CN114032275A - 一种鹿茸多肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多肽制备技术领域，具体涉及一种鹿茸多肽及其制备方法，所述鹿茸多肽的制备方法，包括如下步骤：(1)将鹿茸粉碎后加入匀浆液中匀浆，过滤，得到滤渣A和滤液A；(2)将滤渣A在水中进行酶解，过滤，得到滤液B；(3)将滤液A和滤液B合并，进行醇沉，得到上清液C；(4)将上清液C进行超滤，得到滤液C，干燥后即得。本发明具有抗疲劳、抗氧化和增强免疫效果显著、制备工艺简单的优点。

Description

一种鹿茸多肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及多肽制备技术领域，具体涉及一种鹿茸多肽及其制备方法。
背景技术
鹿茸为鹿科动物梅花鹿Cervus nippon Temminck或马鹿Cervus elaphusLinnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。前者习称为“花鹿茸”，后者习称“马鹿茸”。《神农本草经》中记载“鹿茸味甘温，无毒，主漏下恶血，寒热惊痫，益气强志，生齿不老”。《本草纲目》记载曰：“鹿茸，生精补髓，养血益阳，强筋健骨，治一切虚损、耳聋、目暗、眩晕、虚痢”。
鹿茸的化学成分较复杂，含有包括19种以上氨基酸(包括人体不能合成的必需氨基酸)，9种脂肪酸，10种磷脂及蛋白质、激素物质、生物胺、多肽类硫酸软骨素、前列腺素、核酸、维生素等有机成分，还包括大量的无机元素，其中有5种人体必需的常量元素和11种人体必需的微量元素。目前，许多报道证明了鹿茸具有抗炎、抗损伤、抗老化、抗氧化、缓解体力疲劳、抗肿瘤、保护心血管、增强免疫力、提高性功能等作用。
中医认为“疲劳”属于中医学“虚”、“虚劳”、“虚损”等范畴，在《黄帝内经》中，疲劳多称为“倦”、“解堕”、“困薄”、“身重”、“体重”等。《素问·示从容论篇》中指出“肝虚、肾虚、脾虚，皆令人体重烦冤”，根据中医藏象学说，疲劳与五脏都有联系，主要责之于脾、肝、肾，也与心、肺有关。疲劳的本质是脏腑功能下降或失调以及精血不足，由于大负荷量运动能损耗机体精气血津液和能量物质，累及脏腑，导致运动能力下降。
现代医学认为疲劳是一种生理性现象，对人来说是一种保护性的机制。这是身体向我们发出应该休息的信号。如果对它不管不顾，身体就会受到损害，最后积劳成疾。疲劳根据其发生的方式可分急性疲劳和慢性疲劳。急性疲劳主要是频繁而强烈的肌肉活动所引起的，而慢性疲劳主要是长时间而反复的活动所引起的。
疲劳的症状可分一般症状和局部症状。当进行全身性剧烈肌肉运动时，除肌肉的疲劳以外，也出现呼吸肌的疲劳，心率增加，自觉心悸和呼吸困难。由于各种活动均是在中枢神经控制下进行的，因此，当工作能力因疲劳而降低时，中枢神经活动就要加强活动而补偿，逐渐又陷入中枢神经系统的疲劳。
由于疲劳的存在，会导致影响日常生活、工作和学习的机体障碍，同时可产生一系列的临床症状：体力和精力或心理负荷过重所导致的精神困倦、体力不支、心中烦躁、肌肉酸痛、腰背疼痛、胸部不适、头昏脑胀、头痛失眠、烦躁易怒、抑郁焦虑，思想难集中、健忘等。
中国专利申请CN1631900A公开了一种鹿茸多肽的制备方法，取鹿茸剁成小块，用冷水冲洗至无血色，粉碎，胶体磨匀浆，不断添加匀浆液，超声处理，离心取上清，加入乙醇，放置并搅拌，后离心，取上清，旋转蒸发，冻干得到鹿茸多肽。该发明还公开了上述制备方法所得的鹿茸多肽作为活性成分以及含有一种或多种药学上可接受的载体的药物，如复合鹿茸多肽口腔喷剂。经生化方法提取的鹿茸多肽，保持了其原有的活性，与GHRP配合，并制成口腔喷剂，经过口腔粘膜直接进入人体内从而发挥抗疲劳和增强免疫作用，突破了原来鹿茸利用方法对鹿茸多肽的忽视和浪费，提高了鹿茸的利用效率；为解决中老年人GH分泌不足的问题，提供了技术和产品。但是该发明制备得到的抗氧化效果较差，多肽抗疲劳和增强免疫效果也有待进一步提高。
中国专利申请CN105031606A公开了一种鹿茸多肽混合物及其制备方法与应用。所述鹿茸多肽混合物的制备方法包括如下步骤：1)将鹿茸蛋白先后使用胃蛋白酶和胰酶进行水解，灭酶后得到鹿茸蛋白水解物；2)从鹿茸蛋白水解物中分离分子量小于3kDa的多肽组分；3)经分离纯化得到鹿茸多肽混合物。所述鹿茸多肽混合物的主要组分为Ala-His-Gly，Ala-His-Trp-Lys，Val-His，Leu-Ala-Gln，Ile-Ala，Ala-Tyr，Ala-Leu和Thr-Leu。本发明提供的鹿茸多肽混合物具有抗炎活性，可用于炎症的防治，且其具有天然、安全、高效、成本低等特点。但是，抗疲劳和抗氧化效果较差，抗炎效果有待进一步提高。
因此，利用开发一种能解决上述技术问题的鹿茸多肽及其制备方法是非常必要的。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种抗疲劳、抗氧化和增强免疫效果显著、制备工艺简单的鹿茸多肽及其制备方法。
本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种鹿茸多肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)将鹿茸粉碎后加入匀浆液中匀浆，过滤，得到滤渣A和滤液A；
(2)将滤渣A在水中进行酶解，过滤，得到滤液B；
(3)将滤液A和滤液B合并，进行醇沉，得到上清液C；
(4)将上清液C进行超滤，得到滤液C，干燥后即得。
优选地，步骤(1)中所述鹿茸粉碎前先将鹿茸切成小块，用冷水清洗至无血色。
优选地，步骤(1)中所述匀浆液为pH＝3.5的醋酸-醋酸钠缓冲液。
优选地，步骤(1)中匀浆时间为10-20min。
更优选地，步骤(1)包括如下步骤：
将鹿茸切成小块，用冷水清洗至无血色，粉碎后加入pH＝3.5的醋酸-醋酸钠缓冲液中匀浆10-20min，过滤，得到滤渣A和滤液A。
优选地，步骤(2)中所述滤渣A与水的质量比为1:8-10。
优选地，步骤(2)中所述酶包括胃蛋白酶、菠萝酶、中性蛋白酶、木瓜酶和胰蛋白酶中的至少一种。
更优选地，步骤(2)中所述酶解过程中加入的酶包括胃蛋白酶、菠萝酶和由中性蛋白酶、木瓜酶和胰蛋白酶组成的复合酶。
更优选地，所述复合酶中中性蛋白酶、木瓜酶和胰蛋白酶的质量比为1:2-4:1-2。
更优选地，步骤(2)中所述酶解的步骤如下：依次加入胃蛋白酶、菠萝酶、由中性蛋白酶、木瓜酶和胰蛋白酶组成的复合酶。
更优选地，所述胃蛋白酶的添加量按水质量计为1-3％，pH为1.5-2，酶解温度30-40℃。
更优选地，所述菠萝酶的添加量按水质量计为0.5-2％，pH为6-8，酶解温度40-60℃。
更优选地，所述复合酶的添加量按水质量计为1-3％，pH为5.5-8.0，酶解温度40-60℃。
更优选地，步骤(2)中所述胃蛋白酶、菠萝酶和复合酶的酶解时间均为20-40min。
更优选地，步骤(2)包括如下步骤：
将滤渣A在8-10倍量的水中进行酶解，按水的质量计，先加入1-3％的胃蛋白酶，调节pH为1.5-2，在30-40℃下酶解20-40min；再加入0.5-2％的菠萝酶，调节pH为6-8，在40-60℃下酶解20-40min；最后加入1-3％的复合酶(中性蛋白酶、木瓜酶和胰蛋白酶的质量比为1:2-4:1-2)，调节pH为5.5-8，在40-60℃下酶解20-40min，过滤，得到滤液B。
优选地，步骤(3)中所述醇沉的步骤如下：将滤液A和滤液B合并，加入乙醇至含醇量为70-80％，静置2-5h，2500-3500r/min离心，得到上清液C。
优选地，步骤(4)中所述超滤的步骤如下：将上清液C采用1kDa、3kDa、5kDa和10kDa的超滤膜进行超滤，收集分子量在1kDa-3kDa和5kDa-10kDa之间的肽段，合并，得到滤液C，干燥后即得。
更优选地，所述鹿茸多肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)将鹿茸切成小块，用冷水清洗至无血色，粉碎后加入pH＝3.5的醋酸-醋酸钠缓冲液中匀浆10-20min，过滤，得到滤渣A和滤液A；
(2)将滤渣A在8-10倍量的水中进行酶解，按水的质量计，先加入1-3％的胃蛋白酶，调节pH为1.5-2，在30-40℃下酶解20-40min；再加入0.5-2％的菠萝酶，调节pH为6-8，在40-60℃下酶解20-40min；最后加入1-3％的复合酶(中性蛋白酶、木瓜酶和胰蛋白酶的质量比为1:2-4:1-2)，调节pH为5.5-8，在40-60℃下酶解20-40min，过滤，得到滤液B；
(3)将滤液A和滤液B合并，加入乙醇至含醇量为70-80％，静置2-5h，2500-3500r/min离心，得到上清液C；
(4)将上清液C采用1kDa、3kDa、5kDa和10kDa的超滤膜进行超滤，收集分子量在1kDa-3kDa和5kDa-10kDa之间的肽段，合并，得到滤液C，干燥后即得。
本发明还涉及上述的制备方法制备得到的鹿茸多肽。
本发明还涉及一种组合物，包括上述的鹿茸多肽。
优选地，所述组合物，包括如下组分：鹿茸多肽、人参、枸杞子、麦冬和肉桂。
更优选地，所述组合物按照重量份数计，包括如下组分：人参10-20份、鹿茸多肽3-8份、枸杞子50-70份、麦冬20-40份和肉桂5-15份。
更优选地，所述组合物的制备工艺包括如下步骤：将人参、枸杞子、麦冬和肉桂混合后，加入2-4倍量的45-55％乙醇提取1-2次，提取温度30-40℃，提取时间1-2h，过滤，将滤液浓缩、干燥后，与鹿茸多肽混合，即得。
本发明的有益效果是：
本发明优化了原料鹿茸的处理顺序，先进行匀浆，再进行酶解，有利于多肽的提取，并且提取后的杂质较少，缓解疲劳、抗氧化和增强免疫的活性较高。
本发明优化了酶解工艺，通过将不同的酶进行复合，并且优化酶解顺序，制备得到的多肽缓解疲劳、抗氧化和增强免疫的活性显著提高。
本发明通过采用超滤膜收集特定分子量范围的肽段，同时具有较高的缓解疲劳、抗氧化和增强免疫活性。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
以下各实施例和对比例中的胃蛋白酶购自济南卓岱生物科技有限公司，货号0022；菠萝酶、中性蛋白酶、木瓜酶和碱性蛋白酶购自南宁东恒华道生物科技有限责任公司，胰蛋白酶购自南宁东恒华道生物科技有限责任公司的胰酶。
实施例1
一种人参多肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)将鹿茸切成小块，用冷水清洗至无血色，粉碎后加入pH＝3.5的醋酸-醋酸钠缓冲液中匀浆10min，过滤，得到滤渣A和滤液A；
(2)将滤渣A在8倍量的水中进行酶解，按水的质量计，先加入1％的胃蛋白酶，调节pH为1.5，在30℃下酶解40min；再加入0.5％的菠萝酶，调节pH为6，在40℃下酶解40min；最后加入1％的复合酶(中性蛋白酶、木瓜酶和胰蛋白酶的质量比为1:2:1)，调节pH为5.5，在40℃下酶解40min，过滤，得到滤液B；
(3)将滤液A和滤液B合并，加入乙醇至含醇量为70％，静置2h，2500r/min离心，得到上清液C；
(4)将上清液C采用1kDa、3kDa、5kDa和10kDa的超滤膜进行超滤，收集分子量在1kDa-3kDa和5kDa-10kDa之间的肽段，合并，得到滤液C，干燥后即得。
实施例2
一种人参多肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)将鹿茸切成小块，用冷水清洗至无血色，粉碎后加入pH＝3.5的醋酸-醋酸钠缓冲液中匀浆20min，过滤，得到滤渣A和滤液A；
(2)将滤渣A在10倍量的水中进行酶解，按水的质量计，先加入3％的胃蛋白酶，调节pH为2，在40℃下酶解20min；再加入2％的菠萝酶，调节pH为8，在60℃下酶解20min；最后加入3％的复合酶(中性蛋白酶、木瓜酶和胰蛋白酶的质量比为1:4:2)，调节pH为8，在60℃下酶解20min，过滤，得到滤液B；
(3)将滤液A和滤液B合并，加入乙醇至含醇量为80％，静置5h，3500r/min离心，得到上清液C；
(4)将上清液C采用1kDa、3kDa、5kDa和10kDa的超滤膜进行超滤，收集分子量在1kDa-3kDa和5kDa-10kDa之间的肽段，合并，得到滤液C，干燥后即得。
实施例3
一种人参多肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)将鹿茸切成小块，用冷水清洗至无血色，粉碎后加入pH＝3.5的醋酸-醋酸钠缓冲液中匀浆15min，过滤，得到滤渣A和滤液A；
(2)将滤渣A在9倍量的水中进行酶解，按水的质量计，先加入2％的胃蛋白酶，调节pH为2，在35℃下酶解30min；再加入1％的菠萝酶，调节pH为7，在50℃下酶解30min；最后加入2％的复合酶(中性蛋白酶、木瓜酶和胰蛋白酶的质量比为1:3:2)，调节pH为6.5，在50℃下酶解30min，过滤，得到滤液B；
(3)将滤液A和滤液B合并，加入乙醇至含醇量为75％，静置3h，3000r/min离心，得到上清液C；
(4)将上清液C采用1kDa、3kDa、5kDa和10kDa的超滤膜进行超滤，收集分子量在1kDa-3kDa和5kDa-10kDa之间的肽段，合并，得到滤液C，干燥后即得。
实施例4
与实施例3的区别仅在于将步骤(2)中的复合酶替换为等质量的中性蛋白酶和木瓜酶的混合酶，两者质量比为1:3，其余条件均相同。
实施例5
与实施例3的区别仅在于将步骤(2)中的复合酶替换为等质量的胰蛋白酶，其余条件均相同。
对比例1
与实施例3的区别仅在于将步骤(2)复合酶中的木瓜酶替换为等质量的碱性蛋白酶，其余条件均相同。
对比例2
与实施例3的区别仅在于步骤(2)的酶解顺序不同，其余条件均相同，具体如下：
将滤渣A在9倍量的水中进行酶解，按水的质量计，先加入2％的胃蛋白酶，调节pH为2，在35℃下酶解30min；再加入2％的复合酶(中性蛋白酶、木瓜酶和胰蛋白酶的质量比为1:3:2)，调节pH为6.5，在50℃下酶解30min；最后加入1％的菠萝酶，调节pH为7，在50℃下酶解30min，过滤，得到滤液B。
对比例3
与实施例3的区别仅在于步骤(4)不同，其余条件均相同，具体如下：
将上清液C采用1kDa和10kDa的超滤膜进行超滤，收集分子量在1kDa-10kDa之间的肽段，合并，得到滤液C，干燥后即得。
应用例1
将实施例3和对比例1的鹿茸多肽应用于下述组合物中：
一种组合物按照重量份数计，包括如下组分：人参10-20份、鹿茸多肽3-8份、枸杞子50-70份、麦冬20-40份和肉桂5-15份。
所述组合物的制备工艺包括如下步骤：将人参、枸杞子、麦冬和肉桂混合后，加入3倍量的50％乙醇提取1次，提取温度35℃，提取时间1.5h，过滤，将滤液浓缩、干燥后，与鹿茸多肽混合，即得。
应用实施例3和对比例1的鹿茸多肽制备得到的组合物，分别为组合物A和组合物B。
急性毒性试验
急性毒性试验结果表明，上述各实施例制备得到的鹿茸多肽和组合物A、组合物B雌、雄性小鼠急性经口MTD大于20000mg/kg·bw，根据急性毒性剂量分级标准，该样品属无毒级。根据卫生部《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中安全性研究表明，适合长期服用。
测试例1
缓解疲劳测试
参考《保健食品检验与评价技术规范(2003版)》中缓解体力疲劳功能检验方法-负重游泳实验。
将实施例1-5、对比例1-3制备得到的鹿茸多肽和组合物A、组合物B用生理盐水配制成浓度为2.5％的溶液，作为受试物。
经口每日一次给予小鼠相应剂量的受试物，小鼠灌胃量为0.1mL/10g·bw。连续灌胃一个月。末次给小鼠受试物30min后，置于游泳箱中游泳，水深约35cm，水温25℃±1℃，鼠尾根部负荷5％体重的铅丝。记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，作为小鼠负重游泳时间。
结果如表1所示。
表1
动物数(只) 小鼠负重游泳时间(S)
空白对照组 10 461±132<sup>a</sup>
实施例1 10 549±147<sup>b</sup>
实施例2 10 558±96<sup>b</sup>
实施例3 10 572±126<sup>b</sup>
实施例4 10 507±141<sup>c</sup>
实施例5 10 498±113<sup>c</sup>
对比例1 10 489±152<sup>c</sup>
对比例2 10 475±138<sup>c</sup>
对比例3 10 531±107<sup>c</sup>
组合物A 10 613±138<sup>d</sup>
组合物B 10 556±144<sup>b</sup>
上述各字母不同，表示各组之间具有显著性差异，P<0.05。
测试例2
抗氧化测试
DPPH自由基清除率测试：
将实施例1-5和对比例1-3的鹿茸多肽分别配制成6mg/mL的样品溶液，用无水乙醇配制0.04mg/mL的DPPH溶液，分别取2mL不同浓度的样品溶液加入2mL DPPH溶液，混合均匀后室温静置1小时，5000r/min速度下离心15分钟得到上清液，将上清液在517nm处测定吸光值，按照下式计算出各样品溶液对DPPH自由基清除率：
DPPH自由基清除率＝(A0-A1+A2)/A0×100％。
A0为2mL无水乙醇+2mL DPPH溶液的吸光值；A1为2mL样品溶液+2mLDPPH溶液的吸光值；A2为2mL无水乙醇+样品溶液的吸光值。结果如表2所示。
表2
Figure BDA0003390569160000081
测试例3增强免疫测试
参考《保健食品检验与评价技术规范(2003版)》中二硝基氟苯诱导小鼠DTH(耳肿胀法)。
SPF级KM雌性小鼠，体重18-22g。将实施例1-5、对比例1-3制备得到的鹿茸多肽用生理盐水配制成浓度为2.5％的溶液，作为受试物。并采用生理盐水作为空白对照组。
经口每日一次给予小鼠相应剂量的受试物，小鼠灌胃量为0.1mL/10g·bw。连续灌胃一个月后，小鼠腹部去毛，用1％DNFB丙酮麻油溶液50μL涂抹致敏，致敏后5d，小鼠右耳均匀涂抹1％DNFB丙酮麻油溶液10μL进行攻击，左耳涂抹等量丙酮麻油溶液作对照，攻击后24h处死小鼠，剪下左右耳壳，于同一部位取直径8mm的耳片称重，左右耳片重量之差作为肿胀度。结果如表3所示。
表3
动物数(只) 肿胀度(mg)
空白对照组 10 2.76±0.94<sup>a</sup>
实施例1 10 5.18±1.47<sup>b</sup>
实施例2 10 5.20±2.05<sup>b</sup>
实施例3 10 5.21±1.16<sup>b</sup>
实施例4 10 4.79±2.38<sup>c</sup>
实施例5 10 4.63±1.92<sup>c</sup>
对比例1 10 4.54±3.04<sup>c</sup>
对比例2 10 4.61±1.45<sup>c</sup>
对比例3 10 4.92±2.81
上述各字母不同，表示各组之间具有显著性差异，P<0.05。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种鹿茸多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将鹿茸粉碎后加入匀浆液中匀浆，过滤，得到滤渣A和滤液A；
(2)将滤渣A在水中进行酶解，过滤，得到滤液B；
(3)将滤液A和滤液B合并，进行醇沉，得到上清液C；
(4)将上清液C进行超滤，得到滤液C，干燥后即得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述匀浆液为pH＝3.5的醋酸-醋酸钠缓冲液，匀浆时间为10-20min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述滤渣A与水的质量比为1:8-10；步骤(2)中所述酶解过程中采用的酶包括胃蛋白酶、菠萝酶、中性蛋白酶、木瓜酶和胰蛋白酶中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述酶解过程中加入的酶包括胃蛋白酶、菠萝酶和由中性蛋白酶、木瓜酶和胰蛋白酶组成的复合酶。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述酶解的步骤如下：依次加入胃蛋白酶、菠萝酶、由中性蛋白酶、木瓜酶和胰蛋白酶组成的复合酶。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述复合酶中中性蛋白酶、木瓜酶和胰蛋白酶的质量比为1:2-4:1-2。
7.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述胃蛋白酶的添加量按水质量计为1-3％，pH为1.5-2，酶解温度30-40℃；所述菠萝酶的添加量按水质量计为0.5-2％，pH为6-8，酶解温度40-60℃；所述复合酶的添加量按水质量计为1-3％，pH为5.5-8.0，酶解温度40-60℃。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述超滤的步骤如下：将上清液C采用1kDa、3kDa、5kDa和10kDa的超滤膜进行超滤，收集分子量在1kDa-3kDa和5kDa-10kDa之间的肽段，合并，得到滤液C，干燥后即得。
9.权利要求1-8任一所述的制备方法制备得到的鹿茸多肽。
10.一种组合物，其特征在于，包括权利要求9所述的鹿茸多肽。
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