CN114034595A - 一种测定普鲁兰多糖含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定普鲁兰多糖含量的方法。该方法通过絮凝将发酵液中的菌体、胶体杂质凝聚成絮凝块，再通过离心将杂质固液分离，醇沉提取上清中的普鲁兰多糖，最后干燥得到普鲁兰多糖干品，称重计算发酵液中普鲁兰多糖含量。该方法解决了高粘度发酵液采用高速离心法无法将菌体、胶体等物质完全沉淀，使得醇沉环节的杂质较多，多糖产量测定值偏高的问题，提供了一种更准确的测定方法，属于普鲁兰多糖含量测定领域中直接法，另外，本发明工序简单，适合产业化。
Description
技术领域
本发明属于普鲁兰多糖产量测定技术领域，具体涉及一种测定普鲁兰多糖含量的方法。
背景技术
普鲁兰多糖发酵液是含有菌体、蛋白、胶体、普鲁兰多糖等物质的粘性液体。测定普鲁兰多糖产量时需要先将发酵液中的杂质除去，分离出较为纯净的普鲁兰多糖。
目前对于普鲁兰多糖发酵液的产量检测方法主要分为直接法和间接法两种。
直接法是通过将发酵液中的普鲁兰多糖分离提纯，干燥后计算其产量，传统的直接离心法是将发酵液通过高速离心的方式去除菌体，再取其上清液用乙醇提取普鲁兰多糖，如安超. 普鲁兰多糖产生菌选育及培养基浓度对普鲁兰分子量影响研究[D].西北大学,2017.。此方法对于粘度较低的发酵液尚且适用，但对于像普鲁兰多糖这类粘度较高的发酵液，该方法测定的产量值偏高，因为通过高速离心很难将发酵液中的菌体和胶体完全除尽，且发酵液粘度越大，其残留的菌体残渣越多，产量测定值就越不准确。
间接法大多是通过普鲁兰酶将普鲁兰多糖酶解成麦芽三糖，再通过高效液相色谱法测定出麦芽三糖含量，从而间接计算出普鲁兰多糖的产量，如卢星达. 产普鲁兰多糖出芽短梗霉的菌种筛选及发酵条件优化[D].天津科技大学,2013.，此方法工序较为繁琐，酶活化时间长，普鲁兰酶的活力和稳定性差异也会影响产量测定的稳定性，且高效液相色谱的设备投入成本及其使用门槛都比较高。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种测定普鲁兰多糖含量的方法，该方法解决了高粘度发酵液采用高速离心法无法将菌体、胶体等物质完全沉淀，使得醇沉环节的杂质较多，多糖产量测定值偏高的问题，提供了一种更准确的测定方法，属于普鲁兰多糖含量测定领域中直接法，另外，本发明工序简单，适合产业化。
为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：
一种测定普鲁兰多糖含量的方法，通过絮凝将发酵液中的菌体、胶体杂质凝聚成絮凝块，再通过离心将杂质固液分离，醇沉提取上清中的普鲁兰多糖，最后干燥得到普鲁兰多糖干品，称重计算发酵液中普鲁兰多糖含量。
上述测定普鲁兰多糖含量的方法，包括以下步骤：
步骤1，絮凝
将絮凝剂溶解于水中，按照等体积与发酵液进行混合，产生大块絮凝体，所述絮凝剂与发酵液的质量比为1‰-5%；
步骤2，离心
对絮凝后的料液进行固液分离，收集离心后的上清液；
步骤3，醇沉
取离心后的上清液，用不小于其2倍体积的95%乙醇提取普鲁兰多糖，充分振荡混匀后产生白色沉淀，并通过离心的方式收集沉淀；
步骤4，干燥
将收集的普鲁兰多糖沉淀干燥至恒重，即可计算出发酵液中的普鲁兰多糖产量。
作为改进的是，步骤1中所述絮凝剂为三氯化铝、硫酸铝、三氯化铁、硫酸亚铁、硫酸铁、或明矾中一种或多种混合。
作为改进的是，步骤2中固液分离所用的转速为8000rpm，离心10min。
作为改进的是，步骤4中干燥的温度为80℃。
有益效果：
与现有技术相比，本发明一种测定普鲁兰多糖含量的方法，具有如下优势：
1、本发明通过絮凝可以将高粘度发酵液中的菌体、胶体等物质凝聚沉淀，再通过离心即可充分地将杂质固液分离。此时离心后的上清液中大分子杂质基本去除，相较于传统的直接离心法，其上清液550nm波长下的透光率提升60%左右，如此可以大幅提高测定的多糖产量的准确性，将误差率降低70%左右；
2、本发明通过絮凝离心法，只需要将配好的絮凝剂溶液与发酵液混合，充分絮凝后再通过离心将杂质固液分离，最后用乙醇提取普鲁兰多糖即可测定出其产量。该发明实现了用简单的方法，简单的设备，较低的技术门槛，得到准确度高的产量值，即简化工序，节约设备成本，降低测定门槛。
附图说明
图1 为不同离心方式离心后的发酵液，其中，左侧试管为本发明所得上清液，右侧试管为直接离心上清液。
具体实施方式
实施例1
本发明所用的发酵液以普鲁兰多糖发酵液为例，可参考安超. 普鲁兰多糖产生菌选育及培养基浓度对普鲁兰分子量影响研究[D].西北大学,2017.
实施例2
对实施例1的普鲁兰多糖发酵液进行测定，具体步骤如下：
1.絮凝
取20mL发酵液，配置1%的絮凝剂溶液，在离心管中加入与发酵液等体积的絮凝剂溶液，充分振荡混合，产生大块絮凝体；
2.离心
对絮凝后的料液进行固液分离，8000rpm，离心10min，收集离心后的上清液；
3.醇沉
取15g离心后的上清液用2倍体积的95%乙醇提取普鲁兰多糖，充分振荡混匀后产生白色沉淀，此白色沉淀即为普鲁兰多糖，8000rpm离心10min收集该沉淀，其余清液弃去；
4.干燥
将收集的普鲁兰多糖沉淀于80℃干燥至恒重，即可计算出发酵液中的普鲁兰多糖产量，
具体计算方法为：
多糖产量%（w/w）=普鲁兰多糖沉淀干重/离心的上清液重量*稀释倍数%。
根据以上步骤测得普鲁兰多糖沉淀的干重为0.623g，离心的上清液重量为15g、T550nm为75%，稀释倍数为2，计算得普鲁兰多糖产量为4.15%。
对比例1
取实施例1中发酵液采用传统直接离心法测定普鲁兰多糖产量的步骤为：
1.离心
发酵液固液分离，取40mL发酵液8000rpm离心10min，收集离心后的上清液；
2.醇沉
取15g离心后的上清液用2倍体积的95%乙醇提取普鲁兰多糖，充分振荡混匀后产生白色沉淀，8000rpm离心10min收集该沉淀，其余清液弃去；
3.干燥
将收集的普鲁兰多糖沉淀于80℃干燥至恒重，即可计算出发酵液中的普鲁兰多糖产量。
计算方法为多糖产量%（w/w）=普鲁兰多糖沉淀干重/离心的上清液重量%。
根据以上步骤测得普鲁兰多糖沉淀的干重为0.780g，离心的上清液重量为15g、T550nm为15%，计算得普鲁兰多糖产量为5.2%。
按照上述实施例2的步骤1进行絮凝，再向絮凝后的液体中加入40g/L硅藻土，选用400目滤布作为滤板支撑，通过板框过滤器粗滤，得到的粗滤液再通过硅藻土铺板形成厚度大于4mm的滤饼层进行精滤，最后将精滤液用2倍体积的95%乙醇提取普鲁兰多糖，再将得到的白色沉淀撕成碎片用95%乙醇反复洗涤3-4遍，将得到的白色沉淀80℃烘干至恒重，通过上述方法得到的精制普鲁兰多糖符合普鲁兰多糖的国标，以此作为参考标准，该提纯后的普鲁兰多糖滤液T550nm可达到90%左右，此时测得该滤液中实际的普鲁兰多糖含量为3.6%。
与对比例1相比，实施例2得到的普鲁兰多糖清液更加澄清，杂质更少，透光率T550nm提高了60%；实施例2普鲁兰多糖产量测定的误差率为15%，对比例1普鲁兰多糖产量测定的误差率为44%，因此使用本发明的普鲁兰多糖产量测定方法可将误差率降低70%。
通过絮凝离心法，只需要将配好的絮凝剂溶液与发酵液混合，充分絮凝后再通过离心将杂质固液分离，最后用乙醇提取普鲁兰多糖即可测定出其产量。
相较于传统的直接离心法，其上清液550nm波长下的透光率提升60%，如此可以大幅提高测定的多糖产量的准确性。该发明实现了用简单的方法，简单的设备，较低的技术门槛，得到准确度高的产量值，即简化工序，节约设备成本，降低测定门槛。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (5)
1.一种测定普鲁兰多糖含量的方法，其特征在于，通过絮凝将发酵液中的菌体、胶体杂质凝聚成絮凝块，再通过离心将杂质固液分离，醇沉提取上清中的普鲁兰多糖，最后干燥得到普鲁兰多糖干品，称重计算发酵液中普鲁兰多糖含量。
2.根据权利要求1所述的一种测定普鲁兰多糖含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，絮凝
将絮凝剂溶解于水中，按照等体积与发酵液进行混合，产生大块絮凝体，所述絮凝剂与发酵液的质量比为1‰-5%；
步骤2，离心
对絮凝后的料液进行固液分离，收集离心后的上清液；
步骤3，醇沉
取离心后的上清液用不小于其2倍体积的95%乙醇提取普鲁兰多糖，充分振荡混匀后产生白色沉淀，并通过离心的方式收集沉淀；
步骤4，干燥
将收集的白色沉淀干燥至恒重，即可计算出发酵液中的普鲁兰多糖的产量。
3.根据权利要求2所述的一种测定普鲁兰多糖含量的方法，其特征在于，步骤1中所述絮凝剂为三氯化铝、硫酸铝、三氯化铁、硫酸亚铁、硫酸铁、或明矾中一种或多种混合。
4.根据权利要求2所述的一种测定普鲁兰多糖含量的方法，其特征在于，步骤2中固液分离所用的转速为8000rpm，离心10min。
5.根据权利要求2所述的一种测定普鲁兰多糖含量的方法，其特征在于，步骤4中干燥的温度为80℃。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023079115A1 (en) | 2021-11-05 | 2023-05-11 | Xampla Limited | Plant protein-polysaccharide films |
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