疫系统的细胞的存在、或数量或密度。

生物标志物还包括肿瘤部位处由免疫系统的细胞特异性产生的蛋白质的存在或量。

生物标志物还包括肿瘤部位处指示与宿主特异性免疫应答提高相关的基因表达水平的任何生物材料的存在或量。因此，生物标志物包括肿瘤部位处从下述基因组DNA转录的信使RNA(mRNA)的存在或量，所述基因组DNA编码由免疫系统的细胞特异性产生的蛋白质。

因此，生物标志物包括由免疫系统的细胞特异性表达的表面抗原或者编码所述表面抗原的mRNA，所述免疫系统的细胞包括在肿瘤组织内或在紧邻肿瘤组织处募集的B淋巴细胞、T淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、NK细胞、NKT细胞和NK-DC细胞，所述紧邻肿瘤组织处包括在肿瘤的浸润边缘内和最近的淋巴结中。

举例说明，用作生物标志物的蛋白质还包括由免疫系统的细胞特异性产生的溶细胞蛋白，如穿孔素、颗粒溶素以及粒酶-B。

许多专利申请已经描述了很多指示免疫应答状态的生物标志物，它们可以用于本发明的方法中。

通常，人们可以使用WO2015007625、WO2014023706、WO2014009535、WO2013186374、WO2013107907、WO2013107900、WO2012095448、WO2012072750和WO2007045996(全部通过引用并入)中描述的指示免疫应答状态的生物标志物。

通常可定量2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50个不同生物标志物的组合，优选2、3、4、5、6、7、8、9或10个生物标志物的组合，更优选2、3、4、5或6个生物标志物的组合。

在一个优选的实施方式中，指示免疫应答状态的生物标志物是WO2007045996中描述的那些。

通常，可使用的生物标志物是免疫系统的细胞的细胞密度。

在一个优选的实施方式中，本发明的方法包括定量CD3+细胞的密度和CD8+细胞的密度。

该方法可进一步包括定量CD45RO+细胞的密度、GZM-B+细胞的密度和/或CD45RO+细胞的密度。也可测量B细胞的密度(参见WO2013107900和WO2013107907)。也可测量DC细胞的密度(参见WO2013107907)。

在一个优选的实施方式中，定量在肿瘤中心和/或肿瘤浸润边缘的免疫系统的细胞的密度。

在一个优选的实施方式中，本发明的方法通过目的蛋白质标志物的原位免疫组织化学检测来进行，特别是当在肿瘤中心(CT)和浸润边缘(IM)两处进行所述标志物的分别定量时。

在一个优选的实施方式中，本发明的方法在整个肿瘤或肿瘤活检中，或在肿瘤中心(CT)中、或在浸润边缘(IM)中，通过目的蛋白质标志物或目的mRNA基因表达的原位免疫组织化学检测来进行。

在一个最优选的实施方式中，所述方法包括对肿瘤中心的CD3+细胞密度、肿瘤中心的CD8+细胞密度、浸润边缘的CD3+细胞密度和浸润边缘的CD8+细胞密度进行定量。

所述密度可以在“冷点”中、即在肿瘤样本的密度最低的区域中测量，或在对应于密度最低的2到10个区域的2、3、4、5、6、7、8、9、10个“冷点”中测量。

所述密度也可以在“热点”中、即在密度最高的区域中测量，或在对应于密度最高的2到10个区域的2、3、4、5、6、7、8、9、10个“热点”中测量。

还可以确定整个肿瘤样本的平均密度。

通常，可以使用WO2013/186374或WO2017/194556中公开的方法来定量肿瘤样本中的免疫细胞。

如本文所用的术语“标志物”由指示对象的适应性免疫应答状态的任何可检测、可测量或可量化的参数组成。在一些实施方式中，所述标志物包括免疫系统的细胞的存在、或数量或密度。在一些实施方式中，所述标志物包括由免疫系统的细胞特异性产生的蛋白质的存在或量。在一些实施方式中，所述标志物包括指示与宿主特异性免疫应答提高相关的基因水平的任何生物材料的存在或量。因此，在一些实施方式中，所述标志物包括从下述基因组DNA转录的信使RNA(mRNA)的存在或量，所述基因组DNA编码由免疫系统的细胞特异性产生的蛋白质。在一些实施方式中，所述标志物包括由免疫系统的细胞特异性表达的表面抗原或者编码所述表面抗原的mRNA，所述免疫系统的细胞包括B淋巴细胞、T淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、NK细胞、NKT细胞和NK-DC细胞。当用多于一个生物标志物进行本发明的方法时，被定量的不同生物标志物的数量通常少于100个不同的标志物，并且在大多数实施方式中少于50个不同的标志物，更优选少于20个不同的标志物，更优选少于15个不同的标志物，更优选少于10个不同的标志物。

用于指示免疫应答状态的可被定量的其它生物标志物，包括在WO2007045996的表9中列出的蛋白质，它们是：18s，ACE，ACTB，AGTR1，AGTR2，APC，APOA1，ARF1，AXIN1，BAX，BCL2，BCL2L1，CXCR5，BMP2，BRCA1，BTLA，C3，CASP3，CASP9，CCL1，CCL11，CCL13，CCL16，CCL17，CCL18，CCL19，CCL2，CCL20，CCL21，CCL22，CCL23，CCL24，CCL25，CCL26，CCL27，CCL28，CCL3，CCL5，CCL7，CCL8，CCNB1，CCND1，CCNE1，CCR1，CCR10，CCR2，CCR3，CCR4，CCR5，CCR6，CCR7，CCR8，CCR9，CCRL2，CD154，CD19，CD1a，CD2，CD226，CD244，PDCD1LG1，CD28，CD34，CD36，CD38，CD3E，CD3G，CD3Z，CD4，CD40LG，CD5，CD54，CD6，CD68，CD69，CLIP，CD80，CD83，SLAMF5，CD86，CD8A，CDH1，CDH7，CDK2，CDK4，CDKN1A，CDKN1B，CDKN2A，CDKN2B，CEACAM1，COL4A5，CREBBP，CRLF2，CSF1，CSF2，CSF3，CTLA4，CTNNB1，CTSC，CX3CL1，CX3CR1，CXCL1，CXCL10，CXCL11，CXCL12，CXCL13，CXCL14，CXCL16，CXCL2，CXCL3，CXCL5，CXCL6，CXCL9，CXCR3，CXCR4，CXCR6，CYP1A2，CYP7A1，DCC，DCN，DEFA6，DICER1，DKK1，Dok-1，Dok-2，DOK6，DVL1，E2F4，EBI3，ECE1，ECGF1，EDN1，EGF，EGFR，EIF4E，CD105，ENPEP，ERBB2，EREG，FCGR3A，CGR3B，FN1，FOXP3，FYN，FZD1，GAPD，GLI2，GNLY，GOLPH4，GRB2，GSK3B，GSTP1，GUSB，GZMA，GZMB，GZMH，GZMK，HLA-B，HLA-C，HLA-，MA，HLA-DMB，HLA-DOA，HLA-DOB，HLA-DPA1，HLA-DQA2，HLA-DRA，HLX1，HMOX1，HRAS，HSPB3，HUWE1，ICAM1，ICAM-2，ICOS，ID1，ifna1，ifna17，ifna2，ifna5，ifna6，ifna8，IFNAR1，IFNAR2，IFNG，IFNGR1，IFNGR2，IGF1，IHH，IKBKB，IL10，IL12A，IL12B，IL12RB1，IL12RB2，IL13，IL13RA2，IL15，IL15RA，IL17，IL17R，IL17RB，IL18，IL1A，IL1B，IL1R1，IL2，IL21，IL21R，IL23A，IL23R，IL24，IL27，IL2RA，IL2RB，IL2RG，IL3，IL31RA，IL4，IL4RA，IL5，IL6，IL7，IL7RA，IL8，CXCR1，CXCR2，IL9，IL9R，IRF1，ISGF3G，ITGA4，ITGA7，整联蛋白αE(CD103抗原，人粘膜淋巴细胞，抗原1；α多肽)，hCG33203基因，ITGB3，JAK2，JAK3，KLRB1，KLRC4，KLRF1，KLRG1，KRAS，LAG3，LAIR2，LEF1，LGALS9，LILRB3，LRP2，LTA，SLAMF3，MADCAM1，MADH3，MADH7,MAF，MAP2K1，MDM2，MICA，MICB，MKI67，MMP12，MMP9，MTA1，MTSS1，MYC，MYD88，MYH6，NCAM1，NFATC1，NKG7，NLK，NOS2A，P2X7，PDCD1，PECAM-，CXCL4，PGK1，PIAS1，PIAS2，PIAS3，PIAS4，PLAT，PML，PP1A，CXCL7，PPP2CA，PRF1，PROM1，PSMB5，PTCH，PTGS2，PTP4A3，PTPN6，PTPRC，RAB23，RAC/RHO，RAC2，RAF，RB1，RBL1，REN，Drosha，SELE，SELL，SELP，SERPINE1，SFRP1，SIRPβ1，SKI，SLAMF1，SLAMF6，SLAMF7，SLAMF8，SMAD2，SMAD4，SMO，SMOH，SMURF1，SOCS1，SOCS2，SOCS3，SOCS4，SOCS5，SOCS6，SOCS7，SOD1，SOD2，SOD3，SOS1，SOX17，CD43，ST14，STAM，STAT1，STAT2，STAT3，STAT4，STAT5A，STAT5B，STAT6，STK36，TAP1，TAP2，TBX21，TCF7，TERT，TFRC，TGFA，TGFB1，TGFBR1，TGFBR2，TIM-3，TLR1，TLR10，TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR6，TLR7，TLR8，TLR9，TNF，TNFRSF10A，TNFRSF11A，TNFRSF18，TNFRSF1A，TNFRSF1B，OX-40，TNFRSF5，TNFRSF6，TNFRSF7，TNFRSF8，TNFRSF9，TNFSF10，TNFSF6，TOB1，TP53，TSLP，VCAM1，VEGF，WIF1，WNT1，WNT4，XCL1，XCR1，ZAP70和ZIC2。

在本说明书中，每个目的基因的名称是指如在国际公认的基因序列和蛋白质序列数据库、包括HUGO基因命名委员会(HUGO gene Nomenclature Committee)的数据库中找到的相应基因的国际公认名称。在本说明书中，每个目的基因的名称也可是指如在国际公认的基因序列数据库Genbank中找到的相应基因的国际公认名称。通过这些国际公认的序列数据库，本领域技术人员可检索到本文描述的每个目的基因的核酸。

在一个优选的实施方式中，指示免疫应答状态的其它生物标志物包括适应性免疫应答的代表性基因或蛋白质，或免疫抑制反应的代表性基因或蛋白质。

如本文所用的表述“适应性免疫应答的代表性基因”是指由作为肿瘤中适应性免疫应答的参与者或有助于奠定肿瘤中的适应性免疫应答的细胞表达的任何基因。适应性免疫应答，也称为“获得性免疫应答”，包括T细胞亚型的抗原依赖性刺激、B细胞活化和抗体产生。例如，适应性免疫应答的细胞包括但不限于细胞毒性T细胞、T记忆T细胞、Th1和Th2细胞、活化的巨噬细胞和活化的树突细胞、NK细胞和NKT细胞。因此，适应性免疫应答的代表性基因通常可选自对Th1适应性免疫、细胞毒性应答或记忆应答的共调节基因簇，并且可编码Th1细胞表面标志物、白介素(或白介素受体)、或趋化因子或(趋化因子受体)。

在一个特定的实施方式中，适应性免疫应答的代表性基因选自：

-由CXCL13、CXCL9、CCL5、CCR2、CXCL10、CXCL11、CXCR3、CCL2和CX3CL1组成的趋化因子和趋化因子受体家族，

-由IL15组成的细胞因子家族，

-由IFNG、IRF1、STAT1、STAT4和TBX21组成的TH1家族，

-由ITGAE、CD3D、CD3E、CD3G、CD8A、CD247、CD69和ICOS组成的淋巴细胞膜受体家族，

-由GNLY、GZMH、GZMA、GZMB、GZMK、GZMM和PRF1组成的细胞毒性分子家族，

以及激酶LTK。

优选的此类基因或其相应的蛋白质公开如下：

CCL5，CCR2，CD247，CD3E，CD3G，CD8A，CX3CL1，CXCL11，GZMA，GZMB，GZMH，GZMK，IFNG，IL15，IRF1，ITGAE，PRF1，STAT1，TBX21。

如本文所用的表述“免疫抑制反应的代表性基因”是指由作为肿瘤中免疫抑制反应的参与者或有助于奠定肿瘤中的免疫抑制反应的细胞表达的任何基因。例如，免疫抑制反应包括

-共同抑制T细胞亚型的抗原依赖性刺激：基因CD276、CTLA4、PDCD1、CD274、TIM-3或VTCN1(B7H4)，

-失活巨噬细胞和树突细胞以及失活NK细胞：基因TSLP、CD1A或VEGFA

-表达癌症干细胞标志物、分化和/或肿瘤生成：PROM1、IHH。

-表达在肿瘤环境中产生的免疫抑制蛋白：基因PF4、REN、VEGFA。

例如，免疫抑制反应的细胞包括未成熟树突细胞(CD1A)、调节性T细胞(Treg细胞)和表达IL17A基因的Th17细胞。

因此，适应性免疫应答的代表性基因通常可选自共调节的适应性免疫基因，而免疫抑制基因可以是失活免疫细胞(例如树突细胞)并可能有助于诱导免疫抑制反应的代表性基因。

免疫抑制反应的代表性基因或相应的蛋白质公开如下：

CD274，CTLA4，IHH，IL17A，PDCD1，PF4，PROM1，REN，TIM-3，TSLP，或VEGFA。

在一个优选的实施方式中，适应性免疫应答的代表性基因选自GNLY、CXCL13、CX3CL1、CXCL9、ITGAE、CCL5、GZMH、IFNG、CCR2、CD3D、CD3E、CD3G、CD8A、CXCL10、CXCL11、GZMA、GZMB、GZMK、GZMM、IL15、IRF1、LTK、PRF1、STAT1、CD69、CD247、ICOS、CXCR3、STAT4、CCL2和TBX21，并且免疫抑制反应的代表性基因选自PF4、REN、VEGFA、TSLP、IL17A、PROM1、IHH、CD1A、CTLA4、PDCD1、CD276、CD274、TIM-3和VTCN1(B7H4)。

因为当结合一个适应性基因和一个免疫抑制基因时，更经常发现有些基因重要，所以最优选的基因是：

-适应性免疫应答的代表性基因：CD3G、CD8A、CCR2和GZMA，

-免疫抑制反应的的代表性基因：REN、IL17A、CTLA4和PDCD1。

指示免疫应答状态的生物标志物可包括一个或多个来自下列的基因的表达水平：CCR2、CD3D、CD3E、CD3G、CD8A、CXCL10、CXCL11、GZMA、GZMB、GZMK、GZMM、IL15、IRF1、PRF1、STAT1、CD69、ICOS、CXCR3、STAT4、CCL2和TBX21；

或GZMH、IFNG、CXCL13、GNLY、LAG3、ITGAE、CCL5、CXCL9、PF4、IL17A、TSLP、REN、IHH、PROM1和VEGFA。

本发明的方法还可包括定量miRNA簇的表达水平，所述miRNA簇包括：miR.609、miR.518c、miR.520f、miR.220a、miR.362、miR.29a、miR.660、miR.603、miR.558、miR519b、miR.494、miR.130a或miR.639，如WO2012072750中所述。

生物标志物定量的一般方法

本领域技术人员已知的用于定量本文包括的细胞类型、蛋白质类型或核酸类型的生物标志物的任何一种方法都可用于执行本发明的癌症预后方法。因此，可以容易地应用任何一种本领域公知的用于检测和定量样本中的蛋白质或核酸的标准和非标准(新兴)技术。

如本文所述的生物标志物的表达可通过用于检测转录的核酸或蛋白质表达的多种公知方法中的任一种来评估。这样的方法的非限制性实例包括用于检测分泌蛋白、细胞表面蛋白、细胞质蛋白或核蛋白的免疫学方法、蛋白质纯化方法、蛋白质功能或活性测定法、核酸杂交方法、核酸逆转录方法和核酸扩增方法。

在一个优选的实施方式中，使用与标志物蛋白或其片段、包括已经历其全部或部分正常翻译后修饰的标志物蛋白特异性结合的抗体(例如放射性标记、发色团标记、荧光团标记的聚合物骨架抗体，或酶标抗体)、抗体衍生物(例如与底物或与蛋白-配体对{例如生物素-链霉亲和素}的蛋白或配体缀合的抗体)、或抗体片段(例如单链抗体、分离的抗体高变结构域等)，来评估标志物的表达。

在某些实施方式中，可用本领域已知的任何一种免疫组织化学方法来定量生物标志物或一组生物标志物。

通常，为了进一步分析，将肿瘤的一个薄切片首先与针对一个目的生物标志物的标记抗体一起温育。洗涤后，取决于标记抗体携带的标记的种类，例如放射性、荧光或酶标记，通过适当的技术显露与所述目的生物标志物结合的标记抗体。可以同时进行多重标记。

免疫组织化学通常包括以下步骤i)用福尔马林固定肿瘤组织样本，ii)将所述肿瘤组织样本包埋在石蜡中，iii)将所述肿瘤组织样品切成切片以供染色，iv)将所述切片与目的免疫检查点蛋白特异性结合配偶体一起温育，v)漂洗所述切片，vi)将所述切片与通常生物素化的二抗一起温育，以及vii)通常用亲和素-生物素-过氧化物酶复合物显露抗原-抗体复合物。

因此，首先将肿瘤组织样本与目的免疫检查点蛋白的结合配偶体一起温育。洗涤后，取决于标记抗体携带的标记的种类，例如放射性、荧光或酶标记，通过适当的技术显露与所述目的免疫检查点蛋白结合的标记抗体。可以同时进行多重标记。

或者，本发明的方法可以使用与扩增体系(以增强染色信号)偶联的二抗和酶分子。这样的偶联二抗是可商购的，例如来自Dako的EnVision system。可使用复染，例如苏木精&曙红、DAPI、Hoechst。其它染色方法可使用对本领域技术人员而言将会显而易见的任何合适的方法或系统来完成，包括自动、半自动或手动系统。

例如，可以将一种或多种标记连接到抗体上，从而允许检测靶蛋白(即生物标志物)。示例性标记包括放射性同位素、荧光团、配体、化学发光剂、酶及其组合。可以与一级和/或二级亲和配体缀合的标记的非限制性实例包括荧光性染料或金属(例如荧光素、若丹明、藻红蛋白、荧光胺)、发色染料(例如视紫红质)、化学发光化合物(例如鲁米那、咪唑)和生物发光蛋白质(例如荧光素、荧光素酶)、半抗原(例如生物素)。各种其它有用的荧光剂和发色团在Stryer L(1968)Science 162:526-533以及Brand L和Gohlke J R(1972)Annu.Rev.Biochem.41:843-868中描述。亲和配体也可以用酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-内酰胺酶)、放射性同位素(例如3H、14C、32P、35S或125I)和粒子(例如金粒子)标记。不同类型的标记可以使用各种化学作用、例如胺反应或硫醇反应来与亲和配体缀合。然而，也可以使用胺和硫醇之外的其它反应性基团，例如醛、羧酸和谷氨酰胺。用于检测目的蛋白质的各种酶促染色方法是本领域已知的。例如，可以使用不同的酶例如过氧化物酶、碱性磷酸酶或不同的色原例如DAB、AEC或Fast Red使酶促相互作用可视化。在一些实施方式中，所述标记是量子点。例如，量子点(Qdot)变得越来越有用，应用清单日益增长，包括免疫组织化学、流式细胞术和基于平板的测定，因此可结合本发明一起使用。Qdot纳米晶体具有独特的光学性质，包括用于灵敏度和定量的极其明亮的信号；用于成像和分析的高度光稳定性。需要单个激发源，并且日益增长的缀合物范围使它们可用于广泛的基于细胞的应用。Qdot生物缀合物的特征为量子产率比得上现有的最明亮的传统染料。另外，这些基于量子点的荧光团吸收的光比传统染料多10-1000倍。来自基础Qdot量子点的发光是窄且对称的，这意味着尽管事实上可以同时使用更多的颜色，但与其它颜色的重叠被最小化，导致渗入相邻检测通道的程度轻微并减少串扰。在其他实例中，抗体可以与肽或蛋白质缀合，所述肽或蛋白质可以通过标记的结合配偶体或抗体进行检测。在间接IHC测定中法，需要二抗或第二结合配偶体来检测第一结合配偶体的结合，因为第一结合配偶体没有被标记。

在一些实施方式中，使用用于查看可检测信号并获取图像例如染色的数字图像的系统对所生成的染色标本各自进行成像。用于图像获取的方法是本领域技术人员公知的。例如，一旦样本已经染色，任何光学或非光学成像装置都可以用于检测染色剂或生物标志物标记，例如，正置或倒置光学显微镜、扫描共焦显微镜、照相机、扫描或隧道电子显微镜、扫描探针显微镜和成像红外检测器。在一些实例中，可以数字化方式捕获图像。获得的图像然后可以用于定量或半定量地确定样本中免疫检查点蛋白的量、或对于目的标志物阳性的细胞的绝对数量、或对于目的标志物阳性的细胞的表面。适合与IHC一起使用的各种自动化样本处理、扫描和分析系统在本领域中是现有的。这样的系统可以包括自动染色和显微扫描、计算机图像分析、连续切片比较(以控制样本方向和大小上的变化)、数字报告生成以及样本的存档和跟踪(例如放置组织切片的载玻片)。细胞成像系统是可商购的，它将传统光学显微镜与数字图像处理系统相结合，以对细胞和组织、包括免疫染色样本进行定量分析。参见，例如，CAS-200系统(Becton，Dickinson&Co.)。特别地，检测可以手动或通过通过涉及计算机处理器和软件的图像处理技术进行。使用这样的软件，例如，可以使用本领域技术人员已知的程序(参见例如已发表的美国专利公布US20100136549号)，基于包括例如染色质量或染色强度在内的因素来构造、校准、标准化和/或验证图像。可以基于样本的染色强度对图像进行定量或半定量分析和评分。定量或半定量组织化学是指对经过组织化学的样本的扫描和评分方法，以鉴别和定量指定的生物标志物(即免疫检查点蛋白)的存在。定量或半定量方法可以采用成像软件来检测染色密度或染色量，或采用人眼检测染色的方法，其中受过培训的操作人员对结果进行数值排序。例如，可以使用像素计数算法和组织识别模式(例如Aperio Spectrum软件、自动定量分析平台(

平台)或带有Ilastic和Calopix软件的Tribvn)，以及测量或定量或半定量染色程度的其它标准方法，对图像进行定量分析；参见例如，美国专利8,023,714号；美国专利7,257,268号；美国专利7,219,016号；美国专利7,646,905号；已发表的美国专利公布US20100136549号和20110111435；Camp等人(2002)Nature Medicine，8:1323-1327；Bacus等人(1997)Analyt Quant CytolHistol，19:316-328)。可以计算强阳性染色(如棕色染色)与总染色面积之和的比率并评分。对检测到的生物标志物(即免疫检查点蛋白)的量进行定量并以阳性像素百分比和/或评分给出。例如，所述量可以按阳性像素的百分比来定量。在一些实例中，所述量按染色面积的百分比、例如阳性像素的百分比来定量。例如，样本可以具有与总染色面积相比至少或大约至少或大约0、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的阳性像素。例如，所述量可以按对目的标志物阳性的细胞的绝对数量来定量。在一些实施方式中，对样本给出的评分是所述样本的组织化学染色强度或量的数字表示，并且表示样本中存在的靶生物标志物(例如免疫检查点蛋白)的量。光密度或面积百分比值可以给出一个等级评分，例如在整数尺度上。

因此，在一些实施方式中，本发明的方法包括以下步骤：i)通过使用能够选择性地与生物标志物相互作用的结合配偶体，提供组织切片的通过自动载玻片染色系统获得的一个或多个免疫染色薄切片，ii)通过高分辨率扫描捕获对步骤i)的载玻片进行数字化，iii)在数字图片上检测组织切片的薄切片，iv)以具有相同表面的均匀分布单元提供尺寸参考网格，所述网格适应待分析的组织切片的尺寸，以及v)检测、定量和测量每个单元中染色细胞的强度或绝对数量。

多重组织分析技术对于定量肿瘤组织样本中的几种免疫检查点蛋白特别有用。这样的技术应允许从单个肿瘤组织样本中测量至少五个、或至少十个或更多个生物标志物。此外，该技术有利于保留生物标志物的定位并且能够区分生物标志物在癌细胞和非癌细胞中的存在。这样的方法包括分层免疫组织化学(L-IHC)、分层表达扫描(LES)或多重组织免疫印迹(MTI)，例如在下列文献中教导的：美国专利号6,602,661、6,969,615、7,214,477和7,838,222；美国专利公布号2011/0306514(通过引用并入本文)；以及Chung&Hewitt，MethMol Biol，Prot Blotting Detect，Kurlen&Scofield编著，536：139-148，2009，每个参考文献教导了可以使用在分层和带印迹的膜、纸、滤纸等上制作组织切片的多达8个、多达9个、多达10个、多达11个或更多个图像。可用于进行L-IHC/MTI过程的涂层膜可得自20/20GeneSystems，Inc.(Rockville，MD)。

在一些实施方式中，L-IHC方法可以在无论是新鲜还是留存的各种组织样本中的任何一种上进行。所述样本包括核心针穿刺活检组织，其常规固定在10％正常的缓冲福尔马林中并在病理部门处理。从组织块上切出标准5μm厚组织切片到用于L-IHC的带电荷载玻片上。因此，L-IHC通过获得从组织切片转移到多个生物亲和涂层膜上的分子副本以基本上产生组织“图像”的副本，从而能够测试组织切片中的多个标志物。在石蜡切片的情况下，如本领域已知的那样对组织切片脱蜡，例如，将切片暴露于二甲苯或二甲苯替代品例如

以及分级的乙醇溶液。所述切片可用蛋白酶例如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K等处理。然后，在组织切片上放置膜基底的叠层，其包含例如多片10μm厚的涂层聚合物基材，所述基材具有直径0.4μm的孔以引导组织分子例如蛋白质通过该叠层。流体和组织分子的运动被构造成基本上垂直于膜表面。所述切片、膜、间隔纸、吸收纸、重物等的夹层结构可以受热，以促进分子从组织移动到所述膜叠层中。组织的一部分蛋白质被捕获在所述叠层(可得自20/20GeneSystems，Inc.，Rockville，MD)的每个生物亲和涂层膜上。因此，每个膜都包含组织的一个副本，并且可以使用标准免疫印迹技术探测不同的生物标志物，这使得在单个组织切片上能够进行无限度的标志物谱扩展。由于所述叠层中离组织更远的膜上蛋白质的量可能较低，这可以在例如组织样本中的分子的量不同、从组织样本中释放的分子的迁移率不同、分子对膜的结合亲和力不同、转移的长度等时出现，因此可以在所述程序中包括值的归一化、运行控制、评估组织分子的转移水平等以校正膜内、膜之间和膜之中发生的变化，并使得能够直接比较膜内、膜之间和膜之中的信息。因此，可以使用例如用于定量蛋白质的任何手段，例如使用标准试剂和方法将可用的分子例如蛋白质生物素化，然后通过将所述膜暴露于标记的亲和素或链霉亲和素来显露结合的生物素；本领域已知的蛋白质染色例如Blot fastStain、丽春红、亮蓝染色等，从而确定每个膜的总蛋白质。

在一些实施方式中，本方法利用多重组织印迹(MTI)技术来测量生物标志物，其中所述方法通过允许测量多个生物标志物、在一些情况下至少六个生物标志物来节省宝贵的活检组织。

在一些实施方式中，已有的替代性多重组织分析系统也可用作本发明的一部分。一种这样的技术是基于质谱的选择反应监测(SRM)测定系统(“Liquid tissue”，可得自OncoPlexDx(Rockville，MD))。该技术在美国专利号7,473,532中描述。

在一些实施方式中，本发明的方法利用了GE Global Research(Niskayuna，NY)开发的多重IHC技术。该技术在美国专利公布号2008/0118916和2008/0118934中描述。在那里，对含有多个靶标的生物样本进行顺序分析，包括以下步骤：将荧光探针与样本结合，随后进行信号检测，然后使探针失活，随后将探针与另一个靶标结合，检测并失活，继续这一过程，直到检测过所有靶标为止。

在一些实施方式中，当使用荧光(例如荧光团或量子点)时可以进行多重组织成像，其中信号可以用多光谱成像系统测量。多光谱成像是一种收集图像的每个像素处的光谱信息并用光谱图像处理软件分析所得数据的技术。例如，该系统可以在不同波长下拍摄一系列图像，所述图像可通过电子方式连续选择，然后与为处理这样的数据而设计的分析程序一起使用。该系统可以由此能够同时从多种染料中获得定量信息，即使当染料的光谱高度重叠时或当染料共定位、或存在于在样本中的同一点时，条件是光谱曲线不同。许多生物材料在被高能量光激发时自动发射荧光，或发射低能量的光。该信号可以导致图像和数据的对比度较低。没有多光谱成像能力的高灵敏度相机只会随着荧光信号增加自体荧光信号。多光谱成像可以使自体荧光与组织不混合或分离，从而增加可实现的信噪比。简而言之，定量可以通过以下步骤进行：i)提供从患者获得的肿瘤组织微阵列(TMA)，ii)然后用具有目的免疫检查点蛋白特异性的抗体染色TMA样品，iii)将TMA载玻片进一步用上皮细胞标志物染色以帮助自动区分肿瘤和基质，iv)然后使用多光谱成像系统扫描所述TMA载玻片，v)扫描过的图像使用自动图像分析软件处理(例如Perkin Elmer Technology)，所述软件允许通过强大的模式识别算法对特定组织进行检测、定量和区分。机器学习算法通常事先进行训练，以从基质中区分肿瘤并鉴别标记的细胞。

确定从患者获得的肿瘤样本中基因的表达水平可以通过本领域公知的一组技术来实施。

通常，基因的表达水平是通过确定该基因产生的mRNA的量来评估的。

确定mRNA的量的方法是本领域公知的。例如，首先根据标准方法，例如使用裂解酶或化学溶液，或按照制造商的说明通过核酸结合树脂进行提取，来提取样本(例如从患者制备的细胞或组织)中所含的核酸。然后通过杂交(例如Northern印迹分析)和/或扩增(例如RT-PCR)来检测如此提取的mRNA。优选地，定量或半定量RT-PCR是优选的。实时定量或半定量RT-PCR是特别有利的。

其它扩增方法包括连接酶链式反应(LCR)、转录介导扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)、新一代RNA定量测序(NGS)。

包含至少10个核苷酸并表现出与本文的目的mRNA的序列互补性或同源性的核酸可用作杂交探针或扩增引物。应理解，这样的核酸无需完全相同，但通常与大小相当的同源区域有至少约80％的同一性，更优选85％的同一性，更加优选90-95％的同一性。在某些实施方式中，将核酸与适当的手段、例如可检测标记相结合使用来检测杂交将是有利的。多种合适的指示物是本领域已知的，包括荧光配体、放射性配体、酶配体或其它配体(例如亲和素/生物素)。

探针通常包含长度在10到1000个核苷酸之间、例如10和800个之间、更优选15和700个之间、通常20和500个核苷酸之间的单链核酸。引物通常是长度在10到25个核苷酸之间的较短的单链核酸，其被设计成完全或几乎完全匹配待扩增的目的核酸。探针和引物对于它们所杂交的核酸是“特异性的”，即它们优选在高严格杂交条件(对应于最高解链温度Tm，例如50％甲酰胺，5x或6x SCC。SCC是0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠)下杂交。

在上述扩增和检测方法中可用作引物或探针的核酸可以组装成试剂盒。这样的试剂盒包括共有引物和分子探针。优选的试剂盒还包括确定是否发生扩增所必需的组分。试剂盒还可包括，例如，PCR缓冲液和酶；阳性对照序列、反应对照引物；以及扩增和检测特异性序列的说明。

在一个特定实施方式中，如本文所述的生物标志物的表达可通过用数字寡核苷酸条形码对所述生物标志物加标签(在其DNA、RNA或蛋白质中)并测量或计数条形码的数量来评估。

在一个特定实施方式中，本发明的方法包括以下步骤：提供从卵丘细胞中提取的总RNA，并使所述RNA进行扩增并与特异性探针杂交，更具体地通过定量或半定量RT-PCR。

使用所公开的方法制备的探针可用于核酸检测，例如原位杂交(ISH)程序(例如，荧光原位杂交(FISH)、显色原位杂交(CISH)和银原位杂交(SISH))或比较基因组杂交(CGH)。

原位杂交(ISH)包括在中期或间期染色体制备(例如安装在载玻片上的细胞或组织样本)的背景下，将含有靶核酸序列(例如基因组目标核酸序列)的样本与对靶核酸序列(例如基因组靶核酸序列)而言可特异性杂交的或特异性的标记探针接触。所述载玻片任选进行预处理，例如去除石蜡或其它可以干扰均匀杂交的材料。所述样本和探针都进行处理，例如通过加热使双链核酸变性。所述探针(在合适的杂交缓冲液中配制)和样本在允许杂交发生的条件下合并足够的时间(通常为了达到平衡)。洗涤染色体制备物以去除过量的探针，并使用标准技术进行染色体靶标的特异性标记的检测。

例如，可以使用荧光素标记的亲和素或亲和素-碱性磷酸酶来检测生物素化探针。对于荧光染料检测，可以直接检测荧光染料，或例如，可以将样本与异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的亲和素一起温育。如有必要，可以通过与生物素缀合的山羊抗亲和素抗体一起温育、洗涤并与FITC缀合的亲和素一起二次温育，来进行FITC信号的放大。对于通过酶活性进行检测，例如，样本可以与链霉亲和素一起温育，洗涤，与生物素缀合的碱性磷酸酶一起温育，再次洗涤并预平衡(例如，在碱性磷酸酶(AP)缓冲液中)。对于原位杂交程序的一般性描述，参见，例如，美国专利号4,888,278。

FISH、CISH和SISH的许多程序是本领域已知的。例如，执行FISH的程序在下列文献中描述：美国专利号5,447,841、5,472,842、和5,427,932；以及例如，Pinkel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.83:2934-2938，1986；Pinkel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.85:9138-9142，1988；和Lichter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.85:9664-9668，1988。CISH在例如Tanner等人，Am.J.Pathol.157:1467-1472，2000和美国专利号6,942,970中描述。其它检测方法在美国专利号6,280,929中提供。

许多试剂和检测方案可以与FISH、CISH和SISH程序结合使用，以改善灵敏度、分辨率或其它期望的性质。如上所论述，用荧光团(包括荧光染料和QUANTUM

)标记的探针在进行FISH时可以直接进行光学检测。或者，探针可以用非荧光分子标记，所述用非荧光分子例如半抗原(例如以下非限制性实例：生物素，洋地黄毒苷，DNP，以及各种恶唑类、吡唑类、噻唑类、硝基芳基化合物类、苯并呋咱类、三萜类、脲类、硫脲类、鱼藤酮类、香豆素、基于香豆素的化合物、鬼臼毒素、基于鬼臼毒素的化合物及其组合)、配体或其他可间接检测的部分。然后可以通过将样本(例如，探针结合的细胞或组织样本)与标记的检测试剂、例如对所选的半抗原或配体具有特异性的抗体(或受体，或其它特异性结合配偶体)接触，来检测用这样的非荧光分子标记的探针(以及它们所结合的靶核酸序列)。所述检测试剂可以用荧光团(例如QUANTUM

)或用其它可间接检测的部分标记，或者可以与一种或多种附加的特异性结合试剂(例如二抗或特异性抗体)接触，所述附加的特异性结合试剂可以用荧光团标记。

在其它实例中，所述探针或特异性结合试剂(例如抗体，例如一抗、受体或其它结合试剂)用酶进行标记，所述酶能够将生荧光或生色的组合物转化为可检测的荧光性、有色或以其它方式可检测的信号(例如，如SISH中可检测的金属粒子的沉积)。如上所指出，所述酶可以直接地或通过接头间接地连接到相关的探针或检测试剂上。合适的试剂(例如结合试剂)和化学(例如接头和连接化学)的实例在美国专利申请公布号2006/0246524、2006/0246523和2007/0117153中描述。

本领域技术人员会领会，通过适当选择标记探针与特异性结合试剂对，可以产生多重检测方案以便于在单个测定(例如，在单个细胞或组织样本上或在多于一个细胞或组织样本上)中检测多个靶核酸序列(例如基因组靶核酸序列)。例如，对应第一靶序列的第一探针可以用第一半抗原、例如生物素标记，而对应第二靶序列的第二探针可以用第二半抗原、例如DNP标记。在样本暴露于探针之后，可以通过将所述样本与第一特异性结合试剂(在这种情况下是用第一荧光团标记的亲和素，所述第一荧光团是例如第一个光谱不同的QUANTUM

例如，其在585nm下发光)和第二特异性结合试剂(在这种情况下是用第二荧光团(例如第二个光谱不同的QUANTUM

例如，其在705nm下发光)标记的抗DNP抗体或抗体片段)接触，来检测结合的探针。可以使用其它光谱不同的荧光团将额外的探针/结合试剂对添加到所述多重检测方案中。可以设想直接和间接(一步、两步或更多步)的多种变化方案，所有变化方案都适合于所公开的探针和测定的环境。

探针通常包含长度在10到1000个核苷酸之间、例如10和800个之间、更优选15和700个之间、通常20和500个核苷酸之间的单链核酸。引物通常是长度在10到25个核苷酸之间的较短的单链核酸，其被设计成完全或几乎完全匹配待扩增的目的核酸。探针和引物对于它们所杂交的核酸是“特异性的”，即它们优选在高严格杂交条件(对应于最高解链温度Tm，例如50％甲酰胺，5x或6x SCC。SCC是0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠)下杂交。

上述扩增和检测方法中使用的核酸引物或探针可以组装成试剂盒。这样的试剂盒包括共有引物和分子探针。优选的试剂盒还包括确定是否发生扩增所必需的组分。试剂盒所述还可包括，例如，PCR缓冲液和酶；阳性对照序列、反应对照引物；以及扩增和检测特异性序列的说明。

在一个特定实施方式中，本发明的方法包括以下步骤：提供从卵丘细胞中提取的总RNA，并使所述RNA进行扩增并与特异性探针杂交，更具体地通过定量或半定量RT-PCR。

在另一个优选的实施方式中，通过DNA芯片分析确定表达水平。这样的DNA芯片或核酸微阵列由化学附着于基底上的不同核酸探针组成，所述基底可以是微芯片、载玻片或微球尺寸的珠子。微芯片可由聚合物、塑料、树脂、多糖、二氧化硅或基于二氧化硅的材料、碳、金属、无机玻璃或硝化纤维构成。探针包含核酸，例如可以是约10至约60个碱基对的cDNA或寡核苷酸。为了确定表达水平，来自测试对象的样本，任选首先进行逆转录，被标记并在杂交条件下与所述微阵列接触，导致与附着在微阵列表面的探针序列互补的靶核酸之间形成复合物。然后检测所述标记的杂交复合物并可以进行定量或半定量。标记可以通过各种方法实现，例如通过使用放射性标记或荧光标记。微阵列杂交技术的许多变化方案是本领域技术人员可以获得的(参见例如Hoheisel，Nature Reviews，Genetics，2006，7:200-210中的综述)。

基因表达水平可表示为绝对表达水平或归一化表达水平。这两种类型的值在本方法中均可使用。当使用定量PCR作为评估表达水平的方法时，基因表达水平优选表示为归一化表达水平，因为实验开始时的小差异可能在多次循环后提供巨大的差异。

通常，通过将某个基因的表达与确定患者的癌症分期无关的基因例如组成型表达的管家基因的表达进行比较来校正该基因的绝对表达水平，从而使表达水平归一化。适合用于归一化的基因包括管家基因，例如肌动蛋白基因ACTB、核糖体18S基因、GUSB、PGK1和TFRC。这种归一化允许比较一个样本、例如患者样本的表达水平与另一个样本的表达水平，或比较来自不同来源的样本。

治疗药剂

本文提供了一种在患有癌症的患者中确定、调节或调整使用化疗药剂的治疗方案的方法，其中所述药剂能够影响或促进肿瘤靶向免疫应答。

所述治疗可由辅助疗法(即手术切除原发肿瘤之后的治疗)或新辅助疗法(即手术切除原发肿瘤之前的治疗)组成。

术语“化疗药剂”是指有效抑制肿瘤生长的化合物。

如Galluzzi等人，2016，Cancer Immunol Res，4(11)：895–902以及Galluzzi等人，2015，Cancer Cell Review，28(6)：690-714中所述，能够引起肿瘤靶向免疫应答的药剂，或增加恶性细胞的免疫原性(抗原性或佐剂活性)(“在靶”免疫刺激)，或与免疫效应物或免疫抑制细胞群相互作用(“脱靶”免疫刺激)。

在一个优选的实施方式中，化疗药剂能够引起免疫性细胞死亡(ICD)。与多为非免疫原性或甚至耐受原性的正常细胞凋亡不同，癌细胞的免疫原性细胞凋亡可以通过激活树突细胞(DC)并由此激活特异性T细胞应答来诱导有效的抗肿瘤免疫应答。

在一个最优选的实施方式中，化疗药剂是铂、或铂盐、衍生物或类似物，包括奥沙利铂、顺铂和卡铂，该化疗药剂可单独使用或与其它治疗药剂例如氟嘧啶如5-氟尿嘧啶(5FU)和/或卡培他滨联合使用。优选所述化疗药剂是奥沙利铂，单独使用或与5-氟尿嘧啶(5FU)和/或卡培他滨联合使用。在一个特定实施方式中，疗法是FOLFOX(奥沙利铂+5FU)、mFOLFOX6(奥沙利铂+5FU+甲酰四氢叶酸)或CAPOX(奥沙利铂+卡培他滨)。

或者，能够影响或促进肿瘤靶向免疫应答的其它化疗药剂包括但不限于以下药剂：

博来霉素

硼替佐米

烷化剂(例如环磷酰胺)

达卡巴嗪

紫杉烷类(例如多西紫杉醇或紫杉醇)

蒽环类药物，例如阿霉素

氟嘧啶类(例如5-氟尿嘧啶或卡培他滨)

伊立替康

吉西他滨

伊达比星

美法仑

培美曲塞

长春瑞滨

最优选地，所述化疗药剂能够诱导ICD，例如铂，或铂盐、衍生物或类似物，包括奥沙利铂、顺铂和卡铂，以及博来霉素、硼替佐米、环磷酰胺、或蒽环类药物如阿霉素。

在一个特定实施方式中，所述化疗药剂可以与其它治疗药剂、例如免疫治疗药剂(例如抗体)联合使用。

参考值

用于比较的预定参考值可包括可如本文所述确定的“临界”值或“阈”值。各目的基因的各参考(“临界”)值可通过执行包括以下步骤的方法来预先确定

a)提供来自患有癌症的患者的一系列肿瘤组织样本；

b)确定步骤a)提供的系列中包含的每个肿瘤组织样本的基因或蛋白质表达水平；

c)根据所述表达水平对肿瘤组织样本进行排序

d)将所述肿瘤组织样本分类为根据其表达水平排序的成员数量增加、相应地减少的子集对，

e)对于在步骤a)提供的每个肿瘤组织样本，提供与相应癌症患者的实际临床结局相关的信息(即无病生存期(DFS)或总生存期(OS)的持续时间或复发时间(TTR)或两者)；

f)对于肿瘤组织样本的每个子集对，获得Kaplan Meier百分比生存曲线；

g)对于肿瘤组织样本的每个子集对，计算这两个子集之间的统计显著性(p值)

h)选择表达水平的参考值，该值是p值最小时的表达水平值。

例如，评估100名患者的100个癌症样本的基因X表达水平。该100个样本根据它们的表达水平进行排序。样本1的表达水平最好，而样本100的表达水平最差。第一次分组提供了两个子集：在一侧的样本Nr 1和在另一侧的99个其它样本。下一次分组提供了在一侧的样本1和2以及在另一侧的98个其余样本等，直到最后一次分组：在一侧样本1至99和在另一侧的样本Nr 100。根据与相应癌症患者的实际临床结局相关的信息，对99组的2个子集中的每一组制备Kaplan Meier曲线。还对99组中的每一组，计算两个子集之间的p值。

选择参考值，例如基于最小p值准则的判别力最强进行选择。换言之，将p值最小的两个子集间边界所对应的表达水平认为是参考值。应该说明的是，参考值不一定是表达水平的中值。

在日常工作中，本方法可以利用参考值(临界值)来区分肿瘤样本并因此区分相应的患者。

随时间的存活百分比的Kaplan-Meier曲线通常度量治疗后存活一定时间量的患者的分数，并且是本领域技术人员公知的。

本领域技术人员也理解，同样的评估基因表达水平的技术当然应该用于获得参考值，并在之后用于评估接受本发明方法的患者的基因表达水平。

这样的预定表达水平参考值可对本文定义的任何基因进行确定。

如例如国际专利申请WO2017/194556中所述，参考值可以是从患有所述癌症的患者的参考组获得的CD3和CD8各自的值分布。本发明的方法于是包括确定在定量CD3和CD8中的每一个时获得的值所对应的分布的百分位数；计算百分位数的算术平均值或中值；以及

将得到的百分位数的算术平均值或中值与百分位数的预定参考算术平均值或预定中值进行比较。

当患者为结直肠癌患者时，预定参考值可如Pagès等人，Lancet 2018；391：2128-2139所述。由癌症免疫治疗协会(Society for Immunotherapy of Cancer)牵头的13个国家14个中心的国际联盟对TNM I-III期结肠癌患者的免疫评分测定进行了评估。患者被随机分配到训练组、内部验证组或外部验证组。对每位患者的结肠肿瘤和浸润边缘的石蜡切片进行免疫组织化学处理，并通过数字病理学定量肿瘤中和浸润边缘中CD3+和细胞毒性CD8+T细胞的密度。每个患者的免疫评分由四个密度百分位数的平均值得出。主要终点是评价免疫评分对复发时间的预后价值，复发时间定义为从手术到疾病复发的时间。使用分层多变量Cox模型评估免疫评分与结局之间的关联，并针对潜在的混杂因素进行调整。Harrell C-统计量用于评估模型性能。

在一个特定实施方式中，患者的免疫状态，在实施例中称为“免疫评分(IS)”，可以如下分为两组(低，中等+高)、或三组(低，中等，高)：

确定对应于CT区和IM区的CD3细胞密度以及CT区和IM区的CD8细胞密度的4个标志物(CD3ct，CD8ct，CD3im，CD8im)的4个独立百分位数的平均百分位数。

-低IS对应于平均百分位数低于25％，

-中等IS对应于平均百分位数在25％和70％之间，

-高IS对应于平均百分位数超过70％。

处理或调节治疗方案的方法

按照常规化疗方案，抗癌药物在周期中以接近或等于最大耐受剂量施用，所述周期可以与长的停药期交替，以使患者从不良药物反应中恢复。

例如，典型的结肠癌化疗是卡培他滨、LV5FU2、CAPOX、FOLFOX4或mFOLFOX6，优选按照以下方案施用：

·卡培他滨：每天两次施用1250mg/m²卡培他滨，共14天(周期持续时间)，周期每3周重复；

·LV5FU2：400mg/m² AF(亚叶酸)联合400mg/m² 5-FUb(5-氟尿嘧啶，推注)和24005-FUc(5-氟尿嘧啶，连续)，施用46小时(周期持续时间)，周期每2周重复；

·CAPOX：周期的第一天(第1天)施用130mg/m²奥沙利铂，联合从第1天起每天两次施用1000mg/m²卡培他滨，共14天(周期持续时间)，周期每3周重复；

·FOLFOX4：第1天施用85mg/m²奥沙利铂、400mg/m²AF、400mg/m² 5-FUb和600mg/m²5-FUc，随后在第二天施用400mg/m²AF、400mg/m²5-FUb、600mg/m² 5-FUc(周期持续时间：2天)，周期每2周重复；

·mFOLFOX6：85mg/m²奥沙利铂、400mg/m² AF、400mg/m²5-FUb、2400mg/m² 5-FUc施用46小时(周期持续时间)，周期每2周重复。

基于本发明的体外方法，技术人员可以在此确定、调节或调整治疗方案，使患者更有可能从所述治疗中受益。

施用剂量、施用频率(即周期数)和/或治疗持续时间可相应地调整。

本文提供了一种确定患有癌症的患者对使用化疗药剂的治疗的敏感性的方法，其中所述药剂能够优选通过引起免疫性细胞死亡(ICD)来影响或促进肿瘤靶向免疫应答，所述方法包括对来自患者的肿瘤样本中的至少两个生物标志物、即CD8和CD3进行定量。

本文还提供了治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括定量来自所述患者的肿瘤样本中的至少两个生物标志物，即CD8和CD3，将a)中获得的值与预定参考值进行比较，以及c)

-当在a)中获得的值优于预定参考值时，与标准治疗参考相比，调整化疗药剂在患有癌症的患者中的剂量、治疗持续时间和/或施用频率，其中所述药剂能够影响或促进肿瘤靶向免疫应答；或

-用不包含所述化疗药剂的治疗方案治疗患者。

“累积剂量”是指在治疗期间施用于患者的药剂的量。

累积剂量可通过利用一个或几个参数来调节，所述参数例如施用频率(例如两个施用周期之间的时间段)、施用周期的持续时间和/或每次施用的剂量。

在一个特定实施方式中，预期通过实施节拍方案来调节化疗。“节拍化疗”是以低于最大耐受剂量(MTD)的剂量频繁施用化疗药剂，并且没有长时间的无药间期。

或者，可用预定频率(例如5天和15天之间，优选5和10天之间)重复治疗周期。治疗的持续时间也可延长(如实验部分中所提议的)。

下面阐述了一个特定的实例。

基于奥沙利铂的化疗的典型方案是周期性施用(为期1至3天，每2或3周)，导致治疗3个月后累积剂量为约400mg/m²至500mg/m2，或6个月后累积剂量为600mg/m²至800mg/m2。本发明的方法使得可以在6个月的疗程中以600mg/m²至800mg/m²的累积剂量治疗时，为表现出中等或高IS的患者提供效益。

结直肠癌患者是优选的。

化疗药剂可以通过任何方便的途径施用，优选通过静脉内途径。当预期节拍化疗时，口服途径可能是优选的。

实施例和附图说明本发明而不限制其范围。

实施例

缩写：MFOLFOX6：改良的FOLFOX6疗法(输注5-氟尿嘧啶加甲酰四氢叶酸加奥沙利铂)；CAPOX：用卡培他滨加奥沙利铂的疗法；IS：对应于CD8和CD3细胞密度的免疫评分

状态；高：高IS值；低：高IS值；Int：中等IS值；IM：浸润边缘；CT：肿瘤核心；MSI：微卫星不稳定性；DFS：无病生存期；RMST：受限平均生存时间；TNM分类：肿瘤、淋巴结和转移癌分期如美国癌症联合委员会(American Joint Cancer Committee)定义(GreenFL，Page D，Fleming ID：美国癌症联合委员会分期手册(American Joint CancerCommittee Staging Handbook)，第6版，New York，NY Springer，2002)；T：原发性肿瘤期(例如TX、T0、T1至T4)；N：N区域淋巴结(例如NX、N0、N1至N4)；M：转移期(例如MX、M0、M1)。

材料和方法(1.)

1322名患有III期结肠癌(CC)并打算在3或6个月内接受mFOLFOX6和/或CAPOX疗法的患者被纳入本分析。

每位患者在治疗前、治疗期间每两周、然后每6个月采集肿瘤样本共5年。

如André等人，2018，J Clin Oncol 36.1-11所述，在6个月期间，每位患者接受的中位奥沙利铂(采用mFOLFOX6)剂量为732.39mg/m²(平均：8.9个周期)。

相形之下，在3个月期间，每位患者接受的中位奥沙利铂剂量为494.22mg/m²(采用mFOLFOX6)，或504.44mg/m²(采用CAPOX)。

中心病理实验室(

Ambroise Paré，法国布洛涅(Boulogne))根据

样品制备说明为每位患者选择一个福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)块。简而言之，将一个FFPE块或由4μm厚的相邻FFPE切片制备的四个未染色的标记载玻片在室温下送到两个实验室(HalioDx，法国马赛；Immunmonitoring Platform，

EuropéenGeorges Pompidou AP-HP，INSERM，法国巴黎)，在那里，在对临床数据不知情的情况下进行

测试(免疫组织化学(IHC)和图像分析)，即CD3和CD8表达的测量。在切片的4个月内在BenchMark XT(Ventana)上进行自动免疫组织化学。将按制造商的推荐，切片在37℃下与一抗：兔单克隆抗人CD3抗体(克隆HDx2HalioDx，法国马赛)和小鼠单克隆抗人CD8抗体(克隆HDx1 HalioDx，法国马赛)一起温育。复染的载玻片在NanoZoomer XR(Hamamatsu)上以20×放大倍率和0.45μm/像素分辨率数字化。

图像分析软件用于自动组织检测(肿瘤、健康非上皮组织和上皮)并用于通过使用整合到图象分析系统中的软件算法(

Analyzer，HalioDx，法国马赛)通过肿瘤核心(CT)和浸润边缘(IM)二者每mm²的细胞数来定量染色的免疫CD3+和CD8+细胞的密度(Pagès等人，Lancet 2018；391：2128-2139；Hermitte等人，2016；4：57)。IM，定义为恶性细胞与瘤周基质之间边界的每一侧360μm宽的区域，是自动生成的。根据先前针对I至III期结肠癌患者开发的算法，将CD3+和CD8+T细胞密度转换为具有预定义临界值的免疫评分

(Pagès等人，同上；Hermitte等人，2016；4：57)。免疫评分

利用标准化百分位值(0至100％)，并且该算法使用预定义的密度分数将连续的免疫评分

分为5个组，所述5个组的平均百分位数为[0-10％]、[>10-25％]、[>25-70％]、[>70-95％]和[>95-100％]，分别对应于IS 0、IS 1、IS 2、IS 3和IS 4。3组分类对应于IS 0-1、IS 2和IS 3-4，分别为免疫评分

低、中等和高，分为2组对应于IS 0-1(平均百分位数0-25％)和IS 2-3-4(平均百分位>25-100％)，分别为免疫评分

低和高。

在FFPE块问题、样本识别问题、组织撕裂或折叠、高IHC染色本底、或肿瘤区域(CT或IM)缺失的情况下，样本不合格。对于

分析质量控制，如果某个肿瘤区域(CT或IM)的CD3或CD8计数缺失或如果染色强度被认为低，则样本被排除在该分析之外。

结果(2.)

患者特征和IS确定(2.1.)

在2010年共有1322名患有III期结肠癌(CC)并在治疗前和整个治疗中都有可用的肿瘤样本的患者被纳入分析。

与整个患者群体相比，在有可用于

表征的样本的患者中观察到低危患者(T1-T3N1)、尤其是T1期肿瘤的比例较低(表1)。

表1.结合IS和组织病理学分类的对DFS的多变量分析

在现有的样本中，82个样本由于分析前不合格而被排除。专用软件监测CD3和CD8染色强度并确定IS(图1A)。此程序提供内部质量控制，允许染色细胞计数的一致性(Pagès等人2018，同上)以及参与IS评估的两个中心之间IS的可重复性(图1B)。总体上，1062例(85.6％)达到质量控制。

将免疫密度转换为2类IS评分系统(图1C)后，分别在n＝599(43.6％)和n＝463(56.4％，包括47％中等和9.4％高)名患者中观察到IS低和中等+高。

IS相关的预后价值(2.2.)

分为2类中的IS与T分期、T/N分期(T1-3和N1与T4和/或N2)、微卫星不稳定性(MSI)状态显著相关。

研究的主要目标得到满足，因为通过单变量分析证明，患者群体中通过分为两类(低与中等+高)的IS进行分层的患者组之中，DFS有显著差异(HR＝1.54(95％CI 1.24-1.93)；P＝0.0001)，并由Kaplan-Meier曲线示出(表3和图2A)。IS低和IS中等+高的3年DFS率分别为66.80％[95％CI 62.23-70.95]和77.14％[95％CI 73.50-80.35]。IS作为连续变量(表2)也与DFS显著相关(P<0.0001)。

表2.用于DFS预测的最终多变量模型(具有连续形式的IS)

相应地，以3类(图2B)和以5类分层的IS进一步区分了患者的DFS时间结局(Logrank检验，全部P<0.001)。关于以3类分层的IS，IS高的患者的3年DFS率为85％，而IS低的患者的3年DFS率为67％。关于以5类分层的IS，最低IS(ISO)的患者的3年DFS率为55％，相比之下最高IS(IS4)的组为100％(无复发或死亡)。

最后，进一步根据IS测试受限平均生存时间(RMST)，作为生存时间分布的替代量度。RMST在DFS分析中对于IS高和IS低亚组是显著的，类似于Logrank P值和HR分析。例如，与免疫评分低的患者相比，免疫评分高的患者针对复发或死亡事件的RMST(DFS)显示出提高了367天。

在多变量分析中，当结合性别、组织学分级、T分期、N分期和MSI状态时，IS仍与DFS显著且独立地相关(表1)。此外，当结合T/N分期分类(高危T4和/或N2；低危T1-3和N1)时，IS仍与DFS独立相关。将IS加入到T/N分期中显著改善了模型判别能力[bootstrap C指数平均差，0.022；95％CI 0.005-0.04]。

根据T/N分期亚组的IS预后价值(2.3.)

在低危T1-3和N1肿瘤患者亚组中，2、3或5分类的IS与复发或死亡的发生均存在显著相关(Logrank检验)全部P<＝0.001)(参见图3)。

在高危T4和/或N2肿瘤患者中，IS分类未达到显著性，但最高的IS一直是在事件风险最低的患者中观察到的，并且复发或死亡的风险随着IS降低而逐渐增加(图2)。

根据本发明，IS对辅助FOLFOX6化疗持续时间的预测价值(2.4.)

分别分析了在3个月和6个月组中接受mFOLFOX6的492和481名患者。高危肿瘤(T4和/或N2肿瘤)占该群组的38.4％(n＝408名患者)。

在(中等+高)IS的患者中观察到6个月与3个月FOLFOX6方案相比的有益效果(HR＝0.528；95％CI 0.372至0.750；Logrank P＝0.0004，图3A)。该效益在低危肿瘤(T1-T3和N1；HR＝0.467，Logrank P＝0.010)和高危肿瘤(T4和/或N2肿瘤；HR＝0.542，Logrank P＝0.0067)中得到保持(图3A)。

令人惊讶的是，对于低IS的患者，未观察到6个月FOLFOX6方案的显著效益(HR＝0836，Logrank P＝0.269；(图3B)。在这些患者中，前3年观察到6个月FOLFOX6方案的适度效益，但此后消除。这种趋势在高危肿瘤组中更为明显(图3B)。为了进一步研究免疫渗透密度与6个月化疗效益之间的关系，将IS作为连续变量进行评价。得到的IS越高，以3年DFS率(％)评价的6个月化疗的临床效益变得越重大。

为了进一步研究免疫渗透密度与6个月化疗效益之间的关系，将IS分层为5类。结果表明，6个月化疗效益最大的群体是具有中等IS的患者。

讨论(3.)

免疫评分

(IS)检验以前已被证明对I-III期结肠癌(CC)患者进行预后分类。该检验已在癌症法国群组研究中进行评估，以研究在不同癌症分期(TNM分期T1-T3、N1、T4、N2)的结肠癌患者中3个月对比6个月基于奥沙利铂的辅助化疗。

通过数字病理学定量每位患者的肿瘤和浸润边缘中CD3+和细胞毒性CD8+T细胞的密度，并根据所测量的CD3和CD8密度以及使用预先定义的已发表的临界值，转换为免疫评分

状态(高，低，中等)。在每个研究组的改良意向治疗群体中评估免疫评分

预测无病生存期(DFS)的性能，并在多变量Cox模型中以相关的临床特征进行调整。Harrell C-统计量用于调查IS性能。

在1062名(85.6％)合格患者中成功分析了IS。在2分类IS分析中，分别在n＝599(43.6％)和n＝463(56.4％)名患者中观察到低和中等+高IS。IS与T分期、T/N分期(T1-3和N1对比T4和/或N2)、微卫星不稳定性(MSI)状态显著相关。因此，该研究证实了低IS鉴别复发或死亡风险更高的患者[HR＝1.54；95％CI 1.24-1.93，p＝0.0001]。低IS和中等+高IS的3年DFS率分别为66.80％[95％CI 62.23-70.95]和77.14％[95％CI 73.50-80.35]。在多变量分析中，当结合T/N分期时，IS仍与DFS独立相关(p<0.0012)。将IS加入到T/N分期中显著改善了模型判别能力[bootstrap C指数平均差，0.022；95％CI 0.005-0.04]。此外，3分类(低，中等，高)和作为连续变量的IS也都与DFS显著相关(全部p<0.001)。在单变量分析中，IS也与6个月组的DFS有关(p<0.0001)；在3个月组中观察到类似的趋势(p＝0.09)。

本研究证明，只有中等或高IS状态的患者才能从6个月mFOLFOX6疗法中比3个月疗法获益，在低危(T1-T3，N1)和高危(T4和/或N2)III期组均如此。

Claims (14)

1.一种在患有癌症的患者中确定、调节或调整使用化疗药剂的治疗方案的方法，其中所述药剂能够优选通过引起免疫性细胞死亡(ICD)来影响或促进肿瘤靶向免疫应答，所述方法包括对来自所述患者的肿瘤样本中的至少两个生物标志物、即CD8和CD3进行定量。

2.根据权利要求1所述的方法，其包括a)对来自所述患者的肿瘤样本中的至少两个生物标志物、即CD8和CD3进行定量，以及b)将a)中获得的值与预定参考值进行比较，以及c)当a)中获得的值优于预定参考值时，通过增加剂量、治疗持续时间和/或施用频率来增加所述患者对所述化疗药剂的暴露。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其包括对肿瘤中心(CT)的CD3+细胞密度、肿瘤中心(CT)的CD8+细胞密度、浸润边缘(IM)的CD3+细胞密度、以及浸润边缘(IM)的CD8+细胞密度进行定量。

4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤b)还包括将所述患者分类为如下的组(低、中等或高免疫评分(IS))：

低IS对应于平均百分位数低于25％，

中等IS对应于平均百分位数在25％和70％之间，

高IS对应于平均百分位数超过70％；

其中所述平均百分位数是指对应于CT区和IM区的CD3细胞密度以及CT区和IM区的CD8细胞密度的4个标志物(CD3ct，CD8ct，CD3im，CD8im)的4个独立百分位数的平均百分位数。

5.根据权利要求1至4中的任一项所述的方法，其包括将所述治疗的持续时间调整为至少六个月，优选至少八个月，更优选至少一年。

6.根据权利要求1至5中的任一项所述的方法，其包括当所述患者被分类为属于中等或高IS组时，调节剂量、治疗持续时间和/或施用频率。

7.根据权利要求1至6中的任一项所述的方法，其中所述化疗药剂选自单独或联合使用的铂或其铂盐、衍生物或类似物(例如奥沙利铂、顺铂或卡铂)、博来霉素、硼替佐米、烷化剂(例如环磷酰胺)、蒽环类药物例如阿霉素。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述化疗药剂是铂或其铂盐、衍生物或类似物，例如奥沙利铂，所述化疗药剂单独使用或与至少另一种治疗药剂例如氟嘧啶如5-氟尿嘧啶(5FU)和/或卡培他滨联合使用。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述化疗药剂是奥沙利铂，所述化疗药剂任选与5-氟尿嘧啶(5FU)和/或卡培他滨联合使用。

10.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述癌症是实体癌症。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述癌症选自结直肠癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、胃肠道类癌肿瘤、胃癌、皮肤癌、黑色素瘤、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、胆管癌、喉癌、下咽癌、鼻腔癌、鼻窦癌、鼻咽癌、口腔癌、口咽癌、和唾液腺癌。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述实体癌是结直肠癌。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述癌症优选是结直肠癌，所述化疗药剂是铂或其铂盐、衍生物或类似物(优选奥沙利铂)，所述化疗药剂单独使用或与另一种治疗药剂例如氟嘧啶如5-氟尿嘧啶(5FU)和/或卡培他滨联合使用，所述方法包括a)定量来自所述患者的肿瘤样本中的至少两个生物标志物，即CD8和CD3，优选通过定量所述患者的核心肿瘤(CT)和浸润边缘(IM)的CD3+和细胞毒性CD8+T细胞的密度，以及b)将a)中获得的值与预定参考值进行比较，以及c)当a)中获得的值优于预定参考值时，调节剂量、治疗持续时间和/或施用频率，优选通过调整治疗持续时间到至少六个月和/或调整剂量到至少700mg/m²的累积剂量。

14.根据权利要求13所述的方法，其中步骤b)还包括将所述患者分类为如下的组(低、中等或高免疫评分(IS))：

低IS对应于平均百分位数低于25％，

中等IS对应于平均百分位数在25％和70％之间，

高IS对应于平均百分位数超过70％；

其中所述平均百分位数是指对应于CT区和IM区的CD3细胞密度以及CT区和IM区的CD8细胞密度的4个标志物(CD3ct，CD8ct，CD3im，CD8im)的4个独立百分位数的平均百分位数；并且c)包括当所述患者已被分类为属于中等或高IS组时，调节剂量、治疗持续时间和/或施用频率，优选通过调整治疗持续时间到至少六个月和/或调整剂量到至少700mg/m²的累积剂量。

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