CN114026127A - 条件活性抗epcam抗体、抗体片段、其免疫缀合物以及其用途 - Google Patents

条件活性抗epcam抗体、抗体片段、其免疫缀合物以及其用途 Download PDF

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Abstract

提供了具有重链可变区和/或轻链可变区且与EpCAM蛋白特异性地结合的分离的多肽，以及含有所述重链可变区和/或所述轻链可变区且与EpCAM蛋白结合的抗体和抗体片段。还提供了包括所述多肽和含有所述多肽的所述抗体和抗体片段的药物组合物和试剂盒。

Description

条件活性抗EPCAM抗体、抗体片段、其免疫缀合物以及其用途
技术领域
本公开涉及抗EpCAM抗体、抗体片段以及此类抗体和抗体片段的免疫缀合物以及抗体、抗体片段和免疫缀合物在诊断方法和治疗方法中的用途。
背景技术
上皮细胞粘附/激活分子(EpCAM，还称为CD326、HEA125、MK-1、EGP-2、EGP34、GA733-2、KSA、TROP-1、KS1/4和ESA)是癌症疗法中的第一且最重要的免疫治疗靶标之一，因为其对大多数不同来源的癌有高水平且频繁的表达(赫林(Herlyn)等人,美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA),76:1438-1442,1979；温特(Went)等人,人体病理学(HumPathol),35:122-128,2004)。此分子是在进化期间高度保守的长度为314个氨基酸(aa)的相对较小的I型跨膜糖蛋白。据报道，所述分子介导非钙依赖性同型细胞到细胞粘附(李维诺夫(Litvinov)等人,细胞生物学杂志(J Cell Biology),125:437-446,1994)。所述分子由26个aa的短细胞内结构域组成，其中存在两个α-辅肌动蛋白结合位点用于与肌动蛋白细胞骨架(巴尔萨尔(Balzar)等人,分子与细胞生物学(Mol Cell Biol),18(8):4833-4843,1998)、23-aa跨膜结构域、242-aa细胞外结构域(ECD)和从其成熟形式裂解的23-aa信号肽相互作用。EpCAM的细胞外结构域具有三个N连接的糖基化位点。在某些类型的癌症中，已经报道了正常组织与恶性组织之间的有差别的糖基化状态(泡利(Pauli)等人,癌症快报(Cancer Lett),193:25-32,2003)。
细胞外结构域含有3个结构域。前两个结构域被认为类似于表皮生长因子(EGF)样重复，其中存在十二个半胱氨酸残基(巴尔萨尔等人,分子与细胞生物学,21:2570-2580,2001)。然而，一些研究表明，EpCAM的第二EGF样重复实际上是甲状腺球蛋白(TY)结构域(林南巴赫(Linnenbach)等人,美国国家科学院院刊,86:27-31,1989；庄(Chong)和斯佩泽尔(Speicher),生物化学杂志(J Biol Chem),276:5804-5813,2001)。第三结构域是与任何已知分子都无关的独特的半胱氨酸稀少区(CPR)(博伊尔勒(Baeuerle)和吉莱(Gires),英国癌症杂志(Br J Cancer),96:417-423,2007)。EpCAM在防止细胞到细胞粘附、细胞信号传导、迁移、增殖和分化中起重要作用(图1)。
EpCAM在人体中的表达是上皮特异性的。除了鳞状上皮和如表皮角质细胞、肝细胞、胃壁细胞和肌上皮细胞等一些特异性上皮细胞类型外，大多数人类上皮细胞表达EpCAM(巴尔萨尔等人,分子医学杂志(J Mol Med),77:699-712,1999；蒙堡(Momburg)等人,癌症研究(Cancer Res),47:2883-2891,1987)。在上皮来源的肿瘤中，通常观察到较高的表达水平(巴尔萨尔等人,分子医学杂志,77:699-712,1999；温特等人,美国病理学杂志(Am JPathol),163:2139-2148,2003；温特等人,人体病理学,35:122-128,2004；温特等人,英国癌症杂志,94:128-135,2006)。例如，已经发现EpCAM蛋白在多种人类腺癌和鳞状细胞癌上表达(温特等人,人体病理学,35:122-128,2004)。使用免疫组织化学(IHC)染色连同微阵列技术的最近研究已经在来自乳腺癌、卵巢癌、肾癌、食道癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌和肺癌患者的相当大量的样本中发现了EpCAM表达(斯皮佐(Spizzo)等人,癌症研究和治疗(Cancer Res Treat),86:207-213,2004；斯皮佐等人,妇科肿瘤学(Gynecol Oncol),103:483-488,2006；斯托克莱(Stoecklein)等人,BMC癌症(BMC Cancer),6:165,2006；基穆拉(Kimura)等人,国际肿瘤学杂志(Int J Oncol),30:171-179,2007；温特等人,美国外科病理学杂志(Am J Surg Pathol),29:83-88,2005；温特等人,英国癌症杂志,94:128-135,2006)。数据强调了EpCAM作为用于人类癌症治疗的免疫治疗靶标的潜在效用。
由于已知上皮细胞是人类恶性肿瘤开发中最重要的细胞类型，并且所有恶性肿瘤中90％以上都是上皮来源的(比尔什梅爱尔(Birchmeiera)等人,解刨学报(ActaAnatomica),156(3):217-226,1996)，因此EpCAM现在被认为是最频繁且强烈地表达的肿瘤相关抗原之一。所述分子已经被多次独立地发现为用于单克隆抗体开发的免疫原性肿瘤相关抗原(哥特林格(Gottlinger)等人,国际癌症杂志(Int JCancer),38:47-53,1986；爱德华兹(Edwards)等人,癌症研究,46:1306-1317,1986；斯珀尔(Spurr)等人,国际癌症杂志,38:631-636,1986；蒙堡等人,癌症研究,47:2883-2891,1987；舍恩
Figure BDA0003401749080000021
等人,研究皮肤病学杂志(J Investig Dermatol),102:987-991,1994；鲍莫尔(Bumol)等人,杂交瘤(Hybridoma),7:407-415,1988；夸克(Quak)等人,杂交瘤,9:377-387,1990)。
事实上，曾经应用于人类癌症治疗的第一种单克隆抗体实际上是靶向EpCAM的鼠类IgG2a抗体，称为mAb 17-1A(稍后命名为依决洛单抗(edrecolomab)和派诺雷克斯单抗(Panorexs))(西尔斯(Sears)等人,柳叶刀(Lancet),1(8275):762-765,1982；西尔斯等人,生物反应调节剂杂志(J Biol Response Mod),3(2):138-150,1984)。从那时起，依决洛单抗和其它EpCAM特异性鼠类、嵌合和人源化单克隆抗体还以天然(裸)抗体、杂交双特异性(三功能)抗体或作为与毒素、放射性同位素或细胞因子(IL-2或GM-CSF)的缀合物的形式进行临床前和临床测试，以用于癌症治疗(凡德尔(Velders)等人,癌症研究,54(7):1753-1759,1994；劳姆(Raum)等人,癌症免疫学、免疫疗法(Cancer Immunol Immunother),50(3):141-150,2001；伊莱亚斯(Elias)等人,美国呼吸与危症监护医学杂志(Am JRespirCrit Care Med),150:1114-1122,1994；迪保罗(Di Paolo)等人,临床癌症研究(ClinCancer Res),9:2837-2848,2003；安德拉奇克(Andratschke)等人,抗癌研究(AnticancerRes),27(1A):431-436,2007；湘(Xiang)等人,癌症研究,57(21):4948-4955,1997；尚泽尔(Schanzer)等人,免疫疗法杂志(J Immunother),29(5):477-488,2006；伯格(Wimberger)等人,国际癌症杂志,105(2):241-248,2003；阿曼(Amann)等人,癌症研究,68(1):143-151,2008)。迄今为止，许多不同的靶向EpCAM的免疫治疗方法目前仍在临床试验中(博伊尔勒和吉莱,英国癌症杂志,96:417-423,2007)。来自临床试验的数据已经表明，如依决洛单抗(17-1A；派诺雷克斯单抗)和阿德木单抗(adecatumumab)(MT201)等裸抗EpCAM抗体仅具有有限的抗肿瘤效应(蓬特(Punt)等人,柳叶刀,360:671-677,2002)，这可能是通过激活补体系统(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)效应(施瓦茨贝里(Schwartzberg),肿瘤学血液学重要评论(Crit Rev Oncol Hematol),40(1):17-24,2001；瑙恩多夫(Naundorf)等人,国际癌症杂志,100(1):101-110,2002；普朗(Prang)等人,英国癌症杂志,92(2):342-349,2005；奥伯内德(Oberneder)等人,欧洲癌症杂志(Eur J Cancer),42(15):2530-2538,2006)。与如IL-2、PE毒素或抗CD3等非常强效的效应子机制缀合的抗体似乎具有较好的抗肿瘤效应。然而，一些不良效应限制了对此类抗EpCAM抗体的全身性使用(博伊尔勒和吉莱,英国癌症杂志,96:417-423,2007)。
ING-1是靶向EpCAM阳性细胞的高亲和力人工程化单克隆抗体。ING-1已经在I期临床试验中用于标准疗法难治的晚期腺癌患者，并且来自此研究的数据表明，对EpCAM具有高亲和力但对肿瘤细胞更具细胞毒性的抗体还会诱导快速的胰腺毒性损伤，从而限制其用于全身性施用的治疗窗口(迪保罗等人,临床癌症研究,10(22):7555-65,2004)。与治疗性使用高亲和力抗EpCA抗体相关的可能的全身毒性效应可以通过预靶向策略来降低，所述预靶向策略包含追捕步骤以在给定时间消除循环抗体。可替代地，高亲和力抗EpCAM抗体的使用可以限于局部区域治疗。
已知的抗EpCAM抗体的副作用与正常上皮细胞上EpCAM的存在相关，但是与肿瘤细胞相比密度较低(金姆(Kim)等人,临床癌症研究,10:5464-5471,2004；奥斯塔(Osta)等人,癌症研究,64:5818-5824,2004)。因此，增加抗EpCAM抗体的亲和力或特异性不会导致表达EpCAM的正常组织中抗EpCAM抗体减少，这产生了副作用。
本发明旨在提供适合于治疗和诊断用途，尤其是癌症的诊断和治疗的具有减少的或最小的副作用的抗EpCAM抗体或抗体片段。与正常组织中存在的EpCAM相比，这些抗EpCAM抗体或抗体片段中的一些可以对肿瘤中的EpCAM具有更高的结合亲和力。这些抗EpCAM抗体或抗体片段通常具有至少与已知抗EpCAM抗体相当的功效。另外，与本领域已知的对正常组织中的EpCAM具有相对较低的结合亲和力的单克隆抗EpCAM抗体相比，本发明的抗EpCAM抗体或抗体片段可以展现出减少的副作用。这些优点可以提供对肿瘤的EpCAM的更有选择性的靶向，并且由于肿瘤中存在的EpCAM的抗体的选择性，可以允许使用更高剂量的这些抗EpCAM抗体或抗体片段，由此可以实现更有效的治疗性治疗，而不会对应地增加不期望的副作用。
发明内容
在一方面，本发明提供了一种分离的多肽，所述分离的多肽与EpCAM特异性地结合。所述多肽包括重链可变区，所述重链可变区包含具有序列H1、H2和H3的三个互补决定区(CDR)，其中：
所述H1序列是GYTFTSYWMH(SEQ ID NO:1)；
所述H2序列是X1IRPSTGYTEYNQKFKD(SEQ ID NO:2)；并且
所述H3序列是GDNWVGFAN(SEQ ID NO:3)；
其中X1是Y或D。
在先前的实施例中，所述H2序列可以是YIRPSTGYTEYNQKFKD(SEQ ID NO:22)或所述H2序列可以是DIRPSTGYTEYNQKFKD(SEQ ID NO:23)。
在另一方面，本发明包含一种产物，所述产物由上述分离的多肽中的任何分离的多肽与包括轻链可变区的分离的多肽的组合形成，所述轻链可变区包含具有序列L1、L2和L3的三个CDR，其中：
所述L1序列是SASSSISYMH(SEQ ID NO:4)；
所述L2序列是STSNLX2S(SEQ ID NO:5)；并且
所述L3序列是X3QWSTYX4T(SEQ ID NO:6)，
其中X2是A或H；X3是H或E；并且X4是H或E。
在另一方面，本发明提供了一种分离的多肽，所述分离的多肽包括重链可变区和轻链可变区、与EpCAM，尤其是人EpCAM蛋白特异性地结合，其中所述重链可变区包含具有序列H1、H2和H3的三个互补决定区，其中：
所述H1序列是GYTFTSYWMH(SEQ ID NO:1)；
所述H2序列是X1IRPSTGYTEYNQKFKD(SEQ ID NO:2)；并且
所述H3序列是GDNWVGFAN(SEQ ID NO:3)；其中X1是Y或D；并且
所述轻链可变区包含具有序列L1、L2和L3的三个互补决定区，其中：
所述L1序列是SASSSISYMH(SEQ ID NO:4)；
所述L2序列是STSNLX2S(SEQ ID NO:5)；并且
所述L3序列是X3QWSTYX4T(SEQ ID NO:6)；其中X2是A或H；X3是H或E；并且X4是H或E；并且前提是X1、X2、X3和X4不能同时是Y、A、H和H。
在先前的实施例中，所述H2序列可以是YIRPSTGYTEYNQKFKD(SEQ ID NO:22)或所述H2序列可以是DIRPSTGYTEYNQKFKD(SEQ ID NO:23)。
在先前实施例中的每个实施例中，所述L2序列可以是STSNLAS(SEQ ID NO:24)或所述L2序列可以是STSNLHS(SEQ ID NO:25)。
在先前实施例中的每个实施例中，所述L3序列可以是HQWSTYHT(SEQ ID NO:26)、所述L3序列可以是HQWSTYET(SEQ ID NO:27)或所述L3序列可以是EQWSTYHT(SEQ ID NO:28)。
在先前实施例中的每个实施例中，所述重链可变区可以具有选自SEQ ID NO:7-13的序列。
在前述实施例中的每个实施例中，所述轻链可变区可以具有选自SEQ ID NO:14-21的序列。
在另一个实施例中，本发明的分离的多肽包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和所述轻链可变区具有选自以下的任何一对序列：SEQ ID NO:8和14、SEQ ID NO:9和14、SEQ ID NO:7和15、SEQ ID NO:7和16、SEQ ID NO:7和17、SEQ ID NO:11和20、SEQ IDNO:12和21、SEQ ID NO:11和18、SEQ ID NO:13和18、SEQ ID NO:10和19。
在另一个实施例中，本发明的分离的多肽包括重链可变区和轻链可变区，每个区分别独立地与选自以下的氨基酸序列对具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的一致性：SEQ ID NO:8和14、SEQ ID NO:9和14、SEQ ID NO:7和15、SEQ ID NO:7和16、SEQ IDNO:7和17、SEQ ID NO:11和20、SEQ ID NO:12和21、SEQ ID NO:11和18、SEQ ID NO:13和18以及SEQ ID NO:10和19；并且所述分离的多肽与人EpCAM蛋白特异性地结合。
在另一方面，本发明提供了一种抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含具有序列H1、H2和H3的三个互补决定区，其中：
所述H1序列是GYTFTSYWMH(SEQ ID NO:1)；
所述H2序列是X1IRPSTGYTEYNQKFKD(SEQ ID NO:2)；并且
所述H3序列是GDNWVGFAN(SEQ ID NO:3)；
其中X1是Y或D；并且所述轻链可变区包含具有序列L1、L2和L3的三个互补决定区，其中：
所述L1序列是SASSSISYMH(SEQ ID NO:4)；
所述L2序列是STSNLX2S(SEQ ID NO:5)；并且
所述L3序列是X3QWSTYX4T(SEQ ID NO:6)，
其中X2是A或H；X3是H或E；并且X4是H或E；前提是X1、X2、X3和X4不能同时是Y、A、H和H。
在先前的实施例中，所述H2序列可以是YIRPSTGYTEYNQKFKD(SEQ ID NO:22)或所述H2序列可以是DIRPSTGYTEYNQKFKD(SEQ ID NO:23)。
在先前实施例中的每个实施例中，所述L2序列可以是STSNLAS(SEQ ID NO:24)或所述L2序列可以是STSNLHS(SEQ ID NO:25)。
在先前实施例中的每个实施例中，所述L3序列可以是HQWSTYHT(SEQ ID NO:26)、所述L3序列可以是HQWSTYET(SEQ ID NO:27)或所述L3序列可以是EQWSTYHT(SEQ ID NO:28)。
在先前实施例中的每个实施例中，所述重链可变区可以具有选自SEQ ID NO:7-13的氨基酸序列。
在先前实施例中的每个实施例中，所述轻链可变区可以具有选自SEQ ID NO:14-21的氨基酸序列。
在先前实施例中的每个实施例中，所述重链可变区和所述轻链可变区可以具有选自以下的任何一对序列：SEQ ID NO:8和14、SEQ ID NO:9和14、SEQ ID NO:7和15、SEQ IDNO:7和16、SEQ ID NO:7和17、SEQ ID NO:11和20、SEQ ID NO:12和21、SEQ ID NO:11和18、SEQ ID NO:13和18、SEQ ID NO:10和19。
在另一个实施例中，本发明的抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，每个区分别独立地与选自以下的氨基酸序列对具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的一致性：SEQ ID NO:8和14、SEQ ID NO:9和14、SEQ ID NO:7和15、SEQ ID NO:7和16、SEQID NO:7和17、SEQ ID NO:11和20、SEQ ID NO:12和21、SEQ ID NO:11和18、SEQ ID NO:13和18以及SEQ ID NO:10和19；并且所述抗体或抗体片段与人EpCAM蛋白特异性地结合。
在先前实施例中的每个实施例中，与发生在非肿瘤微环境中的相同条件的不同值相比，所述抗体或抗体片段可以在肿瘤微环境中的条件的值下对EpCAM蛋白具有更高的结合亲和力。在一个实施例中，所述条件是pH。
在先前实施例中的每个实施例中，与发生在非肿瘤微环境中的相同条件的不同值相比，所述抗体或抗体片段可以在肿瘤微环境中的条件的值下对EpCAM蛋白具有更高的抗原结合活性。在一个实施例中，所述条件是pH。
在先前实施例中的每个实施例中，如与亲本抗体或抗体片段在pH 6.0时的相同抗原结合活性相比，条件活性抗体或抗体片段可以在pH 6.0时具有至少70％的抗原结合活性，并且与亲本抗体或抗体片段在pH 7.4时的相同抗原结合活性相比，条件活性抗体或抗体片段可以在pH 7.4时具有小于50％、或小于40％、或小于30％、或小于20％或小于10％的抗原结合活性。所述抗原结合活性可以是与EpCAM蛋白结合或与CD3结合。
在先前实施例中的每个实施例中，抗原结合活性可以通过ELISA测定来测量。
在又一方面，本发明提供了一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含以上所描述的本发明的抗体或抗体片段中的任何抗体或抗体片段。在所述免疫缀合物中，所述抗体或抗体片段可以与选自化学治疗剂、放射性原子、细胞抑制剂和细胞毒性剂的药剂缀合。
在又一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含以上所描述的本发明的多肽、抗体或抗体片段或免疫缀合物中的任何多肽、抗体或抗体片段或免疫缀合物以及药学上可接受的载剂。
单剂量的本发明的所述药物组合物可以包含的所述多肽、所述抗体或抗体片段或所述免疫缀合物的量为约135mg、235mg、335mg、435mg、535mg、635mg、735mg、835mg、935mg、1035mg、1135mg、1235mg或1387mg。
单剂量的本发明的所述药物组合物可以包含的所述多肽、所述抗体或抗体片段或所述免疫缀合物的量的范围为135-235mg、235-335mg、335-435mg、435-535mg、535-635mg、635-735mg、735-835mg、835-935mg、935-1035mg、1035-1135mg、1135-1235mg或1235-1387mg。
前述药物组合物中的每个药物组合物可以进一步包含免疫检查点抑制剂分子。所述免疫检查点抑制剂分子可以是针对免疫检查点的抗体或抗体片段。所述免疫检查点可以选自LAG3、TIM3、TIGIT、VISTA、BTLA、OX40、CD40、4-1BB、CTLA4、PD-1、PD-L1、GITR、B7-H3、B7-H4、KIR、A2aR、CD27、CD70、DR3和ICOS，或所述免疫检查点可以是CTLA4、PD-1或PD-L1。
前述药物组合物中的每个药物组合物可以进一步包含针对选自PD1、PD-L1、CTLA4、AXL、ROR2、CD3、HER2、B7-H3、ROR1、SFRP4和WNT蛋白的抗原的抗体或抗体片段。所述WNT蛋白可以选自WNT1、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11和WNT16。
在又一方面，本发明提供了用于诊断或治疗的试剂盒，所述试剂盒包含以上所描述的本发明的多肽、抗体或抗体片段或免疫缀合物中的任何多肽、抗体或抗体片段或免疫缀合物。
附图说明
图1示出了EpCAM在癌症转移和进展中的功能的示意性表示。
图2示出了本发明的抗EpCAM抗体的示范性重链可变区的序列比对。
图3示出了本发明的抗EpCAM抗体的示范性轻链可变区的序列比对。
图4示出了如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量的本发明的示范性抗EpCAM抗体与人EpCAM在不同的pH值下的结合活性。
图5A-5D示出了如通过荧光激活细胞分选(FACS)测量的本发明的抗EpCAM抗体与表达人EpCAM的Colo205细胞针对抗体的两个不同的量在不同的pH值下的结合活性。
图6A-6D示出了如通过FACS测量的本发明的抗EpCAM抗体与表达人EpCAM的293细胞针对抗体的两个不同的量在不同的pH值下的结合活性。
图7A-7C示出了本发明的MMAE缀合的抗EpCAM抗体用于杀伤EpCAM表达性Colo205细胞的细胞杀伤活性。
图8A-8B示出了用本发明的缀合的抗EpCAM抗体来治疗小鼠的肿瘤异种移植的结果。
图9A-9E示出了如通过ELISA测量的本发明的人源化条件活性抗EpCAM抗体与人EpCAM的结合活性。
图10示出了如通过ELISA测量的人源化条件活性抗EpCAM抗体与人EpCAM在pH滴定下的结合活性。
图11A-11E示出了如通过ELISA测量的人源化条件活性抗EpCAM抗体与cyno EpCAM的结合活性。
图12示出了如通过ELISA测量的人源化条件活性抗EpCAM抗体与cyno EpCAM在pH滴定下的结合活性。
图13A-13B示出了如通过ELISA测量的人源化条件活性抗EpCAM抗体与人EpCAM在不同温度下热处理后在pH 6.0(图13A)和pH 7.4(图13B)时的结合活性。
图14A-14B示出了如通过FACS测量的人源化条件活性抗EpCAM抗体与表达人EpCAM的Colo205细胞的结合活性。
图15A-15B示出了如通过FACS测量的人源化条件活性抗EpCAM抗体与表达人EpCAM的293细胞的结合活性。
图16A-16B示出了如通过FACS测量的人源化条件活性抗EpCAM抗体与表达cynoEpCAM的293细胞的结合活性。
图17A-17B示出了如通过ELISA测量的本发明的缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体与人EpCAM的结合活性。
图18A-18B示出了如通过ELISA测量的本发明的缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体与cyno EpCAM的结合活性。
图19A示出了如通过ELISA用pH滴定测量的缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体与人EpCAM的结合活性。
图19B示出了如通过ELISA用pH滴定测量的缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体与cyno EpCAM的结合活性。
图20A-20B示出了如通过ELISA测量的缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体与人EpCAM在不同温度下热处理后在pH 6.0(图20A)和pH 7.4(图20B)时的结合活性。
图21A-21B示出了如通过FACS测量的缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体与表达人EpCAM的Colo205细胞在pH 6.0(图21A)和pH 7.4(图21B)时的结合活性。
图22A-22B示出了如通过FACS测量的缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体与表达人EpCAM的293细胞在pH 6.0(图22A)和pH 7.4(图22B)时的结合活性。
图23A-23B示出了如通过FACS测量的缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体与表达cyno EpCAM的293细胞在pH 6.0(图23A)和pH 7.4(图23B)时的结合活性。
图24A-24C示出了缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体相对于表达人EpCAM的Colo205细胞在pH 6.0(图24A)、pH 6.5(图24B)和pH 7.4(图24C)时的细胞杀伤活性。
图25A-25C示出了缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体相对于表达人EpCAM的293细胞在pH 6.0(图25A)、pH 6.5(图25B)和pH 7.4(图25C)时的细胞杀伤活性。
图26A-26C示出了缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体相对于不含人EpCAM的293F细胞在pH 6.0(图26A)、pH 6.5(图26B)和pH 7.4(图26C)时的细胞杀伤活性。
图27A-27C示出了使用缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体来治疗肿瘤异种移植小鼠的结果。
图28A-28B示出了缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体在肿瘤微环境pH(图28A)和正常生理pH(图28B)下的结合活性。
图29A-29B示出了在pH 6.0(图29A)和pH 7.4(图29B)下，缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体在抑制表达人EpCAM的Colo205细胞时的细胞毒性。
图29C示出了用缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体来治疗肿瘤异种移植小鼠对肿瘤体积的影响。
图30A-30C示出了如通过ELISA测量的本发明的另外的人源化条件活性抗EpCAM抗体与人EpCAM的结合活性。
图30D-30E示出了本发明的MMAE缀合的抗EpCAM条件活性抗体用于杀伤人EpCAM表达性Colo205细胞的细胞杀伤活性。
图31A-31C示出了如通过ELISA测量的另外的人源化条件活性抗EpCAM抗体与cynoEpCAM的结合活性。
图31D-31E示出了本发明的MMAE缀合的抗EpCAM条件活性抗体用于杀伤表达cynoEpCAM的HEK293细胞的细胞杀伤活性。
图32A示出了通过本发明的双特异性抗体(WT EpCAM×CAB-CD3BA-150-06-BF3)相比于媒剂、非条件活性抗体基准BA-150-06-BF1和同种型对照物治疗肿瘤异种移植小鼠的平均肿瘤体积。
图32B示出了通过本发明的双特异性抗体(WT EpCAM×CAB-CD3BA-150-06-BF3)相比于媒剂、非条件活性抗体基准BA-150-06-BF1和同种型对照物在外周循环系统中的减少的T细胞激活。
图33示出了通过本发明的单条件活性双特异性抗体(WT EpCAM×CAB-CD3 BA-150-15-01-03-BF46)和本发明的双条件活性双特异性抗体(CAB EpCAM×CAB-CD3 BA-150-16-01-02-BF45)相比于媒剂、非条件活性抗体基准BA-150-15-01-03-BF1和同种型对照物治疗肿瘤异种移植小鼠的平均肿瘤体积。
图34示出了针对野生型WT EpCAM×WT CD3 BA-150-06-BF1抗体测试的单条件活性双特异性抗体WT EpCAM×CAB-CD3 BA-150-06-BF3的毒性对白介素-6(IL6)水平的影响和对CD3+水平的影响的测试结果。
图35示出了构建的四个嵌合人/小鼠EpCAM-ECD分子的序列比对，人EpCAM-ECD(顶部)用作参考。仅示出了氨基酸差异。比对中的氨基酸编号与图39所示的PDB条目4mvz中的编号相匹配。
图36示出了如通过ELISA测定的抗-EpCAM克隆BA-105-04-01-05(还称为：BAP-105.4-01-05)与不同的EpCAM ECD的结合数据。
图37示出了人EpCAM的紧密的富含半胱氨酸的N结构域(残基24-62)内BA-105-04-01-05的结合区和抗EpCAM克隆BA-105-04-01-05的七个突变体(M1-M7)的结合区。比对中的氨基酸编号与图39所示的PDB条目4mvz中的编号相匹配。
图38示出了如通过ELISA测定的七个突变体M1-M7与huEpCAM的结合数据。
图39示出了使用如在帕夫希奇
Figure BDA0003401749080000121
等人,自然通讯(Nature Commun)(2014)中的氨基酸编号映射到huEpCAM结构上的表位以及用PyMol可视化的来自tdhe PDB条目4mzv的结构。
定义
为了促进对本文所提供的实例的理解，本文定义了某些频繁出现的术语。
结合测量的量，如本文所使用的术语“约”是指所述测量的量的将会由进行测量并运用与测量目的和所使用的测量设备的精度相称的护理水平的技术人员期望的正常变化。除非另外指示，否则“约”是指所提供值的+/-10％的变化。
如本文所使用的，术语“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指示，否则如本文所使用的，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常见方法来测量，包含本文所描述的那些方法。以下描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性实施例和示范性实施例。
如本文所使用的，术语“亲和力成熟”抗体是指在一或多个重链可变区或轻链可变区具有一或多个变更的抗体，相比之下，亲本抗体不具有此类变更，此类变更导致抗体对抗原的亲和力提高。
如本文所使用的，术语“氨基酸”是指含有氨基(--NH2)和羧基(--COOH)的任何有机化合物；优选地作为游离基团或可替代地在缩合后作为肽键的一部分。“二十种天然编码的多肽形成性α-氨基酸”在本领域中得到理解并且是指：丙氨酸(ala或A)、精氨酸(arg或R)、天冬酰胺(asn或N)、天冬氨酸(asp或D)、半胱氨酸(cys或C)、谷氨酸(glu或E)、谷氨酰胺(gin或Q)、甘氨酸(gly或G)、组氨酸(his或H)、异亮氨酸(ile或I)、亮氨酸(leu或L)、赖氨酸(lys或K)、甲硫氨酸(met或M)、苯丙氨酸(phe或F)、脯氨酸(pro或P)、丝氨酸(ser或S)、苏氨酸(thr或T)、色氨酸(tip或W)、酪氨酸(tyr或Y)以及缬氨酸(val或V)。
如本文所使用的，术语“抗体”是指完整的免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的能够与抗原的表位结合的片段，如Fab片段、Fab′片段、(Fab′)2片段、Fv片段和SCA片段。保留了选择性地与其衍生自的抗体的抗原(例如，多肽抗原)结合的一些能力的这些抗体片段可以使用本领域众所周知的方法制备(参见例如，哈洛(Harlow)和拉内(Lane)，同上)并进一步描述如下。抗体可以用于通过免疫亲和层析来分离制备量的抗原。此类抗体的各种其它用途是诊断疾病(例如，瘤形成)和/或对疾病(例如，瘤形成)进行分期以及用于治疗性应用以用于治疗肿瘤形成、自身免疫性疾病、AIDS、心血管疾病、感染等疾病。嵌合抗体、人样抗体、人源化抗体或完全人抗体特别可用于施用于人类患者。本发明的抗体和抗体片段可以通过使与EpCAM蛋白具有相同类型的活性例如结合活性或亲和力的亲本抗体或抗体片段进化或发生突变来获得。
Fab片段由抗体分子的单价抗原结合片段组成并且可以通过用木瓜蛋白酶消化整个抗体分子以产生由完整的轻链和重链的一部分组成的片段来产生。
抗体分子的Fab′片段可以通过用胃蛋白酶处理整个抗体分子、然后还原以产生由完整的轻链和重链的一部分组成的分子来获得。以此方式处理每个抗体分子获得两个Fab′片段。
抗体的(Fab′)2片段可以通过用胃蛋白酶处理整个抗体分子来获得，而无需随后的还原。(Fab′)2片段是通过两个二硫键保持在一起的具有两个Fab′片段的二聚体。
Fv片段被定义为含有表达为两条链的轻链的可变区和重链的可变区的基因工程化片段。
如本文所使用的，术语“抗体片段”是指除了完整抗体之外的包括完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的部分的分子。抗体片段的实例包含但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所使用的，术语“抗EpCAM抗体”、“EpCAM抗体”和“与EpCAM结合的抗体”是指能够以足够的亲和力结合EpCAM使得抗体可用作靶向EpCAM的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在一个实施例中，抗EpCAM抗体与不相关的非EpCAM蛋白的结合程度小于如例如通过放射免疫测定(RIA)测量的抗体与EpCAM的结合的约10％。在某些实施例中，与EpCAM结合的抗体的解离常数(Kd)≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、或≦0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M到10-13M、例如10-9M到10-13M)。在某些实施例中，抗EpCAM抗体与不同物种的EpCAM中的保守的EpCAM的表位，例如EpCAM的细胞外结构域结合。
如本文所使用的，术语“结合”是指抗体的可变区或Fv与抗原的相互作用，所述相互作用取决于抗原上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在。例如，抗体可变区或Fv识别并与特异性蛋白结构而不是一般的蛋白结合。如本文所使用的，术语“特异性地结合(specifically binding)”或“特异性地结合(binding specifically)”意指相比于与其它蛋白，抗体可变区或Fv更频繁、更快速、以更长的持续时间和/或以更大的亲和力与特定抗原结合或缔合。例如，相比于抗体可变区或Fv与其它抗原的结合，抗体可变区或Fv以更大的亲和力、亲合性、更容易地和/或以更长的持续时间与其抗原特异性地结合。对于另一个实例，相比于抗体可变区或Fv与相关蛋白或其它细胞表面蛋白或与通过多反应性天然抗体(即，通过已知结合人体中天然存在的多种抗原的天然存在的抗体)共同识别的抗原的结合，抗体可变区或Fv以实质上更大的亲和力与细胞表面蛋白(抗原)结合。然而，“特异性地结合”不一定需要另一种抗原的排他性结合或不可检测的结合，这是通过术语“选择性结合”来表示的。在一个实例中，抗体可变区或Fv(或其它结合区)与抗原的“特异性结合”意指抗体可变区或Fv与抗原结合的平衡常数(KD)为l00 nM或更小，如50nM或更小，例如20nM或更小，如15nM或更小或10nM或更小或5nM或更小、2nM或更小或1nM或更小。
如本文所使用的，术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长/增殖为特征的生理病症。癌症的实例包含但不限于癌、淋巴瘤(例如，霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体的实例包含鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌(liver cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、白血病和其它淋巴增生性病症以及各种类型的头颈癌。
如本文所使用的，术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”是指与某种程度的异常细胞增殖相关的病症。在一个实施例中，细胞增殖性病症是癌症。
如本文所使用的，术语“化学治疗剂”是指可用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的实例包含烷化剂，如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclosphosphamide)
Figure BDA0003401749080000151
烷基磺酸盐，如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮杂环丙烷，如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺类和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包含六甲蜜胺、三乙撑密胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲基密胺(trimethylolomelamine)；番蒸枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；Δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚(dronabinol)，
Figure BDA0003401749080000152
)；β-拉帕醌(beta-lapachone)；拉帕醇；秋水仙碱；桦木酸；喜树碱(包含合成的类似物拓扑替康(topotecan)
Figure BDA0003401749080000153
CPT-11(伊立替康(irinotecan)，
Figure BDA0003401749080000154
)、乙酰基喜树碱(acetylcamptothecin)、东莨菪亭(scopolectin)和9-氨基喜树碱(9-aminocamptothecin))；苔藓抑素；凯利他汀(callystatin)；CC-1065(包含其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；足叶草毒素；鬼臼酸；替尼泊苷(teniposide)；念珠藻素(具体地是念珠藻素1和念珠藻素8)；海兔毒素；多卡米星(duocarmycin)(包含合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustard)，如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)、乌拉莫司汀(trofosfamide)；亚硝基脲(nitrosurea)，如卡莫司汀(carmustine)、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，如烯二炔类抗生素(例如，卡奇霉素(calicheamicin)，尤其是卡奇霉素γ1和卡奇霉素ω1(参见例如，尼科拉乌(Nicolaou)等人,应用化学英文国际版(Agnew.Chem.Intl.Ed.Engl.),33:183-186(1994))；口服α-4整合素抑制剂CDP323；达内霉素(dynemicin)，包含达内霉素A；拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团和相关的色素蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素、放线菌素(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycins)、放线菌素D、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包含
Figure BDA0003401749080000161
吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星、盐酸多柔比星脂质体注射剂
Figure BDA0003401749080000162
脂质体多柔比星TLC D-99
Figure BDA0003401749080000163
聚乙二醇化脂质体多柔比星
Figure BDA0003401749080000164
和脱氧多柔比星)、表多柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、马塞罗霉素(marcellomycin)、如丝裂霉素C(mitomycin C)等丝裂霉素、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素类(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，如氨甲蝶呤(methotrexate)、吉西他滨(gemcitabine)
Figure BDA0003401749080000165
喃氟啶(tegafur)
Figure BDA0003401749080000166
卡培他滨(capecitabine)
Figure BDA0003401749080000167
埃坡霉素(epothilone)和5-氟脲嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)、氨甲蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；百垂布西(bestrabucil)；必桑郡(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依落氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；洛尼达宁(lonidainine)；美登木素生物碱，如美坦辛(maytansine)和安丝菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；
Figure BDA0003401749080000172
多糖复合物(俄勒冈州尤金市的JHS天然产物公司(JHS NaturalProducts,Eugene,Oreg.))；雷佐生(razoxane)；根瘤毒素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2′,2′-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素，疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；尿烷；长春地辛(vindesine)
Figure BDA0003401749080000171
达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；盖克托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；噻替派；紫杉烷，例如，紫杉醇
Figure BDA0003401749080000173
白蛋白工程化的紫杉醇纳米颗粒调配物(ABRAXANETM)、以及多西他赛
Figure BDA0003401749080000174
苯丁酸氮芥；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂药剂，如顺铂、奥沙利铂(oxaliplatin)(例如，
Figure BDA0003401749080000175
)和卡铂；长春花(vincas)，其防止微管蛋白聚合形成微管，包含长春碱(vinblastine)
Figure BDA0003401749080000176
硫酸长春碱(vincristine)
Figure BDA0003401749080000178
长春地辛(vindesine)
Figure BDA0003401749080000177
和长春瑞滨(vinorelbine)
Figure BDA0003401749080000179
依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；亚叶酸钙(leucovorin)；诺安托(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨蝶呤；伊班膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸
Figure BDA00034017490800001710
类视黄醇，如视黄酸、包含贝沙罗汀(bexarotene)
Figure BDA00034017490800001713
二膦酸盐类，如氯屈膦酸盐(clodronate)(例如，
Figure BDA00034017490800001711
或
Figure BDA00034017490800001712
)、依替膦酸钠(etidronate)
Figure BDA00034017490800001714
NE-58095、唑来膦酸(zoledronic acid)/唑来膦酸(zoledronate)
Figure BDA00034017490800001716
阿仑膦酸盐(alendronate)
Figure BDA00034017490800001715
帕米膦酸盐(pamidronate)
Figure BDA00034017490800001717
替鲁膦酸盐(tiludronate)
Figure BDA00034017490800001718
或利塞膦酸盐(risedronate)
Figure BDA00034017490800001719
曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制异常细胞增殖所涉及的信号传导通路中的基因表达的那些，例如，PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，如
Figure BDA0003401749080000181
疫苗和基因疗法疫苗，例如，
Figure BDA0003401749080000184
疫苗、
Figure BDA0003401749080000186
疫苗和
Figure BDA0003401749080000182
疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如，
Figure BDA0003401749080000185
)；rmRH(例如，
Figure BDA0003401749080000183
)；BAY439006(索拉菲尼(sorafenib)，拜耳公司(Bayer))；SU-11248(舒尼替尼(sunitinib)，
Figure BDA0003401749080000187
辉瑞公司(Pfizer))；哌立福辛(perifosine)、COX-2抑制劑(例如，塞来昔布(celecoxib)或依托昔布(etoricoxib))、蛋白体抑制剂(例如，PS341)；硼替佐米(bortezomib)
Figure BDA0003401749080000189
CCI-779；替吡法尼(tipifarnib)(R11577)；索拉非尼(orafenib)、ABT510；Bcl-2抑制剂，如闭塞剂钠(oblimersen sodium)
Figure BDA0003401749080000188
匹克生琼(pixantrone)；EGFR抑制剂(参见以下定义)；酪氨酸激酶抑制剂(参见以下定义)；丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，如雷帕霉素(rapamycin)(西罗莫司(sirolimus)，
Figure BDA00034017490800001811
)；法尼基转移酶抑制剂，如洛那法尼(lonafarnib)(SCH 6636，SARASARTM)；以及以上中的任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及以上中的两种或两种以上的组合，如CHOP，环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙的联合疗法的缩写；以及FOLFOX，结合5-FU和亚叶酸钙的奥沙利铂(ELOXATINTM)治疗方案的缩写。
如本文所定义的，化学治疗剂包含“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”，所述抗激素剂或内分泌治疗剂用于调节、减少、阻断或抑制可以促进癌症生长的激素的作用。它们可以是激素本身，包含但不限于：具有混合激动剂/拮抗剂特征的抗雌激素，包含他莫昔芬(tamoxifen)
Figure BDA00034017490800001814
4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene)
Figure BDA00034017490800001815
艾多昔芬(idoxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、雷洛昔芬(raloxifene)
Figure BDA00034017490800001810
曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛西芬(keoxifene)和如SERM3等选择性雌激素受体调节剂(SERM)；不具有激动剂性质的纯抗雌激素，如氟维司群(fulvestrant)
Figure BDA00034017490800001812
和EM800(此类药剂可以阻断雌激素受体(ER)二聚化、抑制DNA结合、增加ER转换和/或抑制ER水平)；芳香化酶抑制剂，包含甾体芳香化酶抑制剂如福美司坦(formestane)和依西美坦(exemestane)
Figure BDA00034017490800001816
和非甾体芳香化酶抑制剂如阿那曲唑(anastrazole)
Figure BDA00034017490800001817
来曲唑片(letrozole)
Figure BDA00034017490800001813
和氨鲁米特(aminoglutethimide)，以及其它芳香化酶抑制剂，包含伏氯唑(vorozole)
Figure BDA00034017490800001818
醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)
Figure BDA00034017490800001819
法倔唑(fadrozole)和4(5)-咪唑；促黄体激素释放激素激动剂，包含亮丙瑞林(leuprolide)(
Figure BDA0003401749080000191
和
Figure BDA0003401749080000192
)、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)和雷公藤红素(tripterelin)；性类固醇，包含孕激素如醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)和醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate)，雌激素如己烯雌酚(diethylstilbestrol)和倍美力(premarin)，以及雄激素/类视黄醇如氟甲睾酮(fluoxymesterone)、全反式维甲酸(all transretionic acid)和芬维A胺(fenretinide)；奥那司酮(onapristone)；抗孕酮(anti-progesterone)；雌激素受体下调因子(ERD)；抗雄激素类，如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡鲁胺(bicalutamide)；以及以上中的任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及以上中的两种或两种以上的组合。
如本文所使用的，术语“嵌合”抗体是指其中重链和/或轻链的一部分衍生自特定的来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分衍生自不同的来源或物种的抗体。
如本文所使用的，术语“条件活性抗体”是指相比于在非肿瘤微环境中的条件下，在肿瘤微环境中的条件下更有活性的抗EpCAM抗体。与非肿瘤微环境相比，肿瘤微环境中的条件包含更低的pH、更高的乳酸盐和丙酮酸盐浓度、缺氧、更低的葡萄糖浓度和略高的温度。例如，条件活性抗体在正常体温下实际上是无活性的，但在肿瘤微环境中的较高温度下是有活性的。在又一方面，条件活性抗体在含氧正常的血液中活性较低，但在肿瘤中存在的含氧较低的环境下活性较高。在又一方面，条件活性抗体在正常生理pH 7.2-7.8中活性较低，但在肿瘤微环境中存在的酸性pH 5.8-7.0或6.0-6.8中活性较高。有本领域技术人员已知的肿瘤微环境中的其它条件也可以用作本发明中的条件，在所述条件下，抗EpCAM抗体与EpCAM具有不同的结合亲和力。
如本文所使用的，术语“细胞抑制剂”是指在体外或体内阻止细胞生长的化合物或组合物。因此，细胞抑制剂可以是显著降低S期细胞的百分比的细胞抑制剂。细胞抑制剂的另外的实例包含通过诱导G0/G1阻滞或M期阻滞来阻断细胞周期进程的药剂。人源化抗Her2抗体曲妥珠单抗(trastuzumab)
Figure BDA0003401749080000193
是诱导G0/G1阻滞的细胞抑制剂的实例。经典的M期阻断剂包含长春花(长春新碱和长春花碱)、紫杉烷和拓扑异构酶II抑制剂，如多柔比星、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷和博莱霉素。阻滞G1的药剂也会影响到S期阻滞，例如，DNA烷化剂，如他莫昔芬、强的松(prednisone)、达卡巴嗪、氮芥、顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和ara-C。另外的信息可以在门德尔松(Mendelsohn)和伊斯雷尔(Israel)编,癌症分子基础(The Molecular Basis of Cancer),第1章,标题为“细胞周期调节、致癌基因和抗肿瘤药物(Cell cycle regulation,oncogenes,and antineoplastic drugs)”,穆拉卡米(Murakami)等人(W.B.桑德斯出版社(W.B.Saunders),费城,1995)，例如第13页中找到。紫杉烷(紫杉醇和多西他赛)是均衍生自紫杉的抗癌药物。衍生自欧洲紫杉的多西他赛(
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罗纳普朗克制药公司(Rhone-Poulenc Rorer))是紫杉醇的半合成类似物(
Figure BDA0003401749080000202
百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb))。紫杉醇和多西他赛促进微管蛋白二聚体的微管组装并通过防止解聚来稳定微管，这导致抑制了细胞的有丝分裂。
如本文所使用的，术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或造成细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包含但不限于放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤、亚德里亚霉素(adriamicin)、长春花生物碱(长春新碱、长春花碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶和其片段，如溶核酶；抗生素；毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包含其片段和/或变体；以及以下所公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。
如本文所使用的，术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包括与同一条多肽链(VH-VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短以至于不允许在同一条链上的两个结构域之间配对的连接体，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合位点。
如本文所使用的，术语“可检测地标记”是指其通过物理或化学手段直接或间接的检测或测量指示样品中存在抗原的任何物质。有用的可检测标记的代表性实例包含但不限于以下：基于吸光率、荧光、反射率、光散射、磷光或发光性质直接或间接可检测的分子或离子；通过其放射性性质可检测的分子或离子；通过其核磁共振或顺磁性质可检测的分子或离子。基于吸光率或荧光间接可检测的分子组中包含例如各种酶，所述各种酶使适当的底物例如从非吸光分子转化为吸光分子或从非荧光分子转化为荧光分子。
如本文所使用的，术语“诊断学”是指对受试者对疾病或病症的易感性的确定、关于受试者目前是否受到疾病或病症的影响的确定、对受疾病或病症影响的受试者的预后(例如，鉴别转移前或转移性癌性状态、癌症阶段或癌症对疗法的反应)以及治疗度量(therametrics)(例如，监测受试者的病症以提供关于疗法效果或功效的信息)。在一些实施例中，本发明的诊断方法在检测早期癌症时特别有用。
如本文所使用的，术语“诊断剂”是指可以直接或间接检测到并用于诊断目的的分子。诊断剂可以施用于受试者或样品。可以提供诊断剂本身，或诊断剂可以与如条件活性抗体等媒剂缀合。
如本文所使用的，术语“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区的随着抗体同种型而变化的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包含：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；以及B细胞激活。
如本文所使用的，术语药剂例如药物调配物的“有效量”是指以剂量计并且在所需的时间段内有效实现所期望的治疗或预防结果的量。
如本文所使用的，术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的含有恒定区的至少一部分的C末端区。所述术语包含天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施例中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸到重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以或可以不存在。除非本文另有说明，否则Fc区或恒定区的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，还称为EU指数，如以下所描述的：卡巴特(Kabat)等人,具有免疫学意义的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)第5版,公共卫生署(PublicHealth Service),国立卫生研究院(National Institutes of Health),贝塞斯达(Bethesda),马里兰州,1991。
如本文所使用的，术语“框架”或“FR”是指除互补决定区(重链中的CDR或H1-3和轻链中的L1-3)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，CDR和FR序列通常以下列序列出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“整个抗体”是指包括抗原结合可变区(VH或VL)以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。根据全长抗体的重链的恒定结构域的氨基酸序列，可以将全长抗体分配到不同类别。主要有五类全长抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的若干类别可以被进一步划分为“亚类”(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类别的抗体的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚单元结构和三维构型是众所周知的。
如本文所使用的，术语“功能保守变体”是指蛋白质或酶中的给定氨基酸残基已经改变而不更改多肽的整体构象和功能，包含但不限于用具有类似性质(例如，极性、氢键合潜力、酸性、碱性、疏水性、芳香族等)的氨基酸置换氨基酸。除了那些被指示为保守的氨基酸之外的氨基酸在蛋白质中可以不同，使得类似功能的任何两种蛋白质之间的蛋白质或氨基酸序列相似度百分比可以变化并且可以是如根据比对方案如通过聚类方法测定的例如70％到99％，其中相似度是基于MEGALIGN算法。“功能保守变体”还包含如通过BLAST或FASTA算法测定的具有至少60％氨基酸一致性，优选地至少75％、更优选地至少85％、仍优选地至少90％并且甚至更优选地至少95％，并且具有与其所比较的天然或亲本蛋白相同或基本上类似的性质或功能的多肽。
如本文所使用的，术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换地使用并且是指其中已经引入外源核酸的细胞，包含此类细胞的子代。宿主细胞包含“转化子”和“转化细胞”，所述转化子和转化细胞包含原代转化细胞和由其衍生的子代，而不考虑传代数量。子代的核酸含量可能与亲本细胞不完全相同，但可以含有突变。本文中包含具有与原始转化的细胞中筛选或选择的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突变子代。
如本文所使用的，术语“人抗体”是具有与由人或人细胞产生的或衍生自利用人抗体库或其它人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的“人抗体”。人抗体的此定义明确排除了包括非人抗原结合残基的人源化抗体。
如本文所使用的，术语“人源化”抗体是指包括来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施例中，人源化抗体将包括至少一个，并且通常两个可变结构域中的基本上所有可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些。人源化抗体可以任选地包括衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体的“人源化形式”，例如非人抗体是指已经经历人源化的抗体。
如本文所使用的，术语“免疫缀合物”是与一或多种异源分子缀合的抗体，所述一或多种异源分子包含但不限于细胞毒性剂。
如本文所使用的，术语“个体”或“受试者”是指哺乳动物。哺乳动物包含但不限于家养动物(例如，牛、羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人和如猴子等非人灵长类动物)、兔子和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施例中，个体或受试者是人。
如本文所使用的，术语“抑制细胞生长或增殖”意指将细胞的生长或增殖减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％并且包含诱导细胞死亡。
如本文所使用的，术语“分离的”抗体是从其天然环境的组分中分离出来的抗体。在一些实施例中，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相高效液相色谱(HPLC))测定的，将抗体纯化到大于95％或99％的纯度。关于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见例如，井兰特曼(Flatman)等人,色谱法杂志B辑(J.Chromatogr.B),第848卷,第79-87页,2007。
如本文所使用的，术语“编码抗EpCAM抗体的分离核酸”是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一或多种核酸分子，包含在单个载体或单独载体中的核酸分子以及存在于宿主细胞中的一或多个位置处的核酸分子。
如本文所使用的，术语“转移”是指支持癌细胞从原发性肿瘤分散、渗透到淋巴管和/或血管中、通过血流循环并在身体其它地方的正常组织中的远处病灶(转移)中生长的所有EpCAM涉及的过程。具体地，转移是指肿瘤细胞的细胞事件，如增殖、迁移、锚定独立性、逃避细胞凋亡或分泌血管生成因子，所述细胞事件构成转移的基础并由EpCAM刺激或介导。
如本文所使用的，术语“微环境”是指组织或身体的与组织的其它区或身体的其它区具有恒定的或暂时的、物理的或化学的差异的任何部分或区。对于肿瘤，如本文所使用的，术语“肿瘤微环境”是指肿瘤存在的环境，所述环境是肿瘤内的非细胞区域和正好在肿瘤组织外部但不属于癌细胞本身的细胞内区室的区域。肿瘤和肿瘤微环境是密切相关的并不断相互作用。肿瘤可以改变其微环境，并且微环境可以影响肿瘤是如何生长和扩散的。通常，肿瘤微环境具有在5.0到7.0的范围内或在5.0到6.8的范围内或在5.8到6.8的范围内或在6.2-6.8的范围内的低pH。另一方面，正常的生理pH在7.2-7.8的范围内。还已知的是，与血浆相比，肿瘤微环境的葡萄糖和其它营养物的浓度更低，但乳酸浓度更高。此外，肿瘤微环境的温度可以比正常生理温度高0.3到1℃。特此通过全文引用的方式并入本文的吉利斯(Gillies)等人,“肿瘤微环境的MRI(MRI of the Tumor Microenvironment)”,磁共振成像杂志(Journal of Magnetic Resonance Imaging),第16卷,第430-450页,2002年中讨论了肿瘤微环境。术语“非肿瘤微环境”是指除肿瘤以外的位点处的微环境。
如本文所使用的，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即包括所述群体的单个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产期间产生的可能的变体抗体，此类变体通常以少量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰语“单克隆”指示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体中获得的，并且不应被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包含但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有人免疫球蛋白基因座的全部或一部分的转基因动物的方法，此类方法和用于制备单克隆抗体的其它示范性方法在本文中进行了描述。
如本文所使用的，术语“裸抗体”是指不与异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物调配物中。
如本文所使用的，术语“包装插页”用于指通常包含在治疗产品的商业包装中的说明书，所述说明书含有关于涉及使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
如本文所使用的，术语相对于参考多肽序列的“氨基酸序列一致性百分比(％)”被定义为在比对序列并引入缺口(如果必要的话)以达到最大序列一致性百分比之后，在与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的候选序列中的氨基酸残基的百分比，而不将任何保守取代视为序列一致性的一部分。可以用本领域技术中的多种方式来实现出于确定氨基酸序列一致性百分比的目的进行的比对，例如使用可公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当的参数，包含在被比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，氨基酸序列一致性％值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成的。ALIGN-2序列比较计算机程序是由基因科技公司(Genentech Inc.)授权的，并且源代码已经在华盛顿特区20559的美国版权办公室(U.S.Copyright Office)以用户文档备案，其中在美国版权注册号TXU510087下注册。ALIGN-2程序可从加利福尼亚州南旧金山的基因科技公司公开获得或可以从源代码编译而来。ALIGN-2程序应该被编译以在包含数字UNIX V4.0D的UNIX操作系统上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设置并且不变化。
在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与(to/with)或相对于给定氨基酸序列B的氨基酸序列一致性％(所述氨基酸序列一致性％可以可替代地表述为给定氨基酸序列A与或相对于给定氨基酸序列B具有或包括一定的氨基酸序列一致性％)计算如下：
100乘以分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在所述程序对A和B的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数量，并且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的氨基酸序列一致性％将不等于B与A的氨基酸序列一致性％。除非另外特别说明，否则本文所使用的所有氨基酸序列一致性％值都是使用ALIGN-2计算机程序如紧接着的前述段落中描述的获得的。
如本文所使用的，术语“药物调配物”是指呈此类形式以允许其中含有的活性成分的生物活性有效并且不含有对调配物将会施用于的受试者有不可接受的毒性的另外的组分的制剂。
如本文所使用的，术语“药学上可接受的载剂”是指药物调配物中对受试者无毒的成分，而不是活性成分。药学上可接受的载剂包含但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
本文所使用的术语“纯化的”和“分离的”是指在基本上不存在相同类型的其它生物大分子的情况下存在所指示的分子的根据本发明的抗体或核苷酸序列。如本文所使用的，术语“纯化的”优选地意指存在至少75重量％、更优选地至少85重量％、仍更优选地至少95重量％并且最优选地至少98重量％的相同类型的生物大分子。编码特定多肽的“分离的”核酸分子是指基本上不含不编码多肽的其它核酸分子的核酸分子；然而，分子可以包含不会有害地影响组合物的基本特性的另外的一些碱基或部分。
如本文所使用的，术语“重组抗体”是指由包括编码抗体的核酸的重组宿主细胞表达的抗体(例如，嵌合、人源化或人抗体或其抗原结合片段)。用于产生重组抗体的“宿主细胞”的实例包含：(1)哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)、COS、骨髓瘤细胞(包含Y0和NS0细胞)、幼仓鼠肾(BHK)、Hela和Vero细胞；(2)昆虫细胞，例如sf9、sf21和Tn5；(3)植物细胞，例如属于烟草属(Nicotiana)的植物(例如，普通烟草(Nicotiana tabacum))；(4)酵母细胞，例如属于酵母属(Saccharomyces)(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))或曲霉属(Aspergillus)(例如，黑曲霉(Aspergillus niger))的那些；(5)细菌细胞，例如大肠杆菌(Escherichia coli)细胞或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞等。
如本文所使用的，术语“单链Fv”(“scFv”)是共价连接的VH::VL异二聚体，所述异二聚体通常是从包含通过肽编码连接体连接的VH和VL编码基因的基因融合表达的。“dsFv”是通过二硫键稳定的VH::VL异二聚体。二价和多价抗体片段可以通过单价scFv的缔合自发地形成，或可以通过如二价sc(Fv)2等肽连接体偶联单价scFv来生成。
术语本发明的抗体的“治疗有效量”意指以适用于任何药物治疗的合理的益处/风险比足够治疗所述癌症的抗体的量。然而，应理解，本发明的抗体和组合物的总日用量将由主治医师在合理的医学判断的范围内决定。任何特定患者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包含所治疗的病症和病症的严重程度；所采用的具体抗体的活性；患者的所采用的具体组合物、年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；所采用的具体抗体的施用时间、施用途径和排泄率；治疗的持续时间；与所采用的具体抗体组合或同时使用的药物；以及医学领域众所周知的类似因素。例如，以低于实现所期望的治疗效果所需的水平开始化合物的给药并逐渐地增加剂量直至所期望的效果得以实现在本领域的技术内是众所周知的。
如本文所使用的，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”或“治疗(treating)”是指试图更改正在治疗的个体的自然进程的临床干预，并且可以被执行以用于预防或在临床病理学进程期间执行。令人期望的治疗效果包含但不限于预防疾病发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理性后果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或缓和疾病状态以及缓解或改进预后。在一些实施例中，本发明的抗体用于延缓疾病的发展或减缓疾病的进展。
如本文所使用的，术语“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，以及所有癌前和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”如本文所引用的并不相互排斥。
如本文所使用的，术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体与抗原结合所涉及的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有类似的结构，其中每个结构域包括四个保守框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。(参见例如，金特(Kindt)等人,Kuby免疫学(Kuby Immunology),第6版,W.H.弗里曼公司(W.H.Freemanand Co.),第91页(2007)。)单个VH或VL结构域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可以使用VH或VL结构域从结合抗原以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库的抗体中分离出来。参见例如，波托拉诺(Portolano)等人,免疫学杂志(J.Immunol.),第150卷,第880-887页,1993；克拉克森(Clarkson)等人,自然(Nature),第352卷,第624-628页,1991。
如本文所使用的，术语“载体”是指能够传播其连接到的另一个核酸的核酸分子。所述术语包含作为自我复制核酸结构的载体以及并入到其已被引入到的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导其可操作地连接到的核酸的表达。此类载体在本文中被称为“表达载体”。
具体实施方式
出于说明的目的，通过参考各种示范性实施例来描述本发明的原理。尽管本文具体描述了本发明的某些实施例，但是本领域普通技术人员应容易认识到，相同的原理同样适用于其它系统和方法并且可以在其它系统和方法中采用。在详细解释本发明的公开的实施例之前，应当理解的是，本发明并不在其申请中限于所示出的任何特定实施例的细节。另外，本文所使用的术语是出于描述的目的而不是用于限制。此外，尽管某些方法是参考本文中以某种顺序呈现的步骤来描述的，但是在许多例子中，这些步骤可以以本领域技术人员认识到的任何顺序来执行；因此，新方法不限于本文所公开的步骤的特定布置。
必须注意，除非上下文另外清楚地规定，否则如本文和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包含复数指代物。此外，术语“一个/种(a)”(或“一个/种(an))”、“一或多个/种”和“至少一个/种”在本文中可以可互换地使用。术语“包括”、“包含”、“具有”和“构造自”也可以可互换地使用。
除非另外指示，否则表达说明书和权利要求书中使用的成分、性质如分子量、百分比、比率、反应条件等的量的所有数字应被理解为在所有情况下均被术语“约”修饰，无论术语“约”是否存在。因此，除非有相反地指示，否则说明书和权利要求书中阐述的数值参数是可以根据寻求通过本公开获得的期望性质来变化的近似值。至少，并且不试图将等同原则的应用限制于权利要求书的范围，每个数值参数至少应按照所报告的有效数字的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。尽管阐述本公开的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但具体实施例中阐述的数值是尽可能精确地报告的。然而，任何数值都固有地含有必然由在其各自的测试测量中发现的标准偏差引起的某些误差。
应当理解的是，本文公开的每个组分、化合物、取代基或参数应被解释为被公开以供单独使用或结合本文所公开的每个和所有其它组分、化合物、取代基或参数中的一或多个使用。
还应当理解的是，本文所公开的每个组分、化合物、取代基或参数的每个量/值或量/值范围应被解释为也结合针对本文所公开的任何其它一或多种组分、一或多种化合物、一或多个取代基或一或多个参数公开的每个量/值或量/值范围公开，并且因此，本文所公开的两个或两个以上一或多个组分、一或多个化合物、一或多个取代基或一或多个参数的量/值或量/值范围的任何组合也出于本说明书的目的结合彼此公开。
应当进一步理解的是，本文所公开的每个范围的每个下限应被解释为结合本文针对相同组分、化合物、取代基或参数所公开的每个范围的每个上限公开。因此，两个范围的公开应被解释为通过将每个范围的每个下限与每个范围的每个上限结合而得到的四个范围的公开。三个范围的公开应被解释为通过将每个范围的每个下限与每个范围的每个上限结合而得到的九个范围的公开等。此外，说明书或实例中公开的组分、化合物、取代基或参数的具体量/值应被解释为范围的下限或上限的公开，并且因此可以与本申请的其它地方所公开的相同组分、化合物、取代基或参数的范围的任何其它下限或上限或具体量/值结合，以形成所述组分、化合物、取代基或参数的范围。
A.抗EpCAM多肽和抗体
在一方面，本发明提供了一种分离的多肽，所述分离的多肽包括重链可变区、与EpCAM，尤其是人EpCAM蛋白特异性地结合。重链可变区包含具有序列H1、H2和H3的三个互补决定区，其中：
所述H1序列是GYTFTSYWMH(SEQ ID NO:1)；
所述H2序列是X1IRPSTGYTEYNQKFKD(SEQ ID NO:2)；并且
所述H3序列是GDNWVGFAN(SEQ ID NO:3)；
其中X1是Y或D。
H2序列可以选自YIRPSTYTEYNQKKD(SEQ ID NO:22)和DIRSTYTEYNQKKD(SEQ IDNO:23)。
本发明的示范性重链可变区的比对示出在图2中，其中互补性决定区H1、H2和H3封闭在方框中。
在另一方面，本发明提供了一种分离的多肽，所述分离的多肽包括轻链可变区、与人EpCAM特异性地结合。所述轻链可变区包含具有序列L1、L2和L3的三个互补决定区，其中：
所述L1序列是SASSSISYMH(SEQ ID NO:4)；
所述L2序列是STSNLX2S(SEQ ID NO:5)；并且
所述L3序列是X3QWSTYX4T(SEQ ID NO:6)，
其中X2是A或H；X3是H或E；并且X4是H或E。
L2序列可以选自STSNLAS(SEQ ID NO:24)和STSNLHS(SEQ ID NO:25)。L3序列可以选自HQWSTYHT(SEQ ID NO:26)、HQWSTYET(SEQ ID NO:27)和EQWSTYHT(SEQ ID NO:28)。
本发明的示范性轻链可变区的比对示出在图3中，其中互补性决定区L1、L2和L3封闭在方框中。
本发明的重链可变区和轻链可变区各自使用美国专利第8,709,755号中公开的方法从亲本抗体获得。生成重链可变区和轻链可变区的此方法，以及美国专利第8,709,755号中公开的生成抗体和抗体片段的方法特此通过引用的方式并入本文。
在另一方面，本发明包含图2所示的重链可变区和图3所示的轻链可变区。图2的7个重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:7-13中阐述。图3的8个轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:14-21中阐述。
在更多具体的方面，本发明提供了一种抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含具有序列H1、H2和H3的三个互补决定区，其中：
所述H1序列是GYTFTSYWMH(SEQ ID NO:1)；
所述H2序列是X1IRPSTGYTEYNQKFKD(SEQ ID NO:2)；并且
所述H3序列是GDNWVGFAN(SEQ ID NO:3)；
其中X1是Y或D；并且所述轻链可变区包含具有序列L1、L2和L3的三个互补决定区，其中：
所述L1序列是SASSSISYMH(SEQ ID NO:4)；
所述L2序列是STSNLX2S(SEQ ID NO:5)；并且
所述L3序列是X3QWSTYX4T(SEQ ID NO:6)，
其中X2是A或H；X3是H或E；并且X4是H或E，并且前提是X1、X2、X3和X4不能同时是Y、A、H和H。
在一个实施例中，抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和所述轻链可变区具有选自以下的任何一对序列：SEQ ID NO:8和14、SEQ ID NO:9和14、SEQ ID NO:7和15、SEQ ID NO:7和16、SEQ ID NO:7和17、SEQ ID NO:11和20、SEQ ID NO:12和21、SEQ ID NO:11和18、SEQ ID NO:13和18以及SEQ ID NO:10和19。
在另一个实施例中，本发明的抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，每个区分别独立地与选自以下的氨基酸序列对具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的一致性：SEQ ID NO:8和14、SEQ ID NO:9和14、SEQ ID NO:7和15、SEQ ID NO:7和16、SEQID NO:7和17、SEQ ID NO:11和20、SEQ ID NO:12和21、SEQ ID NO:11和18、SEQ ID NO:13和18以及SEQ ID NO:10和19，并且所述抗体或抗体片段与人EpCAM特异性地结合。
包含这些重链可变区和轻链可变区的抗体和抗体片段可以与EpCAM，尤其是人EpCAM特异性地结合。已经发现，包括这些重链可变区之一和这些轻链可变区之一的组合的抗体或抗体片段在肿瘤微环境中的pH(例如，pH 6.0-6.8)下与EpCAM具有比在非肿瘤微环境中的pH(例如，pH 7.0-7.6)下更高的结合亲和力。因此，相比于其在典型的正常组织微环境中对EpCAM的结合亲和力，抗EpCAM抗体或抗体片段在肿瘤微环境中对EpCAM具有更高的结合亲和力。
因此，相对于非条件活性抗EpCAM抗体，本发明的抗EpCAM抗体或抗体片段预期展现出减少的副作用，因为其在正常组织微环境中对EpCAM的结合亲和力降低。本发明的抗EpCAM抗体或抗体片段也预期具有与本领域已知的单克隆抗EpCAM抗体相当的功效。由于减少的副作用，特征的此组合允许使用更高剂量的这些抗EpCAM抗体或抗体片段，这可以提供更有效的疗法选项。
在先前实施例中的每个实施例中，与发生在非肿瘤微环境中的相同条件的不同值相比，所述抗体或抗体片段可以在肿瘤微环境中的条件的值下对EpCAM蛋白具有更高的抗原结合活性。在一个实施例中，所述条件是pH。
与衍生其的亲本抗体或抗体片段在pH 6.0时的相同抗原结合活性相比，抗EpCAM抗体或抗体片段在pH 6.0时可以具有至少70％的抗原结合活性，并且与衍生其的亲本抗体或抗体片段在pH 7.4时的相同抗原结合活性相比，抗体或抗体片段在pH 7.4时可以具有小于50％或小于40％或小于30％或小于20％或小于10％的抗原结合活性。抗原结合活性可以是例如与EpCAM蛋白结合或与CD3结合。
在先前实施例中的每个实施例中，抗原结合活性可以通过ELISA测定来测量。
本发明包含图2-3中呈现的重链可变区和轻链可变区以及具有SEQ ID NO:7-21的氨基酸序列的多肽。本发明还包含图2-3中呈现的重链可变区和轻链可变区的变体以及具有SEQ ID NO:7-21的氨基酸序列的多肽，所述多肽可以与EpCAM、尤其是人EpCAM特异性地结合。在一些实施例中，这些变体具有不同的H1序列、H2序列、H3序列、L1序列、L2序列或L3序列。在其它实施例中，在互补决定区之外的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列可以根据取代、插入和缺失的原理进行突变，如本申请中所讨论的，以提供这些变体。在又另外的实施例中，可以修饰恒定区以提供这些变体。
在衍生这些变体时，通过如本文所描述的方法来引导。重链可变区和轻链可变区的变体可以通过向编码重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包含例如重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以获得本发明的抗体或抗体片段，条件是其具有期望的特性，例如与人EpCAM的抗原结合和/或条件活性。
取代变体、插入变体和缺失变体
在某些实施例中，提供了具有一或多个氨基酸取代的抗体或抗体片段变体。取代型诱变的感兴趣位点包含CDR和框架区(FR)。保守取代示出在表1中在标题“优选取代”下。在表1中在标题“示范性取代”下并且如以下参考氨基酸侧链类别进一步描述的，提供了更多实质性改变。可以将氨基酸取代引入到感兴趣的抗体或抗体片段中，并且筛选产物的期望活性，例如，保留的/改进的抗原结合或降低的免疫原性。
表1：氨基酸取代
Figure BDA0003401749080000321
氨基酸可以根据共同的侧链性质进行分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链朝向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代将需要将这些类别中的一个类别的成员交换为另一个类别。
一种类型的取代型变体涉及取代亲本抗体(例如，人源化抗体或人抗体)的一或多个互补决定区残基。通常，选择用于进一步研究的一或多个所得变体将相对于亲本抗体在某些生物性质(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)上具有修饰(例如，改进)，和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物性质。示范性取代型变体是可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(如本文所描述的那些技术)方便地生成的亲和力成熟抗体。简而言之，一或多个CDR残基发生突变，并且变体抗体展示在噬菌体上并筛选特定的生物活性(例如，结合亲和力)。
可以在CDR中进行变更(例如，取代)，例如，以改进抗体亲和力。此类变更可以在CDR“热点”中进行，即由在体细胞成熟过程期间以高频经历突变的密码子编码的残基(参见例如，乔杜里(Chowdhury),分子生物学方法(Methods Mol.Biol.),第207卷,第179-196页,2008)，和/或在SDR(a-CDR)中进行，所得变体VH或VL针对结合亲和力进行测试。通过构建二级文库和从二级文库中重新选择来进行的亲和力成熟已经在例如胡根布姆(Hoogenboom)等人,分子生物学方法(Methods in Molecular Biology),第178卷,第1-37页,2001)中进行了描述。在亲和力成熟的一些实施例中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任何方法将多样性引入到被选择用于成熟的可变基因中。然后产生二级文库。然后对文库进行筛选，以鉴别出具有期望的亲和力的任何抗体变体。用于引入多样性的另一种方法涉及CDR指导的方法，其中若干个CDR残基(例如，一次4-6个残基)被随机化。抗原结合所涉及的CDR残基可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模特异性地鉴别出来。具体地，CDR-H3和CDR-L3通常是靶向的。
在某些实施例中，取代、插入或缺失可以发生在一或多个CDR中，只要此类变更不显著降低抗体或抗体片段结合抗原的能力即可。例如，在CDR中可以进行基本上不降低结合亲和力的保守变更(例如，如本文所提供的保守取代)。此类变更可以在CDR“热点”或SDR之外。在以上所提供的变体VH和VL序列的某些实施例中，每个CDR不改变，或含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
一种用于鉴别可以靶向诱变的抗体的残基或区的有用方法被称为“丙氨酸扫描诱变”，如坎宁安(Cunningham)和威尔斯(Wells),科学(Science),第244卷,第1081-1085页,1989所描述的。在此方法中，靶残基的残基或组(例如，如arg、asp、his、lys和glu等带电荷的残基)被鉴别出来并被中性氨基酸或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)置换，以确定抗体或抗体片段与抗原的相互作用是否受到影响。可以在氨基酸位置处引入另外的取代，从而证明对初始取代的功能敏感性。可替代地或另外，抗原-抗体复合物的晶体结构可以用于鉴别出抗体或抗体片段与抗原之间的接触点。此类接触残基和相邻残基可以作为取代候选项被靶向或消除。可以对变体进行筛选，以确定变体是否含有期望的性质。
氨基酸序列插入包含长度范围为一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基末端和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包含具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体的其它插入变体包含抗体的N末端或C末端与酶(例如，用于ADEPT)或增加抗体的血清半衰期的多肽的融合。
设想了本文所描述的抗体的一或多个氨基酸序列修饰。例如，可能期望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物性质。已知当人源化抗体通过在人抗体的VH和VL的FR中简单地仅移植衍生自非人动物的抗体的VH和VL的CDR而产生时，与衍生自非人动物的原始抗体的抗原结合活性相比，抗原结合活性降低。据认为，不仅在CDR中，而且在FR中，非人抗体的VH和VL的若干个氨基酸残基与抗原结合活性直接或间接相关。因此，用衍生自人抗体的VH和VL的FR的不同氨基酸残基取代这些氨基酸残基将会降低结合活性。为了解决所述问题，在用人CDR移植的抗体中，必须作出尝试以在人抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列中鉴别出和与抗体结合直接相关的氨基酸残基，或与CDR的氨基酸残基相互作用的氨基酸残基，或维持抗体的三维结构并与抗原结合直接相关的氨基酸残基。可以通过用衍生自非人动物的原始抗体的氨基酸残基置换鉴别出的氨基酸来增加降低的抗原结合活性。
可以对本发明的抗体的结构和编码所述抗体的DNA序列作出修饰和改变，并且修饰和改变仍可以获得编码具有令人期望的特性的抗体的功能分子。
在对氨基酸序列作出改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在向蛋白赋予相互作用生物功能方面的重要性在本领域中通常是被理解的。接受的是，氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白的二级结构，所述二级结构进而定义蛋白与其它分子，例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等的相互作用。根据氨基酸的疏水性和电荷特性，每种氨基酸都被指定了亲水指数，它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本发明的另外的目的还涵盖本发明抗体的功能保守变体。
当大于80％，优选地大于85％，优选地大于90％的氨基酸相同，或大于约90％，优选地大于95％在较短序列的整个长度上类似(功能上相同)时，两个氨基酸序列“基本上同源”或“基本上类似”。优选地，类似序列或同源序列通过使用例如GCG(遗传学计算机集团(Genetics Computer Group)，GCG包程序手册(Program Manual for the GCG Package),版本7,麦迪逊(Madison),威斯康星州)堆积程序或如BLAST、FASTA等序列比较算法中的任何序列比较算法进行比对来鉴别。
例如，某些氨基酸可以被蛋白结构中的其它氨基酸取代，而不会明显丧失活性。由于蛋白的相互作用能力和性质限定了蛋白的生物功能活性，因此可以在蛋白序列中以及当然在其DNA编码序列中进行某些氨基酸序列取代，然而同时获得具有类似性质的蛋白质。因此设想可以在本发明的抗体或抗体片段的序列或编码所述抗体或抗体片段的对应的DNA序列中进行各种改变，而不会明显丧失其生物活性。
本领域中已知某些氨基酸可以被具有类似亲水指数或得分的其它氨基酸取代并且仍产生具有类似生物活性的蛋白质，即仍获得生物功能等效蛋白。
如上文所概述的，氨基酸取代因此通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到各种前述特性的示范性取代是本领域技术人员众所周知的并且包含：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
糖基化变体
在某些实施例中，本文所提供的抗EpCAM抗体或抗体片段被改变以增加或降低抗体或抗体片段被糖基化的程度。针对抗体的糖基化位点的添加或缺失可以通过改变氨基酸序列使得一或多个糖基化位点得以产生或去除来方便地完成。
在抗体包括Fc区的情况下，连接到其的碳水化合物可以改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包括通常通过N键连接到Fc区的CH2结构域的Asn297的支链双触角寡糖。参见例如，赖特(Wright)等人,TIBTECH,第15卷,第26-32页,1997。寡糖可以包含各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在双触角寡糖结构的“干”中连接到GlcNAc的岩藻糖。在一些实施例中，可以对本发明的抗体中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改进性质的抗体变体。
在一个实施例中，提供了具有缺少与Fc区(直接或间接)连接的岩藻糖的碳水化合物结构的抗体变体。例如，此类抗体中的岩藻糖的量可以为1％到80％、1％到65％、5％到65％或20％到40％。岩藻糖的量是通过计算Asn297处的相对于如通过MALDI-TOF质谱法测量的与Asn 297连接的所有糖结构(例如，复合、杂合和高甘露糖结构)的总和的糖链内的岩藻糖的平均量来测定的，例如，如WO2008/077546中描述的。Asn297是指位于Fc区中约位置297(Fc区残基的EU编号)处的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297还可以位于位置297上游或下游约±3个氨基酸处，即，位置294与300之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改进的ADCC功能。参见例如，美国专利公开号US2003/0157108(L.普雷斯塔(Presta,L.))；US 2004/0093621(日本协和发酵工业株式会社(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd))。与“去岩藻糖化”或“岩藻糖缺乏性”抗体变体相关的出版物的实例包含：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；冈崎(Okazaki)等人,分子生物学杂志,第336卷,第1239-1249页,2004；山根-大贯(Yamane-Ohnuki)等人,生物技术与生物工程(Biotech.Bioeng.),第87卷,第614-622页,2004。能够产生去岩藻糖化抗体的细胞系的实例包含缺乏蛋白岩藻糖基化的Lec13CHO细胞(朱迪思(Ripka)等人,生物化学与生物物理学集刊(Arch.Biochem.Biophys.),第249卷,第533-545卷,1986；美国专利申请第US 2003/0157108 A号；以及WO 2004/056312A1，尤其在实例11处)；以及敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8、敲除CHO细胞(参见例如，山根-大贯等人,生物技术与生物工程,第87卷第614-622页，2004年；坎达(Kanda)等人,生物技术与生物工程,第94卷,第680-688页,第2006页；以及WO2003/085107)。
抗体变体进一步设置有二等分的寡糖，例如，其中连接到抗体的Fc区的双触角寡糖被GlcNAc二等分。此类抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改进的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878、美国专利第6,602,684号和US 2005/0123546中。还提供了在寡糖中有至少一个半乳糖残基连接到Fc区的抗体变体。此类抗体变体可以具有改进的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO 1997/30087、WO 1998/58964和WO 1999/22764中。
Fc区变体
在某些实施例中，可以将一或多个氨基酸修饰引入到本文所提供的抗EpCAM抗体或抗体片段的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包括在一或多个氨基酸位置处包括氨基酸修饰(例如，取代)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
在某些实施例中，本发明设想了具有一些但不是全部效应子功能的抗体变体，所述效应子功能使所述抗体变体成为这样的应用的令人期望的候选项：抗体在体内的半衰期具有重要性，但某些效应子功能(如ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定，以确认CDC和/或ADCC活性的降低/耗竭。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达总结在拉维奇(Ravetch)和基内特(Kinet),免疫学年度评论(Annu.Rev.Immunol.),第9卷,第457-492,1991的第464页的表3中。以下文献中描述了用于评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例：美国专利第5,500,362号(还参见例如，赫尔斯特伦(Hellstrom)等人,美国国家科学院院刊,第83卷,第7059-7063页,1986)和赫尔斯特伦等人,美国国家科学院院刊,第82卷,第1499-1502页,1985；美国专利第5,821,337号(还参见布里奇曼(Bruggemann)等人,实验医学杂志(J.Exp.Med.),第166卷,第1351-1361页,1987)。可替代地，可以采用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(加利福尼亚州山景城的细胞科技公司(CellTechnology,Inc.Mountain View,Calif.))；和CytoTox
Figure BDA0003401749080000371
非放射性细胞毒性测定(威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega,Madison,Wis.)))。用于此类测定的有用的效应细胞包含外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外，可以例如在如克莱因斯(Clynes)等人,美国国家科学院院刊,第95卷,第652-656页,1998中公开的动物模型等动物模型中在体内评估感兴趣分子的ADCC活性。还可以进行C1q结合测定以确认抗体不能结合C1q并且因此缺乏CDC活性。参见例如WO2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以执行CDC测定(参见例如，加扎诺-桑托罗(Gazzano-Santoro)等人,免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods),第202卷,第163-171页,1996；克拉格(Cragg)等人,血液(Blood),第101卷,第1045-1052页,2003；以及M.S.克拉格(Cragg,M.S)和M.J.格伦尼(M.J.Glennie),血液,第103卷,第2738-2743页,2004)。还可以使用本领域已知的方法执行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如，S.B.佩特科娃(Petkova,S.B.)等人,国际免疫学(Int’l.Immunol.),第18卷,第1759-1769页,2006)。
效应子功能降低的抗体或抗体片段变体包含具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一或多个的取代的抗体或抗体片段变体(美国专利第6,737,056号)。此类Fc突变体包含在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或两个以上氨基酸位置处有取代的Fc突变体，包含将残基265和297取代为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利第7,332,581号)。
描述了与FcR的结合改进的或减少的某些抗体变体。(参见例如，美国专利第6,737,056号；WO 2004/056312；和希尔兹(Shields)等人,生物化学杂志,第9卷,第6591-6604页,2001)。
在某些实施例中，抗体变体包括具有一或多个改进ADCC的氨基酸取代，例如在Fc区的位置298、333和/或334(残基的EU编号)处的取代的Fc区。
在一些实施例中，在Fc区中进行使C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即，改进或减少)的改变，例如，如美国专利第6,194,551号、WO 99/51642和伊杜索吉(Idusogie)等人,免疫学杂志,第164卷,第4178-4184页,2000中描述的。
US2005/0014934中描述了具有增加的半衰期和改进的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体，所述FcRN负责将母体IgG转移到胎儿(古耶尔(Guyer),免疫学杂志,第117卷,第587-593页,1976和金姆等人,免疫学杂志,第24卷,第249页,1994)。那些抗体包括其中具有改进了Fc区与FcRn的结合的一或多个取代的Fc区。此类Fc变体包含在以下Fc区残基中的一或多个处具有取代的Fc变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，Fc区残基434的取代(美国专利第7,371,826号)。关于Fc区变体的其它实例，还参见邓肯(Duncan)和温特,自然,第322卷,第738-740页,1988；美国专利第5,648,260号；美国专利第5,624,821号；以及WO 94/29351。
半胱氨酸工程化抗体变体
在某些实施例中，可以令人期望地产生半胱氨酸工程化抗体，例如“thioMAb”半，其中抗EpCAM抗体或抗体片段的一或多个残基用半胱氨酸残基取代。在特定实施例中，取代的残基出现在抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基由此定位于抗体的可及位点处并可以用于将抗体缀合到如药物部分或连接体-药物部分等其它部分以产生免疫缀合物，如本文进一步描述的。在某些实施例中，以下残基中的任何一或多个残基可以用半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区的5400(EU编号)。半胱氨酸工程化抗体可以如例如美国专利第7,521,541号中描述的产生。
抗体衍生物
在某些实施例中，可以进一步修改本文提供的抗EpCAM抗体或抗体片段以含有本领域中已知且容易获得的另外的非蛋白质部分。适合于抗体或抗体片段的衍生化的部分包含但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包含但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇以及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而可以在制造中具有优势。聚合物可以具有任何分子量并且可以是支链或非支链的。与抗体或抗体片段连接的聚合物的数量可以变化，并且如果连接的聚合物多于一种，则所述聚合物可以是相同或不同的分子。用于衍生化的聚合物的数量和/或类型通常可以基于包含但不限于以下的考虑因素来确定：要改进的抗体或抗体片段的特定性质或功能、衍生物是否将在定义的条件下在疗法中使用等。
在另一个实施例中，提供了抗体或抗体片段与可以通过暴露于辐射而选择性地加热的非蛋白质部分的缀合物。在一个实施例中，非蛋白质部分是碳纳米管(金(Kam)等人,美国国家科学院院刊,第102卷,第11600-11605页,2005)。辐射可以具有任何波长并且包含但不限于不损害普通细胞但将非蛋白质部分加热到抗体-非蛋白质部分附近的细胞被杀死的温度的波长。
本发明的抗EpCAM抗体或抗体片段或其变体在肿瘤微环境中的条件下比在非肿瘤微环境中的条件下对EpCAM具有更高的结合亲和力。在一个实施例中，肿瘤微环境中的条件和非肿瘤微环境中的条件均为pH。因此，本发明的抗EpCAM抗体或抗体片段可以在约5.0-6.8的pH下与EpCAM选择性地结合，但是在正常非肿瘤微环境中遇到的约7.2-7.8的pH下将对EpCAM具有较低的结合亲和力。如实例3和6所示，抗EpCAM抗体或抗体片段在pH 6.0时对EpCAM的结合亲和力比在pH 7.4时更高。
在某些实施例中，本发明的抗EpCAM抗体或抗体片段在肿瘤微环境中的条件下与EpCAM的解离常数(Kd)为约≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM或≦0.001nM(例如10-8M或更少或10-8M到10-13M或10-9M到10-13M)。在一个实施例中，具有EpCAM的抗体或抗体片段在肿瘤微环境中的条件下的Kd与在非肿瘤微环境中的相同条件下的Kd的比率为至少约1.5:1、至少约2:1、至少约3:1、至少约4:1、至少约5:1、至少约6:1、至少约7:1、至少约8:1、至少约9:1、至少约10:1、至少约20:1、至少约30:1、至少约50:1、至少约70:1或至少约100:1。
在一个实施例中，Kd是使用以下测定通过用感兴趣抗体的Fb版本和其抗原执行的放射性标记的抗原结合测定(RIA)来测量的。Fab针对抗原的溶液结合亲和力是通过在滴定系列的未标记抗原的存在下用最小浓度的(125I)标记的抗原平衡Fab、然后将结合的抗原用抗Fab抗体包被的板捕获来测量的(参见例如，陈(Chen)等人,分子生物学杂志293:865-881(1999))。为了确立用于测定的条件，将
Figure BDA0003401749080000401
多孔板(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))用在50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕获性抗Fab抗体(卡佩尔实验室(Cappel Labs))包被过夜，并且随后在室温(约23℃)下用在PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白阻断两到五小时。在非吸附性板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]抗原与感兴趣Fab的连续稀释物混合(例如，与普雷斯塔等人，癌症研究57:4593-4599(1997)中的对抗VEGF抗体Fab-12的评估相一致)。然后将感兴趣Fab温育过夜；然而，温育可以持续更长的时间(例如，约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移到捕获板以用于在室温下温育(例如，持续一小时)。然后去除溶液，并将板用PBS中的0.1％聚山梨酯20
Figure BDA0003401749080000411
洗涤八次。当板已干燥时，添加150微升/孔的闪烁剂(MICROSCINT-20TM；帕卡德公司(Packard))，并且然后将板在TOPCOUNTTM伽玛计数器(帕卡德公司)上计数十分钟。选择给出小于或等于最大结合的20％的每个Fab的浓度用于竞争性结合测定。
根据另一个实施例，Kd是使用表面等离子体共振测定25℃下使用
Figure BDA0003401749080000414
或
Figure BDA0003401749080000412
(新泽西州皮斯卡塔韦的BIAcore公司(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.))用约10个反应单位(RU)的固定化抗原CM5芯片来测量的。简而言之，根据供应商的说明书，用N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)来激活羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIACORE公司)。用pH4.8的10mM乙酸钠将抗原稀释到5μg/ml(大约0.2μM)，之后以5微升/分钟的流速注入，以实现偶联的蛋白质的约10个反应单位(RU)。在注入抗原之后，注入1M乙醇胺以阻断未反应的基团。对于动力学测量，在25℃下在具有将Fab的两倍连续稀释物(0.78nM到500nM)以约25微升/分钟的流速注入具有0.05％聚山梨酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂(PBST)的PBS中。通过同时拟合缔合传感图和解离传感图，使用简单的一对一朗缪尔(Langmuir)结合模型(
Figure BDA0003401749080000413
评估软件版本3.2)计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)被计算为比率koff/kon。参见例如，陈等人,分子生物学杂志293:865-881(1999)。如果通过以上表面等离子体共振测定得到缔合速率超过106M-1s-1，则缔合速率可以通过使用荧光淬灭技术来确定，所述荧光淬灭技术在如在光谱仪(如配备有截流的分光光度计(阿维夫仪器(Aviv Instruments))或具有搅拌的比色皿的8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic))中测量到的增加浓度的抗原存在的情况下测量在25℃下在pH 7.2的PBS中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)。
本发明的抗EpCAM抗体可以是嵌合、人源化或人抗体。在一个实施例中，采用了抗EpCAM抗体片段，例如Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、scFv、双抗体、三抗体、四抗体或F(ab′)2片段和由抗体片段形成的多特异性抗体。在另一个实施例中，抗体是全长抗体例如完整的IgG抗体或如本文所定义的其它抗体类别或同种型。关于某些抗体片段的综述，参见哈德森(Hudson)等人自然医学(Nat.Med.),第9卷,第129-134页,2003。关于scFv片段的综述，参见例如普拉克图恩(Pluckthün),单克隆抗体的药理学(The Pharmacology of MonoclonalAntibodies),第113卷,罗森堡(Rosenburg)和摩尔(Moore)编，(施普林格出版公司(Springer-Verlag),纽约),第269-315页(1994)；还参见WO 93/16185；以及美国专利第5,571,894号和第5,587,458号。关于包括补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab′)2片段的讨论，参见美国专利第5,869,046号。
本发明的双抗体可以是二价的或双特异性的。参见例如EP 404,097；WO1993/01161；哈德森等人,自然医学9:129-134(2003)；以及霍林格(Hollinger)等人,美国国家科学院院刊,第90卷,第6444-6448页,1993。哈德森等人,自然医学,第9卷,第129-134页,2003中还描述了三抗体和链抗体的实例。
在一些实施例中，本发明包括单结构域抗体片段，所述单结构域抗体片段包括抗体的重链可变结构域的全部或一部分或轻链可变结构域的全部或一部分。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(马萨诸塞州沃尔瑟姆的多曼蒂斯公司(Domantis,Inc.,Waltham,Mass.)；参见例如，美国专利第6,248,516B1号)。
抗体片段可以通过各种技术制备，包含但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)的生产，如本文所述。
在一些实施例中，本发明的抗EpCAM抗体可以是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述在例如以下中：美国专利第4,816,567号；以及莫里森(Morrison)等人,美国国家科学院院刊,第81卷,第6851-6855页,1984。在一个实例中，嵌合抗体包括非人可变区(例如，衍生自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物如猴子的可变区)和人恒定区。在另外的实例中，嵌合抗体是“类别转换的”抗体，在所述类别转换的抗体中，相对于亲本抗体的类别或亚类，抗体的类别或亚类已经改变。嵌合抗体包含其抗原结合片段。
在一些实施例中，本发明的嵌合抗体是人源化抗体。典型地，将此类非人抗体人源化以降低对人类的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。人源化抗体通常包括一或多个可变结构域，其中CDR(或其各部分)衍生自非人抗体，并且FR(或其各部分)衍生自人抗体序列。人源化抗体还可以任选地包括人恒定区的至少一部分。在一些实施例中，人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如，CDR残基衍生自的抗体)的对应残基取代，例如以恢复或改进抗体特异性或亲和力。
人源化抗体和制备人源化抗体的方法在例如阿尔玛格罗(Almagro)和弗朗森(Fransson),生物科学里程碑前沿(Front.Biosci.),第13卷,第1619-1633页,2008中进行了综述，并进一步描述于例如以下中：里奇曼(Riechmann)等人,自然,第332卷,第323-329页,1988；奎因(Queen)等人,美国国家科学院院刊,第86卷,第10029-10033页,1989；美国专利第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号和第7,087,409号；克什米尔瑞(Kashmiri)等人,方法(Methods),第36卷,第25-34页,2005(描述了SDR(a-CDR)移植)；帕德兰(Padlan),分子免疫学(Mol.Immunol.),第28卷,第489-498页,1991(描述了“表面重修”)；达拉夸(Dall′Acqua)等人,方法,第36卷,第43-60页,2005(描述了“FR改组”)；以及奥斯本(Osbourn)等人,方法,第36卷,第61-68页,2005和克里姆卡(Klimka)等人,英国癌症杂志,第83卷,第252-260页,2000(描述了用于FR改组的“引导选择”方法)。
可以用于人源化的人框架区包含但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如，西姆斯(Sims)等人,免疫学杂志,第151卷,第2296页,1993)；源自轻链可变区或重链可变区的特定子组的人抗体的共有序列的框架区(参见例如，卡特(Carter)等人美国国家科学院院刊,第89卷,第4285页,1992；以及普雷斯塔等人,免疫学杂志,第151卷,第2623页,1993)；人成熟(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见例如，阿尔玛格罗和弗朗森,生物科学里程碑前沿,第13卷,第1619-1633页,2008)；以及从筛选FR文库得到的框架区(参见例如，巴卡(Baca)等人,生物化学杂志,第272卷,第10678-10684,1997和罗索克(Rosok)等人,生物化学杂志,第271卷,第22611-22618页,1996)。
在一些实施例中，本发明的抗EpCAM抗体是多特异性例如双特异性抗体。多特异性抗体是具有针对至少两种不同位点的结合特异性的单克隆抗体。在某些实施例中，结合特异性中的一种是针对EpCAM，而另一种是针对如CD3等另一种抗原。这一点的一个具体实例是针对EpCAM和CD3+具有结合特异性的双特异性抗体。双特异性条件活性抗体可以是单条件活性的或双条件活性的。因此，在单条件活性双特异性抗体的情况下，结合位点中的一个是条件活性的，而另一个不是条件活性的，例如，与条件活性(CAB)CD3+配对的野生型(WT)EpCAM或与WT CD3+配对的CAB EpCAM。在双条件活性抗体的情况下，两个结合位点都像在CAB EpCAM×CAB CD3+中一样是条件活性的。
本发明的双特异性抗体可以包含下表所列出的抗体：
Figure BDA0003401749080000441
双特异性抗体或抗体片段可以由VK区或由整个轻链特异化。因此，双特异性抗体也可以是包含重链可变区和轻链可变区的双特异性抗体或抗体片段，每个区独立地与选自由SEQ ID NO:35、43和47组成的群组的VK区与选自由SEQ ID NO:37、45和49组成的群组的VH区的组合具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的一致性。相同的双特异性抗体或抗体片段反而可以包含与选自以下组成的群组的轻链具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的一致性的轻链：SEQ ID NO:36、44和48。相同的双特异性抗体或抗体片段可以包含与选自由以下组成的群组的抗CD3-scFv具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的一致性的抗CD3-scFv：SEQ ID NO:38、46和50。
多特异性抗体可以是单条件活性的、双条件活性的、三条件活性的。因此，多特异性抗体的结合区中的任何一或多个可以是条件活性的。
在某些实施例中，双特异性抗体可以与EpCAM的两种不同表位结合。双特异性抗体还可以用于将细胞毒性剂定位到表达EpCAM的细胞。双特异性抗体可以被制备为全长抗体或抗体片段。
用于制备多特异性抗体的技术包含但不限于具有不同特异性的两种免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见米尔斯坦(Milstein)和奎洛(Cuello),自然，第305卷,第537-540页,1983)、WO 93/08829以及特兰内克(Traunecker)等人,欧洲分子生物学学会会刊(EMBO J.)第10卷,第3655-3659页,1991)以及“杵臼结构(knob-in-hole)”工程化(参见例如美国专利第5,731,168号)。多特异性抗体还可以通过以下来制备：工程化静电转向效应以用于制备抗体Fc-异二聚体分子(WO2009/089004A1)；交联两个或两个以上抗体或片段(参见例如，美国专利第4,676,980号和布伦南(Brennan)等人,科学,第229卷,第81-83页,1985)；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如，科斯特尔尼(Kostelny)等人,免疫学杂志,第148卷,第1547-1553页,1992)；使用“双抗体”技术以用于制备双特异性抗体片段(参见例如，霍林格(Hollinger)等人,美国国家科学院院刊,第90卷,第6444-6448页,1993)；使用单链Fv(scFv)二聚体(参见例如，格鲁伯(Gruber)等人,免疫学杂志,第152卷,第5368-5374页,1994)；以及制备三特异性抗体，如例如在图特(Tutt)等人免疫学杂志,第147卷,第60-69页,1991中描述的。
本文还包含具有三个或三个以上功能抗原结合位点的工程化抗体，包含“章鱼抗体(Octopus antibody)”(参见例如，US 2006/0025576A1)。
可以使用US 2016/0017040中详细描述的重组方法和组合物来产生本发明的抗EpCAM抗体或抗体片段。
本发明的抗EpCAM抗体或抗体片段的物理/化学性质和/或生物活性可以通过本领域已知的各种测定进行测试和测量。美国专利第8,853,369号中描述了这些测定中的一些。
B.免疫缀合物
在另一方面，本发明还提供了免疫缀合物，所述免疫缀合物包括与一或多种细胞毒性剂缀合的抗EpCAM抗体或抗体片段，所述一或多种细胞毒性剂如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白毒素、细菌、真菌、植物或动物源的酶活性毒素或其片段)和放射性同位素。
在一个实施例中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体或抗体片段与一或多种药物缀合，包含但不限于美登木素生物碱(参见美国专利第5,208,020号、第5,416,064号和欧洲专利EP 0 425 235B1)；澳瑞他汀(auristatin)，如单甲基澳瑞他汀澳瑞他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利第5,635,483号和第5,780,588号以及第7,498,298号)；海兔毒素；卡奇霉素或其衍生物(参见美国专利第5,712,374号、第5,714,586号、第5,739,116号、第5,767,285号、第5,770,701号、第5,770,710号、第5,773,001号和第5,877,296号；欣曼(Hinman)等人,癌症研究,第53卷,第3336-3342页,1993；以及洛德(Lode)等人,癌症研究,第58卷,第2925-2928页,1998)；蒽环霉素，如道诺霉素或多柔比星(参见克拉兹(Kratz)等人,当今医药化学(Current Med.Chem.),第13卷,第477-523页,2006；杰弗里(Jeffrey)等人,生物有机化学与药物化学快报(Bioorganic&Med.Chem.Letters),第16卷,第358-362页,2006；托戈夫(Torgov)等人,生物共轭化学(Bioconj.Chem.),第16卷,第717-721页,2005；纳吉(Nagy)等人,美国国家科学院院刊,第97卷,第829-834页,2000；杜波奇克(Dubowchik)等人,生物有机化学与药物化学快报,第12卷,第1529-1532页,2002；京(King)等人,药物化学杂志(J.Med.Chem.),第45卷,第4336-4343页,2002；以及美国美国专利第6,630,579号)；甲氨蝶呤；长春地辛；紫杉烷，如多西他赛、紫杉醇、拉洛他赛(larotaxel)、替司他赛(tesetaxel)和奥他赛(ortataxel)；单端孢霉烯；以及CC1065。
在另一个实施例中，免疫缀合物包括与酶活性毒素或其片段缀合的本文所述的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思子毒素A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、帚曲霉素(α-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、垂序商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、丝林毒素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯类。
在另一个实施例中，免疫缀合物包括与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的如本文所述的抗体或抗体片段。多种放射性同位素可用于生产放射性缀合物。实例包含At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，其可以包括用于闪烁照相研究的放射性原子例如tc99m或I123或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰和铁。
在一些实施例中，免疫缀合物包括放射性药剂，所述放射性药剂可以选自α发射体、β发射体和γ发射体。α发射体的实例是211At、210Bi、212Bi、211Bi、223Ra、224Ra、225Ac和227Th。β发射体的实例是67Cu、90Y、131I、153Sm、l66Ho和186Re。γ发射体的实例是60Co、137Ce、55Fe、54Mg、203Hg和133Ba。
抗体/抗体片段和细胞毒性剂的缀合物可以使用多种双功能蛋白偶联剂来制备，如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸盐(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如己二亚氨盐酸二甲酯)、活性酯类(如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛类(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可以如维泰塔(Vitetta)等人,科学,第238卷,第1098-1104页,1987中描述的进行制备。碳-14标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示范性螯合剂。参见WO 94/11026。连接体可以是促进细胞毒性药物在细胞中的释放的“可裂解连接体”。例如，可以使用酸不稳定性连接体、肽酶敏感性连接体、光不稳定性连接体、二甲基连接体或含有二硫键的连接体(查理(Chari)等人,癌症研究,第52卷,第127-131页,1992；美国专利第5,208,020号)。
本文的免疫缀合物明确设想了但不限于用交联剂试剂制备的缀合物，所述交联剂试剂包含但不限于可商购获得的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SLAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB以及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)(例如，来自美国伊利诺伊州罗克福德的皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,Ill.,U.S.A))。
ADC的示范性实施例包含靶向肿瘤细胞、药物部分(D)和将Ab与D连接的连接体部分(L)的抗体或抗体片段(Ab)。在一些实施例中，抗体通过一或多个如赖氨酸和/或半胱氨酸等氨基酸残基与连接体部分(L)连接。
示范性ADC具有式I作为Ab-(L-D)p，其中p为1到约20。在一些实施例中，可以与抗体缀合的药物部分的数量受到游离半胱氨酸残基的数量的限制。在一些实施例中，通过本文所述的方法将游离半胱氨酸残基引入抗体氨基酸序列中。式I的示范性ADC包含但不限于具有1个、2个、3个或4个工程化半胱氨酸氨基酸的抗体(里昂(Lyon)等人,酶学方法(Methods in Enzym.),第502卷,第123-138页,2012)。在一些实施例中，在不使用工程化的情况下，抗体中已经存在一或多个游离半胱氨酸残基，在这种情况下，可以使用现有的游离半胱氨酸残基将抗体与药物缀合。在一些实施例中，在抗体缀合之前，抗体暴露于还原条件，以产生一或多个游离半胱氨酸残基。
连接体用于将部分与抗体缀合以形成如ADC等免疫缀合物。WO2017/180842中描述了适合的连接体。
WO 2017/180842中描述了可以与抗体缀合的一些药物部分。
药物部分还包含具有溶核活性的化合物(例如，核糖核酸酶或DNA核酸内切酶)。
在一些实施例中，免疫缀合物可以包括高放射性原子。多种放射性同位素可用于生产放射性缀合的抗体。实例包含At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在一些实施例中，当免疫缀合物用于检测时，其可以包括用于闪烁照相研究的放射性原子例如Tc99或I123或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记如锆-89、碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰和铁。锆-89可以与各种金属螯合剂复合并与抗体缀合，例如，以用于PET成像(WO 2011/056983)。
可以用已知的方式将放射性或其它标记并入免疫缀合物中。例如，可以使用包括例如代替一或多个氢的一或多个氟-19原子的适合的氨基酸前体来生物合成或化学合成肽。在一些实施例中，如Tc99、I123、Re186、Re188和In111等标记可以通过抗体中的半胱氨酸残基连接。在一些实施例中，钇-90可以通过抗体的赖氨酸残基连接。在一些实施例中，IODOGEN法(弗雷克(Fraker)等人,生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.),第80卷,第49-57页,1978)可以用于并入碘-123。“免疫闪烁照相术中的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy)”(沙塔尔(Chatal),CRC出版公司(CRC Press)1989)描述了某些其它方法。
在某些实施例中，免疫缀合物可以包括与前药激活酶缀合的抗体。在一些此类实施例中，前药激活酶将前药(例如，肽基化学治疗剂，参见WO 81/01145)转化为如抗癌药物等活性药物。在一些实施例中，此类免疫缀合物可用于抗体依赖性酶介导的前药疗法(“ADEPT”)中。可以与抗体缀合的酶包含但不限于碱性磷酸酶，所述碱性磷酸酶可用于将含磷酸盐的前药转化为游离药物；芳基硫酸酯酶，所述芳基硫酸酯酶可用于将含硫酸盐的前药转化为游离药物；胞嘧啶脱氨酶，所述胞嘧啶脱氨酶用于将无毒的5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(如组织蛋白酶B和L)，所述蛋白酶可用于将含肽的前药转化为游离药物；D-丙氨酰基羧肽酶，所述D-丙氨酰基羧肽酶可用于转化含有D-氨基酸取代基的前药；碳水化合物裂解酶，如β-半乳糖苷酶和神经氨酸苷酶，所述碳水化合物裂解酶可用于将糖基化前药转化为游离药物；β-内酰胺酶，所述β-内酰胺酶可用于将用β-内酰胺衍生化的药物转化为游离药物；以及青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶和青霉素G酰胺酶，所述青霉素酰胺酶可用于将分别在其胺氮处用苯氧基乙酰基或苯乙酰基衍生化的药物转化为游离药物。在一些实施例中，酶可以通过本领域中众所周知的重组DNA技术与抗体共价结合。参见例如，纽伯格(Neuberger)等人,自然,第312卷,第604-608页,1984。
缀合物中的载药量由p表示，即每个抗体的药物部分的平均数量。载药量可以在每个抗体1到20个药物部分的范围内。本发明的缀合物的药物部分的范围可以为1到20个。在从缀合反应制备缀合物时使用的每个抗体的药物部分的平均数量可以通过如质谱分析、ELISA测定和HPLC等常规手段来表征。
对于一些抗体-药物缀合物(ADC)，载药量可能受抗体上的连接位点数量的限制。例如，如上文的某些示范性实施例中，在连接是半胱氨酸硫醇时，抗体可以具有仅一个或几个半胱氨酸硫醇基，或者可以具有仅一个或几个可以通过其连接连接体的反应性充分的硫醇基。在某些实施例中，较高的载药量，例如p>5可能造成某些抗体-药物缀合物的聚集、不溶性、毒性或细胞通透性丧失。在某些实施例中，ADC的平均载药量范围为1到约8；约2到约6；或约3到约5。实际上，已经显示对于某些ADC，每个抗体的药物部分的最佳比率可以小于8，并且可以为约2到约5(美国专利第7,498,298号)。
在某些实施例中，在缀合反应期间，与抗体缀合的药物部分少于药物部分的理论最大值。抗体可以含有例如不与药物-连接体中间体或连接体试剂反应的赖氨酸残基，如下文所讨论的。抗体通常不含许多可以与药物部分连接的游离的和反应性半胱氨酸硫醇基。实际上，抗体中的大多数半胱氨酸硫醇残基作为二硫桥存在。在某些实施例中，可以在部分或完全还原条件下用如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)等还原剂来还原抗体，以生成反应性半胱氨酸硫醇基。在某些实施例中，使抗体经受变性条件以揭示例如赖氨酸或半胱氨酸等反应性亲核基团。
ADC的负载(药物/抗体比)可以用不同方式例如通过以下来控制：(i)限制药物-连接体中间体或连接体试剂相对于抗体的摩尔过量；(ii)限制缀合反应时间或温度；以及(iii)限制用于半胱氨酸硫醇修饰的还原条件。
C.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施例中，本文所提供的抗EpCAM抗体或抗体片段中的任何抗EpCAM抗体或抗体片段均可以用于定量地或定性地检测生物样品中EpCAM的存在。在某些实施例中，生物样品包括细胞或组织，如乳腺、胰腺、食道、肺和/或脑细胞或组织。
本发明的另一方面涉及用于诊断和/或监测癌症或另一种疾病的本发明的抗EpCAM抗体或抗体片段，其中EpCAM表达水平在体内至少一个位置中从正常生理水平增加或减少。
在优选的实施例中，本发明的抗体或抗体片段可以用如荧光分子、放射性分子或如上所述的本领域中已知的任何其它标记等可检测分子或物质进行标记。例如，本发明的抗体或抗体片段可以用放射性分子进行标记。例如，适合的放射性分子包含但不限于用于闪烁照相研究的放射性原子，如123I、124I、111In、186Re和188Re。本发明的抗体或抗体片段还可以用用于核磁共振(NMR)成像的自旋标记进行标记，如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧气-17、钆、锰或铁。施用抗体之后，检测放射性标记的抗体在患者体内的分布。可以使用任何适合的已知方法。一些非限制性实例包含计算机断层摄影(CT)、正电子发射断层扫描(PET)、磁共振成像(MRI)、荧光、化学发光和超声检查。
本发明的抗体或抗体片段可以可用于诊断与EpCAM过表达有关的癌症和疾病并对其进行分期。与EpCAM过表达有关的癌症可以包含鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌、胶质细胞瘤(如成胶质细胞瘤和神经纤维瘤)、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、黑色素瘤、结直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer)、肾癌(renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肉瘤、血液癌(白血病)、星形细胞瘤和各种类型的头颈癌或其它EpCAM表达性或过表达性过度增生性疾病。
本发明的抗体或抗体片段可以可用于诊断除EpCAM表达增加或减少的癌症以外的疾病。可溶性或细胞EpCAM形式均可以用于此类诊断。典型地，此类诊断方法涉及使用从患者获得的生物样品。生物样品涵盖可以用于诊断或监测测定中的从受试者获得的多种样品类型。生物样品包含但不限于生物来源的血液和其它液体样品、如活检样本或组织培养或衍生自其的细胞等固体组织样品和其子代。例如，生物样品包含获自从怀疑患有与EpCAM过表达有关的癌症的个体收集并且在优选实施例中从胶质瘤、胃、肺、胰腺、乳腺、前列腺、肾、肝和子宫内膜收集的组织样品的细胞。生物样品涵盖临床样品、培养中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物流体和组织样品。
在特定的实施例中，本发明是通过使用本发明的抗体检测来自受试者的细胞上的EpCAM来诊断受试者体内与EpCAM过表达有关的癌症的方法。具体地，所述方法可以包含以下步骤：
1)在适合于根据本发明的抗体或抗体片段的条件下使受试者的生物样品与抗体或抗体片段接触以与生物样品中表达EpCAM的细胞形成复合物；以及
(b)检测和/或量化所述复合物，由此所述复合物的检测指示与EpCAM过表达有关的癌症。
为了监测癌症的进展，可以在不同的时间重复根据本发明的方法，以确定抗体与样品的结合是否增加或减少，从中可以确定癌症是否已经进展、消退或稳定。
在特定的实施例中，本发明是诊断与EpCAM的表达或过表达有关的疾病的方法。此类疾病的实例可以包含癌症、人类免疫病症、血栓性疾病(血栓形成和动脉粥样硬化血栓形成)和心血管疾病。
在一个实施例中，提供了用于在诊断或检测方法中使用的抗EpCAM抗体或抗体片段。在另一方面，提供了检测生物样品中EpCAM4的存在的方法。在另一方面，提供了量化生物样品中EpCAM的量的方法。在某些实施例中，所述方法包括在允许抗EpCAM抗体或抗体片段与EpCAM结合的条件下使生物样品与如本文所述的抗EpCAM抗体或抗体片段接触；以及检测在抗EpCAM抗体或抗体片段与EpCAM之间是否形成复合物。此类方法可以在体外或在体内进行。在一个实施例中，抗EpCAM4抗体或抗体片段用于选择有资格进行疗法的受试者。在一些实施例中，疗法将包含向受试者施用抗EpCAM抗体或抗体片段。
在某些实施例中，提供了带标记的抗EpCAM抗体或抗体片段。标记包含但不限于直接地检测到的标记或部分(如荧光标记、发色标记、电子致密标记、化学发光标记和放射性标记)以及例如通过酶促反应或分子相互作用间接地检测到的部分如酶或配体。示范性标记包含但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H和131I；荧光团，如稀土螯合物或荧光素和其衍生物；罗丹明和其衍生物；丹酰；伞形酮；萤光素酶，例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利第4,737,456号)；萤光素；2,3-二氢酞嗪二酮；辣根过氧化物酶(HRP)；碱性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖淀粉酶；溶菌酶；糖类氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；与使用过氧化氢氧化如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶等染料前体的酶偶联的杂环氧化酶，如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶；生物素/亲和素；自旋标记；噬菌体标记；稳定的自由基等。
D.药物调配物
抗EpCAM抗体或抗体片段具有细胞杀伤活性。此细胞杀伤活性延伸到多种不同类型的细胞系。进一步地，这些抗体或抗体片段一旦与细胞毒性剂缀合就可以减小肿瘤大小并且可以展现出降低的毒性。因此，抗EpCAM抗体、抗EpCAM抗体的片段或抗EpCAM抗体的免疫缀合物可以用于治疗与EpCAM表达有关的增生性疾病。抗体、片段或免疫缀合物可以单独使用或与任何适合的药剂或其它常规治疗组合使用。
抗EpCAM抗体或抗体片段可以用于治疗与EpCAM表达、过表达或激活有关的疾病。除了对EpCAM表达的要求以外，对可以被治疗的癌症或组织的类型没有特定的限制。实例包含鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌、胶质细胞瘤(如成胶质细胞瘤和神经纤维瘤)、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、黑色素瘤、结直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肉瘤、血液癌(白血病)、星形细胞瘤和各种类型的头颈癌。更优选的癌症是胶质瘤、胃癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、肝癌和子宫内膜癌。
抗EpCAM抗体或抗体片段是先天性免疫反应的潜在激活剂并且因此可以用于如败血症等人类免疫性病症的治疗中。本发明的抗EpCAM抗体或抗体片段还可以用作用于如针对疫苗免疫的佐剂和用作针对例如细菌、病毒和寄生虫的抗感染剂。
抗EpCAM抗体或抗体片段可以用于防范、预防或治疗如静脉和动脉血栓形成和动脉粥样硬化血栓形成等血栓性疾病。抗EpCAM抗体或抗体片段还可用于防范、预防或治疗心血管疾病并且防止或抑制如拉沙病毒和埃博拉病毒等病毒的进入并且治疗病毒性感染。
在本文描述的治疗方法的实施例中的每个实施例中，抗EpCAM抗体、抗体片段或抗EpCAM抗体或抗体片段免疫缀合物可以以与和对寻求治疗的疾病或病症的管理有关的常规方法一致的方式进行递送。根据本文的公开，在足以预防或治疗疾病或病症的条件下在一定时间内向需要此类治疗的受试者施用有效量的抗体、抗体片段或免疫缀合物。因此，本发明的一方面涉及一种用于治疗与EpCAM的表达有关的疾病的方法，所述方法包括向需要的受试者施用治疗有效量的本发明的抗体、抗体片段或免疫缀合物。
针对施用，可以将抗EpCAM抗体、抗体片段或免疫缀合物调配成药物组合物。可以根据用于制备药物组合物的已知的方法来调配包含抗EpCAM抗体、抗体片段或免疫缀合物的药物组合物。在此类方法中，通常将治疗性分子与含有药学上可接受的载剂的混合物、溶液或组合物进行组合。
药学上可接受的载剂是受体患者可以耐受的材料。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上可接受的载剂的一个实例。其它适合的药学上可接受的载剂是本领域的技术人员众所周知的。(参见例如，根纳罗(Gennaro)(编),雷明顿药物科学(Remington′sPharmaceuticalSciences)(麦克出版公司(Mack Publishing Company),第19版1995))调配物可以进一步包含一或多种赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、白蛋白，以防止蛋白质在小瓶表面上的损失等等。
药物组合物的形式、施用途径、剂量和方案自然取决于要治疗的病状、疾病的严重程度、患者的年龄、体重和性别等。这些考虑因素可以被技术人员考虑在内以调配适合的药物组合物。本发明的药物组合物可以被调配用于局部施用、口服、肠胃外施用、鼻内施用、静脉内施用、肌内施用、皮下施用或眼内施用等。
优选地，药物组合物含有针对能够被注射的调配物药学上可接受的媒剂。这些可以具体地是等渗的无菌盐水溶液(磷酸一钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或此类盐的混合物)或干燥的尤其是冷冻干燥的组合物，所述组合物在添加例如无菌水或生理盐水后允许构成可注射溶液。
在一些实施例中，存在张力剂，有时称为“稳定剂”，以调节或维持组合物中液体的张力。当与如蛋白质和抗体等大的带电的生物分子一起使用时，张力剂通常被称为“稳定剂”，因为其可以与氨基酸侧链的带电的基团相互作用，由此降低分子间和分子内相互作用的可能性。张力剂可以以占药物组合物的按重量计0.1％到25％，优选地1％到5％的任何量存在。优选的张力剂包含多元糖醇，优选地三元或更高的糖醇，如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
另外的赋形剂包含可以用作以下中的一或多种的药剂：(1)填充剂，(2)溶解度增强剂，(3)稳定剂，以及(4)防止变性或粘附在容器壁上的药剂。此类赋形剂可以包含：多元糖醇(上面列举的)；氨基酸，如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌肉肌醇糖(myoinisitose)、肌肉肌醇(myoinisitol)、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环醇(例如，肌醇)、聚乙二醇；含有硫的还原剂，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙酸钠、硫代甘油、α-一硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白质，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其它免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；单糖(例如，木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖)；二糖(例如，乳糖、麦芽糖、蔗糖)；三糖，如棉子糖；以及多糖，如糊精或葡聚糖。
可以采用非离子表面活性剂或去污剂(也称为“润湿剂”)来帮助溶解治疗剂并保护治疗性蛋白免受搅动引起的聚集，这也允许调配物暴露于剪切表面应力而不会造成活性治疗性蛋白或抗体的变性。非离子表面活性剂可以存在的浓度范围为约0.05mg/ml到约1.0mg/ml，优选地约0.07mg/ml到约0.2mg/ml。
适合的非离子表面活性剂包含聚山梨酸酯(20、40、60、65、80等)、泊洛沙姆(polyoxamer)(184、188等)、
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多元醇、
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聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(
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等)、聚桂醇400，聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、单硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。可以使用的阴离子去污剂包含月桂基硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠和二辛基磺酸钠。阳离子去污剂包含苯扎氯铵或苄索氯铵。
用于施用的剂量可以被适配成各种参数的函数，并且具体地适配成所使用的施用模式、相关病理学或可替代地期望的治疗持续时间的函数。为了制备药物组合物，可以将有效量的抗体或抗体片段溶解或分散在药学上可接受的载剂或水介质中。
适合于可注射用途的药物形式包含无菌水溶液或分散体；包含芝麻油、花生油或丙二醇水溶液的调配物；以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，形式必须是无菌的并且必须是以易于注射的程度流动的。其在制造和储存条件下必须是稳定的并且必须被保存免于如细菌和真菌等微生物的污染作用。
作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液可以在适合地混合有表面活性剂的水中制备。还可以在甘油、液体聚乙二醇和其混合物中以及在油中制备分散体。在普通储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
可以将抗EpCAM抗体或抗体片段调配成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包含酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，并且药学上可接受的盐与如盐酸或磷酸等无机酸或如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等有机酸等形成。与游离羧基形成的盐还可以衍生自如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物等无机碱和如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等有机碱等。
载剂还可以是溶剂或含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物和植物油的分散介质。适当的流动性可以例如通过使用如卵磷脂等包衣、在分散体的情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持。对微生物的作用的预防可以通过多种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来提供。在许多情况下，包含等渗剂例如糖或氯化钠将是优选的。对可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶来提供。
通过根据需要将活性化合物以所需的量与上面列举的其它成分中的一或多种成分并入适当的溶剂中、随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分并入无菌媒剂中来制备分散体，所述无菌媒剂含有基础分散介质和来自以上列举的那些的所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述技术从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分加上任何另外的期望成分的粉末。
还设想了制备用于直接注射的更多或高度浓缩的溶液，其中设想使用二甲亚砜(DMSO)作为溶剂导致渗透极快，从而将高浓度的活性剂递送到小的肿瘤区域。
调配后，溶液将以与剂量调配物相兼容的方式并且以具有治疗有效性这样的量施用。调配物易于以多种剂型施用，如上文所描述的可注射溶液的类型，但是也可以采用药物释放胶囊等。
针对在水溶液中的肠胃外施用，例如，如果需要，应当适合地缓冲溶液并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。就此方面，鉴于本公开，可以采用的无菌水性介质将是本领域技术人员已知的。例如，可以将一个剂量溶解在1ml等渗NaCl溶液中，并且添加到1000ml皮下输液用液体中或注射在建议的输注部位处(参见例如，“雷明顿药物科学”,第15版,第1035-1038页和第1570-1580页)。取决于被治疗的受试者的病状，必然发生剂量的一些变化。在任何情况下，负责施用的人员都将确定用于个体受试者的适当的剂量。
可以将抗体或抗体片段调配在治疗性混合物中，以递送每剂量约0.0001毫克到10.0毫克或约0.001毫克到5毫克或约0.001毫克到1毫克或约0.001毫克到0.1毫克或约0.1毫克到1.0毫克或甚至约10毫克。还可以按选定的时间间隔施用多个剂量。
除了被调配用于肠胃外施用如静脉内或肌内注射的化合物外，其它药学上可接受的形式还包含例如用于口服施用的片剂或其它固体；定时释放胶囊；以及当前使用的任何其它形式。
在某些实施例中，设想使用脂质体和/或纳米颗粒将抗体或抗体片段引入宿主细胞中。脂质体和/或纳米颗粒的调配和使用是本领域技术人员已知的。
纳米胶囊通常可以以稳定且可再现的方式包埋化合物。为了避免由于细胞内聚合超负载引起的副作用，通常使用能够在体内降解的聚合物来设计此类超微粒子(大小设定为大约0.1μm)。设想将满足这些要求的可生物降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米颗粒用于本发明中，并且此类颗粒可以容易地制备。
脂质体由分散在水性介质中的磷脂形成并且自发形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(MLV))。MLV的直径通常为25nm到4μm。MLV的超声处理导致形成直径在
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到
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的范围内的小单层囊泡(SUV)，从而在核心包含水溶液。脂质体的物理特征取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。
含有本文所述的抗EpCAM抗体或抗体片段的药物调配物通过将具有所需纯度的此类抗体或抗体片段与一或多种任选的药学上可接受的载剂混合以冻干调配物或水溶液的形式来制备(雷明顿药物科学第16版,A.奥索(Osol,A)编(1980))。药学上可接受的载剂通常在所采用的剂量和浓度下对受体无毒并且包含但不限于：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟苯甲酸烷酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和包含葡萄糖、甘露糖或糊精的其它碳水化合物；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反离子，如钠；金属复合物，例如Zn-蛋白质复合物；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
本文的示范性药学上可接受的载剂进一步包含间质性药物分散剂，如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(
Figure BDA0003401749080000571
百特国际公司(Baxter International,Inc.))。在美国专利公开第2005/0260186号和第2006/0104968号中描述了包含rHuPH20在内的某些示范性sHASEGP和使用方法。在一方面，将sHASEGP与一或多种另外的如软骨素酶等糖胺聚糖酶(glycosaminoglycanase)组合。
在美国专利第6,267,958号中描述了示范性冻干抗体调配物。水性抗体调配物包含在美国专利第6,171,586号和WO 2006/044908中描述的那些，后面的调配物包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。
如被治疗的特定适应症所必需的，本文的调配物还可以含有一种以上的活性成分。优选地，可以将具有不对彼此产生不利影响的互补活性的成分组合成单一调配物。例如，可以期望除了本发明的抗CTLA4抗体、抗体片段或免疫缀合物外，还提供EGFR拮抗剂(如埃罗替尼(erlotinib))、抗血管生成剂(如可以是抗VEGF抗体的VEGF拮抗剂)或化学治疗剂(如紫杉烷或铂剂)。此类活性成分适合地以对于预期目的有效的量组合地存在。
在一个实施例中，将本发明的抗EpCAM抗体、抗体片段或免疫缀合物与针对选自CTLA4、PD1、PD-L1、AXL、ROR2、CD3、HER2、B7-H3、ROR1、SFRP4和包含WNT1、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16的WNT蛋白的抗原的另一种抗体或抗体片段组合成调配物。组合可以呈两个单独分子的形式：本发明的抗EpCAM抗体、抗体片段或免疫缀合物以及另一种抗体或抗体片段。可替代地，组合还可以是对EpCAM和另一种抗原均具有结合亲和力的单分子的形式，从而形成多特异性(例如，双特异性)抗体。
活性成分可以被囊化在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中。例如，可以采用分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、清蛋白微球、微乳液、纳米颗粒以及纳米胶囊)中或在粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊以及聚甲基丙烯酸甲酯(methylmethacylate)微胶囊。此类技术公开在雷明顿药物科学第16版,A.奥索编(1980)中。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的适合的实例包含含有抗体或抗体片段的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质可以呈成形物品的形式，例如，薄膜或微胶囊。
用于体内施用的调配物通常是无菌的。无菌性可以例如通过穿过无菌滤膜过滤容易地实现。
E.治疗方法和组合物
本文提供的抗EpCAM抗体或抗体片段中的任何抗EpCAM抗体或抗体片段均可以用于治疗方法中。在一方面，提供了用于用作药剂的抗EpCAM抗体或抗体片段。在另一方面，提供了用于在治疗癌症(例如，乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌(pancreatic cancer)、脑癌(brain cancer)、胰腺癌(cancer of pancreas)、脑癌(brain)、肾癌、卵巢癌、胃癌、白血病、子宫内膜癌、结肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、肝癌、骨肉瘤和/或黑色素瘤)时使用的抗EpCAM抗体或抗体片段。在某些实施例中，提供了用于在治疗方法中使用的抗EpCAM抗体或抗体片段。在某些实施例中，本发明提供了用于在治疗患有癌症的个体的方法中使用的抗EpCAM抗体或抗体片段，所述方法包括向个体施用有效量的抗EpCAM抗体或抗体片段。在某些实施例中，本发明提供了用于在治疗患有免疫性病症(例如，自身免疫障碍)、心血管病症(例如，动脉粥样硬化、高血压、血栓形成)、感染性疾病(例如，埃博拉病毒、马尔堡病毒)或糖尿病的个体的方法中使用的抗EpCAM抗体或抗体片段，所述方法包括向个体施用有效量的抗EpCAM抗体或抗体片段。在一个此类实施例中，所述方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如下所述。在另外的实施例中，本发明提供了用于在抑制血管生成、抑制细胞增殖、抑制免疫功能、抑制促炎性细胞因子分泌(例如，来自肿瘤相关巨噬细胞)、抑制肿瘤脉管系统(例如，肿瘤内脉管系统或肿瘤相关脉管系统)和/或抑制肿瘤基质功能时使用的抗EpCAM抗体或抗体片段。
在某些实施例中，本发明提供了用于在个体中抑制血管生成、抑制细胞增殖、抑制免疫功能、抑制促炎性细胞因子分泌(例如，来自肿瘤相关巨噬细胞)、抑制肿瘤脉管系统(例如，肿瘤内脉管系统或肿瘤相关脉管系统)和/或抑制肿瘤基质功能的方法中使用的抗EpCAM抗体或抗体片段，所述方法包括向个体施用有效量的抗EpCAM抗体或抗体片段以抑制血管生成、抑制细胞增殖、抑制免疫功能、抑制促炎性细胞因子分泌(例如，肿瘤相关巨噬细胞)、抑制肿瘤脉管系统发育(例如，肿瘤内脉管系统或肿瘤相关脉管系统)和/或抑制肿瘤基质功能。根据上面的实施例中的任何实施例的“个体”优选地是人类。
在另一方面，本发明提供了抗EpCAM抗体或抗体片段在药剂的制造或制备中的用途。在一个实施例中，药剂是用于治疗癌症(在一些实施例中，乳腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、脑癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、卵巢癌、胃癌、白血病、子宫内膜癌、结肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、肝癌、骨肉瘤和/或黑色素瘤)。在另一实施例中，药剂是用于在治疗癌症的方法中使用，所述方法包括向患有癌症的个体施用有效量的药物。在另一实施例中，药剂是用于在治疗患有免疫性病症(例如，自身免疫障碍)、心血管病症(例如，动脉粥样硬化、高血压、血栓形成)、感染性疾病(例如，埃博拉病毒、马尔堡病毒)或糖尿病的个体的方法中使用，所述方法包括向个体施用有效量的抗EpCAM抗体或抗体片段。在一个此类实施例中，所述方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如下所述。在另一实施例中，药剂是用于抑制血管生成、抑制细胞增殖、抑制免疫功能、抑制促炎性细胞因子分泌(例如，来自肿瘤相关巨噬细胞)、抑制肿瘤脉管系统(例如，肿瘤内脉管系统或肿瘤相关脉管系统)和/或抑制肿瘤基质功能。在另外的实施例中，药剂是用于在个体中抑制血管生成、抑制细胞增殖、抑制免疫功能、抑制促炎性细胞因子分泌(例如，来自肿瘤相关巨噬细胞)、抑制肿瘤脉管系统(例如，肿瘤内脉管系统或肿瘤相关脉管系统)和/或抑制肿瘤基质功能的方法中使用，所述方法包括向个体施用有效量的药剂以抑制血管生成、抑制细胞增殖、提升免疫功能、诱导促炎性细胞因子分泌(例如，肿瘤相关巨噬细胞)、抑制肿瘤脉管系统发育(例如，肿瘤内脉管系统或肿瘤相关脉管系统)和/或抑制肿瘤基质功能。根据上面的实施例中的任何实施例的“个体”可以是人类。
在另一方面，本发明提供了用于治疗癌症的方法。在一个实施例中，所述方法包括向患有此类癌症的个体施用有效量的抗EpCAM抗体或抗体片段。在一个此类实施例中，所述方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，如下所述。根据上面的实施例中的任何实施例的“个体”可以是人类。
在另一方面，本发明提供用于治疗免疫性病症(例如，自身免疫障碍)、心血管病症(例如，动脉粥样硬化、高血压、血栓形成)、感染性疾病(例如，埃博拉病毒、马尔堡病毒)或糖尿病的方法。在一个此类实施例中，所述方法进一步包括向个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，如下所述。根据上面的实施例中的任何实施例的“个体”可以是人类。
在另一方面，本发明提供用于在个体中抑制血管生成、抑制细胞增殖、抑制免疫功能、抑制促炎性细胞因子分泌(例如，来自肿瘤相关巨噬细胞)、抑制肿瘤脉管系统(例如，肿瘤内脉管系统或肿瘤相关脉管系统)和/或抑制肿瘤基质功能的方法。在一个实施例中，所述方法包括向个体施用有效量的抗EpCAM抗体或抗体片段以抑制血管生成、抑制细胞增殖、提升免疫功能、诱导促炎性细胞因子分泌(例如，来自肿瘤相关巨噬细胞)、抑制肿瘤脉管系统(例如，肿瘤内脉管系统或肿瘤相关脉管系统)和/或抑制肿瘤基质功能。在一个实施例中，“个体”是人类。
在另一方面，本发明提供了包括本文提供的抗EpCAM抗体或抗体片段中的任何抗EpCAM抗体或抗体片段的药物调配物，例如以用于在以上治疗方法中的任何治疗方法中使用。在一个实施例中，药物调配物包括本文提供的抗EpCAM抗体或抗体片段中的任何抗EpCAM抗体或抗体片段和药学上可接受的载剂。在另一个实施例中，药物调配物包括本文提供的抗EpCAM抗体或抗体片段中的任何抗EpCAM抗体或抗体片段和至少一种另外的治疗剂，例如，如下所述。
在上述每一种治疗中，本发明的抗体或抗体片段可以单独作为免疫缀合物或与其它药剂组合地在疗法中使用。例如，本发明的抗体可以与至少一种另外的治疗剂共同施用。在某些实施例中，另外的治疗剂是抗血管生成剂。在某些实施例中，另外的治疗剂是VEGF拮抗剂(在一些实施例中，抗VEGF抗体，例如，贝伐单抗(bevacizumab))。在某些实施例中，另外的治疗剂是EGFR拮抗剂(在一些实施例中，埃罗替尼)。在某些实施例中，另外的治疗剂是化学治疗剂和/或细胞抑制剂。在某些实施例中，另外的治疗剂是紫杉烷(例如，紫杉醇)和/或铂剂(例如，卡铂)。在某些实施例中，另外的治疗剂是增强患者的免疫力或免疫系统的药剂。
上文指出的此类联合疗法涵盖联合施用(其中两种或两种以上治疗剂被包含在相同或单独的调配物中)和单独施用，在这种情况下，抗体或抗体片段的施用可以在施用另外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后发生。抗体或抗体片段还可以与放射疗法组合使用。
抗EpCAM抗体或抗体片段可以用符合良好的医学实践的方式调配、给药和施用。在此上下文中考虑的因素包含被治疗的特定病症、被治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病状、病症的起因、药剂的递送部位、施用方法、施用时间安排以及执业医师已知的其它因素。抗体或抗体片段不一定但任选地与当前用于预防或治疗所讨论的病症的一或多种药剂一起调配。此类其它药剂的有效量取决于调配物中存在的抗体或抗体片段的量、病症或治疗的类型以及上文所讨论的其它因素。这些通常以相同的剂量并且用如本文所述的施用途径或本文所述的剂量的约1％到99％或以经验地/临床地确定适当的任何剂量和任何途径使用。
针对疾病的预防或治疗，抗体或抗体片段的适当剂量(当单独使用或与一或多种其它另外的治疗剂组合使用时)将取决于要治疗的疾病类型、抗体或抗体片段的类型、疾病的严重程度和进程、施用抗体或抗体片段是否是出于预防或治疗目的、先前的疗法、患者的临床病史和对抗体或抗体片段的反应以及主治医师的判断。将抗体或抗体片段适合地一次或通过一系列治疗施用于患者。取决于疾病的类型和严重程度，约1μg抗体或抗体片段/kg患者体重到40mg抗体或抗体片段/kg患者体重可以是向患者施用的初始候选剂量，无论是例如通过一或多次单独施用，还是通过连续输注。一个典型的日剂量的范围可以为约1μg抗体或抗体片段/kg患者体重到100mg抗体或抗体片段/kg患者体重或更多，这取决于上文所提到的因素。针对几天或更长时间内的重复施用，取决于病状，治疗通常将会持续到出现对疾病症状的期望抑制为止。此类剂量可以间歇地施用，例如每周或每三周(例如，使得患者接受约两剂到约二十剂或例如约六剂抗体或抗体片段)。可以施用初始较高负载剂量，随后施用一或多个较低剂量。然而，其它剂量方案可以是有用的。通过常规技术和测定容易地监测此疗法的进展。
为了预防或治疗受试者的疾病而可以施用的本发明的抗EpCAM抗体或抗体片段的具体剂量可以是约0.3mg、0.6mg、1.2mg、1.8mg、2.4mg、3.0mg、3.6mg、4.2mg、4.8mg、5.4mg、6.0mg、6.6mg、7.2mg、7.8mg、8.4mg、9.0mg、9.6mg或10.2mg抗体或抗体片段/kg患者体重。在某些实施例中，剂量的范围可以为0.3-2.4、2.4-4.2、4.2-6.0、6.0-7.8、7.8-10.2、10.2-12、12-14、14-16、16-18或18-20mg抗体或抗体片段/kg患者体重。如果以双特异性抗体的形式、与另一种免疫检查点抑制剂或另一种抗体或抗体片段组合或作为免疫缀合物施用，则抗体或抗体片段的剂量将保持相同。进一步地，具有抗EpCAM活性的多肽将以与抗体或抗体片段相同的量施用。
单剂量的本发明的药物调配物可以含有的本发明的抗EpCAM抗体或抗体片段的量为约45μg抗体或抗体片段到约13,600mg或约45μg抗体或抗体片段到约5440mg。在一些实施例中，单剂量的本发明的药物调配物可以含有的本发明的抗EpCAM抗体或抗体片段的量为135mg到1,387mg或如135mg、235mg、335mg、435mg、535mg、635mg、735mg、835mg、935mg、1035mg、1135mg、1235mg、1387mg等量。在某些实施例中，单剂量的药物调配物中本发明的抗EpCAM抗体或抗体片段的量的范围为135-235mg、235-335mg、335-435mg、435-535mg、535-635mg、635-735mg、735-835mg、835-935mg、935-1035mg、1035-1135mg、1135-1235mg、1235-1387mg。如果以双特异性抗体的形式与另一种免疫检查点抑制剂组合或作为免疫缀合物或与针对本文所公开的另一种抗原的另一种抗体或抗体片段组合施用，则单剂量的药物调配物中抗体或抗体片段的量将保持相同。进一步地，具有抗EpCAM活性的多肽将以与抗体或抗体片段相同的量包含在单剂量的药物调配物中。
在一个实例中，抗EpCAM抗体或抗体片段可以与免疫检查点抑制剂分子缀合或可以与免疫检查点抑制剂形成双特异性抗体的一部分。
组合可以是本申请中公开的抗EpCAM抗体或抗体片段和作为单独分子或作为双特异性抗体施用的免疫检查点抑制剂分子。此类双特异性抗体与EpCAM具有结合活性并且与免疫检查点具有第二结合活性。
免疫检查点可以选自CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT、VISTA、BTLA、OX40、CD40、4-1BB、PD-1、PD-L1和GITR(扎哈维(Zahavi)和维纳(Weiner),国际分子科学杂志(InternationalJournal of Molecular Sciences)第20卷,158,2019)。另外的免疫检查点包含B7-H3、B7-H4、KIR、A2aR、CD27、CD70、DR3和ICOS(曼尼(Manni)等人,用于癌症治疗的免疫检查点阻断和其与小分子抑制剂的联合疗法(Immune checkpoint blockade and its combinationtherapy with small-molecule inhibitors for cancer treatment),Bbacan,https://doi.org/10.1016/j.bbcan.2018.12.002,2018)。
免疫检查点优选地是CTLA4、PD-1或PD-L1。
应理解，代替抗EpCAM抗体或除了抗EpCAM抗体之外，可以使用本发明的抗体片段或免疫缀合物实施以上调配物或治疗方法中的任何调配物或治疗方法。
增强宿主抵抗肿瘤的免疫功能是人们越来越感兴趣的主题。常规方法包含(i)APC增强，如(a)将编码外源MHC同种抗原的DNA注入肿瘤，或(b)用增加免疫抗原识别的可能性的基因(例如，免疫刺激性细胞因子GM-CSF、共刺激分子B7.1、B7.2)来转染活检肿瘤细胞，(ii)过继细胞免疫疗法或用激活的肿瘤特异性T细胞治疗。过继细胞免疫疗法包含分离肿瘤浸润性宿主T淋巴细胞、在体外扩增群体，如通过IL-2或肿瘤或两者的刺激。另外，功能障碍的分离的T细胞还可以通过体外应用本发明的抗PD-L1抗体来激活。然后，如此激活的T细胞可以重新施用于宿主。这些方法中的一或多种方法可以与本发明的抗体、抗体片段或免疫缀合物的施用组合使用。
用于癌症的传统疗法包含以下：(i)放射疗法(例如，放射疗法、x射线疗法、辐照)或使用电离辐射来杀死癌细胞并缩小肿瘤。放射疗法可以通过外部光束放射疗法(EBRT)外部地或通过近距离放射疗法内部地施用；(ii)化学疗法，或应用通常影响快速分裂的细胞的细胞毒性药物；(iii)靶向疗法，或特异性地影响癌细胞的失调蛋白的药剂(例如，酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)；单克隆抗体、光动力学疗法)；(iv)免疫疗法，或增强宿主的免疫反应(例如，疫苗)；(v)激素疗法，或阻断激素(例如，当肿瘤对激素敏感时)，(vi)血管生成抑制剂，或阻断血管形成和生长，以及(vii)姑息照护，或旨在改善照护质量以减少疼痛、恶心、呕吐、腹泻和出血的治疗。如吗啡(morphine)和羟考酮(oxycodone)等止痛药、如昂丹司琼(ondansetron)和阿瑞匹坦(aprepitant)等止吐药可以允许更积极的治疗方案。
在癌症的治疗中，可以在施用抗EpCAM抗体或抗体片段之前、之后或同时进行任何先前描述的用于治疗癌症免疫力的常规治疗。另外，可以在如施用肿瘤结合抗体(例如，单克隆抗体、毒素缀合的单克隆抗体)和/或施用化学治疗剂等常规癌症治疗之前、之后或同时施用抗EpCAM抗体或抗体片段。
F.制品和试剂盒
在本发明的另一方面，提供了含有抗EpCAM抗体或抗体片段以及可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的其它材料的制品。制品可以包括容器和在容器上或与容器有关的标签或包装插页。适合的容器包含例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由如玻璃或塑料等多种材料形成。容器容纳有通过本身有效用于治疗、预防和/或诊断病状或与有效用于治疗、预防和/或诊断病状的另一种组合物组合的组合物并且可以具有无菌进入孔(例如，容器可以是静脉注射溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体或抗体片段。标签或包装插页指示治疗组合物是用于治疗所选病状。而且，制品可以包括：(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包括抗体或抗体片段；以及(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包括另外的细胞毒性剂或其它治疗剂。本发明的此实施例中的制品可以进一步包括指示组合物可以用于治疗特定病状的包装插页。可替代地或另外，制品可以进一步包括第二(或第三)容器，所述容器包括药学上可接受的缓冲剂，如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。制品可以进一步包含从商业和使用者立场上期望的其它材料，所述材料包含其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。
应理解，代替或除了抗EpCAM抗体或抗体片段之外，以上制品中的任何制品可以包含本发明的免疫缀合物。
最后，本发明还提供了包括至少一个本发明的抗体或抗体片段的试剂盒。含有本发明的多肽、抗体或抗体片段或抗体药物缀合物的试剂盒可用于检测EpCAM表达(增加或减少)或用于治疗测定或诊断测定。本发明的试剂盒可以含有与固体支持物例如组织培养板或珠(例如，琼脂糖珠)偶联的抗体。可以提供含有用于在体外例如在ELISA或蛋白质印迹法中检测和定量EpCAM的抗体的试剂盒。可用于检测的此类抗体可以设置有如荧光或放射性标记等标记。
试剂盒进一步含有关于其用途的说明。在一些实施例中，说明包括美国食品和药物管理局针对体外诊断试剂盒要求的说明。在一些实施例中，试剂盒进一步包括用于基于样品中EpCAM的存在或不存在来诊断所述样品中脑脊液的存在或不存在的说明。在一些实施例中，试剂盒包括一或多种抗体或抗体片段。在其它实施例中，试剂盒包括一或多种酶、酶抑制剂或酶激活剂。在再其它实施例中，试剂盒进一步包括一或多种色谱化合物。在又其它实施例中，试剂盒进一步包括一或多种用于制备用于光谱测定的样品的化合物。在另外的实施例中，试剂盒进一步包括用于根据指示剂的强度、色谱或其它物理属性来解释EpCAM的存在或不存在的对比参考材料。
以下实例是对本公开的抗EpCAM抗体的说明而不是限制。在本领域中通常遇到的并且对于本领域技术人员而言显而易见的对多种条件和参数的其它适合的修改和调整在本公开的范围内。
实例
实例1：用EpCAM免疫的小鼠的杂交瘤克隆
用重组人EpCAM细胞外结构域(ECD)免疫小鼠。用人EpCAM ECD和表达人EpCAM的稳定CHO细胞筛选使用免疫的小鼠的B细胞生成的杂交瘤克隆。基于杂交瘤克隆与人EpCAMECD、cyno EpCAM和表达人EpCAM的CHO细胞结合但不与小鼠或大鼠EpCAM结合的能力来选择杂交瘤克隆。所选杂交瘤克隆示出在表2中。
表2.表达抗EpCAM抗体的所选杂交瘤克隆
Figure BDA0003401749080000651
实例2：条件活性生物(CAB)抗EpCAM抗体
使用由杂交瘤克隆12C10F12表达的抗EpCAM抗体作为用于生成条件活性抗EpCAM抗体的模板抗体。使用全面位置进化(CPETM)使编码模板抗体的DNA发生突变，以产生突变抗体。针对条件活性抗EpCAM抗体对突变抗体进行筛选，与在非肿瘤微环境中存在的正常生理pH下与EpCAM的结合活性相比，所述条件活性抗EpCAM抗体在肿瘤微环境的低pH下与人EpCAM的结合活性增加，如图4和表3所示。抗体克隆BAP-105-01-01是如图4所示的模板抗体(WT)。
表3.条件活性抗EpCAM抗体
抗体克隆 轻链可变区 重链可变区
BAP-105-01-01 BAP105-1-VK01(SEQ ID NO:14) BAP105-1-VH01(SEQ ID NO:7)
BAP-105-01-02 BAP105-1-VK01(SEQ ID NO:14) BAP105-1-VH02(SEQ ID NO:8)
BAP-105-01-03 BAP105-1-VK01(SEQ ID NO:14) BAP105-1-VH03(SEQ ID NO:9)
BAP-105-01-04 BAP105-1-VK02(SEQ ID NO:15) BAP105-1-VH01(SEQ ID NO:7)
BAP-105-01-05 BAP105-1-VK03(SEQ ID NO:16) BAP105-1-VH01(SEQ ID NO:7)
BAP-105-01-06 BAP105-1-VK04(SEQ ID NO:17) BAP105-1-VH01(SEQ ID NO:7)
这些条件活性抗EpCAM抗体被进一步表征。
实例3：条件活性抗EpCAM抗体的结合活性
使用BAP-105-01-01作为对照物分析所选条件活性抗EpCAM抗体(以BAP-105-01-03和BAP-105-01-06为例)与EpCAM的结合。通过荧光激活细胞分选(FACS)在两个不同的pH值6.0和7.4下测量这些抗EpCAM抗体与EpCAM表达性Colo205细胞的结合活性。使用不同剂量的抗体10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL和0.01μg/mL。条件活性抗EpCAM抗体一致地示出了在pH 6.0时与EpCAM表达性Colo205细胞的结合活性高于pH 7.4时。参见图5A-5D。
还使用表达人EpCAM的293细胞实施了类似的FACS分析。条件活性抗EpCAM抗体还示出了在pH 6.0时与表达293细胞的EpCAM的结合活性一致高于pH 7.4时。参见图6A-6D。
实例4：条件活性抗EpCAM抗体缀合物的细胞杀伤
将所选条件活性抗EpCAM抗体BAP-105-01-03和BAP-105-01-06与强效抗有丝分裂剂单甲基澳瑞他汀E(MMAE)，以产生抗体药物缀合物(ADC)。使用抗体BAP-105-01-01作为非条件活性抗体对照物，并且使用B12作为阴性对照物。在6.0、6.2和7.4三个pH值下测量EpCAM表达性Colo205细胞的体外细胞杀伤。还确定了条件活性抗EpCAM抗体对Colo205细胞的体外杀伤的IC50。参见图7A-7C。
还使用Colo205异种移植小鼠模型测量条件活性抗EpCAM抗体ADC的体内细胞杀伤。通过IV注射用间歇方案Q4Dx4(每四天四次)来治疗异种移植小鼠模型。使用1mg/kg和6mg/kg两种剂量。使用八(8)只小鼠用于每个治疗组。与对照物相比，在6mg/kg的剂量下，条件活性抗EpCAM抗体ADC显著降低了肿瘤的体积，但并未显著降低动物的重量。参见图8A-8B。这表明条件活性抗EpCAM抗体ADC在展现减少的副作用的同时治疗肿瘤方面是有效的。
实例5：条件活性抗EpCAM抗体的人源化
对条件活性抗EpCAM抗体之一BAP-1-5-01-06人源化，以产生另外的人源化条件活性抗EpCAM抗体。参见表4。
表4.针对EpCAM的人源化条件活性抗EpCAM抗体
Figure BDA0003401749080000661
实例6：人源化条件活性抗EpCAM抗体与人EpCAM的结合活性
使用模板抗体BAP 105-01-01作为对照物通过ELISA测量了人源化条件活性抗EpCAM抗体与人EpCAM的结合活性。参见图9A-9E。表5中汇总了在pH 6.0和pH 7.4时人源化条件活性抗EpCAM抗体与人EpCAM结合的EC50值。
表5.人源化条件活性抗EpCAM抗体针对人EpCAM的EC50
Figure BDA0003401749080000671
还通过ELISA测量了人源化条件活性抗EpCAM抗体在pH滴定下与人EpCAM的结合活性。参见图10。表6中汇总了人源化条件活性抗EpCAM抗体与人EpCAM的pH拐点。
表6.人源化条件活性抗EpCAM抗体针对人EpCAM的pH拐点
Figure BDA0003401749080000672
实例7：人源化条件活性抗EpCAM抗体与cyno EpCAM的结合活性
类似地测量了人源化条件活性抗EpCAM抗体与cyno EpCAM的结合活性。参见图11A-11E。表7中汇总了人源化条件活性抗EpCAM抗体在pH 6.0和pH 7.4时与cyno EpCAM结合的EC50。
表7.人源化条件活性抗EpCAM抗体针对cyno EpCAM的EC50
Figure BDA0003401749080000673
通过ELISA类似地测量了人源化条件活性抗EpCAM抗体在pH滴定下与cyno EpCAM的结合活性。参见图12。表8中汇总了人源化条件活性抗EpCAM抗体与cyno EpCAM的pH拐点。
表8.人源化条件活性抗EpCAM抗体针对cyno EpCAM的拐点
Figure BDA0003401749080000681
实例8：人源化条件活性抗EpCAM抗体的热稳定性
通过测量人源化条件活性抗EpCAM抗体在热处理后的结合活性评估了其热稳定性。通过ELISA测量在不同温度下在pH 6.0和pH 7.4时热处理一(1)小时后人源化条件活性抗EpCAM抗体与人EpCAM的结合活性。参见图13A-13B。温度高达45℃的热处理不会显著地影响结合亲和力，从而示出在这些温度下具有良好的热稳定性。
实例9：通过FACS测量的人源化条件活性抗EpCAM抗体的结合活性
通过FACS在pH 6.0和pH 7.4下测量人源化条件活性抗EpCAM抗体与表达人EpCAM的Colo205细胞的结合活性。人源化条件活性抗EpCAM抗体一致地示出了在pH 6.0时与表达人EpCAM的Colo205细胞的结合活性高于pH 7.4时。参见图14A-14B。表9中汇总了人源化条件活性抗EpCAM抗体与表达人EpCAM的Colo205细胞结合的EC50值。
表9.人源化条件活性抗EpCAM抗体与表达人EpCAM的Colo205细胞的EC50
EC50(ng/mL) BA-105-01-01 105.4-01-02 105.4-01-05 105.4-02-01 105.4-03-02
pH6.0 263.4 272.8 341.6 321.2 496.8
pH7.4 267.8 397.1 418 652.4 669.6
还使用表达人EpCAM的293细胞实施了类似的FACS分析。人源化条件活性抗EpCAM抗体还一致地示出了在pH 6.0时与表达人EpCAM的293细胞的结合活性高于pH 7.4时。参见图15A-15B。表10中汇总了人源化条件活性抗EpCAM抗体与表达人EpCAM的293细胞结合的EC50值。
表10.人源化条件活性抗EpCAM抗体与表达人EpCAM的293细胞的EC50
Figure BDA0003401749080000682
Figure BDA0003401749080000691
还使用表达cyno EpCAM的293细胞实施了类似的FACS分析。人源化条件活性抗EpCAM抗体还一致地示出了在pH 6.0时与表达cyno EpCAM的293细胞的结合活性高于pH7.4时。参见图16A-16B。表11中汇总了人源化条件活性抗EpCAM抗体与表达cyno EpCAM的293细胞结合的EC50值。
表11.人源化条件活性抗EpCAM抗体与表达cyno EpCAM的293细胞的EC50
EC50(ug/mL) BA-105-01-01 105.4-01-02 105.4-01-05 105.4-02-01 105.4-03-02
pH6.0 0.6248 1.263 1.6 2.417 1.417
pH7.4 0.8625 6.36 11.58 14.09 4.465
实例10：人源化条件活性抗EpCAM抗体ADC的结合活性
将人源化条件活性抗EpCAM抗体与MMAE缀合，以产生抗体药物缀合物。通过ELISA在pH 6.0和pH 7.4下在不同的抗体浓度下测量缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体与人EpCAM的结合活性。缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体一致地示出了在pH 6.0时与人EpCAM的结合活性高于pH 7.4时。参见图17A-17B。表12中汇总了缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体与人EpCAM结合的EC50值。
表12.缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体与人EpCAM的EC50
EC50(ng/mL) pH6.0 pH7.4
BA-105-01-01 23.96 14.74
BA-105.4-01-02 39.16 126.5
BA-105.4-01-05 30.55 70.27
BA-105.4-02-01 32.41 220.2
还使用cyno EpCAM实施了ELISA分析，以测量缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体的结合亲和力。缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体还一致地示出了在pH 6.0时与cynoEpCAM的结合活性高于pH 7.4时。参见图18A-18B。表13中汇总了缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体与cyno EpCAM结合的EC50值。
表13.缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体与cyno EpCAM的EC50
Figure BDA0003401749080000692
Figure BDA0003401749080000701
实例11：pH滴定下人源化条件活性抗EpCAM抗体ADC的结合活性
在pH滴定下通过ELISA测量缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体与人EpCAM的结合活性。在pH从pH 5.5增加时，缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体示出了与人EpCAM的结合活性降低。参见图19A。表14中汇总了缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体在pH 6.0和pH7.4时与人EpCAM的结合活性的比率以及其pH拐点。
表14.缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体与人EpCAM的结合特征
人EpCAM 比率(pH 6.0/7.4) pH拐点
BA-105-01-01 7376-vcMMAE 0.86 6.71
BA-105.4-01-02 8316-vcMMAE 1.75 NA
BA-105.4-01-05 8317-vcMMAE 2.39 6.98
BA-105.4-02-01 8318-vcMMAE 6.74 6.83
还在pH滴定下通过ELISA测量了缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体与cynoEpCAM的结合活性。在pH从pH 5.5增加时，缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体示出了与cyno EpCAM的结合活性类似地降低。参见图19B。表15中汇总了缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体在pH 6.0和pH 7.4时与cyno EpCAM的结合活性的比率以及其pH拐点。
表15.缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体与cyno EpCAM的结合特征
cyno-EpCAM 比率(pH 6.0/7.4) pH拐点
BA-105-01-01 7376-vcMMAE 0.93 5.07
BA-105.4-01-02 8316-vcMMAE 2.75 6.30
BA-105.4-01-05 8317-vcMMAE 2.76 6.28
BA-105.4-02-01 8318-vcMMAE 3.61 6.16
实例12：人源化条件活性抗EpCAM抗体ADC的热稳定性
通过测量缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体(具有MMAE)在热处理后的结合活性评估了其热稳定性。通过ELISA在pH 6.0和pH 7.4下确定在不同温度下热处理一(1)小时后缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体与人EpCAM的结合活性。参见图20A-20B。温度高达45℃的热处理不会显著地影响结合亲和力，从而示出在这些温度下具有良好的热稳定性。
实例13：通过FACS测量的人源化条件活性抗EpCAM抗体ADC的结合活性
通过FACS在以下两个不同的pH下测量缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体(具有MMAE)与表达人EpCAM的Colo205细胞的结合活性：6.0和7.4。缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体一致地示出了在pH 6.0时与表达人EpCAM的Colo205细胞的结合活性高于pH 7.4时。参见图21A-21B。表16中汇总了缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体与表达人EpCAM的Colo205细胞结合的EC50值。
表16.缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体与表达人EpCAM的Colo205细胞的EC50
EC50(ng/mL) BAP105-01-01 BA-105.4-01-02 BA-105.4-01-05 BA-105.4-02-01
pH 6.0 300.7 150.4 187.9 463.9
pH 7.4 375 152.7 202.6 693.2
还使用表达人EpCAM的293细胞实施了类似的FACS分析。缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体还一致地示出了在pH 6.0时与表达人EpCAM的293细胞的结合活性高于pH 7.4时。参见图22A-22B。表17中汇总了缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体与表达人EpCAM的293细胞结合的EC50值。
表17.缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体与表达人EpCAM的293细胞的EC50
EC50(ng/mL) BAP105-01-01 BA-105.4-01-02 BA-105.4-01-05 BA-105.4-02-01
pH 6.0 129.3 63.7 77.18 206.5
pH 7.4 111.8 84.95 108.8 335
还使用表达cyno EpCAM的293细胞实施了类似的FACS分析。缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体(具有MMAE)还一致地示出了在pH 6.0时与表达cynoEpCAM的293细胞的结合活性高于pH 7.4时。参见图23A-23B。表18中汇总了缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体与表达cyno EpCAM的293细胞结合的EC50值。
表18.缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体与表达cyno EpCAM的293细胞的EC50
EC50(ug/mL) BA-105-01-01 105.4-01-02 105.4-01-05 105.4-02-01
pH6.0 1.361 4.722 5.541 7.964
pH7.4 1.741 17.68 43.36 61.07
实例14：人源化条件活性抗EpCAM抗体ADC的细胞杀伤
分析了缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体(具有MMAE)的细胞杀伤。使用抗体BAP-105-01-01作为非条件活性抗体对照物，并且使用B12作为阴性对照物。使用人EpCAM表达性Colo205细胞在6.0、6.5和7.4三个pH值下分析体外细胞杀伤。图24A-24C中示出了缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体对表达人EpCAM的Colo205细胞的体外杀伤。表19中示出了表达人EpCAM的Colo205细胞的细胞杀伤的IC50值。
表19.人源化条件活性抗EpCAM抗体缀合物对Colo205细胞的细胞杀伤的IC50
BA-105-01-01 BA-105.4-01-02 BA-105.4-01-05 BA-105.4-02-01 B12
pH6.0 10.24 18.83 45.66 255.5 34409
pH6.5 7.624 21.06 96.45 约567.9 24797
pH7.4 12.21 53.46 264.6 1399 21567
使用人EpCAM表达性293细胞在6.0、6.5和7.4三个pH值下类似地分析了表达人EpCAM的293细胞的体外细胞杀伤。图25A-25C中示出了缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体对表达人EpCAM的293细胞的体外杀伤。表20中示出缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体对表达人EpCAM的293细胞的细胞杀伤的IC50值。
表20.人源化条件活性抗EpCAM抗体缀合物对293细胞的细胞杀伤的IC50
BA-105-01-01 BA-105.4-01-02 BA-105.4-01-05 BA-105.4-02-01 B12
pH6.0 约22.92 约22.14 32.58 143.7 约46655
pH6.5 15.78 18.47 70.79 247.3 56126
pH7.4 20.72 26.73 105.7 516.1 51285
使用不含EpCAM的293F细胞在6.0、6.2和7.4三个pH值下类似地分析了不含人EpCAM的293F细胞的体外细胞杀伤。图26A-26C中示出了缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体对293F细胞的体外杀伤。缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体的细胞杀伤与对照物无显著差异。表21中示出了缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体对293F细胞的细胞杀伤的IC50值。
表21.人源化条件活性抗EpCAM抗体缀合物对293F细胞的细胞杀伤的IC50
BA-105-01-01 BA-105.4-01-02 BA-105.4-01-05 BA-105.4-02-01 B12
pH6.0 41775 26422 22381 30263 37512
pH6.5 30566 21116 21000 21545 32412
pH7.4 27499 18458 17729 22446 23925
实例15：人源化条件活性抗EpCAM抗体ADC对肿瘤的治疗
在Colo205异种移植小鼠模型中测量了缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体(具有MMAE)对肿瘤的体内治疗。使用抗体BAP-105-01-01作为非条件活性抗体对照物，并且使用B12作为阴性对照物。通过IV注射用间歇方案Q4Dx4(每四天四次)来治疗异种移植模型。使用3mg/kg和6mg/kg两种剂量。使用八(8)只小鼠用于每个治疗组。与对照物相比，缀合的条件活性抗EpCAM抗体(BAP-105.4-01-02、BAP-105.4-01-05和BAP-105.4-02-01)在剂量3mg/kg和6mg/kg下显著地降低了肿瘤的体积，但并未显著地降低动物的重量，从而表明缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体具有更有效的治疗和减少的副作用两者。参见图27A-27C。
实例16：人源化条件活性抗EpCAM抗体ADC在肿瘤微环境中的结合活性
将所选人源化条件活性抗EpCAM抗体与MMAE缀合，以产生抗体药物缀合物(ADC)。人源化条件活性抗EpCAM抗体为BAP-105.4-01-02、BAP-105.4-01-05和BAP-105.4-02-01。在pH 6.0下测量人源化条件活性抗EpCAM抗体缀合物的结合活性，以模拟肿瘤微环境中的pH，并且在正常生理pH 7.4下测量人源化条件活性抗EpCAM抗体缀合物的结合活性。非条件活性抗体也与MMAE缀合并用作阴性对照物。使用ELISA在不同的ADC浓度下测量缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体与重组人EpCAM细胞外结构域的结合活性。与在正常生理pH下的结合活性相比，ADC在肿瘤微环境pH下示出了更高的结合活性。参见图28A-28B。
实例17：人源化条件活性抗EpCAM抗体缀合物在抑制表达人EpCAM的Colo205细胞时的细胞毒性
实例16的ADC用于在肿瘤微环境pH 6.0和正常生理pH 7.4下治疗表达Colo205细胞的人EpCAM。ADC在肿瘤微环境pH值下诱导了比正常生理pH下更大的抑制率(IR％)。图29A-29B。
ADC还用于治疗Colo205细胞诱导的癌症异种移植模型。将Colo205细胞植入免疫缺陷小鼠中，以诱导体积为80-100mm3的肿瘤。将荷瘤动物随机分为每组8只小鼠的治疗组。使用两个其它阴性对照物用于治疗：媒剂和同种型匹配的对照ADC(同种型对照ADC)。以3mg/kg Q4Dx4(每四天四次)的剂量施用ADC。本发明的缀合的人源化条件活性抗EpCAM抗体在异种移植模型中实现了肿瘤完全消退。参见图29C。
实例18：人源化条件活性抗EpCAM抗体与人EpCAM的结合活性
使用模板抗体BAP 105-01-01作为对照物通过ELISA测量了人源化条件活性抗EpCAM抗体与人EpCAM的结合活性。参见图30A-30C。在此实例中使用的人源化条件活性抗EpCAM抗体如下：
Figure BDA0003401749080000741
表22中汇总了在pH 6.0和pH 7.4时人源化条件活性抗EpCAM抗体与人EpCAM结合的EC50值。
表22.人源化条件活性抗EpCAM抗体针对人EpCAM的IC50
Figure BDA0003401749080000742
实例19：人源化条件活性抗EpCAM抗体与cyno EpCAM的结合活性
类似地测量了人源化条件活性抗EpCAM抗体与cyno EpCAM的结合活性。参见图31A-31C。表23中汇总了实例18的人源化条件活性抗EpCAM抗体在pH6.0和pH 7.4时与cynoEpCAM结合的IC50。
表23.人源化条件活性抗EpCAM抗体针对cyno EpCAM的IC50
Figure BDA0003401749080000743
实例20：条件活性抗EpCAM抗体缀合物的细胞杀伤
将所选条件活性抗EpCAM抗体BAP-105-06-01和BAP-105-06-02与强效抗有丝分裂剂单甲基澳瑞他汀E(MMAE)缀合，以产生抗体药物缀合物(ADC)。使用抗体BAP-105-01-01作为非条件活性抗体对照物，并且使用B12作为阴性对照物。在pH值6.0、和7.4下测量EpCAM表达性Colo205细胞的体外细胞杀伤。参见图32A-32B。还确定了人源化条件活性抗EpCAM抗体对Colo205细胞的体外杀伤的IC50，并在下表24中示出。
表24.人源化条件活性抗EpCAM抗体用于体外杀伤Colo205细胞的IC50
Figure BDA0003401749080000751
实例21：双特异性单条件活性抗体
将不具有条件活性的抗EpCAM抗体与单链条件活性抗CD3抗体连接以形成对EpCAM和CD3均具有特异性的双特异性抗体(WT EpCAM×CAB-CD3BA-150-06-BF3(SEQ ID NO:35-38)。双特异性抗体用于治疗由冠科生物技术公司(Crown Bioscience(加利福尼亚州圣迭戈))生产的MiXeno小鼠模型中的肿瘤异种移植小鼠模型。具体地，将结肠癌细胞系HCT116细胞(EpCAM阳性)植入移植有人外周血单核细胞的三重免疫缺陷小鼠中，以在小鼠模型中诱导肿瘤。当肿瘤体积达到约150mm3时，将荷瘤动物随机分为4个治疗组。四个治疗组分别用媒剂作为阴性对照物(第1组)、非CAB-CD3基准抗体BA-150-06-BF1(SEQ ID NO：31-34)作为阳性对照物(第2组)、双特异性抗体BA-150-06-BF3(第3组)或同种型匹配的抗体作为阴性对照物(第4组)来进行治疗。以每两周2.5mg/kg的剂量施用抗体，持续4周。
双特异性抗体WT EpCAM×CAB-CD3 BA-150-06-BF3与阳性对照物非CAB-CD3基准抗体BA-150-06-BF1在异种移植小鼠模型中引起肿瘤完全消退中一样有效，而两个阴性对照物未能引起肿瘤消退并且阴性对照组的肿瘤大小持续增加。参见图32A。
抗CD3抗体通常具有造成外周循环系统中的T细胞激活的副作用，这可以使用MesoScale Discovery(MSD)测定通过血清INF-γ水平进行测量。参见图32B。与阳性对照物非CAB-CD3基准抗体BA-150-06-BF1相比，双特异性抗体WT EpCAM×CAB-CD3 BA-150-06-BF3使T细胞激活显著减少。参见图32B。因此，与阳性对照物非CAB-CD3基准抗体BA-150-06-BF1相比，双特异性抗体WT EpCAM×CAB-CD3 BA-150-06-BF3由于具有条件活性抗CD3抗体组分而使副作用显著减少但具有相当的治疗效果。
实例22：双特异性双条件活性抗体
将条件活性抗EpCAM抗体与单链条件活性抗CD3抗体连接以形成对EpCAM和CD3均具有特异性的双条件活性双特异性抗体(CAB EpCAM×CAB-CD3 BA-150-16-01-02-BF45——SEQ ID NO:47-50)。还通过将不具有条件活性的抗EpCAM抗体与单链条件活性抗CD3抗体连接以形成对EpCAM和CD3均具有特异性的双特异性抗体(WT EpCAM×CAB-CD3 BA-150-15-01-03-BF46–SEQ ID NO:43-46)来制备单条件活性双特异性抗EpCAM抗体。双特异性抗体BA-150-16-01-02-BF45和BA-150-15-01-03-BF46用于治疗由冠科生物技术公司(加利福尼亚州圣迭戈)生产的MiXeno小鼠模型中的肿瘤异种移植小鼠模型。具体地，将结肠癌细胞系HCT116细胞(EpCAM阳性)植入移植有人外周血单核细胞的三重免疫缺陷小鼠中，以在小鼠模型中诱导肿瘤。当肿瘤体积达到约150mm3时，将荷瘤动物随机分为五个治疗组。五个治疗组分别用媒剂作为阴性对照物(第1组)、非CAB-CD3基准抗体BA-150-15-01-03-BF1(SEQ ID NO:39-42)作为阳性对照物(第2组)、双条件活性双特异性抗体CAB EpCAM×CAB-CD3 BA-BA-150-16-01-02-BF45(第3组)、同种型匹配的抗体作为阴性对照物(第4组)或单条件活性双特异性抗体WT EpCAM×CAB-CD3 BA-150-15-01-03-BF46(第5组)来进行治疗。以每两周2.5mg/kg的剂量施用抗体，持续4周。
双条件活性双特异性抗体CAB EpCAM×CAB-CD3 BA-150-16-01-02-BF45与阳性对照物非CAB-CD3基准抗体BA-150-15-01-03-BF1在异种移植小鼠模型中引起肿瘤完全消退中一样有效，而两个阴性对照物未能引起肿瘤消退并且阴性对照组的肿瘤大小持续增加。双条件活性双特异性抗体CAB EpCAM×CAB-CD3BA-150-16-01-02-BF45比单条件活性双特异性抗体WT EpCAM×CAB-CD3BA-150-15-01-03-BF46略微更有效。参见图33。
针对野生型WT EpCAM×WT CD3 BA-150-06-BF1抗体，测试了单条件活性双特异性抗体WT EpCAM×CAB-CD3 BA-150-06-BF3，以确定毒性、对白介素-6(IL6)水平的影响和对CD3+水平的影响。结果示出于图34中。如从这些结果可以看到的，单条件活性双特异性抗体WT EpCAM×CAB-CD3 BA-150-06-BF3的毒性显著低于野生型WT EpCAM×WT CD3 BA-150-06-BF1抗体。而且，单条件活性双特异性抗体WT EpCAM×CAB-CD3 BA-150-06-BF3在测试的第2天使不需要的IL-6的水平显著地更低并且CD3+显著地改善的减少，从而示出了肿瘤治疗的有效性。
抗体、重链可变区和轻链可变区以及抗CD3 scFv的序列如下：
SEQ ID NO:31＝BA-150-06-BF1-VK(抗EpCAM)
SEQ ID NO:32＝BA-150-06-BF1轻链
SEQ ID NO:33＝BA-150-06-BF1-抗CD3-scFv
SEQ ID NO:34＝BA-150-06-BF1-VH(抗EpCAM)
SEQ ID NO:35＝BA-150-06-BF3-VK(抗EpCAM)
SEQ ID NO:36＝BA-150-06-BF3轻链
SEQ ID NO:37＝BA-150-06-BF3-抗CD3-scFv
SEQ ID NO:38＝BA-150-06-BF3-VH(抗EpCAM)
SEQ ID NO:39＝BA-150-15-01-03-BF1-VK(抗EpCAM)
SEQ ID NO:40＝BA-150-15-01-03-BF1轻链
SEQ ID NO:41＝BA-150-15-01-03-BF1抗CD3-scFv
SEQ ID NO:42＝BA-150-15-01-03-BF1-VH(抗EpCAM)
SEQ ID NO:43＝BA-150-15-01-03-BF46-VK(抗EpCAM)
SEQ ID NO:44＝BA-150-15-01-03-BF46轻链
SEQ ID NO:45＝BA-150-15-01-03-BF46-抗CD3-scFV
SEQ ID NO:46＝BA-150-15-01-03-BF46-VH(抗EpCAM)
SEQ ID NO:47＝BA-150-16-01-02-BF45-VK(抗EpCAM)
SEQ ID NO:48＝BA-150-16-01-02-BF45轻链
SEQ ID NO:49＝BA-150-16-01-02-BF45-抗CD3-scFv
SEQ ID NO:50＝BA-150-16-01-02-BF45-VH(抗EpCAM)
VK序列是用于EpCAM结合的轻链可变结构域。
轻链序列是包含用于EpCAM结合的VK轻链可变结构域、κ恒定区和抗CD3-scFv的全长轻链。
抗CD3-scFv序列是抗CD3-scFv结构域。
VH序列是用于EpCAM结合的重链可变结构域。
实例23：表位作图
人/小鼠EpCAM-ECD嵌合体的构建和测试
克隆与人和食蟹猴EpCAM细胞外结构域牢固结合，但不与小鼠EpCAM-ECD交叉反应。为了鉴定人EpCAM-ECD上的结合区，构建了四个嵌合的人/小鼠EpCAM-ECD分子。通过PCR将人EpCAM-ECD的片段置换为小鼠EpCAM-ECD的碎片。如图35所示，各个小鼠片段用黑色竖直线指示。在图35的序列比对中，使用人EpCAM-ECD(顶图)作为参考。其它分子中相同的氨基酸示出为点，仅示出了氨基酸差异。比对中的氨基酸编号与图39所示的PDB条目4mvz中的编号相匹配。
在CHO细胞中用C末端His标签表达并纯化人、小鼠和四个嵌合EpCAM细胞外结构域。通过ELISA来确定克隆BA-105-04-01-05与不同的EpCAM ECD的结合。
观察到与人EpCAM-ECD和嵌合分子2、3和4有良好结合。如图36所示，未观察到与嵌合EpCAM-ECD 1(ch1EpCAM-his)和小鼠EpCAM-ECD结合。ELISA数据清楚地示出了，BA-105-04-01-05的结合区在人EpCAM的紧凑的富含半胱氨酸的N结构域(残基24-62)内，如图37所示。
人EpCAM-ECD突变体的构建和测试
为了提高表位分析的分辨率，基于人、食蟹猴与小鼠EpCAM-ECD.N结构域之间的序列差异将突变引入人EpCAM中。构建并测试了总共七个突变体(M1-M7)。在图37所示的序列比对中，使用人EpCAM-ECD(顶图)作为参考。其它分子中相同的氨基酸示出为点，并且因此仅示出了氨基酸差异。比对中的氨基酸编号与图39所示的PDB条目4mvz中的编号相匹配。
将残基25/26和/或51改变为小鼠序列稍微减少了结合，同时改变残基36/37完全消除了结合。这表明残基25/26是主要的接触点(在图39所示的结构中用红色标记)。这两个残基在表面上侧接残基25/26和51(图39中用橙色标记)，从而表明BA-105-04-01-05识别出人EpCAM细胞外结构域的N结构域内的非线性表位。
在实例中使用的方法
使用以下方案执行ELISA测定：
1)在碳酸盐-碳酸氢盐涂覆缓冲液中用100μL 0.5μg/mL(06_20_17和06_28_17实验)或1μg/mL(07_06_17和07_11_17实验)重组EpCAM抗原涂覆ELISA板
2)用密封薄膜覆盖板并在4℃下温育过夜
3)倾析板并在一叠纸巾上敲出残留的液体
4)通过根据样品图将200μL各种pH温育缓冲液分配到孔中并完全抽出内容物将孔洗涤两次
5)根据样品图向孔添加200μL各种pH温育缓冲液。用密封薄膜覆盖并在室温下将板放置在板振荡器上(设置为200rpm)，持续60分钟
6)倾析板并在一叠纸巾上敲出残留的液体。
7)将各种pH温育缓冲液中的测试物质连续稀释到250ng/mL、100ng/mL或25ng/mL。
8)根据样品图将100微升/孔的经过稀释的测试物质添加到板。
9)用密封薄膜覆盖并在室温下将板放置在板振荡器上(设置为200rpm)，持续60分钟。
10)倾析板并在一叠纸巾上敲出残留的液体。
11)通过根据样品图将200μL各种pH洗涤缓冲液分配到孔中并完全抽出内容物将孔洗涤三次
12)在各种pH温育缓冲液中以1:2500稀释HRP第二抗体
13)根据样品图将在各种pH温育缓冲液中经过稀释的100μL HRP第二抗体添加到每个孔。
14)用密封薄膜覆盖并在室温下将板放置在板振荡器上(设置为200rpm)，持续60分钟。
15)倾析板并在一叠纸巾上敲出残留的液体。
16)根据样品图通过将200μL各种pH洗涤缓冲液分配到孔中并完全抽出内容，将孔洗涤三次
17)将每孔50μL TMB底物溶液分配到板的所有孔中。在室温下温育3分钟。
18)将每孔50μL 1N HCl添加到板的所有孔中。使用Molecular DeviceSpectraMax190酶标仪在450nm处读板。
19)测量OD450 nm原始数据。
20)使用Softmax Pro软件(美谷分子仪器有限公司(Molecular Devices))针对缓冲液的pH在不同的pH值下将平均OD值(来自2个重复)制图。使用内置在软件中的4参数模型进行曲线拟合。pH曲线的拐点(50％的结合活性)等于拟合方程的参数C。将pH 6.0时的结合活性设为100％。使用Softmax Pro软件的“InterpX”函数从拟合曲线内插用于90％结合活性的pH。
使用以下方案执行表面等离子体共振(SPR)测定：
SPR 2/4仪器、SPR亲和力传感器——胺平(Amine Flat)和固定缓冲液试剂盒是由塞拉传感器公司(Sirra Sensors)制造的。SPR传感器含有四个流通池(FC1-FC4)，每个流通池可以被单独寻址或成组寻址。将EpCAM细胞外结构域固定在FC2和FC4中，通过将BSA固定在FC1和FC3(对照表面)中。
按照供应商建议的方案进行固定：
(1)通过在注射前立即混合200mM EDC和50mM NHS(塞拉传感器公司)来制备激活剂。用混合物以25微升/分钟的流速将胺传感器芯片激活480秒。
(2)将含25mg/mL人EpCAM的10mM NaAc(pH 5.0)以25微升/分钟的流速分别注入FC2和FC4，持续480秒。用流经FC1-4的1M乙醇胺-HCl(塞拉传感器公司)以25微升/分钟的流速将芯片表面失活480秒。
(3)使用相同的条件将对照表面激活和失活，但不注射蛋白质。
(4)在注射分析物之前，将运行缓冲液切换到具有所需pH的PBST。在第一次注射分析物之前，用运行缓冲液平衡仪器，持续1小时。
(5)所有分析物注射均在25℃下以25微升/分钟进行
使用没有固定蛋白的流通池1(或3)作为用于参考减法的对照表面。另外，从每次运行中减去仅使用缓冲液作为分析物(0nM分析物)的数据。使用1:1结合模型，用提供的分析软件Analyzer R2(塞拉传感器公司)拟合减去两次的数据。使用分子量146kDa来计算分析物的摩尔浓度。
使用以下方案执行荧光激活细胞分选(FACS)测定。
细胞染色，以确定人或食蟹猴EpCAM的表面表达
1)将3×106个细胞接种到T-75烧瓶中并根据供应商的说明进行培养。
2)在FACS分析当天，去除并丢弃培养基。
3)用PBS溶液短暂地冲洗细胞层。
4)将1.5mL Detachin溶液添加到每个T-75烧瓶中。等待到细胞层分散为止。
5)添加4.5mL用于对应的细胞系的培养基并通过轻轻地移液来重悬细胞。
6)聚拢细胞，并将细胞悬浮液转移到50-mL圆锥管。
7)用台盼蓝染色法对细胞进行计数，之后在4℃下以1500rpm离心5分钟。
8)用PBS洗涤细胞一次，并将3×105个细胞转移到Eppendorf管中。
9)将2μL小鼠抗EpCAM(PE缀合的小鼠IgG1)或PE同种型小鼠IgG1添加到每管含1％BSA的100μL PBS溶液中，并在冰上以100RPM振荡一小时。
10)用150μL PBS溶液洗涤细胞三次。
11)在环境温度下用4％PFA固定细胞10分钟，然后用PBS洗涤细胞一次。
12)将细胞重悬于100μL PBS中，并在NovoCyte流式细胞仪上分析细胞。
使用测试的抗体对表达人EpCAM或食蟹猴EpCAM的CHO细胞进行FACS分析。
1)收获细胞(如3.3，步骤1到7)，用PBS洗涤细胞一次。
2)以3×106个细胞/毫升的浓度将细胞重悬于pH 6.0或pH 7.4FACS缓冲液中。
3)将3×105个细胞等分到96孔U底板中的100μL pH 6.0或pH 7.4FACS缓冲液中。
4)旋降细胞并丢弃缓冲液。
5)在pH 6.0或pH 7.4FACS缓冲液中，从10μg/mL开始以3倍稀释度连续稀释测试物品。
6)将100微升/孔的经过稀释的测试物品添加到细胞、轻轻地充分混合并在冰上通过振荡(100rpm)温育一小时。
7)在4℃下以1500rpm离心细胞5分钟。用150μL pH 6.0或pH 7.4洗涤缓冲液来洗涤细胞两次。
8)在pH 6.0或pH 7.4FACS缓冲液中以1:300稀释山羊抗人IgG AF488抗体。
9)将来自上述步骤8)的100μL经过稀释的抗体添加到细胞并在冰上温育45分钟，避光保存。
10)沉淀细胞并用150μL pH 6.0或pH 7.4洗涤缓冲液洗涤三次。
11)在环境温度下用在1X PBS中稀释的4％PFA固定细胞10分钟，然后用1X PBS洗涤细胞。
12)将细胞重悬于100μL 1X PBS中。
13)使用Ex488nm/Em530nm用NovoCyte流式细胞仪分析细胞。收集至少20,000个细胞。
使用内置在GraphPad Prism软件版本7.03中的非线性拟合(可变斜率、四个参数)模型来分析FACS数据。
然而，应当理解，尽管在前面的描述中已经列出了本发明的许多特征和优点以及本发明的结构和功能的细节，但是本公开仅仅是说明性的，并且可以在本发明的原理内在表达所附权利要求书的术语的广泛一般含义所指示的最大程度上对细节作出改变，特别是在形状、大小和布置方面。
本文所提及的所有文件特此通过全文引用的方式或可替代地并入，以提供其所具体依赖的公开内容。申请人不打算将任何公开的实施例奉献给公众，并且在任何公开的修改或变更可以不字面上落入权利要求的范围内的程度上，根据等效原则，所述修改或变更被视为权利要求的一部分。
序列表
<110> 生物蛋白有限公司(BiatAtla LLC)
<120> 条件活性抗EPCAM抗体、抗体片段、其免疫缀合物以及其用途
<130> KHP212111818.5
<160> 50
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 1
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His
1 5 10
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<211> 17
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<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 变体
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<223> 此位置可以是Y或D
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Xaa Ile Arg Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
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Asp
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<211> 9
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<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 3
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 4
Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> 此位置可以是A或H
<400> 5
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1 5
<210> 6
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 变体
<222> (1)..(1)
<223> 此位置可以是H或E
<220>
<221> 变体
<222> (7)..(7)
<223> 此位置可以是H或E
<400> 6
Xaa Gln Trp Ser Thr Tyr Xaa Thr
1 5
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Arg Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Asp Asn Trp Val Gly Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 8
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Arg Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Asp Asn Trp Val Gly Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Arg Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Asp Gly Asp Asn Trp Val Gly Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 10
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Arg Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
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Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Gly Arg Gly Asp Asn Trp Val Gly Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr
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Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Tyr Ile Arg Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
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Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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Gly Arg Gly Asp Asn Trp Val Gly Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr
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Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Tyr Ile Arg Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Asp Asn Trp Val Gly Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Arg Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Asp Asn Trp Val Gly Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 14
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Glu Ile Ala Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Asp Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr His Thr Phe
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 15
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 15
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Glu Ile Ala Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Asp Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr His Thr Phe
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 16
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 16
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Glu Ile Ala Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Asp Tyr Phe Cys Glu Gln Trp Ser Thr Tyr His Thr Phe
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 17
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 17
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Glu Ile Ala Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Asp Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Glu Thr Phe
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 18
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 18
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Glu Thr Phe
85 90 95
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 19
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Glu Thr Phe
85 90 95
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 20
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 20
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile Glu Ser Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Glu Thr Phe
85 90 95
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 21
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 21
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Glu Thr Phe
85 90 95
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 22
Tyr Ile Arg Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 23
Asp Ile Arg Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 24
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 25
Ser Thr Ser Asn Leu His Ser
1 5
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 26
His Gln Trp Ser Thr Tyr His Thr
1 5
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 27
His Gln Trp Ser Thr Tyr Glu Thr
1 5
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 28
Glu Gln Trp Ser Thr Tyr His Thr
1 5
<210> 29
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 29
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Glu Thr Phe
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Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 30
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 30
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Glu Thr Phe
85 90 95
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 31
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 31
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Glu Ile Ala Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Asp Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr His Thr Phe
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 32
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 32
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Glu Ile Ala Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Asp Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr His Thr Phe
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser
100 105 110
Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala
115 120 125
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
130 135 140
Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser
145 150 155 160
Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr
165 170 175
Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys
180 185 190
Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
195 200 205
Arg Gly Glu Cys Ser Arg Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val
210 215 220
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
225 230 235 240
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val
245 250 255
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser
260 265 270
Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg
275 280 285
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met
290 295 300
Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His
305 310 315 320
Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
325 330 335
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
340 345 350
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu
355 360 365
Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr
370 375 380
Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro
385 390 395 400
Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
405 410 415
Trp Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala
420 425 430
Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
435 440 445
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
450 455 460
Thr Val Leu Ser Arg
465
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<211> 250
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 33
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
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Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
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Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
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Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
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Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Arg
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<213> 人工
<220>
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<213> 人工
<220>
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<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
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<223> 合成序列
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 43
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<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 44
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu
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Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Arg
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<211> 118
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<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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<213> 人工
<220>
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<400> 47
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<211> 469
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
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130 135 140
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165 170 175
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275 280 285
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met
290 295 300
Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His
305 310 315 320
Ser Asn Phe Gly Asn Ser Lys Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
325 330 335
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
340 345 350
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu
355 360 365
Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Ala
370 375 380
Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Asp Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro
385 390 395 400
Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
405 410 415
Trp Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala
420 425 430
Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
435 440 445
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
450 455 460
Thr Val Leu Ser Arg
465
<210> 49
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Ser Asn Phe Gly Asn Ser Lys Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gln Ala Val Val Thr
130 135 140
Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr
145 150 155 160
Cys Arg Ser Ser Ala Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Asp Asn Trp
165 170 175
Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr
180 185 190
Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu
195 200 205
Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu
210 215 220
Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly
225 230 235 240
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Arg
245 250
<210> 50
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 50
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Tyr Ile Arg Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Asp Asn Trp Val Gly Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115

Claims (51)

1.一种分离的多肽，其包括重链可变区和轻链可变区且与人EpCAM特异性地结合，其中所述重链可变区包含具有序列H1、H2和H3的三个互补决定区，其中：
所述H1序列是GYTFTSYWMH(SEQ ID NO:1)；
所述H2序列是X1IRPSTGYTEYNQKFKD(SEQ ID NO:2)；并且
所述H3序列是GDNWVGFAN(SEQ ID NO:3)；其中X1是Y或D；并且
所述轻链可变区包含具有序列L1、L2和L3的三个互补决定区，其中：
所述L1序列是SASSSISYMH(SEQ ID NO:4)；
所述L2序列是STSNLX2S(SEQ ID NO:5)；并且
所述L3序列是X3QWSTYX4T(SEQ ID NO:6)；其中X2是A或H；X3是H或E；并且X4是H或E；并且前提是X1、X2、X3和X4不能同时是Y、A、H和H。
2.根据权利要求1所述的分离的多肽，其中所述H2序列是YIRPSTGYTEYNQKFKD(SEQ IDNO:22)。
3.根据权利要求1所述的分离的多肽，其中所述H2序列是DIRPSTGYTEYNQKFKD(SEQ IDNO:23)。
4.根据权利要求1所述的分离的多肽，其中所述重链可变区具有选自SEQ ID NO:7-13的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的分离的多肽，其中所述L2序列是STSNLAS(SEQ ID NO:24)。
6.根据权利要求1所述的分离的多肽，其中所述L2序列是STSNLHS(SEQ ID NO:25)。
7.根据权利要求2到6中任一权利要求所述的分离的多肽，其中所述L3序列是HQWSTYHT(SEQ ID NO:26)。
8.根据权利要求2到6中任一权利要求所述的分离的多肽，其中所述L3序列是HQWSTYET(SEQ ID NO:27)。
9.根据权利要求2到6中任一权利要求所述的分离的多肽，其中所述L3序列是EQWSTYHT(SEQ ID NO:28)。
10.根据权利要求1或4所述的分离的多肽，其中所述轻链可变区具有选自SEQ ID NO:14-21的氨基酸序列。
11.一种抗EpCAM抗体或抗体片段，其包括一或多个根据权利要求1到10中任一权利要求所述的分离的多肽。
12.一种抗体或抗体片段，其与人EpCAM蛋白特异性地结合且包括重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含三个互补决定区，所述区具有序列H1、H2和H3，其中：
所述H1序列是GYTFTSYWMH(SEQ ID NO:1)；
所述H2序列是X1IRPSTGYTEYNQKFKD(SEQ ID NO:2)；并且
所述H3序列是GDNWVGFAN(SEQ ID NO:3)；
其中X1是Y或D，并且
所述轻链可变区包含三个互补决定区，所述区具有序列L1、L2和L3，其中：
所述L1序列是SASSSISYMH(SEQ ID NO:4)；
所述L2序列是STSNLX2S(SEQ ID NO:5)；并且
所述L3序列是X3QWSTYX4T(SEQ ID NO:6)；
其中X2是A或H；X3是H或E；并且X4是H或E；并且前提是X1、X2、X3和X4分别不能同时是Y、A、H和H。
13.根据权利要求12所述的抗体或抗体片段，其中所述H2序列是YIRPSTGYTEYNQKFKD(SEQ ID NO:22)。
14.根据权利要求12所述的抗体或抗体片段，其中所述H2序列是DIRPSTGYTEYNQKFKD(SEQ ID NO:23)。
15.根据权利要求12所述的抗体或抗体片段，其中所述重链可变区具有选自SEQ IDNO:7-13的氨基酸序列。
16.根据权利要求13到15中任一权利要求所述的抗体或抗体片段，其中所述L2序列是STSNLAS(SEQ ID NO:24)。
17.根据权利要求13到15中任一权利要求所述的抗体或抗体片段，其中所述L2序列是STSNLHS(SEQ ID NO:25)。
18.根据权利要求13到15中任一权利要求所述的抗体或抗体片段，其中所述L3序列是HQWSTYHT(SEQ ID NO:26)。
19.根据权利要求13到15中任一权利要求所述的抗体或抗体片段，其中所述L3序列是HQWSTYET(SEQ ID NO:27)。
20.根据权利要求13到15中任一权利要求所述的抗体或抗体片段，其中所述L3序列是EQWSTYHT(SEQ ID NO:28)。
21.根据权利要求12和15中任一权利要求所述的抗体或抗体片段，其中所述轻链可变区具有选自SEQ ID NO:14-21的氨基酸序列。
22.一种抗体或抗体片段，其包括重链可变区和轻链可变区，每个区分别独立地与选自以下的氨基酸序列对具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％一致性：SEQ ID NO:8和14、SEQ ID NO:9和14、SEQ ID NO:7和15、SEQ ID NO:7和16、SEQ ID NO:7和17、SEQ ID NO:11和20、SEQ ID NO:12和21、SEQ ID NO:11和18、SEQ ID NO:13和18以及SEQ ID NO:10和19；所述抗体或抗体片段与人EpCAM蛋白特异性地结合。
23.根据权利要求22所述的抗体或抗体片段，其中所述重链可变区和所述轻链可变区具有选自以下对的任何一对序列：SEQ ID NO:8和14、SEQ ID NO:9和14、SEQ ID NO:7和15、SEQ ID NO:7和16、SEQ ID NO:7和17、SEQ ID NO:11和20、SEQ ID NO:12和21、SEQ ID NO:11和18、SEQ ID NO:13和18、SEQ ID NO:10和19。
24.根据权利要求12到15、22和23中任一权利要求所述的抗体或抗体片段，其中与发生在非肿瘤微环境中的相同条件的不同值相比，所述抗体或抗体片段在肿瘤微环境中的条件的值下对EpCAM蛋白具有更高的结合亲和力。
25.根据权利要求24所述的抗体或抗体片段，其中所述条件是pH。
26.根据权利要求25所述的抗体或抗体片段，其中所述肿瘤微环境中的pH在5.0到6.8的范围内并且所述非肿瘤微环境中的pH在7.0到7.6的范围内。
27.根据权利要求24所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段在肿瘤微环境中的条件的值下对所述EpCAM蛋白的结合亲和力与在非肿瘤微环境中的相同条件的不同值下对所述EpCAM蛋白的结合亲和力的比率为至少约1.5:1、至少约2:1、至少约3:1、至少约4:1、至少约5:1、至少约6:1、至少约7:1、至少约8:1、至少约9:1、至少约10:1、至少约20:1、至少约30:1、至少约50:1、至少约70:1或至少约100:1。
28.根据权利要求12到15、22和23中任一权利要求所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体是多特异性抗体或抗体片段。
29.根据权利要求12到15、22和23中任一权利要求所述的抗体或抗体片段，其中所述抗体是双特异性抗体或抗体片段。
30.根据权利要求29所述的抗体或抗体片段，其中所述双特异性抗体或抗体片段包括抗CD3-ScFv。
31.一种双特异性抗体或抗体片段，其包括重链可变区和轻链可变区，每个区独立地与选自由SEQ ID NO:35、43和47组成的群组的VK区与选自由SEQ ID NO:37、45和49组成的群组的VH区的组合具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致性。
32.根据权利要求31所述的双特异性抗体或抗体片段，其包括与选自由以下组成的群组的轻链具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致性的轻链：SEQ ID NO:36、44和48。
33.根据权利要求31到32中任一权利要求所述的双特异性抗体或抗体片段，其包括与选自由以下组成的群组的抗CD3-scFv具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％一致性的抗CD3-scFv：SEQ ID NO:38、46和50。
34.一种免疫缀合物，其包括根据权利要求12到33中任一权利要求所述的抗体或抗体片段。
35.根据权利要求34所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包括至少一种选自化学治疗剂、放射性原子、细胞抑制剂和细胞毒性剂的药剂。
36.根据权利要求35所述的免疫缀合物，其包括至少两种所述药剂。
37.根据权利要求35到36中任一权利要求所述的免疫缀合物，其中所述至少一种药剂是放射性药剂。
38.根据权利要求37所述的免疫缀合物，其中所述放射性药剂选自α发射体、β发射体和γ发射体。
39.根据权利要求35到36中任一权利要求所述的免疫缀合物，其中所述抗体或抗体片段和所述至少一种药剂与连接体分子共价地结合。
40.根据权利要求35到36中任一权利要求所述的免疫缀合物，其中所述至少一种药剂选自美登木素生物碱、澳瑞他汀、海兔毒素、卡奇霉素、吡咯并苯并二氮杂卓和蒽环类。
41.一种药物组合物，其包括：
根据权利要求1到11中任一权利要求所述的多肽、根据权利要求12到33中任一权利要求所述的抗体或抗体片段或根据权利要求34到40中任一权利要求所述的免疫缀合物；以及
药学上可接受的载剂。
42.根据权利要求41所述的药物组合物，其进一步包括张力剂。
43.根据权利要求41所述的药物组合物，其作为单剂量包括约135mg、235mg、335mg、435mg、535mg、635mg、735mg、835mg、935mg、1035mg、1135mg、1235mg或1387mg的量的所述多肽、所述抗体或抗体片段或所述免疫缀合物。
44.根据权利要求41所述的药物组合物，其作为单剂量包括在135-235mg、235-335mg、335-435mg、435-535mg、535-635mg、635-735mg、735-835mg、835-935mg、935-1035mg、1035-1135mg、1135-1235mg或1235-1387mg范围内的量的所述多肽、所述抗体或抗体片段或所述免疫缀合物。
45.根据权利要求41到44中任一权利要求所述的药物组合物，其进一步包括免疫检查点抑制剂分子。
46.根据权利要求45所述的药物组合物，其中所述免疫检查点抑制剂分子是针对免疫检查点的抗体或抗体片段。
47.根据权利要求46所述的药物组合物，其中所述免疫检查点选自CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT、VISTA、BTLA、OX40、CD40、4-1BB、PD-1、PD-L1、GITR、B7-H3、B7-H4、KIR、A2aR、CD27、CD70、DR3和ICOS。
48.根据权利要求47所述的药物组合物，其中所述免疫检查点是CTLA4、PD-1或PD-L1。
49.根据权利要求45到48中任一权利要求所述的药物组合物，其进一步包括针对选自CTLA4、PD1、PD-L1、AXL、ROR2、CD3、HER2、B7-H3、ROR1、SFRP4和WNT蛋白的抗原的抗体或抗体片段。
50.一种根据权利要求1到11中任一权利要求所述的多肽、根据权利要求12到33中任一权利要求所述的抗体或抗体片段、根据权利要求34到40中任一权利要求所述的免疫缀合物或根据权利要求41到49中任一权利要求所述的药物组合物的用途，其用于制造用于治疗癌症的药剂。
51.一种用于诊断或治疗的试剂盒，所述试剂盒包括根据权利要求1到11中任一权利要求所述的多肽、根据权利要求12到33中任一权利要求所述的抗体或抗体片段或根据权利要求34到40中任一权利要求所述的免疫缀合物或根据权利要求41到49中任一权利要求所述的药物组合物以及用于使用所述抗体或抗体片段、所述免疫缀合物和/或所述药物组合物进行诊断或治疗的说明书。
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