JP2022531504A - 条件付きで活性な抗ｅｐｃａｍ抗体、抗体フラグメント、それらのイムノコンジュゲート、及びそれらの使用 - Google Patents

条件付きで活性な抗ｅｐｃａｍ抗体、抗体フラグメント、それらのイムノコンジュゲート、及びそれらの使用 Download PDF

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Abstract

ＥｐＣＡＭタンパク質に特異的に結合する重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域、ならびにＥｐＣＡＭタンパク質に結合する重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む抗体及び抗体フラグメントを有する単離ポリペプチド。ポリペプチドならびにポリペプチドを含む抗体及び抗体フラグメントを含む医薬組成物及びキットも提供される。【選択図】図４

Description

本開示は、抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗体フラグメントならびにそのような抗体及び抗体フラグメントのイムノコンジュゲート、ならびに診断方法及び治療方法における抗体、抗体フラグメント、及びイムノコンジュゲートの使用に関する。
上皮細胞接着／活性化分子（ＥｐＣＡＭ、また、ＣＤ３２６、ＨＥＡ１２５、ＭＫ－１、ＥＧＰ－２、ＥＧＰ３４、ＧＡ７３３－２、ＫＳＡ、ＴＲＯＰ－１、ＫＳ１／４、及びＥＳＡとして公知である）は、異なる起源の大半の癌腫でのその高レベルで頻繁な発現に起因して、癌治療における第１の最も重要な免疫療法標的の１つである（Ｈｅｒｌｙｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，７６：１４３８－１４４２，１９７９；Ｗｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ，３５：１２２－１２８，２００４）。この分子は、進化の間で高度に保存されている、長さ３１４アミノ酸（ａａ）の比較的小さなＩ型膜貫通型糖タンパク質である。それは、カルシウム非依存性の同型細胞間接着を媒介することが報告されている（Ｌｉｔｖｉｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２５：４３７－４４６，１９９４）。この分子は、α－アクチニンについての２つの結合部位がアクチン細胞骨格との相互作用のために存在している２６ａａの短い細胞外ドメイン（Ｂａｌｚａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１８（８）：４８３３－４８４３，１９９８）、２３－ａａ膜貫通ドメイン、２４２－ａａ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、及びその成熟形態から切断される２３－ａａシグナルペプチドからなる。ＥｐＣＡＭの細胞外ドメインは、３つのＮ連結グリコシル化部位を有する。正常組織と悪性組織の間の異なるグリコシル化状態が、特定の型の癌において報告されている（Ｐａｕｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ，１９３：２５－３２，２００３）。
細胞外ドメインは３つのドメインを含む。最初の２つは、１２のシステイン残基がその間に存在する上皮成長因子（ＥＧＦ）様リピートに似ていると考えられている（Ｂａｌｚａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２１：２５７０－２５８０，２００１）。しかし、一部の試験によって、ＥｐＣＡＭの第２のＥＧＦ様リピートが実際にはチログロブリン（ＴＹ）ドメインであることが示唆されている（Ｌｉｎｎｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８６：２７－３１，１９８９；Ｃｈｏｎｇ ａｎｄ Ｓｐｅｉｃｈｅｒ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７６：５８０４－５８１３，２００１）。第３のドメインは、任意の公知の分子とは無関係な固有のシステイン欠乏領域（ＣＰＲ）である（Ｂａｅｕｅｒｌｅ ａｎｄ Ｇｉｒｅｓ，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，９６：４１７－４２３，２００７）。ＥｐＣＡＭは、細胞間接着、細胞シグナル伝達、遊走、増殖、及び分化の防止において重要な役割を果たす（図１）。
ヒトにおけるＥｐＣＡＭ発現は上皮特異的である。ヒト上皮細胞の大部分がＥｐＣＡＭを発現するが、扁平上皮及び特定の上皮細胞型、例えば上皮ケラチノサイト、肝細胞、胃壁細胞、及び筋上皮細胞などを除く（Ｂａｌｚａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ，７７：６９９－７１２，１９９９；Ｍｏｍｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，４７：２８８３－２８９１，１９８７）。上皮起源の腫瘍では、一般的に、より高い発現レベルが観察される（Ｂａｌｚａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ，７７：６９９－７１２，１９９９；Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，１６３：２１３９－２１４８，２００３；Ｗｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ，３５：１２２－１２８，２００４；Ｗｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，９４：１２８－１３５，２００６）。例えば、ＥｐＣＡＭタンパク質は多種多様なヒト腺癌及び扁平上皮癌で発現されることが見出されている（Ｗｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｐａｔｈｏｌ，３５：１２２－１２８，２００４）。免疫組織化学（ＩＨＣ）染色をマイクロアレイ技術と一緒に使用した最近の試験によって、乳癌、卵巣癌、腎癌、食道癌、結腸癌、胃癌、前立腺癌、及び肺癌を伴う患者からのかなり多数のサンプル中でのＥｐＣＡＭ発現が発見されている（Ｓｐｉｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ，８６：２０７－２１３，２００４；Ｓｐｉｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ，１０３：４８３－４８８，２００６；Ｓｔｏｅｃｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ，６：１６５，２００６；Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ，３０：１７１－１７９，２００７；Ｗｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｓｕｒｇ Ｐａｔｈｏｌ，２９：８３－８８，２００５；Ｗｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，９４：１２８－１３５，２００６）。
データによって、ヒト癌の処置のための免疫療法標的としてのＥｐＣＡＭの潜在的な有用性が強調される。
上皮細胞は、ヒトの悪性腫瘍の発生において最も重要な細胞型であることが公知であり、全ての悪性腫瘍の９０％以上が上皮起源であるため（Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ａｎａｔｏｍｉｃａ，１５６ （３）：２１７－２２６，１９９６）、ＥｐＣＡＭは現在、最も頻繁に強く発現する腫瘍関連抗原の１つであると考えられている。この分子は、モノクローナル抗体の開発のための免疫原性腫瘍関連抗原として何度も独立して発見されてきた（Ｇｏｔｔｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，３８：４７－５３，１９８６；Ｅｄｗａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，４６：１３０６－１３１７，１９８６；Ｓｐｕｒｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，３８：６３１－６３６，１９８６；Ｍｏｍｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，４７：２８８３－２８９１，１９８７；Ｓｃｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１０２：９８７－９９１，１９９４；Ｂｕｍｏｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，７：４０７－４１５，１９８８；Ｑｕａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，９：３７７－３８７，１９９０）。
実際に、これまでにヒトの癌治療のために適用された最初のモノクローナル抗体は、実際には、ＥｐＣＡＭを標的化するｍＡｂ １７－１Ａ（後にエドレコロマブ及びＰａｎｏｒｅｘｓと名付けられた）と呼ばれるマウスＩｇＧ２ａ抗体であった（Ｓｅａｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，１（８２７５）：７６２－７６５，１９８２；Ｓｅａｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄ，３（２）：１３８－１５０，１９８４）。それ以降、エドレコロマブならびに他のＥｐＣＡＭ特異的マウス、キメラ、及びヒト化モノクローナル抗体がまた、天然（ネイキッド）抗体、ハイブリッド二重特異性（三機能性）抗体の形態において、あるいは毒素、放射性同位元素、又は癌処置のためのサイトカイン（ＩＬ－２又はＧＭ－ＣＳＦ）とのコンジュゲートとして前臨床的及び臨床的にテストされた（Ｖｅｌｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５４（７）：１７５３－１７５９，１９９４；Ｒａｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，５０（３）：１４１－１５０，２００１；Ｅｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ，１５０：１１１４－１１２２，１９９４；Ｄｉ Ｐａｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，９：２８３７－２８４８，２００３；Ａｎｄｒａｔｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２７（１Ａ）：４３１－４３６，２００７；Ｘｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５７（２１）：４９４８－４９５５，１９９７；Ｓｃｈａｎｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２９（５）：４７７－４８８，２００６；Ｗｉｍｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，１０５（２）：２４１－２４８，２００３；Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６８（１）：１４３－１５１，２００８）。現在まで、ＥｐＣＡＭを標的化する多数の異なる免疫療法アプローチが、依然として現在、臨床治験中である（Ｂａｅｕｅｒｌｅ ａｎｄ Ｇｉｒｅｓ，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，９６：４１７－４２３，２００７）。臨床治験からのデータによって、ネイキッド抗ＥｐＣＡＭ抗体、例えばエドレコロマブ（１７－１Ａ；Ｐａｎｏｒｅｘｓ）及びアデカツムマブ（ＭＴ２０１）などが、限られた抗腫瘍効果だけを有することが示唆されており（Ｐｕｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３６０：６７１－６７７，２００２）、恐らくは補体系（ＣＤＣ）の活性化及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）効果を通してである（Ｓｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇ，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ，４０（１）：１７－２４，２００１；Ｎａｕｎｄｏｒｆ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，１００（１）：１０１－１１０，２００２；Ｐｒａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，９２（２）：３４２－３４９，２００５；Ｏｂｅｒｎｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，４２（１５）：２５３０－２５３８，２００６）。非常に強力なエフェクター機構、例えばＩＬ－２、ＰＥ毒素、又は抗ＣＤ３などとコンジュゲートされた抗体は、より良好な抗腫瘍効果を有するように思われる。しかし、一部の有害効果によって、そのような抗ＥｐＣＡＭ抗体の全身的使用は限定される（Ｂａｅｕｅｒｌｅ ａｎｄ Ｇｉｒｅｓ，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，９６：４１７－４２３，２００７）。
ＩＮＧ－１は、ＥｐＣＡＭ陽性細胞を標的化する高親和性ヒト操作モノクローナル抗体である。それは、標準治療に抵抗性の進行腺癌を伴う患者における第Ｉ相臨床治験において使用されており、この試験からのデータは、ＥｐＣＡＭへの高い親和性を伴う抗体が、腫瘍細胞に対してより細胞傷害性である一方で、また、迅速な膵臓毒性損傷を誘導しうることを示唆し、このように、全身投与のためのそれらの治療ウィンドウが限定されている（Ｄｅ Ｂｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１０（２２）：７５５５－６５，２００４）。高親和性抗ＥｐＣＡＭ抗体の治療的使用に関連付けられる可能な全身毒性効果は、所与の時間に循環抗体を排除するための追跡工程を含む前標的化戦略により低下されうる。あるいは、高親和性抗ＥｐＣＡＭ抗体の使用は、局所領域処置に制限されうる。
公知の抗ＥｐＣＡＭ抗体の副作用は、腫瘍細胞と比較してより低い密度にもかかわらず、正常な上皮細胞上のＥｐＣＡＭの存在に関連付けられる（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１０：５４６４－５４７１，２００４；Ｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６４：５８１８－５８２４，２００４）。このように、抗ＥｐＣＡＭ抗体の親和性又は特異性を増加させることによって、ＥｐＣＡＭを発現する正常組織中での抗ＥｐＣＡＭ抗体の低下に導かれることはなく、それによって副作用が産生される。
本発明は、特に癌の診断及び処置のための、治療的及び診断的使用のために適切な、低下した又は最小限の副作用を伴う抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントを提供することを目的とする。これらの抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントの一部は、正常組織中に存在しているＥｐＣＡＭとの比較において、腫瘍中のＥｐＣＡＭへのより高い結合親和性を有しうる。これらの抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントは、典型的には、公知の抗ＥｐＣＡＭ抗体と少なくとも同等の有効性を有する。また、本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントは、正常組織中でのＥｐＣＡＭへの比較的低い結合親和性を有することが当技術分野において公知のモノクローナル抗ＥｐＣＡＭ抗体との比較において、低下した副作用を示しうる。これらの利点は、腫瘍についてのＥｐＣＡＭのより選択的な標的化を提供しうる、及び腫瘍中に存在しているＥｐＣＡＭについての抗体の選択性の結果として、これらの抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントのより高い投与量の使用が可能になりうるが、それにより、より有効な治療的処置を、望ましくない副作用における対応する増加を伴うことなく実現することができる。
一態様では、本発明は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合する単離ポリペプチドを提供する。
ポリペプチドは、配列Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３を有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域を含み、
Ｈ１配列はＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨ（配列番号１）であり；
Ｈ２配列はＸ1ＩＲＰＳＴＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２）であり；及び
Ｈ３配列はＧＤＮＷＶＧＦＡＮ（配列番号３）であり；
ここでＸ1はＹ又はＤである。
以前の実施形態では、Ｈ２配列はＹＩＲＰＳＴＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２２）でありうる、又はＨ２配列はＤＩＲＰＳＴＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２３）でありうる。
別の態様では、本発明は、上記の単離ポリペプチドのいずれかと、配列Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３を有する３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む単離ポリペプチドとの組み合わせにより形成される産物を含み、
Ｌ１配列はＳＡＳＳＳＩＳＹＭＨ（配列番号４）であり；
Ｌ２配列はＳＴＳＮＬＸ2Ｓ（配列番号５）であり；及び
Ｌ３配列はＸ3ＱＷＳＴＹＸ4Ｔ（配列番号６）であり、
ここでＸ2はＡ又はＨであり；Ｘ3はＨ又はＥであり；及びＸ4はＨ又はＥである。
別の態様では、本発明は、ＥｐＣＡＭ、特にヒトＥｐＣＡＭタンパク質に特異的に結合する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む単離ポリペプチドを提供し、重鎖可変領域は、配列Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３を有する３つの相補性決定領域を含み、
Ｈ１配列はＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨ（配列番号１）であり；
Ｈ２配列はＸ1ＩＲＰＳＴＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２）であり；及び
Ｈ３配列はＧＤＮＷＶＧＦＡＮ（配列番号３）であり；ここでＸ1はＹ又はＤであり；ならびに
軽鎖可変領域は、配列Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３を有する３つの相補性決定領域を含み、
Ｌ１配列はＳＡＳＳＳＩＳＹＭＨ（配列番号４）であり；
Ｌ２配列はＳＴＳＮＬＸ2Ｓ（配列番号５）であり；及び
Ｌ３配列はＸ3ＱＷＳＴＹＸ4Ｔ（配列番号６）であり；ここでＸ2はＡ又はＨであり；Ｘ3はＨ又はＥであり；及びＸ4はＨ又はＥであり；但し、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、及びＸ4は同時にＹ、Ａ、Ｈ、及びＨであることはできない。
以前の実施形態では、Ｈ２配列はＹＩＲＰＳＴＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２２）でありうる、又はＨ２配列はＤＩＲＰＳＴＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２３）でありうる。
以前の実施形態の各々では、Ｌ２配列はＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号２４）でありうる、又はＬ２配列はＳＴＳＮＬＨＳ（配列番号２５）でありうる。
以前の実施形態の各々では、Ｌ３配列はＨＱＷＳＴＹＨＴ（配列番号２６）でありうる、Ｌ３配列はＨＱＷＳＴＹＥＴ（配列番号２７）でありうる、又はＬ３配列はＥＱＷＳＴＹＨＴ（配列番号２８）でありうる。
以前の実施形態の各々では、重鎖可変領域は配列番号７～１３より選択される配列を有しうる。
以前の実施形態の各々では、軽鎖可変領域は配列番号１４～２１より選択される配列を有しうる。
別の実施形態では、本発明の単離ポリペプチドは、配列番号８及び１４、配列番号９及び１４、配列番号７及び１５、配列番号７及び１６、配列番号７及び１７、配列番号１１及び２０、配列番号１２及び２１、配列番号１１及び１８、配列番号１３及び１８、配列番号１０及び１９より選択される配列の任意の１対を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。
別の実施形態では、本発明の単離ポリペプチドは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、各々の領域が、それぞれ配列番号８及び１４、配列番号９及び１４、配列番号７及び１５、配列番号７及び１６、配列番号７及び１７、配列番号１１及び２０、配列番号１２及び２１、配列番号１１及び１８、配列番号１３及び１８、ならびに配列番号１０及び１９より選択されるアミノ酸配列の対と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の同一性を独立して有し；及び、前記単離ポリペプチドは、ヒトＥｐＣＡＭタンパク質に特異的に結合する。
別の態様では、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体又は抗体フラグメントを提供し、重鎖可変領域は、配列Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３を有する３つの相補性決定領域を含み、
Ｈ１配列はＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨ（配列番号１）であり；
Ｈ２配列はＸ1ＩＲＰＳＴＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２）であり；及び
Ｈ３配列はＧＤＮＷＶＧＦＡＮ（配列番号３）であり；ここでＸ1はＹ又はＤであり；ならびに
軽鎖可変領域は、配列Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３を有する３つの相補性決定領域を含み、
Ｌ１配列はＳＡＳＳＳＩＳＹＭＨ（配列番号４）であり；
Ｌ２配列はＳＴＳＮＬＸ2Ｓ（配列番号５）であり；及び
Ｌ３配列はＸ3ＱＷＳＴＹＸ4Ｔ（配列番号６）であり、
ここでＸ2はＡ又はＨであり；Ｘ3はＨ又はＥであり；Ｘ4はＨ又はＥであり；但し、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、及びＸ4はそれぞれ同時にＹ、Ａ、Ｈ、及びＨであることはできない。
以前の実施形態では、Ｈ２配列はＹＩＲＰＳＴＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２２）でありうる、又はＨ２配列はＤＩＲＰＳＴＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２３）でありうる。
以前の実施形態の各々では、Ｌ２配列はＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号２４）でありうる、又はＬ２配列はＳＴＳＮＬＨＳ（配列番号２５）でありうる。
以前の実施形態の各々では、Ｌ３配列はＨＱＷＳＴＹＨＴ（配列番号２６）でありうる、Ｌ３配列はＨＱＷＳＴＹＥＴ（配列番号２７）でありうる、又はＬ３配列はＥＱＷＳＴＹＨＴ（配列番号２８）でありうる。
以前の実施形態の各々では、重鎖可変領域は配列番号７～１３より選択されるアミノ酸配列を有しうる。
以前の実施形態の各々では、軽鎖可変領域は配列番号１４～２１より選択されるアミノ酸配列を有しうる。
以前の実施形態の各々では、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、配列番号８及び１４、配列番号９及び１４、配列番号７及び１５、配列番号７及び１６、配列番号７及び１７、配列番号１１及び２０、配列番号１２及び２１、配列番号１１及び１８、配列番号１３及び１８、配列番号１０及び１９より選択される配列の任意の１対を有しうる。
別の実施形態では、本発明の抗体又は抗体フラグメントは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、各々の領域が、それぞれ配列番号８及び１４、配列番号９及び１４、配列番号７及び１５、配列番号７及び１６、配列番号７及び１７、配列番号１１及び２０、配列番号１２及び２１、配列番号１１及び１８、配列番号１３及び１８、ならびに配列番号１０及び１９より選択されるアミノ酸配列の対と独立して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の同一性を有し；及び前記抗体又は抗体フラグメントは、ヒトＥｐＣＡＭタンパク質に特異的に結合する。
以前の実施形態の各々では、抗体又は抗体フラグメントは、非腫瘍微小環境において生じる同じ条件での異なる値との比較において、腫瘍微小環境における条件での値でＥｐＣＡＭタンパク質へのより高い結合親和性を有しうる。一実施形態では、条件はｐＨである。
以前の実施形態の各々では、抗体又は抗体フラグメントは、非腫瘍微小環境において生じる同じ条件での異なる値との比較において、腫瘍微小環境における条件での値でＥｐＣＡＭタンパク質へのより高い抗原結合活性を有しうる。一実施形態では、条件はｐＨである。
以前の実施形態の各々では、条件付きで活性な抗体又は抗体フラグメントは、ｐＨ６．０での親抗体又は抗体フラグメントの同じ抗原結合活性と比較し、ｐＨ６．０で少なくとも７０％の抗原結合活性を有しうる、及び条件付きで活性な抗体又は抗体フラグメントは、ｐＨ７．４での親抗体又は抗体フラグメントの同じ抗原結合活性と比較し、ｐＨ７．４で５０％未満、又は４０％未満、又は３０％未満、又は２０％未満、又は１０％未満の抗原結合活性を有しうる。抗原結合活性は、ＥｐＣＡＭタンパク質への結合又はＣＤ３への結合でありうる。
以前の実施形態の各々では、抗原結合活性は、ＥＬＩＳＡアッセイにより測定されうる。
さらに別の態様では、本発明は、上に記載する本発明の抗体又は抗体フラグメントのいずれかを含むイムノコンジュゲートを提供する。イムノコンジュゲートにおいて、抗体又は抗体フラグメントは、化学療法剤、放射性原子、細胞分裂阻害剤、及び細胞傷害性薬剤より選択される薬剤にコンジュゲートされうる。
さらに別の態様では、本発明は、ポリペプチド、抗体又は抗体フラグメント、あるいは上に記載する本発明のイムノコンジュゲートのいずれかを、医薬的に許容可能な担体と一緒に含む医薬組成物を提供する。
の医薬組成物の単一用量は、約１３５ｍｇ、２３５ｍｇ、３３５ｍｇ、４３５ｍｇ、５３５ｍｇ、６３５ｍｇ、７３５ｍｇ、８３５ｍｇ、９３５ｍｇ、１０３５ｍｇ、１１３５ｍｇ、１２３５ｍｇ、又は１３８７ｍｇのある量のポリペプチド、抗体又は抗体フラグメント、あるいはイムノコンジュゲートを含みうる。
の医薬組成物の単一用量は、１３５～２３５ｍｇ、２３５～３３５ｍｇ、３３５～４３５ｍｇ、４３５～５３５ｍｇ、５３５～６３５ｍｇ、６３５～７３５ｍｇ、７３５～８３５ｍｇ、８３５～９３５ｍｇ、９３５～１０３５ｍｇ、１０３５～１１３５ｍｇ、１１３５～１２３５ｍｇ、又は１２３５～１３８７ｍｇの範囲中のある量のポリペプチド、抗体又は抗体フラグメント、あるいはイムノコンジュゲートを含みうる。
前述の医薬組成物の各々は、免疫チェックポイント阻害剤分子をさらに含みうる。免疫チェックポイント阻害剤分子は、免疫チェックポイントに対する抗体又は抗体フラグメントでありうる。免疫チェックポイントは、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＧＩＴＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＤＲ３、及びＩＣＯＳより選択されうる、あるいは免疫チェックポイントは、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、又はＰＤ－Ｌ１でありうる。
前述の医薬組成物の各々は、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＡＸＬ、ＲＯＲ２、ＣＤ３、ＨＥＲ２、Ｂ７－Ｈ３、ＲＯＲ１、ＳＦＲＰ４、及びＷＮＴタンパク質より選択される抗原に対する抗体又は抗体フラグメントをさらに含みうる。ＷＮＴタンパク質は、ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、及びＷＮＴ１６より選択されうる。
さらに別の態様では、本発明は、ポリペプチド、抗体又は抗体フラグメント、あるいは上に記載する本発明のイムノコンジュゲートのいずれかを含む診断又は処置のためのキットを提供する。
図１は、癌の転移及び進行におけるＥｐＣＡＭの機能の概略図を示す。 図２は、本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体の例示的な重鎖可変領域の配列アラインメントを示す。 図３は、本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体の例示的な軽鎖可変領域の配列アラインメントを示す。 図４は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により測定された、異なる値のｐＨでの、ヒトＥｐＣＡＭへの、本発明の例示的な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図５Ａは、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により測定された、２つの異なる量の抗体についての、異なるｐＨの値での、ヒトＥｐＣＡＭを発現するＣｏｌｏ２０５細胞への本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図５Ｂは、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により測定された、２つの異なる量の抗体についての、異なるｐＨの値での、ヒトＥｐＣＡＭを発現するＣｏｌｏ２０５細胞への本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図５Ｃは、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により測定された、２つの異なる量の抗体についての、異なるｐＨの値での、ヒトＥｐＣＡＭを発現するＣｏｌｏ２０５細胞への本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図５Ｄは、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により測定された、２つの異なる量の抗体についての、異なるｐＨの値での、ヒトＥｐＣＡＭを発現するＣｏｌｏ２０５細胞への本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。。 図６Ａは、ＦＡＣＳにより測定された、２つの異なる量の抗体についての、異なる値のｐＨでの、ヒトＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞への本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図６Ｂは、ＦＡＣＳにより測定された、２つの異なる量の抗体についての、異なる値のｐＨでの、ヒトＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞への本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図６Ｃは、ＦＡＣＳにより測定された、２つの異なる量の抗体についての、異なる値のｐＨでの、ヒトＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞への本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図６Ｄは、ＦＡＣＳにより測定された、２つの異なる量の抗体についての、異なる値のｐＨでの、ヒトＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞への本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図７Ａは、ＥｐＣＡＭ発現Ｃｏｌｏ２０５細胞を死滅させるための、本発明のＭＭＡＥコンジュゲート抗ＥｐＣＡＭ抗体の細胞死滅活性を示す。 図７Ｂは、ＥｐＣＡＭ発現Ｃｏｌｏ２０５細胞を死滅させるための、本発明のＭＭＡＥコンジュゲート抗ＥｐＣＡＭ抗体の細胞死滅活性を示す。 図７Ｃは、ＥｐＣＡＭ発現Ｃｏｌｏ２０５細胞を死滅させるための、本発明のＭＭＡＥコンジュゲート抗ＥｐＣＡＭ抗体の細胞死滅活性を示す。 図８Ａは、本発明のコンジュゲート抗ＥｐＣＡＭ抗体を用いた、マウスにおける腫瘍異種移植片の処置の結果を示す。 図８Ｂは、本発明のコンジュゲート抗ＥｐＣＡＭ抗体を用いた、マウスにおける腫瘍異種移植片の処置の結果を示す。 図９Ａは、ＥＬＩＳＡにより測定された、ヒトＥｐＣＡＭへの、本発明のヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図９Ｂは、ＥＬＩＳＡにより測定された、ヒトＥｐＣＡＭへの、本発明のヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図９Ｃは、ＥＬＩＳＡにより測定された、ヒトＥｐＣＡＭへの、本発明のヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図９Ｄは、ＥＬＩＳＡにより測定された、ヒトＥｐＣＡＭへの、本発明のヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図９Ｅは、ＥＬＩＳＡにより測定された、ヒトＥｐＣＡＭへの、本発明のヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図１０は、ＥＬＩＳＡにより測定された、ｐＨ滴定下でのヒトＥｐＣＡＭへの、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図１１Ａは、ＥＬＩＳＡにより測定された、カニクイザルＥｐＣＡＭへの、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図１１Ｂは、ＥＬＩＳＡにより測定された、カニクイザルＥｐＣＡＭへの、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図１１Ｃは、ＥＬＩＳＡにより測定された、カニクイザルＥｐＣＡＭへの、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図１１Ｄは、ＥＬＩＳＡにより測定された、カニクイザルＥｐＣＡＭへの、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図１１Ｅは、ＥＬＩＳＡにより測定された、カニクイザルＥｐＣＡＭへの、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図１２は、ＥＬＩＳＡにより測定された、ｐＨ滴定下でのカニクイザルＥｐＣＡＭへの、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図１３Ａは、ＥＬＩＳＡにより測定された、異なる温度での熱処理後の、ｐＨ６．０での、ヒトＥｐＣＡＭへの、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図１３Ｂは、ＥＬＩＳＡにより測定された、異なる温度での熱処理後の、ｐＨ７．４での、ヒトＥｐＣＡＭへの、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図１４Ａは、ＦＡＣＳにより測定された、ヒトＥｐＣＡＭを発現するＣｏｌｏ２０５細胞への、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図１４Ｂは、ＦＡＣＳにより測定された、ヒトＥｐＣＡＭを発現するＣｏｌｏ２０５細胞への、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図１５Ａは、ＦＡＣＳにより測定された、ヒトＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞への、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図１５Ｂは、ＦＡＣＳにより測定された、ヒトＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞への、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図１６Ａは、ＦＡＣＳにより測定された、カニクイザルＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞への、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図１６Ｂは、ＦＡＣＳにより測定された、カニクイザルＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞への、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図１７Ａは、ＥＬＩＳＡにより測定された、ヒトＥｐＣＡＭへの、本発明の、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図１７Ｂは、ＥＬＩＳＡにより測定された、ヒトＥｐＣＡＭへの、本発明の、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図１８Ａは、ＥＬＩＳＡにより測定された、カニクイザルＥｐＣＡＭへの、本発明の、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図１８Ｂは、ＥＬＩＳＡにより測定された、カニクイザルＥｐＣＡＭへの、本発明の、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図１９Ａは、ｐＨ滴定を伴うＥＬＩＳＡにより測定された、ヒトＥｐＣＡＭへの、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図１９Ｂは、ｐＨ滴定を伴うＥＬＩＳＡにより測定された、カニクイザルＥｐＣＡＭへの、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図２０Ａは、ＥＬＩＳＡにより測定された、異なる温度での熱処理後の、ｐＨ６．０でのヒトＥｐＣＡＭへの、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図２０Ｂは、ＥＬＩＳＡにより測定された、異なる温度での熱処理後の、ｐＨ７．４でのヒトＥｐＣＡＭへの、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図２１Ａは、ＦＡＣＳにより測定された、ｐＨ６．０でのヒトＥｐＣＡＭを発現するＣｏｌｏ２０５細胞への、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図２１Ｂは、ＦＡＣＳにより測定された、ｐＨ７．４でのヒトＥｐＣＡＭを発現するＣｏｌｏ２０５細胞への、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図２２Ａは、ＦＡＣＳにより測定された、ｐＨ６．０でのヒトＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞への、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図２２Ｂは、ＦＡＣＳにより測定された、ｐＨ７．４でのヒトＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞への、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図２３Ａは、ＦＡＣＳにより測定された、ｐＨ６．０でのカニクイザルＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞への、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図２３Ｂは、ＦＡＣＳにより測定された、ｐＨ７．４でのカニクイザルＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞への、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図２４Ａは、ｐＨ６．０でのヒトＥｐＣＡＭを発現するＣｏｌｏ２０５細胞への、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の細胞死滅活性を示す。 図２４Ｂは、ｐＨ６．５でのヒトＥｐＣＡＭを発現するＣｏｌｏ２０５細胞への、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の細胞死滅活性を示す。 図２４Ｃは、ｐＨ７．４でのヒトＥｐＣＡＭを発現するＣｏｌｏ２０５細胞への、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の細胞死滅活性を示す。 図２５Ａは、ｐＨ６．０でのヒトＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞への、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の細胞死滅活性を示す。 図２５Ｂは、ｐＨ６．５でのヒトＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞への、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の細胞死滅活性を示す。 図２５Ｃは、ｐＨ７．４でのヒトＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞への、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の細胞死滅活性を示す。 図２６Ａは、ｐＨ６．０でのヒトＥｐＣＡＭを含まない２９３Ｆ細胞への、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の細胞死滅活性を示す。 図２６Ｂは、ｐＨ６．５でのヒトＥｐＣＡＭを含まない２９３Ｆ細胞への、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の細胞死滅活性を示す。 図２６Ｃは、ｐＨ７．４でのヒトＥｐＣＡＭを含まない２９３Ｆ細胞への、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の細胞死滅活性を示す。 図２７Ａは、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体を使用した腫瘍異種移植マウスの処置の結果を示す。 図２７Ｂは、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体を使用した腫瘍異種移植マウスの処置の結果を示す。 図２７Ｃは、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体を使用した腫瘍異種移植マウスの処置の結果を示す。 図２８Ａは、腫瘍微小環境におけるｐＨでの、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図２８Ｂは、通常の生理学的ｐＨでの、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図２９Ａは、ｐＨ６．０での、ヒトＥｐＣＡＭを発現するＣｏｌｏ２０５細胞の阻害におけるコンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の細胞傷害性を示す。 図２９Ｂは、ｐＨ７．４での、ヒトＥｐＣＡＭを発現するＣｏｌｏ２０５細胞の阻害におけるコンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の細胞傷害性を示す。 図２９Ｃは、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体を用いた腫瘍異種移植マウスの処置の腫瘍容積に対する効果を示す。 図３０Ａは、ＥＬＩＳＡにより測定された、ヒトＥｐＣＡＭへの、本発明の追加のヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図３０Ｂは、ＥＬＩＳＡにより測定された、ヒトＥｐＣＡＭへの、本発明の追加のヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図３０Ｃは、ＥＬＩＳＡにより測定された、ヒトＥｐＣＡＭへの、本発明の追加のヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図３０Ｄは、ヒトＥｐＣＡＭ発現Ｃｏｌｏ２０５細胞を死滅させるための、本発明のＭＭＡＥコンジュゲート抗ＥｐＣＡＭの条件付きで活性な抗体の細胞死滅活性を示す。 図３０Ｅは、ヒトＥｐＣＡＭ発現Ｃｏｌｏ２０５細胞を死滅させるための、本発明のＭＭＡＥコンジュゲート抗ＥｐＣＡＭの条件付きで活性な抗体の細胞死滅活性を示す。 図３１Ａは、ＥＬＩＳＡにより測定された、カニクイザルＥｐＣＡＭへの、追加のヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図３１Ｂは、ＥＬＩＳＡにより測定された、カニクイザルＥｐＣＡＭへの、追加のヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図３１Ｃは、ＥＬＩＳＡにより測定された、カニクイザルＥｐＣＡＭへの、追加のヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を示す。 図３１Ｄは、カニクイザルＥｐＣＡＭを発現するＨＥＫ２９３細胞を死滅させるための、本発明のＭＭＡＥコンジュゲート抗ＥｐＣＡＭの条件付きで活性な抗体の細胞死滅活性を示す。 図３１Ｅは、カニクイザルＥｐＣＡＭを発現するＨＥＫ２９３細胞を死滅させるための、本発明のＭＭＡＥコンジュゲート抗ＥｐＣＡＭの条件付きで活性な抗体の細胞死滅活性を示す。 図３２Ａは、賦形剤、非条件的に活性な抗体ベンチマークＢＡ－１５０－０６－ＢＦ１及びアイソタイプコントロールとの比較における、本発明の二重特異性抗体（ＷＴ ＥｐＣＡＭ ｘ ＣＡＢ－ＣＤ３ ＢＡ－１５０－０６－ＢＦ３）による腫瘍異種移植マウスの処置についての平均腫瘍容積を示す。 図３２Ｂは、賦形剤、非条件的に活性な抗体ベンチマークＢＡ－１５０－０６－ＢＦ１及びアイソタイプコントロールとの比較における、本発明の二重特異性抗体（ＷＴ ＥｐＣＡＭ ｘ ＣＡＢ－ＣＤ３ ＢＡ－１５０－０６－ＢＦ３）による末梢循環系における低下したＴ細胞活性化を示す。 図３３は、賦形剤、非条件的に活性な抗体ベンチマークＢＡ－１５０－１５－０１－０３－ＢＦ１及びアイソタイプコントロールとの比較における、本発明の単一条件的に活性な二重特異性抗体（ＷＴ ＥｐＣＡＭ ｘ ＣＡＢ－ＣＤ３ ＢＡ－１５０－１５－０１－０３－ＢＦ４６）及び本発明の二重条件的に活性な二重特異性抗体（ＣＡＢ ＥｐＣＡＭ ｘ ＣＡＢ－ＣＤ３ ＢＡ－１５０－１６－０１－０２－ＢＦ４５）による腫瘍異種移植マウスの処置についての平均腫瘍容積を示す。 図３４は、単一条件的に活性な二重特異性抗体ＷＴ ＥｐＣＡＭ ｘ ＣＡＢ－ＣＤ３ ＢＡ－１５０－０６－ＢＦ３を、野生型ＷＴ ＥｐＣＡＭ ｘ ＷＴ ＣＤ３ ＢＡ－１５０－０６－ＢＦ１抗体に対して、毒性、インターロイキン－６（ＩＬ６）レベルに対する効果及びＣＤ３＋レベルに対する効果についてテストした結果を示す。 図３５は、構築された４つのキメラヒト／マウスＥｐＣＡＭ－ＥＣＤ分子についての配列アラインメントを示し、ヒトＥｐＣＡＭ－ＥＣＤ（上）を参照として使用している。アミノ酸の違いだけを示している。アラインメント中のアミノ酸ナンバリングは、図３９中に示すＰＤＢエントリー４ｍｖｚ中のナンバリングと一致する。 図３６は、ＥＬＩＳＡにより決定された、異なるＥｐＣＡＭ ＥＣＤへの抗ＥｐＣＡＭクローンＢＡ－１０５－０４－０１－０５（また、ＢＡＰ－１０５．４－０１－０５として言及される）についての結合データを示す。 図３７は、ヒトＥｐＣＡＭのコンパクトでシステインに富むＮドメイン（残基２４～６２）内のＢＡ－１０５－０４－０１－０５についての結合領域及び抗ＥｐＣＡＭクローンＢＡ－１０５－０４－０１－０５の７つの変異体（Ｍ１～Ｍ７）についての結合領域を示す。アラインメント中のアミノ酸ナンバリングは、図３９中に示すＰＤＢエントリー４ｍｖｚ中のナンバリングと一致する。 図３８は、ＥＬＩＳＡにより決定された、ｈｕＥｐＣＡＭへの７つの変異体Ｍ１～Ｍ７についての結合データを示す。 図３９は、Ｐａｖｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎ．（２０１４）におけるように、アミノ酸ナンバリングを使用してｈｕＥｐＣＡＭ構造上にマッピングされたエピトープ及びＰｙＭｏｌを用いて可視化されたＰＤＢエントリー４ｍｚｖからの構造を示す。
定義
本明細書中で提供する実施例の理解を促すために、特定の頻繁に出る用語を本明細書中で定義する。
測定量に関連して、本明細書中で使用する用語「約」は、測定を行い、測定の目的及び使用される測定機器の精度と釣り合うレベルのケアを行う当業者により予想されうる、その測定量における通常の変動を指す。別に示さない限り、「約」は、提供された値の＋／－１０％の変動を指す。
本明細書中で使用する用語「親和性」は、分子（例、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例、抗原）の間での非共有結合的な相互作用の合計の強さを指す。別に示さない限り、本明細書中で使用するように、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例、抗体及び抗原）間での１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。パートナーＹについての分子Ｘの親和性は、一般的に、解離定数（Ｋｄ）により表すことができる。親和性は、本明細書中に記載するものを含む、当技術分野において公知の一般的な方法により測定することができる。結合親和性を測定するための特定の例証的及び例示的な実施形態を以下に記載する。
本明細書中で使用する用語「親和性成熟」抗体は、そのような変化を持たない親抗体と比較し、１つ又は複数の重鎖又は軽鎖可変領域中に１つ又は複数の変化を伴う抗体を指し、そのような変化は、抗原についての抗体の親和性における改善をもたらす。
本明細書中で使用する用語「アミノ酸」は、好ましくは、遊離基として、又は、あるいは縮合後に、ペプチド結合の一部として、アミノ基（－－ＮＨ２）及びカルボキシル基（－－ＣＯＯＨ）を含む任意の有機化合物を指す。「２０の天然にコードされたポリペプチド形成アルファ－アミノ酸」は当技術分野において理解されており、アラニン（ａｌａ又はＡ）、アルギニン（ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（ａｓｐ又はＤ）、システイン（ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン酸（ｇｌｕ又はＥ）、グルタミン（ｇｉｎ又はＱ）、グリシン（ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（ｌｅｕ又はＬ）、リジン（ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（ｐｒｏ又はＰ）、セリン（ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（ｔｉｐ又はＷ）、チロシン（ｔｙｒ又はＹ）、及びバリン（ｖａｌ又はＶ）を指す。
本明細書中で使用する用語「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン分子、ならびに抗原のエピトープに結合することが可能である免疫グロブリン分子のフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、及びＳＣＡフラグメントなどを指す。これらの抗体フラグメントは、それらが由来する抗体の抗原（例、ポリペプチド抗原）に選択的に結合する特定の能力を保持し、当技術分野において周知の方法を使用して作ることができ（例、上記のＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅを参照のこと）、及び以下のようにさらに記載する。抗体は、免疫親和性クロマトグラフィーにより分取量の抗原を単離するために使用することができる。そのような抗体の種々の他の使用は、疾患（例、新生物）を診断及び／又は病期分類することであり、ならびに疾患、例えば、新生物、自己免疫疾患、ＡＩＤＳ、心血管疾患、感染症などを処置するための治療的適用のためである。キメラ抗体、ヒト様抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト抗体は、ヒト患者への投与のために特に有用である。本発明の抗体及び抗体フラグメントは、同じ型の活性、例えば、ＥｐＣＡＭタンパク質への結合活性又は親和性を有する親抗体又は抗体フラグメントの進化又は変異により得ることができる。
Ｆａｂフラグメントは、抗体分子の一価の抗原結合フラグメントからなり、酵素パパインを用いた抗体分子全体の消化により産生され、インタクトな軽鎖及び重鎖の一部からなるフラグメントをもたらすことができる。
抗体分子のＦａｂ’フラグメントは、ペプシンを用いて抗体分子全体を処理し、それに続く還元により得ることができ、インタクトな軽鎖及び重鎖の一部からなる分子をもたらす。２つのＦａｂ’フラグメントが、この様式において処理された抗体分子当たりで得られる。
抗体の（Ｆａｂ’）２フラグメントは、酵素ペプシンを用いて抗体分子全体を処理することにより得ることができ、その後の還元を伴わない。（Ｆａｂ’）２フラグメントは、２つのＦａｂ’フラグメントの二量体であり、２つのジスルフィド結合により保持されている。
Ｆｖフラグメントは、２本の鎖として発現される軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域を含む遺伝子操作されたフラグメントとして定義する。
本明細書中で使用する用語「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）2；ダイアボディ；線形抗体；単鎖抗体分子（例、ｓｃＦｖ）；及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を含むが、それらに限定しない。
本明細書中で使用する用語「抗ＥｐＣＡＭ抗体」、「ＥｐＣＡＭ抗体」、及び「ＥｐＣＡＭに結合する抗体」は、抗体がＥｐＣＡＭを標的化する際に診断用薬剤及び／又は治療用薬剤として有用であるように、十分な親和性を伴ってＥｐＣＡＭに結合することが可能な抗体を指す。一実施形態では、無関係の非ＥｐＣＡＭタンパク質への抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定されるように、ＥｐＣＡＭへの抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、ＥｐＣＡＭに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例、１０-8Ｍ又はそれ未満、例、１０-8Ｍ～１０-13Ｍ、例、１０-9Ｍ～１０-13Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。特定の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ抗体は、異なる種からのＥｐＣＡＭの間で保存されているＥｐＣＡＭのエピトープ、例えば、ＥｐＣＡＭの細胞外ドメインに結合する。
本明細書中で使用する用語「結合」は、抗体の可変領域又はＦｖと抗原との相互作用を指し、この相互作用は、抗原上の特定の構造（例、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存する。例えば、抗体可変領域又はＦｖは、一般的にタンパク質よりむしろ、特定のタンパク質構造を認識して結合する。本明細書中で使用するように、用語「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｉｎｇ）」又は「特異的に結合する（ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」は、抗体可変領域又はＦｖが、他のタンパク質よりも特定の抗原とより頻繁に、より迅速に、より大きな持続時間を伴い及び／又はより大きな親和性を伴い結合又は会合することを意味する。例えば、抗体可変領域又はＦｖは、それが他の抗原に結合するよりも、より大きな親和性、結合力を伴い、より容易に、及び／又はより大きな持続時間を伴いその抗原に特異的に結合する。別の例では、抗体可変領域又はＦｖは、それが関連タンパク質もしくは他の細胞表面タンパク質、又は多反応性天然抗体により一般的に認識される抗原に結合するよりも、実質的により大きな親和性を伴い細胞表面タンパク質（抗原）に結合する（即ち、ヒトにおいて自然に見出される多様な抗原に結合することが公知である天然抗体による）。しかし、「特異的に結合する」は、必ずしも別の抗原の排他的な結合又は検出不可能な結合を要求せず、これは用語「選択的結合」により意味される。１つ例では、抗原に結合する抗体可変領域又はＦｖ（又は他の結合領域）の「特異的結合」は、抗体可変領域又はＦｖが、１００ｎＭ又はそれ未満、例えば５０ｎＭ又はそれ未満など、例えば、２０ｎＭ又はそれ未満、例えば１５ｎＭ又はそれ未満、あるいは１０ｎＭ又はそれ未満、あるいは５ｎＭ又はそれ未満、２ｎＭ又はそれ未満、あるいは１ｎＭ又はそれ未満などの平衡定数（ＫＤ）を伴い抗原に結合することを意味する。
本明細書中で使用する用語「癌」及び「癌性」は、典型的には、無制御な細胞成長／増殖により特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を指す、又は記載する。癌の例は、癌腫、リンパ腫（例、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、及び白血病を含むが、それらに限定しない。そのような癌のより具体的な例は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝細胞癌、白血病及び他のリンパ増殖性疾患、ならびに種々の型の頭頸部癌を含む。
本明細書中で使用する用語「細胞増殖性障害」及び「増殖性障害」は、ある程度の異常な細胞増殖に関連付けられる障害を指す。一実施形態では、細胞増殖性障害は癌である。
本明細書中で使用する用語「化学療法剤」は、癌の処置において有用な化学的化合物を指す。化学療法剤の例は、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））など；アルキルスルホン酸塩、例えばブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファンなど；アジリジン、例えばベンゾドーパ、カルボクオン、メチュレドーパ、及びウレドパなど；エチレンイミン及びメチルアメラミン（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、及びトリメチロメラミンを含む）；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；デルタ－９－テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；ベータ－ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ－１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン、及び９－アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ－２１８９及びＣＢ１－ＴＭ１を含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコディクチン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなど；ニトロソウレア、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムヌスチンなど；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質など（例、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１（例、Ｎｉｃｏｌａｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３－１８６（１９９４）を参照のこと）；ＣＤＰ３２３、経口アルファ－４インテグリン阻害剤；ダイネミシン（ダイネミシンＡを含む）；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチンクロモフォア及び関連するクロモプロテインエンジイン抗生物質クロモフォア）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射（ＤＯＸＩＬ（登録商標）、リポソームドキソルビシンＴＬＣ Ｄ－９９（ＭＹＯＣＥＴ（登録商標））、ペグリル化リポソームドキソルビシン（ＣＡＥＬＹＸ（登録商標））、及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣなど、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、プロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、例えばメトトレキサート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標）、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロン、及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）など；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなど；プリン類縁物質、例えばフルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなど；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなど；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストトラクトンなど；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなど；葉酸補充剤、例えばフロリン酸など；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシッド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシノイド、例えばメイタンシン及びアンサミトシンなど；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、オレゴン州ユージーン）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２′，２′－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ－２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、及びアンギジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標））、及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；クロランブシル；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金剤、例えばシスプラチン、オキサリプラチン（例、ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））、及びカルボプラチンなど；ビンカ（チューブリン重合が微小管を形成することを防止する）（ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））、及びビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））など）；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ロイコボリン；ノバントロン；エダトレキサート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦ（登録商標））；レチノイド、例えばレチノイン酸など（ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））を含む）；ビスホスホネート）、例えばクロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）又はＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロネート（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ－５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロネート（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））、又はリセドロネート（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））など；トロキサシタビン（１，３－ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子（例えば、ＰＫＣ－アルファ、Ｒａｆ、Ｈ－Ｒａｓ、及び上皮成長因子受容体（ＥＧＦ－Ｒ）など）の発現を阻害するもの；ワクチン、例えばＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチン及び遺伝子治療ワクチンなど、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤（例、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；ｒｍＲＨ（例、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；ＢＡＹ４３９００６（ソラフェニブ；Ｂａｙｅｒ）；ＳＵ－１１２４８（スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）；ペリホシン、ＣＯＸ－２阻害剤（例、セレコキシブ又はエトリコキシブ）、プロテオソーム阻害剤（例、ＰＳ３４１）；ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））；ＣＣＩ－７７９；ティピファルニブ（Ｒ１１５７７）；オラフェニブ、ＡＢＴ５１０；Ｂｃｌ－２阻害剤、例えばオブリメルセンナトリウム（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））など；ピキサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤（以下の定義を参照のこと）；チロシンキナーゼ阻害剤（以下の定義を参照のこと）；セリン－スレオニンキナーゼ阻害剤、例えばラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標））など；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、例えばロナファルニブ（ＳＣＨ ６６３６、ＳＡＲＡＳＡＲ（商標））など；及び上に記載するいずれかの医薬的に許容可能な塩、酸、又は誘導体；ならびに上の２つ又はそれより多くの併用、例えばＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの併用治療についての略語）など；及びＦＯＬＦＯＸ（５－ＦＵ及びロイコボリンと併用されたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））を用いた処置レジメンについての略語）を含む。
本明細書中で定義する化学療法剤は、「抗ホルモン剤」又は「内分泌療法剤」を含み、それらは、癌の成長を促進することができるホルモンの効果を調節、低下、遮断、又は阻害するように作用する。それらはそれ自体がホルモンでありうるが、混合アゴニスト／アンタゴニストプロファイルを伴う抗エストロゲン（タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標））、４－ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））、イドキシフェン、ドロロキシフェン、ラロキシフェン（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標））、トリオキシフェン、ケオキシフェン、及び選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）を含む）、例えばＳＥＲＭ３など；アゴニスト特性を伴わない純粋な抗エストロゲン、例えばフルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））、及びＥＭ８００など（そのような薬剤は、エストロゲン受容体（ＥＲ）の二量体化を遮断し、ＤＮＡ結合を阻害し、ＥＲ代謝回転を増加させ、及び／又はＥＲレベルを抑制しうる）；アロマターゼ阻害剤（ステロイドアロマターゼ阻害剤を含む）、例えばフォルメスタン及びエキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））、及び非ステロイド性アロマターゼ阻害剤など、例えばアナストロゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））、及びアミノグルテチミドなど、ならびに他のアロマターゼ阻害剤は、ボロゾール（ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標））、酢酸メゲストロール（ＭＥＧＡＳＥ（登録商標））、ファドロゾール、及び４（５）－イミダゾール；黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト（リュープロリド（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）及びＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標））、ゴセレリン、ブセレリン、及びトリプテレリンを含む）；性ステロイド（プロゲスチン、例えば酢酸メゲストロール及び酢酸メドロキシプロゲステロンなど、エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロール及びプレマリンなど、ならびにアンドロゲン／レチノイド、例えばフルオキシメステロン、全てのトランスレチオン酸及びフェンレチニドなどを含む）；オナプリストーン；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（ＥＲＤ）；抗アンドロゲン剤、例えばフルタミド、ニルタミド、及びビカルタミドなど；及び上のいずれかの医薬的に許容可能な塩、酸、又は誘導体；ならびに上の２つ又はそれより多くの併用を含むが、それらに限定しない。
本明細書中で使用する用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種から由来する一方で、重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる供給源又は種から由来する抗体を指す。
本明細書中で使用する用語「条件付きで活性な抗体」は、非腫瘍微小環境中の条件下と比較し、腫瘍微小環境中の条件下でより活性である抗ＥｐＣＡＭ抗体を指す。腫瘍微小環境中の条件は、非腫瘍微小環境と比較し、より低いｐＨ、より高い濃度の乳酸及びピルビン酸、低酸素症、より低い濃度のグルコース、ならびにわずかに高い温度を含む。例えば、条件付きで活性な抗体は、通常の身体温度では実質的に不活性であるが、しかし、腫瘍微小環境中ではより高い温度で活性がある。さらに別の態様では、条件付きで活性な抗体は、正常な酸素化された血液中ではあまり活性ではないが、しかし、腫瘍中のあまり酸素化されていない環境下ではより活性である。さらに別の態様では、条件付きで活性な抗体は、通常の生理学的ｐＨ７．２～７．８中ではあまり活性ではないが、しかし、腫瘍微小環境中に存在する酸性ｐＨ５．８～７．０又は６．０～６．８中ではより活性である。当業者に公知の腫瘍微小環境における他の条件を、また、本発明における条件として使用してもよく、その下では、抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＥｐＣＡＭへの異なる結合親和性を有する。
本明細書中で使用する用語「細胞分裂阻害剤」は、インビトロ又はインビボのいずれかで細胞の成長を停止させる化合物又は組成物を指す。このように、細胞分裂阻害剤は、Ｓ期中の細胞のパーセンテージを有意に低下させるものでありうる。細胞分裂阻害剤のさらなる例は、Ｇ０／Ｇ１停止又はＭ期停止を誘導することにより細胞周期進行を遮断する薬剤を含む。ヒト化抗Ｈｅｒ２抗体トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））は、Ｇ０／Ｇ１停止を誘導する細胞分裂阻害剤の例である。古典的なＭ相遮断薬は、ビンカ（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンなどを含む。Ｇ１を停止させる特定の薬剤はまた、Ｓ期停止中に波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５－フルオロウラシル、及びａｒａ－Ｃなどである。さらなる情報は、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ ａｎｄ Ｉｓｒａｅｌ，ｅｄｓ．，Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｃｈａｐｔｅｒ １，ｅｎｔｉｔｌｅｄ “Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｒｕｇｓ” ｂｙ Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５），ｅ．ｇ．，ｐ．１３において見出すことができる。タキサン（パクリタキセル及びドセタキセル）は、両方ともイチイの木から由来する抗癌薬である。ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）は、ヨーロッパイチイから由来し、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体からの微小管の集合を促進させ、脱重合を防止することにより微小管を安定化させ、それによって、細胞における有糸分裂の阻害がもたらされる。
本明細書中で使用する用語「細胞傷害性薬剤」は、細胞機能を阻害もしくは防止する、及び／又は細胞死もしくは破壊を起こす物質を指す。細胞傷害性薬剤は、放射性同位元素（例、Ａｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｒｅ188、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32、Ｐｂ212及びＬｕの放射性同位元素）；化学療法剤又は薬物（例、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；成長阻害剤；酵素及びそのフラグメント、例えば核酸分解酵素など；抗生物質；毒素、例えば細菌、真菌、植物、又は動物由来の小分子毒素又は酵素的に活性な毒素など（そのフラグメント及び／又は変異体を含む）；及び下に開示する種々の抗腫瘍剤又は抗癌剤を含むが、それらに限定しない。
本明細書中で使用する用語「抗体」は、２つの抗原結合部位を伴う小さな抗体フラグメントを指し、それらのフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶH－ＶL）中に軽鎖可変ドメイン（ＶL）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶH）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間での対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合することを強制され、２つの抗原結合部位を作製する。
本明細書中で使用する用語「検出可能に標識」は、物理的又は化学的な手段による直接的又は間接的のいずれかでの検出又は測定が、サンプル中での抗原の存在を示している任意の物質を指す。有用な検出可能な標識の代表的な例は、以下を含むが、それらに限定しない：光吸収、蛍光、反射、光散乱、リン光、又は発光特性に基づいて直接的又は間接的に検出可能な分子又はイオン；それらの放射性特性により検出可能な分子又はイオン；それらの核磁気共鳴又は常磁性により検出可能な分子又はイオン。光吸収又は蛍光に基づいて間接的に検出可能な分子の群の間に含まれるのは、例えば、適した基質を、例えば、非光吸収分子から光吸収分子に、又は非蛍光分子から蛍光分子に変換させる種々の酵素である。
本明細書中で使用する用語「診断」は、疾患又は障害への対象の感受性の決定、対象が現在、疾患又は障害により冒されているか否かに関する決定、疾患又は障害により冒されている対象の予後（例、転移前又は転移性の癌性状態、癌の病期、又は治療への癌の応答性の同定）、及びセラメトリックス（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ）（例、治療の効果又は有効性に関する情報を提供するために対象の状態をモニタリングすること）を指す。一部の実施形態では、本発明の診断方法は、初期段階の癌を検出する際に特に有用である。
本明細書中で使用する用語「診断用薬剤」は、直接的又は間接的に検出することができ、診断目的のために使用される分子を指す。診断用薬剤は、対象又はサンプルに投与してもよい。診断用薬剤は、それ自体で提供することができ、又は賦形剤、例えば条件付きで活性な抗体などにコンジュゲートさせてもよい。
本明細書中で使用する用語「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指し、それは抗体のアイソタイプにより変動する。抗体エフェクター機能の例は、以下を含む：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例、Ｂ細胞受容体）の下方調節；及びＢ細胞活性化。
本明細書中で使用する薬剤、例えば、医薬製剤の用語「有効量」は、所望の治療的又は予防的結果を達成するために必要な投与量で及び期間にわたり有効な量を指す。
本明細書中で使用する用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで伸長する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しうる、又は存在しないであろう。本明細書中で他に特定しない限り、Ｆｃ領域又は定常領域中のアミノ酸残基のナンバリングは、ＥＵナンバリングシステム（また、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１において記載されるＥＵインデックスと呼ばれる）に従う。
本明細書中で使用する用語「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、相補性決定領域（重鎖中のＣＤＲ又はＨ１－３及び軽鎖中のＬ１－３）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、４つのＦＲドメインからなる：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４。したがって、ＣＤＲ配列及びＦＲ配列は、一般的に、ＶH（又はＶL）中の以下の配列中に出現する：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。
用語「全長抗体」、「インタクト抗体」、又は「全抗体」は、抗原結合可変領域（ＶH又はＶL）ならびに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む抗体を指す。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例、ヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体でありうる。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、全長抗体を異なる「クラス」に割り当てることができる。全長抗体の５つの主要なクラスがあり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、これらのいくつかは「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２中にさらに分けられうる。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元構成は周知である。
本明細書中で使用する用語「機能保存的変異体」は、タンパク質又は酵素中の所与のアミノ酸残基が、ポリペプチドの全体的な立体構造及び機能を変えることなく変化されていることを指し、類似の特性（例えば、例えば、極性、水素結合ポテンシャル、酸性、塩基性、疎水性、芳香族など）を有するアミノ酸を用いたアミノ酸の置換を含むが、それに限定しない。保存されているとして示されたアミノ酸以外のアミノ酸は、タンパク質において異なりうるが、類似の機能の任意の２つのタンパク質間のタンパク質配列又はアミノ酸配列の類似性パーセントは変動しうる、例えば、アラインメントスキームに従った、例えばクラスター方法などにより決定された７０％～９９％でありうるが、それにおいて類似性はＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づく。「機能保存的変異体」はまた、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡアルゴリズムにより決定されるように少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含み、それは、それが比較される天然又は親タンパク質と同じ又は実質的に類似の特性又は機能を有する。
本明細書中で使用する用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の後代を含む。宿主細胞は「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、それらは、継代の数に関係なく、初代形質転換細胞及びそれから由来する後代を含む。後代は、核酸含量において親細胞と完全に同一ではないであろうが、しかし、変異を含みうる。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体後代が、本明細書中に含まれる。
本明細書中で使用する用語「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生される、又はヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト供給源から由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するヒト抗体である。ヒト抗体のこの定義は、具体的には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
本明細書中で使用する用語「ヒト化」抗体は、非ヒトＣＤＲからのアミノ酸残基及びヒトＦＲからのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、それにおいて、ＣＤＲの全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のＣＤＲに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てが、ヒト抗体のＦＲに対応する。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体から由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含みうる。抗体の「ヒト化形態」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を受けている抗体を指す。
本明細書中で使用する用語「イムノコンジュゲート」は、細胞傷害性薬剤を含むが、それに限定されない、１つ又は複数の異種分子にコンジュゲートされた抗体である。
本明細書中で使用する用語「個体」又は「対象」は、哺乳動物を指す。哺乳動物は、家畜化動物（例、牛、羊、猫、犬、及び馬）、霊長類（例、ヒト及び非ヒト霊長類、例えばサルなど）、ウサギ、及びげっ歯類（例、マウス及びラット）を含むが、それらに限定しない。特定の実施形態では、個体又は対象はヒトである。
本明細書中で使用する用語「細胞の成長又は増殖を阻害する」は、細胞の成長又は増殖を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％だけ減少させることを意味し、及び細胞死を誘導することを含む。
本明細書中で使用する用語「単離」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。一部の実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動（例、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例、イオン交換又は逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））により決定されるように、９５％又は９９％を上回る純度に精製される。抗体純度の評価のための方法の総説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ，ｖｏｌ．８４８，ｐｐ．７９－８７，２００７を参照のこと。
本明細書中で使用する用語「抗ＥｐＣＡＭ抗体をコードする単離核酸」は、抗体重鎖及び軽鎖（又はそのフラグメント）をコードする１つ又は複数の核酸分子を指し、単一ベクター又は別々のベクター中のそのような核酸分子、及び宿主細胞中の１つ又は複数の位置に存在するそのような核酸分子を含む。
本明細書中で使用する用語「転移」は、癌細胞が原発腫瘍から分散し、リンパ管及び／又は血管中に浸透し、血流を通じて循環し、身体中の他の場所の正常組織における遠隔病巣（転移）中で成長することを支持する全てのＥｐＣＡＭを含む過程を指す。特に、それは、転移の根底にあり、ＥｐＣＡＭにより刺激又は媒介される、腫瘍細胞の細胞事象、例えば増殖、遊走、足場非依存性、アポトーシスの回避、又は血管新生因子の分泌などを指す。
本明細書中で使用する用語「微小環境」は、身体の組織又は領域の他の領域から一定の又は時間的、物理的、もしくは化学的な違いを有する組織又は身体の任意の部分又は領域を意味する。腫瘍について、本明細書中で使用する用語「腫瘍微小環境」は、腫瘍が存在する環境を指し、それは、腫瘍内の非細胞領域及び腫瘍性組織の直ぐ外側の領域であるが、しかし、癌細胞自体の細胞内区画には関係しない。腫瘍及び腫瘍微小環境は密接に関係しており、常に相互作用している。腫瘍はその微小環境を変化させうるが、微小環境は腫瘍がどのように成長し、広がるのかに影響を及ぼしうる。典型的には、腫瘍微小環境は、５．０～７．０の範囲中、又は５．０～６．８の範囲中、又は５．８～６．８の範囲中、又は６．２～６．８の範囲中の低いｐＨを有する。他方で、正常な生理学的ｐＨは７．２～７．８の範囲中である。腫瘍微小環境はまた、血漿との比較において、グルコース及び他の栄養素のより低い濃度を、しかし、乳酸のより高い濃度を有することが公知である。さらに、腫瘍微小環境は、正常な生理学的温度よりも０．３～１℃高い温度を有しうる。腫瘍微小環境は、Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，“ＭＲＩ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｕｍｏｒ Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ，ｖｏｌ．１６，ｐｐ．４３０－４５０，２００２において考察されているが、本明細書により、参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる。用語「非腫瘍微小環境」は、腫瘍以外の部位での微小環境を指す。
本明細書中で使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、この集団を含む個々の抗体は、例えば、天然変異を含む又はモノクローナル抗体調製物の産生の間に生じる、可能な変異体抗体を除く、同一である、及び／又は同じエピトープに結合し、そのような変異体は一般的に少量中で存在する。ポリクローナル抗体調製物（典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を含む）とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各々のモノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対して向けられている。このように、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られるものとしての抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を要求しているとして解釈すべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、多様な技術（ハイブリドーマ方法、組換えＤＮＡ方法、ファージディスプレイ方法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、それらに限定しない）により作られうるが、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法が、本明細書中に記載されている。
本明細書中で使用する用語「ネイキッド抗体」は、異種部分（例、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートされていない抗体を指す。ネイキッド抗体は医薬製剤中に存在しうる。
本明細書中で使用する用語「添付文書」は、治療用製品の商業用パッケージ中に習慣的に含まれる説明書を指すために使用され、それは、そのような治療用製品の使用に関する適応症、使用法、投与量、投与、併用治療、禁忌、及び／又は警告に関する情報を含む。
本明細書中で使用する参照ポリペプチド配列に関する用語「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、必要な場合にギャップを導入して最大パーセントの配列同一性を達成した後、及び配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮せず、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当技術分野の技術内にある種々の方法において、例えば、公的に利用可能なコンピューターソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどを使用して達成することができる。当業者は、配列を整列させるための適したパラメーターを決定することができ、比較される配列の全長にわたり最大のアラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む。本明細書中の目的のために、しかし、％アミノ酸配列同一性の値を、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成する。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータープログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．により作成され、ソースコードは米国著作権局（ワシントンＤ．Ｃ．、２０５５９）においてユーザードキュメントとともに提出されており、そこでは、それは米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）から公開されている、又はソースコードからコンパイルされうる。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルすべきである。全ての配列比較パラメーターがＡＬＩＧＮ－２プログラムにより設定され、変動しない。
ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列の比較のために用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ｂと、それとの、又はそれに対する所与のアミノ酸配列Ａ（それは、あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂと、それとの、又はそれに対する特定の％のアミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａとして言い表すことができる）の％アミノ酸配列同一性を以下のように計算する：
Ｘ／Ｙの分数の１００倍
ここで、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ－２により、そのプログラムのＡ及びＢのアラインメントにおいて同一の一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、ここで、ＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性は、Ａに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくないことが理解されよう。別に述べない限り、本明細書中で使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ－２コンピュータープログラムを使用して直前の段落中に記載されているように得られる。
本明細書中で使用する用語「医薬製剤」は、その中に含まれる活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態中にあり、製剤が投与されうる対象に対して容認不可能なほど毒性である追加の成分を含まない製剤を指す。
本明細書中で使用する用語「医薬的に許容可能な担体」は、対象に対して無毒である、活性成分以外の、医薬製剤中の成分を指す。医薬的に許容可能な担体は、緩衝剤、添加剤、安定剤、又は保存剤を含むが、それらに限定しない。
本明細書中で使用する用語「精製」及び「単離」は、本発明に従った抗体又はヌクレオチド配列を指し、示した分子は、同じ型の他の生物学的高分子の実質的な非存在において存在する。本明細書中で使用する用語「精製」は、好ましくは、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、より好ましくはさらに少なくとも９５重量％、最も好ましくは少なくとも９８重量％の同じ型の生物学的高分子が存在していることを意味する。特定のポリペプチドをコードする「単離」核酸分子は、このポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子を指し；しかし、この分子は、組成物の基本的特徴に悪影響を及ぼさない一部の追加の塩基又は部分を含みうる。
本明細書中で使用する用語「組換え抗体」は、抗体をコードする核酸を含む組換え宿主細胞により発現される抗体（例、キメラ、ヒト化、又はヒト抗体もしくはその抗原結合フラグメント）を指す。組換え抗体を産生するための「宿主細胞」の例は、以下を含む：（１）哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＣＯＳ、骨髄腫細胞（Ｙ０細胞及びＮＳ０細胞を含む）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、Ｈｅｌａ及びＶｅｒｏ細胞；（２）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９、ｓｆ２１、及びＴｎ５；（３）植物細胞、例えば、ニコチアナ属に属する植物（例、ニコチアナタバカム）；（４）酵母細胞、例えば、サッカロミセス属（例、サッカロミセス・セレビシエ）又はアスペルギルス属（例、アスペルギルス・ニガー）に属するもの；（５）細菌細胞、例えば、エシェリキア・コリ細胞又はバチルス・スブチリス細胞など。
本明細書中で使用する用語「単鎖Ｆｖ」（「ｓｃＦｖ」）は、共有結合的に連結されたＶH：：ＶLヘテロ二量体であり、それは通常、ペプチドをコードするリンカーにより連結されたＶH及びＶLをコードする遺伝子を含む遺伝子融合体から発現される。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合により安定化されたＶH：：ＶLヘテロ二量体である。二価及び多価抗体フラグメントは、一価ｓｃＦｖの会合により自発的に形成することができる、又はペプチドリンカー、例えば二価ｓｃ（Ｆｖ）２などにより一価ｓｃＦｖをカップリングすることにより生成することができる。
本発明の抗体の用語「治療有効量」は、任意の医学的処置に適用可能な合理的な利益／リスク比率で、前記癌を処置するために十分な量の抗体を意味する。しかし、本発明の抗体及び組成物の１日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医により決定されることが理解されるであろう。任意の特定の患者についての特定の治療的に有効な用量レベルは、多様な要因（処置されている障害及びこの障害の重症度；用いられた特定の抗体の活性；用いられた特定の組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、及び食事；用いられた特異的抗体の投与の時間、投与の経路、及び排泄の速度；処置の持続時間；用いられた特異的抗体との組み合わせにおいて又は同時に使用される薬物；ならびに医学的な技術分野において周知の同様の要因を含む）に依存しうる。例えば、所望の治療的効果を達成するために要求されるレベルよりも低いレベルで化合物の用量を開始し、所望の効果が達成されるまでこの投与量を徐々に増加させることは当技術分野の技能の内で周知である。
本明細書中で使用する用語「処置」、「処置する」、又は「処置している」は、処置されている個体の自然経過を変えるための試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理学の経過の間のいずれかで実施することができる。処置の望ましい効果は、疾患の発生又は再発の防止、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的転帰の減弱、転移の防止、疾患進行の速度の減少、疾患状態の寛解又は緩和、及び緩解又は改善された予後を含むが、それらに限定しない。一部の実施形態では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるために、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
本明細書中で使用する用語「腫瘍」は、悪性又は良性を問わず、全ての新生物細胞の成長及び増殖、ならびに全ての前癌性及び癌性の細胞及び組織を指す。用語「癌」、「癌性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」、及び「腫瘍」は、本明細書中で言及されるように相互に排他的ではない。
本明細書中で使用する用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体を抗原へ結合させる際に含まれる抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖（それぞれＶH及びＶL）の可変ドメインは、一般的に、類似の構造を有し、各々のドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。（例、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１ （２００７）を参照のこと）単一のＶH又はＶLドメインは、抗原結合特異性を与えるのに十分でありうる。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体からのＶH又はＶLドメインを使用して単離してもよく、それぞれ相補的なＶL又はＶHドメインのライブラリーをスクリーニングする。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１５０，ｐｐ．８８０－８８７，１９９３；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３５２，ｐｐ．６２４－６２８，１９９１を参照のこと。
本明細書中で使用する用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を増やすことができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、ならびにそれが導入された宿主細胞のゲノム中に組み入れられたベクターを含む。特定のベクターは、それらが操作的に連結されている核酸の発現を方向づけることが可能である。そのようなベクターは、本明細書中で「発現ベクター」として言及される。
例証的な目的のために、本発明の原理を、種々の例示的な実施形態を参照することにより記載する。本発明の特定の実施形態が本明細書中に具体的に記載されているが、当業者は、同じ原理が他のシステム及び方法に等しく適用可能であり、用いることができることを容易に認識するであろう。本発明の開示された実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、示された任意の特定の実施形態の詳細に限定されないことを理解すべきである。さらに、本明細書中で使用する用語は、説明の目的のためであり、限定のためではない。さらに、特定の方法が、特定の順序において本明細書中で提示される工程を参照して記載されているが、多くの例では、これらの工程は、当業者により理解されうるように、任意の順序において実施することができる；新規の方法は、従って、本明細書中に開示される工程の特定の配置に限定されない。
本明細書中で及び添付の特許請求の範囲中で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別に定めない限り、複数形の参照を含むことに留意しなければならない。さらに、用語「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ又は複数」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書中で互換的に使用することができる。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する」、及び「から構築される」をまた、互換的に使用することができる。
別に示さない限り、本明細書及び特許請求の範囲において使用される成分の量、特性、例えば分子量、パーセント、比率、反応条件などを表現する全ての数値が、用語「約」が存在するか否かを問わず、全ての例において用語「約」により修飾されるとして理解すべきである。したがって、反対が示されない限り、明細書及び特許請求の範囲において示された数値パラメーターは、本開示により得られることが求められる所望の特性に依存して変動しうる近似値である。少なくとも、及び均等論の適用を請求項の範囲に限定する試みとしてではなく、各々の数値パラメーターは、少なくとも報告された有効桁数に照らして、通常の丸め技術を適用することにより解釈すべきである。本開示の広い範囲を示す数値範囲及びパラメーターは近似値であるにもかかわらず、特定の例において示される数値は可能な限り正確に報告される。任意の数値は、しかし、それらのそれぞれのテスト測定において見出された標準偏差から起因する特定の誤差を固有に含む。
本明細書中で開示される各々の成分、化合物、置換基、又はパラメーターは、単独での、あるいは本明細書中で開示される他の全ての成分、化合物、置換基、又はパラメーターの１つ又は複数との組み合わせにおける使用のために開示されるとして解釈すべきである。
また、本明細書中で開示される各々の成分、化合物、置換基、又はパラメーターについての各々の量／値又は量／値の範囲は、また、本明細書中で開示される任意の他の成分、化合物、置換基、又はパラメーターについて開示される各々の量／値又は量／値の範囲との組み合わせにおいて開示されるものとして解釈すべきであること、ならびに本明細書中で開示される２つ又はそれより多くの成分、化合物、置換基、又はパラメーターについての量／値又は量／値の範囲の任意の組み合わせが、このように、この説明の目的のために互いの組み合わせにおいて開示されることを理解すべきである。
本明細書中で開示される各々の範囲の各々の下限は、同じ成分、化合物、置換基、又はパラメーターについて本明細書中で開示される各々の範囲の各々の上限との組み合わせにおいて開示されるとして解釈すべきであることがさらに理解される。このように、２つの範囲の開示は、各々の範囲の各々の下限を各々の範囲の各々の上限と組み合わせることにより導き出された４つの範囲の開示として解釈すべきである。３つの範囲の開示は、各々の範囲の各々の下限を各々の範囲の各々の上限などと組み合わせることにより導き出された９つの範囲の開示として解釈すべきである。さらに、説明又は実施例において開示される成分、化合物、置換基、又はパラメーターの特定の量／値は、範囲の下限又は上限のいずれかの開示として解釈すべきであり、このように、本願の他の場所で開示されている同じ成分、化合物、置換基、又はパラメーターについての範囲の任意の他の下限又は上限、あるいは特定の量／値と組み合わせて、その成分、化合物、置換基、又はパラメーターについての範囲を形成することができる。
Ａ．抗ＥｐＣＡＭポリペプチド及び抗体
一態様では、本発明は、ＥｐＣＡＭ、特にヒトＥｐＣＡＭタンパク質に特異的に結合する重鎖可変領域を含む単離ポリペプチドを提供する。重鎖可変領域は、配列Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３を有する３つの相補性決定領域を含み、
Ｈ１配列はＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨ（配列番号１）であり；
Ｈ２配列はＸ1ＩＲＰＳＴＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２）であり；及び
Ｈ３配列はＧＤＮＷＶＧＦＡＮ（配列番号３）であり；
ここでＸ1はＹ又はＤである。
Ｈ２配列は、ＹＩＲＰＳＴＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２２）及びＤＩＲＰＳＴＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２３）より選択してもよい。
本発明の例示的な重鎖可変領域のアラインメントを図２中に示し、ここで、相補性決定領域Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３をボックス中に囲んでいる。
別の態様では、本発明は、ヒトＥｐＣＡＭに特異的に結合する軽鎖可変領域を含む単離ポリペプチドを提供する。軽鎖可変領域は、配列Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３を有する３つの相補性決定領域を含み、
Ｌ１配列はＳＡＳＳＳＩＳＹＭＨ（配列番号４）であり；
Ｌ２配列はＳＴＳＮＬＸ2Ｓ（配列番号５）であり；及び
Ｌ３配列はＸ3ＱＷＳＴＹＸ4Ｔ（配列番号６）であり、
ここでＸ2はＡ又はＨであり；Ｘ3はＨ又はＥであり；及びＸ4はＨ又はＥである。
Ｌ２配列は、ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号２４）、及びＳＴＳＮＬＨＳ（配列番号２５）より選択されうる。Ｌ３配列は、ＨＱＷＳＴＹＨＴ（配列番号２６）、ＨＱＷＳＴＹＥＴ（配列番号２７）、及びＥＱＷＳＴＹＨＴ（配列番号２８）より選択されうる。
本発明の例示的な軽鎖可変領域のアラインメントを図３中に示し、ここで、相補性決定領域Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３をボックス中に囲んでいる。
本発明の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、各々が、米国特許第８，７０９，７５５号において開示されている方法を使用して親抗体から得られた。重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を生成するこの方法、ならびに米国特許第８，７０９，７５５号において開示されている抗体及び抗体フラグメントを生成する方法が、本明細書中の参照により本明細書により組み入れられる。
別の態様では、本発明は、図２中に示す重鎖可変領域及び図３中に示す軽鎖可変領域を含む。図２の７つの重鎖可変領域のアミノ酸配列を、配列番号７～１３において示す。図３の８つの軽鎖可変領域のアミノ酸配列を、配列番号１４～２１において示す。
より具体的な態様では、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体又は抗体フラグメントを提供し、重鎖可変領域は、配列Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３を有する３つの相補性決定領域を含み、
Ｈ１配列はＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨ（配列番号１）であり；
Ｈ２配列はＸ1ＩＲＰＳＴＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２）であり；及び
Ｈ３配列はＧＤＮＷＶＧＦＡＮ（配列番号３）であり；ここでＸ1はＹ又はＤであり；ならびに
軽鎖可変領域は、配列Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３を有する３つの相補性決定領域を含み、
Ｌ１配列はＳＡＳＳＳＩＳＹＭＨ（配列番号４）であり；
Ｌ２配列はＳＴＳＮＬＸ2Ｓ（配列番号５）であり；及び
Ｌ３配列はＸ3ＱＷＳＴＹＸ4Ｔ（配列番号６）であり、
ここでＸ2はＡ又はＨであり；Ｘ3はＨ又はＥであり；及びＸ4はＨ又はＥであり、但し、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、及びＸ4は同時にＹ、Ａ、Ｈ、及びＨであることはできない。
一実施形態では、抗体又は抗体フラグメントは、配列番号８及び１４、配列番号９及び１４、配列番号７及び１５、配列番号７及び１６、配列番号７及び１７、配列番号１１及び２０、配列番号１２及び２１、配列番号１１及び１８、配列番号１３及び１８、ならびに配列番号１０及び１９より選択される配列の任意の１対を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。
別の実施形態では、本発明の抗体又は抗体フラグメントは重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、各々の領域は、独立して、配列番号８及び１４、配列番号９及び１４、配列番号７及び１５、配列番号７及び１６、配列番号７及び１７、配列番号１１及び２０、配列番号１２及び２１、配列番号１１及び１８、配列番号１３及び１８、ならびに配列番号１０及び１９よりそれぞれ選択されるアミノ酸配列の対と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の同一性を有し、及び前記抗体又は抗体フラグメントはヒトＥｐＣＡＭに特異的に結合する。
これらの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体及び抗体フラグメントは、ＥｐＣＡＭ、特にヒトＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる。これらの重鎖可変領域の１つ及びこれらの軽鎖可変領域の１つの組み合わせを含む抗体又は抗体フラグメントは、非腫瘍微小環境におけるｐＨ（例、ｐＨ７．０～７．６）よりも、腫瘍微小環境におけるｐＨ（例、ｐＨ６．０～６．８）で、ＥｐＣＡＭへのより高い結合親和性を有することが見出されている。結果として、抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントは、典型的な正常組織微小環境におけるＥｐＣＡＭへのそれらの結合親和性との比較において、腫瘍微小環境におけるＥｐＣＡＭへのより高い結合親和性を有する。
本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントは、このように、正常組織微小環境におけるＥｐＣＡＭへのそれらの低下した結合親和性に起因して、無条件で活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体と比べて、低下した副作用を示すと予想される。本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントはまた、当技術分野において公知のモノクローナル抗ＥｐＣＡＭ抗体と同等の有効性を有することが期待される。この機色の組み合わせによって、低下した副作用に起因して、これらの抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントのより高い投与量の使用が可能になり、それによって、より有効な治療オプションが提供されうる。
以前の実施形態の各々では、抗体又は抗体フラグメントは、非腫瘍微小環境において生じる同じ条件での異なる値との比較において、腫瘍微小環境における条件での値でＥｐＣＡＭタンパク質へのより高い抗原結合活性を有しうる。一実施形態では、条件はｐＨである。
抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントは、それがまた、ｐＨ６．０で由来する親抗体又は抗体フラグメントの同じ抗原結合活性と比較し、ｐＨ６．０でその抗原結合活性の少なくとも７０％を有しうるが、抗体又は抗体フラグメントは、それがｐＨ７．４で由来する親抗体又は抗体フラグメントの同じ抗原結合活性と比較し、ｐＨ７．４でその抗原結合活性の５０％未満、又は４０％未満、又は３０％未満、又は２０％未満、又は１０％未満を有しうる。抗原結合活性は、例えば、ＥｐＣＡＭタンパク質への結合又はＣＤ３への結合でありうる。
以前の実施形態の各々では、抗原結合活性は、ＥＬＩＳＡアッセイにより測定されうる。
本発明は、図２～３中に提示する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、ならびに配列番号７～２１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。本発明はまた、図２～３中に提示する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の変異体、ならびにＥｐＣＡＭ、特にヒトＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる配列番号７～２１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、これらの変異体は、異なるＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２、又はＬ３配列を有する。他の実施形態では、相補性決定領域の外側の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、これらの変異体を提供するために本願において考察されるように、置換、挿入、及び欠失の原理に従って変異されうる。さらなる実施形態では、定常領域を改変し、これらの変異体を提供してもよい。
これらの変異体を派生させる際に、本明細書中に記載する過程により導かれる。重鎖及び軽鎖可変領域の変異体は、重鎖及び軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列中に適した改変を導入することにより、又はペプチド合成により調製してもよい。そのような改変は、例えば、重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はその中への挿入、及び／又はその置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを作り、それらが所望の特徴、例えば、ヒトＥｐＣＡＭへの抗原結合及び／又は条件付き活性を持つという条件で、本発明の抗体又は抗体フラグメントに達することができる。
置換、挿入、及び欠失変異体
特定の実施形態では、１つ又は複数のアミノ酸置換を有する抗体又は抗体フラグメントの変異体が提供される。置換変異誘発のための目的の部位は、ＣＤＲ及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。保存的置換は、「保存的置換」の見出しの下で表１中に示されている。より実質的な変化が、「例示的な置換」の見出しの下で、及びアミノ酸側鎖クラスを参照して以下でさらに記載するように、表１中に提供されている。アミノ酸置換は、目的の抗体又は抗体フラグメント中に導入されうるが、その産物は、所望の活性、例えば、保持された／改善された抗原結合、又は減少した免疫原性についてスクリーニングされうる。
Figure 2022531504000002
アミノ酸は、一般的な側鎖の特性に従ってグループ化されうる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の方向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存置換は、これらのクラスの１つのメンバーを、別のクラスについて交換することを伴いうる。
１つの型の置換変異体は、親抗体（例、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ又は複数の相補性決定領域残基を置換することを含む。一般的に、さらなる試験のために選択された、結果として得られる変異体は、親抗体と比べて、特定の生物学的特性（例、増加した親和性の増加、低下した免疫原性）において改変（例、改善）を有しうる、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、それは、例えば、ファージディスプレイベースの親和性成熟技術、例えば本明細書中に記載されるものなどを使用して、便利に生成されうる。簡単には、１つ又は複数のＣＤＲ残基が変異され、変異体抗体がファージ上で呈され、特定の生物学的活性（例、結合親和性）についてスクリーニングされる。
変化（例、置換）は、例えば、抗体親和性を改善するために、ＣＤＲ中に作られうる。そのような変化は、ＣＤＲ「ホットスポット」、即ち、体細胞成熟過程の間に高頻度で変異を受けるコドンによりコードされる残基、及び／又はＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）において作られうるが（例、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２０７，ｐｐ．１７９－１９６，２００８を参照のこと）、結果として得られる変異体ＶH又はＶLは結合親和性についてテストされる。二次ライブラリーを構築する及びそれより再選択することによる親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１７８，ｐｐ．１－３７，２００１）において記載されている。親和性成熟の一部の実施形態では、多様性が、多様な方法（例、エラープローンＰＣＲ、チェーンシャッフリング、又はオリゴヌクレオチド特異的変異誘発）のいずれかによる成熟のために選ばれた可変遺伝子中に導入される。二次ライブラリーが次に作製される。ライブラリーを次にスクリーニングし、所望の親和性を伴う任意の抗体変異体を同定する。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのＣＤＲ残基（例、一度に４～６残基）がランダム化されるＣＤＲ特異的アプローチを含む。抗原結合において含まれるＣＤＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発又はモデリングを使用し、特異的に同定されうる。ＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ３が特に、しばしば標的化される。
特定の実施形態では、置換、挿入、又は欠失は、そのような変化によって、抗原に結合する抗体又は抗体フラグメントの能力が実質的に低下されない限り、１つ又は複数のＣＤＲ内で生じうる。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的変異（例、本明細書において提供するような保存的置換）が、ＣＤＲ中に作られうる。そのような変化は、ＣＤＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外部でありうる。上に提供する変異体ＶH及びＶL配列の特定の実施形態では、各々のＣＤＲは、不変である、あるいはわずか１つ、２つ、又は３つだけのアミノ酸置換を含む。
変異誘発のために標的化されうる抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２４４，ｐｐ．１０８１－１０８５，１９８９により記載されているように「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基又は群（例、荷電残基、例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなど）が同定され、中性の又は負に荷電したアミノ酸（例、アラニン又はポリアラニン）により置換され、抗体又は抗体フラグメントと抗原との相互作用に影響が及ぼされるか否かを決定する。さらなる置換を、最初の置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置中に導入してもよい。あるいは、又は加えて、抗体又は抗体フラグメントと抗原の間での接触点を同定するための抗原－抗体複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基は、置換のための候補として標的化されうる又は排除されうる。変異体をスクリーニングし、それらが所望の特性を含むか否かを決定してもよい。
アミノ酸配列の挿入は、１残基から、１００又はそれより多くの残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ酸及び／又はカルボキシル末端融合、ならびに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を伴う抗体を含む。抗体の他の挿入変異体は、酵素（例、ＡＤＥＰＴについて）又は抗体の血清中半減期を増加させるポリペプチドへの抗体のＮ末端又はＣ末端への融合を含む。
本明細書中に記載する抗体のアミノ酸配列修飾が熟慮されている。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましいであろう。ヒト化抗体を、単純に、非ヒト動物から由来する抗体のＶH及びＶL中のＣＤＲだけを、ヒト抗体のＶH及びＶLのＦＲ中に移植することにより産生する場合、抗原結合活性が、非ヒト動物から由来する本来の抗体のものとの比較において低下することが公知である。非ヒト抗体のＶH及びＶLのいくつかのアミノ酸残基は、ＣＤＲ中だけでなく、しかし、また、ＦＲ中で、抗原結合活性に直接的又は間接的に関連付けられると考えられる。それ故に、ヒト抗体のＶH及びＶLのＦＲから由来する異なるアミノ酸残基を用いたこれらのアミノ酸残基の置換によって、結合活性が低下するであろう。この問題を解決するためには、ヒトＣＤＲを用いて移植された抗体において、ヒト抗体のＶH及びＶLのＦＲのアミノ酸配列の間で、抗体への結合に直接的に関連付けられる、又はＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用する、又は抗体の三次元構造を維持する、及び抗原への結合に直接的に関連付けられるアミノ酸残基を同定するための試みを行わなければならない。低下した抗原結合活性は、同定されたアミノ酸を、非ヒト動物から由来する本来の抗体のアミノ酸残基を用いて置換することにより増加させることができうる。
改変及び変化を、本発明の抗体の構造において、及びそれらをコードするＤＮＡ配列において作ってもよく、依然として、望ましい特徴を伴う抗体をコードする機能性分子を得る。
アミノ配列において変化を作製する際、アミノ酸のヒドロパシー指標を考慮しうる。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際でのヒドロパシーアミノ酸指標の重要性は、当技術分野において一般的に理解されている。アミノ酸の相対的なヒドロパシー特性が、結果としてのタンパク質の二次構造に寄与し、それが、次に、タンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を定義することが受け入れられている。各々のアミノ酸には、それらの疎水性及び電荷特徴に基づいてヒドロパシー指標が割り当てられており、これらは以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（－０．４）；スレオニン（－０．７）；セリン（－０．８）；トリプトファン（－０．９）；チロシン（－１．３）；プロリン（－１．６）；ヒスチジン（－３．２）；グルタミン酸（－３．５）；グルタミン（－３．５）；アスパラギン酸（－３．５）；アスパラギン（－３．５）；リジン（－３．９）；及びアルギニン（－４．５）。
本発明のさらなる目的はまた、本発明の抗体の機能保存的変異体を包含する。
２つのアミノ酸配列が、アミノ酸の８０％を上回り、好ましくは８５％を上回り、好ましくは９０％を上回り同一である、又はより短い配列の全長にわたり約９０％を上回り、好ましくは９５％を上回り類似している（機能的に同一である）場合、「実質的に相同」又は「実質的に類似」である。好ましくは、類似配列又は相同配列は、例えば、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ７、ウィスコンシン州マディソン）パイルアッププログラムを使用したアラインメント、又は配列比較アルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのいずれかにより同定される。
例えば、特定のアミノ酸は、活性の認識可能な喪失を伴わずに、タンパク質構造中の他のアミノ酸により置換されうる。タンパク質の相互作用能力及び性質によってタンパク質の生物学的機能活性が定義されるため、特定のアミノ酸置換を、タンパク質配列中に、及び、無論、そのＤＮＡコード配列中に作る一方で、それにもかかわらず同様の特性を伴うタンパク質を得ることができる。このように、種々の変化が、本発明の抗体又は抗体フラグメントの配列、あるいは、前記抗体又は抗体フラグメントをコードする対応するＤＮＡ配列中に、それらの生物学的活性の認識可能な喪失を伴うことなく作られうることが熟慮される。
特定のアミノ酸が、同様のヒドロパシー指標又はスコアを有する他のアミノ酸により置換され、依然として同様の生物学的活性を伴うタンパク質がもたらされ、即ち、依然として生物学的な、機能的に同等のタンパク質が得られうることが当技術分野において公知である。
上で概説したように、アミノ酸置換は、一般的に、従って、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。種々の前述の特徴を考慮に入れる例示的な置換は、当業者に周知であり、以下を含む：グルタミン酸及びアスパラギン酸；セリン及びスレオニン；グルタミン及びアスパラギン；バリン、ロイシン、及びイソロイシン。
グリコシル化変異体
特定の実施形態では、本明細書中で提供される抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントは、抗体又は抗体フラグメントがグリコシル化される程度を増加又は減少させるように変化される。抗体へのグリコシル化部位の追加又は欠失は、１つ又は複数のグリコシル化部位が作製又は除去されるようにアミノ酸配列を変化させることにより便利に達成されうる。
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに付着した糖が変化されうる。哺乳動物細胞により産生される天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ連結により一般的に付着されている分岐した二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ，ｖｏｌ．１５，ｐｐ．２６－３２，１９９７を参照のこと。オリゴ糖は、種々の糖、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「幹」においてＧｌｃＮＡｃに付着されたフコースを含む。一部の実施形態では、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を伴う抗体変異体を作製するために作られうる。
一実施形態では、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）付着されたフコースを欠く糖構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、そのような抗体中でのフコースの量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％、又は２０％～４０％でありうる。フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６において記載されているように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析により測定された、Ａｓｎ２９７に付着された糖構造（例、複合体構造、ハイブリッド構造、及び高マンノース構造）の合計に対する、Ａｓｎ２９７での糖鎖内のフコースの平均量を計算することにより決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域中の位置約２９７に位置付けられるアスパラギン残基を指す（Ｆｃ領域残基のＥｕナンバリング）；しかし、Ａｓｎ２９７はまた、抗体中の小さな配列変動に起因して、位置２９７の上流又は下流の約±３アミノ酸、即ち、位置２９４と３００の間に位置付けられうる。そのようなフコース化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ）；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照のこと。「脱フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関する刊行物の例は、以下を含む：米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；ＷＯ２０００／６１７３９；ＷＯ２００１／２９２４６；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号；米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号；米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号；米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号；米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号；ＷＯ２００３／０８５１１９；ＷＯ２００３／０８４５７０；ＷＯ２００５／０３５５８６；ＷＯ２００５／０３５７７８；ＷＯ２００５／０５３７４２；ＷＯ２００２／０３１１４０；Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．３３６，ｐｐ．１２３９－１２４９，２００４；Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，ｖｏｌ．８７，ｐｐ．６１４－６２２，２００４。脱フコシル化抗体を産生することが可能な細胞株の例は、タンパク質フコース化において欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，ｖｏｌ．２４９，ｐｐ．５３３－５４５，１９８６；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８Ａ号；及びＷＯ２００４／０５６３１２ Ａ１、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞など（例、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，ｖｏｌ．８７，ｐｐ．６１４－６２２，２００４；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，ｖｏｌ．９４，ｐｐ．６８０－６８８，２００６；及びＷＯ２００３／０８５１０７を参照のこと）を含む。
抗体変異体はさらに、二分されたオリゴ糖を伴って提供され、例えば、抗体のＦｃ領域に付着された二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されている。そのような抗体変異体は、低下したフコース化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。そのような抗体変異体の例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８；米国特許第６，６０２，６８４号；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号において記載されている。Ｆｃ領域に付着されたオリゴ糖において少なくとも１つのガラクトース残基を伴う抗体変異体も提供される。そのような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有しうる。そのような抗体変異体は、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７；ＷＯ１９９８／５８９６４；及びＷＯ１９９９／２２７６４において記載されている。
Ｆｃ領域変異体
特定の実施形態では、１つ又は複数のアミノ酸改変を、本明細書中で提供される抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントのＦｃ領域中に導入してもよく、それにより、Ｆｃ領域変異体が生成される。Ｆｃ領域変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含みうる。
特定の実施形態では、本発明は、一部の、しかし、全てではないエフェクター機能を持つ抗体変異体を熟慮し、それによって、それは、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、しかし、特定のエフェクター機能（例えばＡＤＣＣなど）が不必要又は有害である適用のための望ましい候補となる。インビトロ及び／又はインビボ細胞傷害性アッセイを行って、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の低下／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠いている（それ故に、ＡＤＣＣ活性を欠いている可能性が高い）が、しかし、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩだけを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現が、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．９，ｐｐ．４５７－４９２，１９９１の４６４ページの表３中に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例が、米国特許第５，５００，３６２号（また、例、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８３，ｐｐ．７０５９－７０６３，１９８６を参照のこと）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８２，ｐｐ．１４９９－１５０２，１９８５；米国特許第５，８２１，３３７号（また、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．１６６，ｐｐ．１３５１－１３６１，１９８７を参照のこと）において記載されている。あるいは、非放射性アッセイ方法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州マウンテンビュー）；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を参照のこと）。そのようなアッセイのために有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいは、又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９５，ｐｐ．６５２－６５６，１９９８において開示されているような動物モデルにおいて評価されうる。Ｃ１ｑ結合アッセイも行って、抗体がＣ１ｑに結合することができず、それ故にＣＤＣ活性を欠くことを確認してもよい。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施してもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．２０２，ｐｐ．１６３－１７１，１９９６；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０１，ｐｐ．１０４５－１０５２，２００３；及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ，ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０３，ｐｐ．２７３８－２７４３，２００４を参照のこと）。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期の決定を、また、当技術分野において公知の方法を使用して実施することができる（例、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１８，ｐｐ．１７５９－１７６９，２００６を参照のこと）。
低下したエフェクター機能を伴う抗体又は抗体フラグメントの変異体は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９（米国特許第６，７３７，０５６号）の１つ又は複数の置換を伴うものを含む。そのようなＦｃ変異体は、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７の２つ又はそれより多くで置換を伴うＦｃ変異体を含み、アラニンへの残基２６５及び２９７の置換を伴う、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
ＦｃＲへの改善又は減弱された結合を伴う特定の抗体変異体が記載されている。（例、米国特許第６，７３７，０５６号；ＷＯ２００４／０５６３１２、及びＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．９，ｐｐ．６５９１－６６０４，２００１を参照のこと）。
特定の実施形態では、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善させる１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４での置換（残基のＥＵナンバリング）を伴うＦｃ領域を含む。
一部の実施形態では、変化がＦｃ領域中で作られ、それらによって変化された（即ち、改善又は減弱された）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）がもたらされ、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１６４，ｐｐ．４１７８－４１８４，２０００において記載されている通りである。
増加した半減期及び新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）（胎児への母体ＩｇＧの移行について関与している（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１１７，ｐｐ．５８７－５９３，１９７６及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．２４，ｐ．２４９，１９９４））への改善された結合を伴う抗体が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号において記載されている。それらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善させる、その中の１つ又は複数の置換を伴うＦｃ領域を含む。そのようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、又は４３４の１つ又は複数での置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換（米国特許第７，３７１，８２６号）を伴うものを含む。また、Ｆｃ領域変異体の他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３２２，ｐｐ．７３８－７４０，１９８８；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及びＷＯ９４／２９３５１を参照のこと。
システイン操作抗体変異体
特定の実施形態では、システイン操作抗体、例えば、「チオＭＡｂ」を作製することが望ましいであろうが、それにおいて、抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントの１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換されている。特定の実施形態では、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それにより、抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載するように、抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー－薬物部分などにコンジュゲートさせてイムノコンジュゲートを作製するために使用してもよい。特定の実施形態では、以下の残基の任意の１つ又は複数は、システインで置換されうる：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔナンバリング）；重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）；及び重鎖Ｆｃ領域の５４００（ＥＵナンバリング）。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号において記載されているように生成されうる。
抗体誘導体
特定の実施形態では、本明細書中で提供する抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントは、当技術分野において公知であり、容易に入手可能な追加の非タンパク質性部分を含むようにさらに改変されうる。抗体又は抗体フラグメントの誘導体化のために適切な部分は、水溶性ポリマーを含むが、それに限定しない。水溶性ポリマーの非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、酸化プロリプロピレン／酸化エチレンコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例、グリセロール）、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物を含むが、それらに限定しない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性に起因して、製造における利点を有しうる。ポリマーは任意の分子量でありうる、及び分枝又は非分枝でありうる。抗体又は抗体フラグメントに付着されているポリマーの数は変動しうるが、１を上回るポリマーが付着されている場合、それらは同じ分子又は異なる分子でありうる。一般的に、誘導体化のために使用されるポリマーの数及び／又は型は、誘導体が定義された条件下での治療において使用される否かを問わず、考慮（改善される抗体又は抗体フラグメントの特定の特性又は機能などを含むが、それらに限定しない）に基づいて決定することができる。
別の実施形態では、抗体又は抗体フラグメント及び放射線への曝露により選択的に加熱されうる非タンパク質性部分のコンジュゲートが提供される。一実施形態では、非タンパク質性部分はカーボンナノチューブである（Ｋａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１０２，ｐｐ．１１６００－１１６０５，２００５）。放射線は任意の波長でありうるが、通常の細胞に害を及ぼさないが、しかし、非タンパク質性部分を、抗体－非タンパク質性部分への近位の細胞が死滅される温度まで加熱する波長を含むが、それに限定しない。
本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメント、あるいはそれらの変異体は、非腫瘍微小環境中の条件下よりも、腫瘍微小環境中の条件下で、ＥｐＣＡＭへのより高い結合親和性を有する。一実施形態では、腫瘍微小環境中の条件及び非腫瘍微小環境中の条件は、両方ともｐＨである。本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントは、このように、ｐＨ約５．０～６．８でＥｐＣＡＭに選択的に結合することができるが、通常の非腫瘍微小環境中で遭遇するｐＨ約７．２～７．８ではＥｐＣＡＭへのより低い結合親和性を有しうる。実施例３及び６において示すように、抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントは、ｐＨ７．４よりも、ｐＨ６．０でＥｐＣＡＭへのより高い結合親和性を有する。
特定の実施形態では、本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントは、約≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例、１０-8Ｍ又はそれ未満、あるいは１０-8Ｍ～１０-13Ｍ、あるいは１０-9Ｍ～１０-13Ｍ）の、腫瘍微小環境における条件下でのＥｐＣＡＭとの解離定数（Ｋｄ）を有する。一実施形態では、腫瘍微小環境における条件での抗体又は抗体フラグメントとＥｐＣＡＭとのＫｄと、非腫瘍微小環境における同じ条件でのＫｄとの比率は、少なくとも約１．５：１、少なくとも約２：１、少なくとも約３：１、少なくとも約４：１、少なくとも約５：１、少なくとも約６：１、少なくとも約７：１、少なくとも約８：１、少なくとも約９：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約２０：１、少なくとも約３０：１、少なくとも約５０：１、少なくとも約７０：１、又は少なくとも約１００：１である。
一実施形態では、Ｋｄは、以下のアッセイを使用し、目的の抗体のＦａｂバージョン及びその抗原を用いて実施される放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。抗原についてのＦａｂの溶液結合親和性は、Ｆａｂを、滴定系列の非標識抗原の存在において、最小濃度の（125Ｉ）標識抗原を用いて平衡化し、次に結合した抗原を、抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートを用いて捕捉することにより測定される（例、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９）を参照のこと）。アッセイのための条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍｌの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）を用いて一晩コーティングし、その後にＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを室温（約２３℃）で２～５時間にわたり用いてブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）中で、１００ｐＭ又は２６ｐＭ［125Ｉ］－抗原を、目的のＦａｂの段階希釈液と混合する（例、Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４５９３－４５９９（１９９７）における抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ－１２の評価と一致する）。目的のＦａｂを次に一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは、平衡に達することを確実にするために、より長い期間（例、約６５時間）にわたり継続しうる。その後、混合物を、室温での（例、１時間にわたる）インキュベーションのために捕捉プレートに移す。この溶液を次に除去し、プレートをＰＢＳ中の０．１％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０（登録商標））を用いて８回洗浄する。プレートが乾燥した際、１５０μｌ／ウェルのシンチラント（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ－２０（商標）；Ｐａｃｋａｒｄ）を加えて、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で１０分間にわたりカウントする。２０％を下回る又はそれに等しい最大結合を与える各々のＦａｂの濃度を、競合結合アッセイにおける使用のために選ぶ。
別の実施形態によれば、Ｋｄを、約１０応答単位（ＲＵ）での固定化された抗原ＣＭ５チップを用いて、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用した表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定する。簡単には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、供給元の説明書に従って、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて活性化させる。抗原を、５μｌ／分の流速での注入前に、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８を用いて５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈し、約１０応答単位（ＲＵ）のコンジュゲートタンパク質を達成する。抗原の注入に続いて、１Ｍエタノールアミンを注入して未反応基をブロックする。速度論的測定のために、Ｆａｂの２倍段階希釈物（０．７８ｎＭ～５００ｎＭ）を、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０（商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）を伴うＰＢＳ中に２５℃で約２５μｌ／分の流速で注入する。会合率（ｋon）及び解離率（ｋoff）は、単純な１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を使用し、会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィットさせることにより計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）を、比率ｋoff／ｋonとして計算する。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９）を参照のこと。オンレートが、上の表面プラズモン共鳴アッセイにより１０6Ｍ-1 ｓ-1を超える場合、次にこのオンレートは、分光計、例えばストップフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）及び撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ－ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などにおいて測定されるように、増加濃度の抗原の存在において、２５℃での、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中の２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を使用することにより決定することができる。
本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体でありうる。一実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ抗体フラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ又はＦ（ａｂ’）2フラグメント、及び抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体を用いる。別の実施形態では、抗体は、全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ抗体、又は本明細書中で定義する他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。特定の抗体フラグメントの概説については、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．９，ｐｐ．１２９－１３４，２００３を参照のこと。ｓｃＦｖフラグメントの概説については、例えばＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照のこと；また、ＷＯ９３／１６１８５；ならびに米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号を参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、増加したインビボ半減期を有するＦａｂ及びＦ（ａｂ’）2フラグメントの考察については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照のこと。
本発明のダイアボディは、二価又は二重特異的でありうる。ダイアボディの例については、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９０，ｐｐ．６４４４－６４４８，１９９３を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディの例はまた、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．９，ｐｐ．１２９－１３４，２００３において記載されている。
一部の実施形態では、本発明は、抗体の重鎖可変ドメインの全部又は一部あるいは軽鎖可変ドメインの全部又は一部を含む単一ドメイン抗体フラグメントを含む。特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ウォルサム；例えば、米国特許第６，２４８，５１６ Ｂ１号を参照のこと）。
抗体フラグメントは、本明細書中に記載されているように、種々の技術（インタクトな抗体のタンパク質分解消化、ならびに組換え宿主細胞（例、大腸菌又はファージ）による産生を含むが、それらに限定しない）により作ることができる。
一部の実施形態では、本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体は、キメラ抗体でありうる。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８１，ｐｐ．６８５１－６８５５，１９８４）において記載されている。１つ例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又は非ヒト霊長類、例えばサルなどから由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、抗体のクラス又はサブクラスが、親抗体のクラス又はサブクラスと比べて変化している「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体はその抗原結合フラグメントを含む。
特定の実施形態では、本発明のキメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、そのような非ヒト抗体は、ヒトへの免疫原性を低下させるためにヒト化される一方で、親の非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持している。一般的に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ（又はその部分）が非ヒト抗体から由来し、及びＦＲ（又はその部分）がヒト抗体配列から由来する１つ又は複数の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、場合により、ヒト定常領域の少なくとも部分を含みうる。一部の実施形態では、ヒト化抗体中の一部のＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例、ＣＤＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。
ヒト化抗体及びそれらを作製する方法が、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．１６１９－１６３３，２００８において概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３３２，ｐｐ．３２３－３２９，１９８８；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８６，ｐｐ．１００２９－１００３３，１９８９；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び同第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．３６，ｐｐ．２５－３４，２００５（ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）移植を記載している）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．２８，ｐｐ．４８９－４９８，１９９１（「リサーフェシング」を記載している）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．３６，ｐｐ．４３－６０，２００５（「ＦＲシャッフリング」を記載している）；ならびにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．３６，ｐｐ．６１－６８，２００５及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．８３，ｐｐ．２５２－２６０，２０００（ＦＲシャッフリングへの「ガイド付き選択」アプローチを記載している）においてさらに記載されている。
ヒト化のために使用されうるヒトフレームワーク領域は、以下を含むが、それらに限定しない：「ベストフィット」方法を使用して選択されたフレームワーク領域（例、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１５１，ｐ．２２９６，１９９３を参照のこと）；軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列から由来するフレームワーク領域（例、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．８９，ｐ．４２８５，１９９２；及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１５１，ｐ．２６２３，１９９３を参照のこと）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク領域（例、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．１６１９－１６３３，２００８を参照のこと）；及びＦＲライブラリーをスクリーニングすることから由来するフレームワーク領域（例、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７２，ｐｐ．１０６７８－１０６８４，１９９７及びＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７１，ｐｐ．２２６１１－２２６１８，１９９６を参照のこと）。
一部の実施形態では、本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体は、多重特異性、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位について結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施形態では、結合特異性の１つは、ＥｐＣＡＭについてであり、他は、別の抗原、例えばＣＤ３などについてである。このことの１つの特定の例は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ３＋についての結合特異性を伴う二重特異性抗体である。二重特異性の条件付きで活性な抗体は、単一条件付きで活性でありうる又は二重条件付きで活性でありうる。このように、単一条件付きで活性な二重特異性抗体の場合では、結合部位の１つは条件付きで活性であり、他、例えば、条件付きで活性な（ＣＡＢ）ＣＤ３＋と対形成した野生型（ＷＴ）ＥｐＣＡＭ又はＷＴ ＣＤ３＋と対形成したＣＡＢ ＥｐＣＡＭは活性ではない。二重条件付きで活性な抗体の場合では、両方の結合部位は、ＣＡＢ ＥｐＣＡＭ ｘ ＣＡＢ ＣＤ３＋におけるように条件付きで活性である。
本発明の二重特異性抗体は、以下の表において示す抗体を含みうる：
Figure 2022531504000003
二重特異性抗体又は抗体フラグメントは、ＶＫ領域により又は軽鎖全体により特定されうる。このように、二重特異性抗体はまた、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む二重特異性抗体又は抗体フラグメントでありうるが、各々の領域は、独立して、配列番号３５、４３、及び４７からなる群より選択されるＶＫ領域ならびに配列番号３７、４５、及び４９からなる群より選択されるＶＨ領域の組み合わせと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する。同じ二重特異性抗体又は抗体フラグメントは代わりに、配列番号３６、４４、及び４８からなる群より選択される軽鎖に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する軽鎖を含みうる。同じ二重特異性抗体又は抗体フラグメントは、配列番号３８、４６、及び５０からなる群より選択される抗ＣＤ３－ｓｃＦｖと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する抗ＣＤ３－ｓｃＦｖを含みうる。
多重特異性抗体は、単一、二重、三重などの条件付きで活性でありうる。このように、多重特異性抗体の結合領域の任意の１つ又は複数は、条件付きで活性でありうる。
特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ＥｐＣＡＭの２つの異なるエピトープに結合しうる。二重特異性抗体はまた、ＥｐＣＡＭを発現する細胞に細胞傷害性薬剤を局在化させるために使用してもよい。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体フラグメントとして調製することができる。
多重特異性抗体を作製するための技術は、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え同時発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３０５，ｐｐ．５３７－５４０，１９８３を参照のこと）、ＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．ｖｏｌ．１０，ｐｐ．３６５５－３６５９，１９９１）、及び「ノブインホール」操作（例、米国特許第５，７３１，１６８号を参照のこと）を含むが、それらに限定しない。多重特異性抗体はまた、抗体のＦｃヘテロ二量体分子を作るための静電ステアリング効果を操作する（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）；２つ又はそれより多くの抗体又はフラグメントを架橋する（例、米国特許第４，６７６，９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２２９，ｐｐ．８１－８３，１９８５を参照のこと）；ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を産生する（例、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１４８，ｐｐ．１５４７－１５５３，１９９２を参照のこと）；二重特異性抗体フラグメントを作製するための「ダイアボディ」技術を使用する（例、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９０，ｐｐ．６４４４－６４４８，１９９３を参照のこと）；単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）二量体を使用する（例、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１５２，ｐｐ．５３６８－５３７４，１９９４を参照のこと）；及び、例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１４７，ｐｐ．６０－６９，１９９１において記載されているように、三重特異性抗体を調製することにより作製してもよい。
３つ又はそれより多くの機能的抗原結合部位を伴う操作抗体（「オクトパス抗体」を含む）がまた、本明細書中に含まれる（例、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号を参照のこと）。
本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントは、組換え方法及び組成物を使用して産生されうるが、それらは米国特許出願公開第２０１６／００１７０４０号において詳細に記載されている。
本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントの物理的／化学的特性及び／又は生物学的活性は、当技術分野において公知の種々のアッセイによりテスト及び測定されうる。これらのアッセイの一部は、米国特許第８，８５３，３６９号において記載されている。
Ｂ．イムノコンジュゲート
別の態様では、本発明はまた、１つ又は複数の細胞傷害性薬剤、例えば化学療法剤又は薬物、成長阻害剤、毒素（例、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物由来の酵素的に活性な毒素、又はそれらのフラグメント）など、及び放射性同位体にコンジュゲートされた抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントを含むイムノコンジュゲートを提供する。
一実施形態では、イムノコンジュゲートは、抗体又は抗体フラグメントが、１つ又は複数の薬物（メイタンシノイド（米国特許第５，２０８，０２０号、同第５，４１６，０６４号及び欧州特許０４２５２３５Ｂ１号を参照のこと）；アウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチンの薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）など（米国特許第５，６３５，４８３号及び同第５，７８０，５８８号及び同第７，４９８，２９８号を参照のこと）；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５，７１２，３７４号、同第５，７１４，５８６号、同第５，７３９，１１６号、同第５，７６７，２８５号、同第５，７７０，７０１号、同第５，７７０，７１０号、同第５，７７３，００１号、及び同第５，８７７，２９６号；Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．５３，ｐｐ．３３３６－３３４２，１９９３；及びＬｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．２９２５－２９２８，１９９８を参照のこと）；アントラサイクリン、例えばダウノマイシン又はドキソルビシンなど（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．４７７－５２３，２００６；Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．１６，ｐｐ．３５８－３６２，２００６；Ｔｏｒｇｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１６，ｐｐ．７１７－７２１，２００５；Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９７，ｐｐ．８２９－８３４，２０００；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．１２，ｖｏｌ．１５２９－１５３２，２００２；Ｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．４５，ｐｐ．４３３６－４３４３，２００２；及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照のこと）；メトトレキサート；ビンデシン；タキサン、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなど；トリコテセン；及びＣＣ１０６５を含むが、それらに限定しない）にコンジュゲートされている抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。
別の実施形態では、イムノコンジュゲートは、酵素的に活性な毒素又はそのフラグメント（ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌から）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ジェロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンを含むが、それらに限定しない）にコンジュゲートされた、本明細書中に記載する抗体又は抗体フラグメントを含む。
別の実施形態では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートされて放射性コンジュゲートを形成する、本明細書中に記載する抗体又は抗体フラグメントを含む。多様な放射性同位元素が、放射性コンジュゲートの産生のために利用可能である。例は、Ａｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｒｅ188、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32、Ｐｂ212、及びＬｕの放射性同位体を含む。放射性コンジュゲートが検出用に使用される場合、それは、シンチグラフィー試験用の放射性原子、例えば、ｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ＭＲＩとしても公知である）用のスピン標識、例えばヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガン、及び鉄などを含めてもよい。
一部の実施形態では、イムノコンジュゲートは放射性薬剤を含み、それはアルファエミッター、ベータエミッター、及びガンマエミッターより選択されうる。アルファエミッターの例は、211Ａｔ、210Ｂｉ、212Ｂｉ、211Ｂｉ、223Ｒａ、224Ｒａ、225Ａｃ、及び227Ｔｈである。ベータエミッターの例は67Ｃｕ、90Ｙ、131Ｉ、153Ｓｍ、l66Ｈｏ、及び186Ｒｅである。ガンマエミッターの例は、60Ｃｏ、137Ｃｅ、55Ｆｅ、54Ｍｇ、203Ｈｇ、及び133Ｂａである。
抗体／抗体フラグメント及び細胞傷害性薬剤のコンジュゲートは、多様な二機能性タンパク質カップリング薬剤、例えばＮ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌなど）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレートなど）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒドなど）、ビスアジド化合物（例えばビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えばビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６－ジイソシアネートなど）、及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンなど）などを使用して作られうる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２３８，ｐｐ．１０９８－，１９８７において記載されるように調製することができる。炭素１４標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドのコンジュゲートのための例示的なキレート薬剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。このリンカーは、細胞中での細胞傷害性薬物の放出を促進する「切断可能なリンカー」でありうる。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光に不安定なリンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．５２，ｐｐ．１２７－１３１，１９９２；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用してもよい。
本明細書中のイムノコンジュゲートは、架橋試薬（ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＬＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、及びスルホ－ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むが、それらに限定せず、これらは商業的に入手可能である（例、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、米国イリノイ州ロックフォードから））を用いて調製されたコンジュゲートを明示的に熟慮する。
ＡＤＣの例示的な実施形態は、腫瘍細胞を標的化する抗体又は抗体フラグメント（Ａｂ）、薬物部分（Ｄ）、及びＡｂをＤに付着させるリンカー部分（Ｌ）を含む。一部の実施形態では、抗体は、１つ又は複数のアミノ酸残基、例えばリジン及び／又はシステインなどを通じてリンカー部分（Ｌ）に付着される。
例示的なＡＤＣは、Ａｂ－（Ｌ－Ｄ）pとして式Ｉを有し、ここでｐは１～約２０である。一部の実施形態では、抗体にコンジュゲートさせることができる薬物部分の数は、遊離システイン残基の数により限定される。一部の実施形態では、遊離システイン残基が、本明細書中に記載される方法により抗体アミノ酸配列中に導入される。式Ｉの例示的なＡＤＣは、１、２、３、又は４の操作システインアミノ酸を有する抗体を含むが、それらに限定しない（Ｌｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ．，ｖｏｌ．５０２，ｐｐ．１２３－１３８，２０１２）。一部の実施形態では、１つ又は複数の遊離システイン残基は、操作の使用を伴わずに、抗体中に既に存在しており、その場合では、既存の遊離システイン残基を、抗体を薬物にコンジュゲートさせるために使用してもよい。一部の実施形態では、抗体は、１つ又は複数の遊離システイン残基を生成するために、抗体のコンジュゲートの前に還元条件に曝露される。
リンカーは、部分を抗体にコンジュゲートさせて、イムノコンジュゲート、例えばＡＤＣなどを形成するために使用される。適切なリンカーは、ＷＯ２０１７／１８０８４２において記載されている。
抗体にコンジュゲートされうる一部の薬物部分が、ＷＯ２０１７／１８０８４２において記載されている。
薬物部分はまた、核酸分解活性を伴う化合物（例、リボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ）を含む。
特定の実施形態では、イムノコンジュゲートは、高放射性原子を含みうる。多様な放射性同位体が、放射性コンジュゲート抗体の産生のために利用可能である。例は、Ａｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｒｅ188、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32、Ｐｂ212、及びＬｕの放射性同位体を含む。一部の実施形態では、イムノコンジュゲートが検出のために使用される場合、それは、シンチグラフィー試験のための放射性原子、例えば、Ｔｃ99もしくは１123、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ＭＲＩとしても公知である）のためのスピン標識、例えばジルコニウム－８９、ヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガン、又は鉄などを含みうる。ジルコニウム－８９は、種々の金属キレート薬剤に複合体化させて、抗体にコンジュゲートさせてもよい（例、ＰＥＴイメージングのため）（ＷＯ２０１１／０５６９８３）。
放射性標識又は他の標識は、公知の方法においてイムノコンジュゲート中に組み入れてもよい。例えば、ペプチドは、例えば、１つ又は複数の水素の代わりに１つ又は複数のフッ素－１９原子を含む適切なアミノ酸前駆体を使用して生合成又は化学的に合成されうる。一部の実施形態では、標識、例えばＴｃ99、Ｉ123、Ｒｅ186、Ｒｅ188、及びＩｎ111などは、抗体中のシステイン残基を介して付着させることができる。一部の実施形態では、イットリウム－９０は、抗体のリジン残基を介して付着させることができる。一部の実施形態では、ＩＯＤＯＧＥＮ方法（Ｆｒａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，ｖｏｌ．８０，ｐｐ．４９－５７，１９７８）を使用して、ヨウ素－１２３を組み入れることができる。「免疫シンチグラフィーにおけるモノクローナル抗体」（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９）には、特定の他の方法が記載されている。
特定の実施形態では、イムノコンジュゲートは、プロドラッグ活性化酵素にコンジュゲートされた抗体を含みうる。一部のそのような実施形態では、プロドラッグ活性化酵素によって、プロドラッグ（例、ペプチジル化学療法剤、ＷＯ８１／０１１４５を参照のこと）が、活性薬物、例えば抗癌薬物などに変換される。そのようなイムノコンジュゲートは、一部の実施形態では、抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ治療（「ＡＤＥＰＴ」）において有用である。抗体にコンジュゲートされうる酵素は、アルカリホスファターゼ（リン酸塩含有プロドラッグを遊離薬物に変換するために有用である）；アリールスルファターゼ（硫酸塩含有プロドラッグを遊離薬物に変換するために有用である）；シトシンデアミナーゼ（非毒性５－フルオロシトシンを抗癌剤５－フルオロウラシルに変換するために有用である）；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、熱分解、スブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、及びカテプシン（例えばカテプシンＢ及びＬなど）など（ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換するために有用である）；Ｄ－アラニルカルボキシペプチダーゼ（Ｄ－アミノ酸置換基を含むプロドラッグを変換するために有用である）；炭水化物切断酵素、例えばβ－ガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼなど（グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するために有用である）；β－ラクタマーゼ（β－ラクタムを用いて誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するために有用である）；ならびにペニシリンアミダーゼ、例えばペニシリンＶアミダーゼ及びペニシリンＧアミダーゼなど（それぞれフェノキシアセチル基又はフェニルアセチル基を伴うそれらのアミン窒素で誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するために有用である）を含むが、それらに限定しない。一部の実施形態では、酵素は、当技術分野において周知の組換えＤＮＡ技術により抗体に共有結合的に結合されうる。例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３１２，ｐｐ．６０４－６０８，１９８４を参照のこと。
コンジュゲート中での薬物負荷は、ｐ（抗体当たりの薬物部分の平均数）により表される。薬物負荷は、抗体当たり１～２０の薬物部分の範囲でありうる。本発明のコンジュゲートは、１～２０の薬物部分の範囲を有しうる。コンジュゲート反応からのコンジュゲートの調製における抗体使用当たりでの薬物部分の平均数は、従来の手段、例えば質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、及びＨＰＬＣなどにより特徴付けられうる。
一部の抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）について、薬物負荷は、抗体上の付着部位の数により限定されうる。例えば、付着がシステインチオールである場合、上の特定の例示的な実施形態におけるように、抗体は、１つ又はいくつかのシステインチオール基だけを有しうる、あるいはリンカーが付着されうる１つ又はいくつかの十分に反応性のチオール基だけを有しうる。特定の実施形態では、より高い薬物負荷（例、ｐ＞５）は、特定の抗体－薬物コンジュゲートの凝集、不溶性、毒性、又は細胞透過性の喪失を起こしうる。特定の実施形態では、ＡＤＣについての平均薬物負荷は、１～約８；約２～約６；又は約３～約５の範囲である。実際に、特定のＡＤＣについて、抗体当たりの薬物部分の最適な比率は８を下回り、約２～約５でありうることが示されている（米国特許第７，４９８，２９８号）。
特定の実施形態では、薬物部分の理論上の最大値よりも少ないものが、コンジュゲート反応の間に抗体にコンジュゲートされる。抗体は、例えば、以下で考察されているように、薬物－リンカー中間体又はリンカー試薬と反応しないリジン残基を含みうる。一般的に、抗体は、薬物部分に連結されうる多くの遊離及び反応性システインチオール基を含まない。実際に、抗体中の大半のシステインチオール残基がジスルフィド架橋として存在する。特定の実施形態では、抗体は、部分的又は全体的な還元条件下で、還元剤、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はトリカルボニルエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）などを用いて還元されて、反応性システインチオール基を生成しうる。特定の実施形態では、抗体は、反応性求核基、例えばリジン又はシステインなどを明らかにするために変性条件に供される。
ＡＤＣの負荷（薬物／抗体比率）は、異なる方法において、例えば、（ｉ）抗体に対する薬物－リンカー中間体又はリンカー試薬のモル過剰を限定すること、（ｉｉ）コンジュゲート反応時間又は温度を限定すること、及び（ｉｉｉ）システインチオール修飾のための部分的又は限定的な還元条件により制御されうる。
Ｃ．診断及び検出のための方法及び組成物。
特定の実施形態では、本明細書中で提供される抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントのいずれかが、生物学的サンプル中のＥｐＣＡＭの存在を定量的又は定性的のいずれかで検出するために使用されうる。特定の実施形態では、生物学的サンプルは、細胞もしくは組織、例えば乳房、膵臓、食道、肺、及び／又は脳の細胞もしくは組織などを含む。
本発明のさらなる態様は、ＥｐＣＡＭ発現レベルが正常な生理学的レベルから、身体における少なくとも１つの場所で増加又は減少する癌又は別の疾患を診断及び／又はモニタリングするための本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントに関する。
好ましい実施形態では、本発明の抗体又は抗体フラグメントは、検出可能な分子又は物質、例えば蛍光分子、放射性分子、又は上に記載する当技術分野において公知の任意の他の標識を用いて標識されうる。例えば、本発明の抗体又は抗体フラグメントは、放射性分子を用いて標識されうる。例えば、適切な放射性分子は、シンチグラフィー試験のために使用される放射性原子、例えば123Ｉ、124Ｉ、111Ｉｎ、186Ｒｅ、及び188Ｒｅなどを含むが、それらに限定しない。本発明の抗体又は抗体フラグメントはまた、核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージングのためのスピン標識、例えばヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－ＩＩＩ、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガン、又は鉄などを用いて標識してもよい。抗体の投与後、患者内の放射性標識抗体の分布が検出される。任意の適切な公知の方法を使用することができる。一部の非限定的な例は、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、ポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、蛍光、化学発光、及び超音波検査を含む。
本発明の抗体又は抗体フラグメントは、ＥｐＣＡＭの過剰発現に関連付けられる癌及び疾患の診断及び病期分類のために有用でありうる。ＥｐＣＡＭの過剰発現に関連付けられる癌は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、膵臓癌、グリア細胞腫瘍、例えば神経膠芽細胞腫及び神経線維腫症など、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、黒色腫、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肉腫、血液癌（白血病）、星状細胞腫、及び種々の型の頭頸部癌又は他のＥｐＣＡＭを発現もしくは過剰発現する過剰増殖性疾患を含みうる。
本発明の抗体又は抗体フラグメントは、ＥｐＣＡＭ発現が増加又は減少する癌以外の疾患を診断するために有用でありうる。可溶性又は細胞性ＥｐＣＡＭ形態の両方をそのような診断のために使用することができる。典型的には、そのような診断方法は、患者から得られた生物学的サンプルの使用を含む。生物学的サンプルは、診断アッセイ又はモニタリングアッセイにおいて使用することができる対象から得られた多様なサンプル型を包含する。生物学的サンプルは、血液及び生物学的起源の他の液体サンプル、固体組織サンプル、例えば生検標本又は組織培養物又はそれらから由来する細胞など、ならびにそれらの後代を含むが、それらに限定しない。例えば、生物学的サンプルは、ＥｐＣＡＭ過剰発現に関連付けられる癌を有すると疑われる個体から収集された組織サンプルから、好ましい実施形態では、神経膠腫、胃、肺、膵臓、乳房、前立腺、腎臓、肝臓、及び子宮内膜から得られた細胞を含む。生物学的サンプルは、臨床サンプル、培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生物学的液体、及び組織サンプルを包含する。
特定の実施形態では、本発明は、本発明の抗体を使用して対象からの細胞上のＥｐＣＡＭを検出することにより、対象におけるＥｐＣＡＭ過剰発現に関連付けられる癌を診断する方法である。特に、前記方法は、以下の工程を含みうる：
１）対象の生物学的サンプルを、抗体又は抗体フラグメントについて適切な条件下で本発明に従った抗体又は抗体フラグメントと接触させ、ＥｐＣＡＭを発現する生物学的サンプル中の細胞と複合体を形成すること；及び
（ｂ）前記複合体を検出及び／又は定量化し、それにより、前記複合体の検出は、ＥｐＣＡＭ過剰発現に関連付けられる癌を示している。
癌の進行をモニタリングするために、本発明に従った方法を異なる時間に繰り返してもよく、サンプルへの抗体結合が増加又は減少するか否かを決定するために、そこから、癌が進行した、退行した、又は安定化したか否かを決定することができる。
特定の実施形態では、本発明は、ＥｐＣＡＭの発現又は過剰発現に関連付けられる疾患を診断する方法である。そのような疾患の例は、癌、ヒト免疫障害、血栓性疾患（血栓症及びアテローム血栓症）、及び心血管疾患を含みうる。
一実施形態では、診断又は検出の方法における使用のための抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントが提供される。さらなる態様では、生物学的サンプル中のＥｐＣＡＭ４の存在を検出する方法が提供される。さらなる態様では、生物学的サンプル中のＥｐＣＡＭの量を定量化する方法が提供される。特定の実施形態では、この方法は、生物学的サンプルを、本明細書中に記載する抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントと、ＥｐＣＡＭへの抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントの結合について許容的な条件下で接触させること、ならびに複合体が抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメント及びＥｐＣＡＭの間で形成されるか否かを検出することを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボで行ってもよい。一実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ４抗体又は抗体フラグメントを使用して、治療について適格な対象を選択する。一部の実施形態では、治療は、対象への抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントの投与を含むであろう。
特定の実施形態では、標識された抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントが提供される。標識は、直接的に検出される標識又は部分（例えば蛍光標識、発色団標識、電子密度標識、化学発光標識、及び放射性標識など）、ならびに、例えば、酵素反応又は分子相互作用を介して間接的に検出される部分、例えば酵素又はリガンドなどを含むが、それらに限定しない。例示的な標識は、放射性同位元素32Ｐ、14Ｃ、125Ｉ、3Ｈ、及び131Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体など、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルセリフェラーゼ（例、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ（例、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環式オキシダーゼ（例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなど（過酸化水素を用いて色素前駆体を酸化する酵素、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼなどとカップリングされる）、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定なフリーラジカルなどを含むが、それらに限定しない。
Ｄ．医薬製剤
抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントは細胞死滅活性を有する。この細胞死滅活性は、複数の異なる型の細胞株にまで広がる。さらに、これらの抗体又は抗体フラグメントは、一度、細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされると、腫瘍サイズを低下させることができ、低下した毒性を示しうる。このように、抗ＥｐＣＡＭ抗体、そのフラグメント又はイムノコンジュゲートは、ＥｐＣＡＭ発現に関連付けられる増殖性疾患を処置するために有用でありうる。抗体、フラグメント又はイムノコンジュゲートは、単独で、又は任意の適切な薬剤もしくは他の従来の処置との組み合わせにおいて使用してもよい。
抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントは、ＥｐＣＡＭ発現、過剰発現、又は活性化に関連付けられる疾患を処置するために使用されうる。ＥｐＣＡＭ発現の要件以外に処置することができる癌又は組織の型に特別な限定はない。例は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、膵臓癌、グリア細胞腫瘍、例えば神経膠芽細胞腫及び神経線維腫症など、子宮頚部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、黒色腫、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肉腫、血液癌（白血病）、星状細胞腫、及び種々の型の頭頚部癌を含む。より好ましい癌は、神経膠腫、胃癌、肺癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、腎癌、肝癌、及び子宮内膜癌である。
抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントは、自然免疫応答の潜在的な活性化因子であり、このように、ヒト免疫障害、例えば敗血症などの処置において使用されうる。本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントはまた、免疫化のための、例えばワクチンなどのためのアジュバントとして、ならびに、例えば、細菌、ウイルス、及び寄生虫に対する抗感染薬剤として使用されうる。
抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントは、血栓性疾患、例えば静脈及び動脈血栓症ならびにアテローム血栓症などに対して保護する、それを防止、又は処置するために使用されうる。抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントはまた、心血管疾患に対して保護する、それを防止又は処置するために、ならびにウイルス、例えばラッサウイルス及びエボラウイルスなどの侵入を防止又は阻害するために、及びウイルス感染を処置するために使用されうる。
本明細書中に記載する処置方法の実施形態の各々において、抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗体フラグメント又は抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントイムノコンジュゲートは、処置が求められている疾患又は障害の管理に関連付けられる従来の方法論と一致する様式において送達されうる。本明細書の開示に従って、有効量の抗体、抗体フラグメント、又はイムノコンジュゲートが、疾患又は障害を防止又は処置するのに十分な時間にわたり及び条件下で、そのような処置を必要とする対象に投与される。このように、本発明の一態様は、それを必要とする対象に、治療有効量の本発明の抗体、抗体フラグメント又はイムノコンジュゲートを投与することを含む、ＥｐＣＡＭの発現に関連付けられる疾患を処置するための方法に関する。
投与のために、抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗体フラグメント又はイムノコンジュゲートは、医薬組成物として製剤化されうる。抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗体フラグメント、又はイムノコンジュゲートを含む医薬組成物は、医薬組成物を調製するための公知の方法に従って製剤化することができる。そのような方法では、治療用分子は、典型的には、医薬的に許容可能な担体を含む混合物、溶液、又は組成物と組み合わされる。
医薬的に許容可能な担体は、レシピエント患者により許容されることができる材料である。無菌リン酸緩衝生理食塩水は、医薬的に許容可能な担体の１つの例である。他の適切な医薬的に許容可能な担体は、当業者に周知である。（例、Ｇｅｎｎａｒｏ （ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９ｔｈ ｅｄ．１９９５）を参照のこと）。製剤は、バイアル表面などでのタンパク質の損失を防止するために、１つ又は複数の添加剤、保存剤、可溶化剤、緩衝薬剤、アルブミンをさらに含みうる。
医薬組成物の形態、投与経路、投与量及びレジメンは、自然に、処置される状態、病気の重症度、患者の年齢、体重、及び性別などに依存する。これらの考慮が、適切な医薬組成物を製剤化するために当業者により入れられる。本発明の医薬組成物は、局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、又は眼内投与などのために製剤化することができる。
好ましくは、医薬組成物は、注射することが可能な製剤のために医薬的に許容可能である賦形剤を含む。これらは、特に、等張性無菌生理食塩水（リン酸一ナトリウム又は二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム、又はマグネシウムなど、又はそのような塩の混合物）、又は乾燥した、特に凍結乾燥した組成物でありうるが、それらによって、例えば、無菌水又は生理食塩水の添加時に、注射可能な溶液の構成が可能になる。
一部の実施形態では、等張化剤は、時折「安定剤」として公知であり、組成物中の液体の張性を調整又は維持するために存在している。大きな荷電生体分子、例えばタンパク質及び抗体などと使用される場合、それらはしばしば、「安定剤」とも呼ばれる。なぜなら、それらは、アミノ酸側鎖の荷電基と相互作用し、それにより、分子間及び分子内相互作用の可能性を減らすことができるためである。等張化剤は、０．１重量％～２５重量％、好ましくは医薬組成物の１～５％の任意の量で存在することができる。好ましい等張化剤は、多価糖アルコール、好ましくは三価又はそれより多価の糖アルコール、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトールなどを含む。
追加の添加剤は、以下の１つ又は複数として役立つことができる薬剤を含む：（１）増量剤、（２）溶解性増強剤、（３）安定剤、及び（４）及び変性又は容器壁への付着を防止する薬剤。そのような添加剤は以下を含みうる：多価糖アルコール（上に列挙する）；アミノ酸、例えばアラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど；有機糖又は糖アルコール、例えばスクロース、ラクトース、ラクチトール、トレハロース、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース、ミオイニシトール、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例、イノシトール）、ポリエチレングリコールなど；硫黄含有還元剤、例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコレートナトリウム、チオグリセロール、α－モノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウムなど；低分子量タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、又は他の免疫グロブリンなど；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンなど；単糖類（例、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース；二糖類（例、ラクトース、マルトース、スクロース）；三糖類、例えばラフィノースなど；及び多糖類、例えばデキストリン又はデキストランなど。
非イオン性界面活性剤又は洗剤（「湿潤剤」としても公知である）を用いて、治療用薬剤の可溶化を助ける、ならびに、撹拌誘導性凝集に対して治療用タンパク質を保護してもよく、それによってまた、活性な治療用タンパク質又は抗体の変性を起こすことなく、製剤を剪断表面応力に曝露させることが可能である。非イオン性洗剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ～約１．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０７ｍｇ／ｍｌ～約０．２ｍｇ／ｍｌの濃度範囲中で存在しうる。
適切な非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート（２０、４０、６０、６５、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ポリオール、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０など）、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０、及び６０、モノステアリン酸グリセロール、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースを含む。使用することができる陰イオン性界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、及びスルホン酸ジオクチルナトリウムを含む。カチオン性洗剤は、塩化ベンザルコニウム又は塩化ベンゼトニウムを含む。
投与のために使用される用量は、種々のパラメーターの関数として、特に、使用される投与様式の、関連する病理の、又は、あるいは所望の治療期間の関数として適合させることができる。医薬組成物を調製するために、有効量の抗体又は抗体フラグメントを、医薬的に許容可能な担体又は水性培地中に溶解又は分散させてもよい。
注射用の使用のために適切な医薬形態は、無菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油、又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び無菌の注射用溶液又は分散液の即時調製用の無菌粉末を含む。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度まで流動性でなければならない。それは、製造及び保管の条件下で安定していなければならず、微生物、例えば細菌及び真菌などの混入作用に対して保存されなければならない。
遊離塩基又は薬理学的に許容可能な塩としての活性化合物の溶液は、界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中で、ならびに油中で調製することができる。保存及び使用の通常の条件下では、これらの調製物は微生物の成長を防止するための保存剤を含む。
抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントは、中性又は塩の形態において組成物中に製剤化することができる。医薬的に許容可能な塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基を伴って形成される）を含み、それは、無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸など、又は例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸を伴って形成される。遊離カルボキシル基を伴って形成される塩はまた、無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化第二鉄など、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することができる。
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、及び野菜油を含む溶媒又は分散培地でありうる。適した流動性は、例えば、コーティング、例えばレシチンなどの使用により、分散液の場合における要求される粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌薬剤及び抗真菌薬剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらすことができる。多くの場合において、等張化剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物中での使用によりもたらすことができる。
無菌注射用溶液は、要求されうるように、上に列挙した他の成分の１つ又は複数を伴う、適した溶媒中に、要求される量の活性化合物を組み入れること、それに続く濾過滅菌により調製される。一般的に、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、基礎分散培地及び上に列挙するものからの要求される他の成分を含む無菌賦形剤中に組み入れることにより調製される。無菌注射用溶液の調製用の無菌粉末の場合において、好ましい調製方法は、真空乾燥技術及び凍結乾燥技術であって、それらによって、活性成分に加えて、以前に滅菌濾過されたその溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末がもたらされる。
直接注射用のより多くの、又は高度に濃縮された溶液の調製も熟慮され、そこでは、溶媒としてのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の使用が、極度に迅速な浸透をもたらし、高濃度の活性薬剤を小さな腫瘍領域に送達することが想定される。
製剤化時に、溶液は、投薬製剤と適合性のある様式で、及び治療的に有効であるような量で投与される。製剤は、多様な投薬形態、例えば上に記載する注射用溶液の型などにおいて簡単に投与されるが、しかし、薬物放出カプセルなども用いることができる。
水溶液中での非経口投与のために、例えば、溶液を、必要な場合、適切に緩衝化させ、液体希釈剤を最初に十分な生理食塩水又はグルコースを用いて等張にすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与のために特に適切である。この関連において、用いることができる無菌水性培地は、本開示に照らして当業者に公知であろう。例えば、１つの投与量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液中に溶解し、１０００ｍｌの皮下点滴液に加える、又は提案された注入部位に注射することができうる（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ” １５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ １０３５－１０３８ ａｎｄ １５７０－１５８０を参照のこと）。投与量における一部の変動が、処置される対象の状態に依存して必然的に生じる。投与について責任ある者は、任意の事象において、個々の対象について適した用量を決定する。
抗体又は抗体フラグメントは、治療用混合物内に製剤化されて、用量当たり約０．０００１～１０．０ミリグラム、又は約０．００１～５ミリグラム、又は約０．００１～１ミリグラム、又は約０．００１～０．１ミリグラム、又は約０．１～１．０ミリグラム又はさらに約１０ミリグラムを送達しうる。複数用量を、選択した時間間隔で投与することもできる。
非経口投与、例えば静脈内又は筋肉内注射などのために製剤化された化合物に加えて、他の医薬的に許容可能な形態は、例えば、経口投与用の錠剤又は他の固形物；徐放性カプセル；及び現在使用されている任意の他の形態を含む。
特定の実施形態では、リポソーム及び／又はナノ粒子の使用が、宿主細胞中への抗体又は抗体フラグメントの導入のために熟慮されている。リポソーム及び／又はナノ粒子の形成及び使用は、当業者に公知である。
ナノカプセルは一般的に、安定で再現可能な方法において化合物を封入することができる。細胞内ポリマーの過負荷に起因する副作用を回避するために、そのような超微粒子（サイズ約０．１μＭ）が一般的に、インビボで分解できるポリマーを使用して設計されている。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル－シアノアクリレートナノ粒子が、本発明における使用のために熟慮されており、そのような粒子は簡単に作られうる。
リポソームは、水性培地中に分散され、自発的に多層同心性二重層ベシクル（多層ベシクル（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を形成するリン脂質から形成される。ＭＬＶは一般的に２５ｎｍ～４μＭの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理によって、コア中に水溶液を含む、２００～５００Åの範囲の直径を伴う小さな単層ベシクル（ＳＵＶ）の形成がもたらされる。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、及び二価カチオンの存在に依存する。
本明細書中に記載する抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントを含む医薬製剤は、所望の純度を有するそのような抗体又は抗体フラグメントを、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態において、１つ又は複数の任意の医薬的に許容可能な担体と混合することにより調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。医薬的に許容可能な担体は、一般的に、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに無毒であり、以下を含むが、それらに限定しない：緩衝剤、例えばリン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸など；酸化防止剤（アスコルビン酸及びメチオニンを含む）；保存料（例えばオクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコールなど；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベンなど；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなど；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンなど；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなど；単糖類、二糖類、及び他の糖（グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む）；キレート剤、例えばＥＤＴＡなど；砂糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトールなど；塩形成対イオン、例えばナトリウムなど；金属錯体（例、Ｚｎ－タンパク質複合体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など。
本明細書中の例示的な医薬的に許容可能な担体は、侵入型薬物分散剤、例えば可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）など、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などをさらに含む。特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用の方法（ｒＨｕＰＨ２０を含む）が、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号において記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、１つ又は複数の追加のグリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼなどと組み合わされる。
例示的な凍結乾燥抗体製剤が、米国特許第６，２６７，９５８号において記載されている。水性抗体製剤は、米国特許第６，１７１，５８６号及びＷＯ２００６／０４４９０８において記載されているものを含み、後者の製剤はヒスチジン－酢酸緩衝剤を含む。
本明細書中の製剤はまた、処置されている特定の適応症について必要な１を上回る活性成分を含みうる。好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない補完的な活性を伴う成分を、単一の製剤中に組み合わせてもよい。例えば、ＥＧＦＲアンタゴニスト（例えばエルロチニブなど）、抗血管新生剤（例えば抗ＶＥＧＦ抗体でありうるＶＥＧＦアンタゴニストなど）又は化学療法剤（例えばタキソイド又は白金薬剤など）を、本発明の抗ＣＴＬＡ４抗体、抗体フラグメント、又はイムノコンジュゲートに加えて提供することが望ましいであろう。そのような活性成分は、意図された目的のために有効な量で組み合わせにおいて適切に存在している。
一実施形態では、本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗体フラグメント、又はイムノコンジュゲートは、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＡＸＬ、ＲＯＲ２、ＣＤ３、ＨＥＲ２、Ｂ７－Ｈ３、ＲＯＲ１、ＳＦＲＰ４、及びＷＮＴタンパク質（ＷＮＴ１、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＮＴ５Ｂ、ＷＮＴ６、ＷＮＴ７Ａ、ＷＮＴ７Ｂ、ＷＮＴ８Ａ、ＷＮＴ８Ｂ、ＷＮＴ９Ａ、ＷＮＴ９Ｂ、ＷＮＴ１０Ａ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１１、ＷＮＴ１６を含む）より選択される抗原に対する別の抗体又は抗体フラグメントを伴う製剤中で組み合わされる。組み合わせは、２つの別々の分子の形態でありうる：本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗体フラグメント、又はイムノコンジュゲート、及び別の抗体又は抗体フラグメント。あるいは、組み合わせはまた、ＥｐＣＡＭ及び他の抗原の両方への結合親和性を伴う単一分子の形態であり、このように、多重特異性（例、二重特異性）抗体を形成しうる。
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル中にカプセル化されうる。例えば、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）中の又はマクロエマルジョン中の、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン－マイクロカプセル及びポリ－（メチルメタシレート）マイクロカプセルを用いてもよい。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）において開示されている。
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例は、抗体又は抗体フラグメントを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、それらのマトリックスは、成形品の形態、例えば、フィルム、又はマイクロカプセルでありうる。
インビボ投与のために使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌は、例えば、無菌濾過膜を通じた濾過により容易に達成されうる。
Ｅ．治療方法及び組成物
本明細書中で提供される抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントのいずれかを治療方法において使用してもよい。一態様では、医薬としての使用のための抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントが提供される。さらなる態様では、癌（例、乳癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、脳癌、膵臓、脳、腎臓、卵巣、胃、白血病、子宮内膜、結腸、前立腺、甲状腺、肝臓、骨肉腫、及び／又は黒色腫の癌）を処置する際での使用のための抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントが提供される。特定の実施形態では、処置の方法における使用のための抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントが提供される。特定の実施形態では、本発明は、有効量の抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントを個体に投与することを含む、癌を有する個体を処置する方法における使用のための抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントを提供する。特定の実施形態では、本発明は、免疫障害（例、自己免疫障害）、心血管障害（例、アテローム性動脈硬化症、高血圧、血栓症）、感染性疾患（例、エボラウイルス、マールブルグウイルス）又は糖尿病を有する個体を処置する方法における使用のための抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントを提供し、有効量の抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントを個体に投与することを含む。そのような一実施形態では、この方法は、例えば、下に記載されるように、有効量の少なくとも１つの追加の治療用薬剤を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施形態では、本発明は、血管新生の阻害、細胞増殖の阻害、免疫機能の阻害、炎症性サイトカイン分泌（例、腫瘍関連マクロファージから）の阻害、腫瘍血管系（例、腫瘍内血管系又は腫瘍関連血管系）の阻害、及び／又は腫瘍間質機能の阻害における使用のための抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントを提供する。
特定の実施形態では、本発明は、個体における血管新生の阻害、細胞増殖の阻害、免疫機能の阻害、炎症性サイトカイン分泌（例、腫瘍関連マクロファージから）の阻害、腫瘍血管系（例、腫瘍内血管系又は腫瘍関連血管系）の阻害、及び／又は腫瘍間質機能の阻害の方法における使用のための抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントを提供し、血管新生を阻害するために、細胞増殖を阻害するために、免疫機能を阻害するために、炎症性サイトカイン分泌（例、腫瘍関連マクロファージから）を阻害するために、腫瘍血管系の発生（例、腫瘍内血管系又は腫瘍関連血管系）を阻害するために、及び／又は腫瘍間質機能を阻害するために有効な抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントを個体に投与することを含む。上の実施形態のいずれかに従った「個体」は、好ましくはヒトである。
さらなる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントの使用を提供する。一実施形態では、医薬は、癌（一部の実施形態では、乳癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、脳癌、膵臓、脳、腎臓、卵巣、胃、白血病、子宮内膜、結腸、前立腺、甲状腺、肝臓、骨肉腫、及び／又は黒色腫の癌）の処置のためである。さらなる実施形態では、医薬は、癌を有する個体に有効量の医薬を投与することを含む、癌を処置する方法における使用のためのものである。さらなる実施形態では、医薬は、免疫障害（例、自己免疫障害）、心血管障害（例、アテローム性動脈硬化症、高血圧、血栓症）、感染性疾患（例、エボラウイルス、マールブルグウイルス）、又は糖尿病を処置する方法における使用のためであり、有効量の抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントを個体に投与することを含む。そのような一実施形態では、この方法は、例えば、下に記載されるように、有効量の少なくとも１つの追加の治療用薬剤を個体に投与することをさらに含む。さらなる実施形態では、医薬は、血管新生を阻害する、細胞増殖を阻害する、免疫機能を阻害する、炎症性サイトカイン分泌（例、腫瘍関連マクロファージから）を阻害する、腫瘍血管系（例、腫瘍内血管系又は腫瘍関連血管系）を阻害する、及び／又は腫瘍間質機能を阻害するためである。さらなる実施形態では、医薬は、個体における血管新生の阻害、細胞増殖の阻害、免疫機能の阻害、炎症性サイトカイン分泌（例、腫瘍関連マクロファージから）の阻害、腫瘍血管系（例、腫瘍内血管系又は腫瘍関連血管系）の阻害、及び／又は腫瘍間質機能の阻害の方法における使用のためであり、血管新生を阻害するために、細胞増殖を阻害するために、免疫機能を促進させるために、炎症性サイトカイン分泌（例、腫瘍関連マクロファージから）を誘導させるために、腫瘍血管系（例、腫瘍内血管系又は腫瘍関連血管系）を阻害するために、及び／又は腫瘍間質機能を阻害するためにこの医薬の有効量を個体に投与することを含む。上の実施形態のいずれかに従った「個体」は、ヒトでありうる。
さらなる態様では、本発明は、癌を処置するための方法を提供する。一実施形態では、この方法は、そのような癌を有する個体に有効量の抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントを投与することを含む。そのような一実施形態では、この方法は、下に記載されるように、有効量の少なくとも１つの追加の治療用薬剤を個体に投与することをさらに含む。上の実施形態のいずれかに従った「個体」は、ヒトでありうる。
さらなる態様では、本発明は、免疫障害（例、自己免疫障害）、心血管障害（例、アテローム性動脈硬化症、高血圧、血栓症）、感染性疾患（例、エボラウイルス、マールブルグウイルス）、又は糖尿病を処置するための方法を提供する。そのような一実施形態では、この方法は、下に記載されるように、有効量の少なくとも１つの追加の治療用薬剤を個体に投与することをさらに含む。上の実施形態のいずれかに従った「個体」は、ヒトでありうる。
さらなる態様では、本発明は、個体において血管新生を阻害する、細胞増殖を阻害する、免疫機能を阻害する、炎症性サイトカイン分泌（例、腫瘍関連マクロファージから）を阻害する、腫瘍血管系（例、腫瘍内血管系又は腫瘍関連血管系）を阻害する、及び／又は腫瘍間質機能を阻害するための方法を提供する。一実施形態では、この方法は、血管新生を阻害する、細胞増殖を阻害する、免疫機能を促進させる、炎症性サイトカイン切片（例、腫瘍関連マクロファージから）を誘導する、腫瘍血管系の発生（例、腫瘍内血管系又は腫瘍関連血管系）を阻害する、及び／又は腫瘍間質機能を阻害するために有効量の抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントを個体に投与することを含む。一実施形態では、「個体」はヒトである。
さらなる態様では、本発明は、例えば、上の治療方法のいずれかにおける使用のために、本明細書中で提供される抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントのいずれかを含む医薬製剤を提供する。一実施形態では、医薬製剤は、本明細書中で提供される抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントのいずれかと、医薬的に許容可能な担体とを含む。別の実施形態では、医薬製剤は、例えば、下に記載されるように、本明細書中で提供される抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントのいずれか及び少なくとも１つの追加の治療用薬剤を含む。
上に記載される各々の及びすべての処置において、本発明の抗体又は抗体フラグメントは、治療において、単独で、イムノコンジュゲートとして、又は他の薬剤との組み合わせにおいて使用することができる。例えば、本発明の抗体は、少なくとも１つの追加の治療用薬剤と同時投与されうる。特定の実施形態では、追加の治療用薬剤は抗血管新生剤である。特定の実施形態では、追加の治療用薬剤は、ＶＥＧＦアンタゴニスト（一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体、例えば、ベバシズマブ）である。特定の実施形態では、追加の治療用薬剤は、ＥＧＦＲアンタゴニスト（一部の実施形態では、エルロチニブ）である。特定の実施形態では、追加の治療用薬剤は、化学療法剤及び／又は細胞分裂阻害剤である。特定の実施形態では、追加の治療用薬剤は、タキソイド（例、パクリタキセル）及び／又は白金剤（例、カルボプラチン）である。特定の実施形態では、追加の治療用薬剤は、患者の免疫又は免疫系を増強する薬剤である。
上に述べられているそのような併用治療は、併用投与（ここで、２つ又はそれより多くの治療用薬剤が、同じ又は別々の製剤中に含まれる）、及び別々の投与を含み、その場合において、抗体又は抗体フラグメントの投与は、追加の治療用薬剤及び／又はアジュバントの投与の前に、それと同時に、及び／又はそれに続いて起こりうる。抗体又は抗体フラグメントはまた、放射線治療との組み合わせにおいて使用することができる。
抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントは、良好な医療行為と一致する様式において製剤化、投薬、及び投与されうる。この文脈における考慮のための要因は、処置されている特定の障害、処置されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与の方法、投与のスケジュール、及び医師に公知の他の要因を含む。抗体又は抗体フラグメントは、そうである必要はないが、しかし、場合により、問題の障害を防止又は処置するために現在使用されている１つ又は複数の薬剤を用いて製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体又は抗体フラグメントの量、障害又は処置の型、及び上で考察する他の要因に依存する。これらは一般的に、本明細書中に記載されるのと同じ投与量中で及び投与経路を用いて、又は本明細書中に記載される投与量の約１～９９％で、又は経験的／臨床的に適していると決定される任意の投与量中で及び任意の経路により使用される。
疾患の防止又は処置のために、抗体又は抗体フラグメントの適した投与量（単独で、あるいは１つ又は複数の他の追加の治療用薬剤との組み合わせにおいて使用される場合）は、処置される疾患の型、抗体又は抗体フラグメントの型、疾患の重症度及び経過、抗体又は抗体フラグメントが防止的又は治療的な目的のために投与されるか否か、以前の治療、患者の病歴及び抗体又は抗体フラグメントへの応答、ならびに主治医の判断に依存するであろう。抗体又は抗体フラグメントは、一度に又は一連の処置にわたり患者に適切に投与される。疾患の型及び重症度に依存し、約１μｇの抗体又は抗体フラグメント／ｋｇ患者の体重から４０ｍｇの抗体又は抗体フラグメント／ｋｇ患者の体重が、例えば、１つ又は複数の別々の投与による、あるいは継続的注入によるかを問わず、患者への投与のための最初の候補投与量となりうる。１つの典型的な１日投与量は、上に言及する要因に依存して、約１μｇの抗体又は抗体フラグメント／ｋｇ患者の体重から１００ｍｇの抗体又は抗体フラグメント／ｋｇ患者の体重又はそれより高い範囲でありうる。数日又はそれより長くにわたる反復投与のために、状態に依存するが、この処置は一般的に、疾患症状の所望の抑制が起こるまで持続されるであろう。そのような用量は、例えば、毎週又は３週間毎に、間欠的に投与されうる（例、患者が約２～約２０、又は、例えば、約６用量の抗体又は抗体フラグメントを受けるようにする）。最初のより高い負荷用量、それに続く１つ又は複数のより低い用量が、投与されうる。しかし、他の投薬レジメンが有用でありうる。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイにより簡単にモニタリングされる。
対象における疾患の防止又は処置のために投与されうる本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントの特定の投与量は、約０．３、０．６、１．２、１８、２．４、３．０、３．６、４．２、４．８、５．４、６．０、６．６、７．２、７．８、８．４、９．０、９．６、又は１０．２ｍｇの抗体又は抗体フラグメント／ｋｇ患者の体重でありうる。特定の実施形態では、投与量は、０．３～２．４、２．４～４．２、４．２～６．０、６．０～７．８、７．８～１０．２、１０．２～１２、１２～１４、１４～１６、１６～１８、又は１８～２０ｍｇの抗体又は抗体フラグメント／ｋｇ患者の体重の範囲でありうる。抗体又は抗体フラグメントの投与量は、二重特異性抗体の形態において、別の免疫チェックポイント阻害剤又は別の抗体もしくは抗体フラグメントとの組み合わせにおいて、あるいはイムノコンジュゲートとして投与された場合、同じままであろう。さらに、抗ＥｐＣＡＭ活性を有するポリペプチドは、抗体又は抗体フラグメントと同じ量で投与されるであろう。
本発明の単一用量の医薬製剤は、約１３，６００ｍｇからの約４５μｇの抗体又は抗体フラグメントからの、あるいは約５４４０ｍｇからの約４５μｇの抗体又は抗体フラグメントからの本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントの量を含みうる。一部の実施形態では、本発明の単一用量の医薬製剤は、１３５ｍｇ～１，３８７ｍｇの量の本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメント、あるいは量、例えば１３５、２３５、３３５、４３５、５３５、６３５、７３５、８３５、９３５、１０３５、１１３５、１２３５、１３８７ｍｇなどを含みうる。特定の実施形態では、医薬製剤の単一用量中での本発明の抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントの量は、１３５～２３５、２３５～３３５、３３５～４３５、４３５～５３５、５３５～６３５、６３５～７３５、７３５～８３５、８３５～９３５、９３５～１０３５、１０３５～１１３５、１１３５～１２３５、１２３５～１３８７ｍｇの範囲中である。医薬製剤の単一用量中での抗体又は抗体フラグメントの量は、二重特異性抗体の形態において、別の免疫チェックポイント阻害剤との組み合わせにおいて、あるいはイムノコンジュゲートとして、あるいは本明細書中に開示される別の抗原に対する別の抗体又は抗体フラグメントとの組み合わせにおいて投与された場合、同じままであろう。さらに、抗ＥｐＣＡＭ活性を有するポリペプチドは、抗体又は抗体フラグメントと同じ量で、医薬製剤の単一用量中に含まれるであろう。
１つの例では、抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントは、免疫チェックポイント阻害剤分子にコンジュゲートされうる、又は免疫チェックポイント阻害剤との二重特異性抗体の一部を形成しうる。
組み合わせは、本願において開示される抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメント、及び別々の分子として又は二重特異性抗体として投与される免疫チェックポイント阻害剤分子でありうる。そのような二重特異性抗体は、ＥｐＣＡＭへの結合活性及び免疫チェックポイントへの第２の結合活性を有する。
免疫チェックポイントは、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及びＧＩＴＲより選択されうる（Ｚａｈａｖｉ ａｎｄ Ｗｅｉｎｅｒ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｖｏｌ．２０，１５８，２０１９）。追加の免疫チェックポイントは、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＤＲ３、及びＩＣＯＳを含む（Ｍａｎｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｓｍａｌｌ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｂｂａｃａｎ，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｂｃａｎ．２０１８．１２．００２，２０１８）。
免疫チェックポイントは、好ましくは、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、又はＰＤ－Ｌ１である。
上の製剤又は治療方法のいずれかが、抗ＥｐＣＡＭ抗体の代わりに、又はそれに加えて、本発明の抗体フラグメント又はイムノコンジュゲートを使用して行われうることが理解される。
腫瘍と戦うために宿主の免疫機能を増強することは、関心が増加している主題である。従来の方法は、（ｉ）ＡＰＣ増強、例えば（ａ）腫瘍中への、外来ＭＨＣ同種抗原をコードするＤＮＡの注射、又は（ｂ）腫瘍の免疫抗原認識の可能性を増加させる遺伝子（例、免疫刺激性サイトカイン、ＧＭ－ＣＳＦ、共刺激分子Ｂ７．１、Ｂ７．２）を用いて、生検された腫瘍細胞をトランスフェクトすることなど、（ｉｉｉ）養子細胞免疫療法、又は活性化された腫瘍特異的Ｔ細胞を用いた処置を含む。養子細胞免疫療法は、腫瘍浸潤性宿主Ｔリンパ球を単離すること、この集団をインビトロで増殖させること（例えばＩＬ－２もしくは腫瘍、又はその両方による刺激を通じて、など）を含む。加えて、機能障害性である単離Ｔ細胞はまた、本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗体のインビトロ適用により活性化されうる。そのように活性化されたＴ細胞は次に、宿主に再投与されうる。これらの方法の１つ又は複数が、本発明の抗体、抗体フラグメント、又はイムノコンジュゲートの投与との組み合わせにおいて使用されうる。
癌のための従来の治療は、以下を含む：（ｉ）放射線治療（例、放射線療法、Ｘ線治療、照射）又は癌細胞を死滅させ、腫瘍を縮小させるための電離放射線の使用。放射線治療は、体外照射療法（ＥＢＲＴ）を介して外部的に、又は近接照射療法を介して内部的に投与することができる、（ｉｉ）化学療法、又は一般的に迅速に分裂する細胞に影響を及ぼす細胞傷害性薬物の適用、（ｉｉｉ）標的治療、又は癌細胞の調節解除されたタンパク質に特異的に影響を及ぼす薬剤（例、チロシンキナーゼ阻害剤イマチニブ、ゲフィチニブ；モノクローナル抗体、光力学的治療）、（ｉｖ）免疫療法、又は宿主免疫応答の増強（例、ワクチン）、（ｖ）ホルモン治療、又はホルモンの遮断（例、腫瘍がホルモン感受性である場合）、（ｖｉ）血管新生阻害剤、又は血管形成及び成長の遮断、ならびに（ｖｉｉ）緩和ケア、又は疼痛、嘔気、嘔吐、下痢、及び出血を低下させるためのケアの質を改善させるように向けられた処置。鎮痛薬、例えばモルヒネ及びオキシコドンなど、制吐薬、例えばオンダンセトロン及びアプレピタントなどは、より積極的な処置レジメンを可能することができる。
癌の処置において、癌免疫の処置のための以前に記載した従来の処置のいずれかを、抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントの投与の前に、その後に、又はそれと同時に行ってもよい。加えて、抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントは、従来の癌処置、例えば腫瘍結合抗体（例、モノクローナル抗体、毒素コンジュゲートモノクローナル抗体）の投与及び／又は化学療法剤の投与などの前に、その後に、又はそれと同時に投与することができる。
Ｆ．製造品及びキット
本発明の別の態様では、抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントならびに上の障害の処置、防止、及び／又は診断のために有用な他の材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器及び容器上の又はそれに関連付けられたラベル又は添付文書を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどを含む。この容器は、多様な材料、例えばガラス又はプラスチックなどから形成されうる。この容器は、それ自体により、あるいはその状態を処置、防止、及び／又は診断するために有効な別の組成物と組み合わせた組成物を保持し、無菌アクセスポートを有しうる（例えば、この容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針により穿刺可能なストッパーを有するバイアルでありうる）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本発明の抗体又は抗体フラグメントである。ラベル又は添付文書は、組成物が、選ばれた状態を処置するために使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）その中に含まれる組成物を伴う第１の容器（それにおいて、組成物は、抗体又は抗体フラグメントを含む）；及び（ｂ）その中に含まれる組成物を伴う第２の容器（それにおいて、組成物は、さらなる細胞傷害性薬剤又は別の治療用薬剤を含む）を含みうる。本発明のこの実施形態における製造品は、組成物を、特定の状態を処置するために使用することができることを示す添付文書をさらに含みうる。あるいは、又は加えて、製造品は、医薬的に許容可能な緩衝液、例えば注射用の静菌性水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液、及びデキストロース溶液などを含む第２（又は第３）の容器をさらに含みうる。それは、商業的な及びユーザーの観点から望ましい他の材料（他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む）をさらに含みうる。
上の製造品のいずれも、抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメントの代わりに、又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含みうることが理解される。
最後に、本発明はまた、本発明の少なくとも１つの抗体又は抗体フラグメントを含むキットを提供する。本発明のポリペプチド、抗体又は抗体フラグメント、又は抗体薬物コンジュゲートを含むキットでは、ＥｐＣＡＭ発現（増加又は減少）を検出する際での、又は治療的もしくは診断的アッセイにおける使用が見出される。本発明のキットは、固体支持体、例えば、組織培養プレート又はビーズ（例、セファロースビーズ）にコンジュゲートされた抗体を含むことができる。インビトロでの、例えば、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットにおけるＥｐＣＡＭの検出及び定量化のための抗体を含むキットを提供することができる。検出のために有用なそのような抗体は、標識、例えば蛍光又は放射性標識などを伴って提供されうる。
キットは、その使用に関する説明書をさらに含む。一部の実施形態では、説明書は、インビトロ診断キットについて米国食品医薬品局により要求される説明書を含む。一部の実施形態では、キットは、サンプル中の脳脊髄液の存在又は非存在を、前記サンプル中のＥｐＣＡＭの存在又は非存在に基づいて診断するための説明書をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、１つ又は複数の抗体又は抗体フラグメントを含む。他の実施形態では、キットは、１つ又は複数の酵素、酵素阻害剤、又は酵素アクチベーターをさらに含む。さらに他の実施形態では、キットは、１つ又は複数のクロマトグラフィー化合物をさらに含む。さらに他の実施形態では、キットは、分光アッセイ用のサンプルを調製するために使用される１つ又は複数の化合物をさらに含む。さらなる実施形態では、キットは、インジケーターの強度、色スペクトル、又は他の物理的属性に従って、ＥｐＣＡＭの存在又は非存在を解釈するための比較参照材料をさらに含む。
以下の実施例は、本開示の抗ＥＰＣＡＭ抗体の例証であり、しかし、それに限定しない。この分野において通常遭遇する多様な条件及びパラメーターの他の適切な修正及び適合は、当業者に明らかであり、本開示の範囲内である。
実施例１：ＥｐＣＡＭを用いて免疫化されたマウスからのハイブリドーマクローン。
マウスを、組換えヒトＥｐＣＡＭ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を用いて免疫化した。免疫化されたマウスのＢ細胞を使用して生成されたハイブリドーマクローンを、ヒトＥｐＣＡＭ ＥＣＤ及びヒトＥｐＣＡＭを発現する安定なＣＨＯ細胞の両方を用いてスクリーニングした。ハイブリドーマクローンを、ヒトＥｐＣＡＭ ＥＣＤに、カニクイザルＥｐＣＡＭ及びヒトＥｐＣＡＭを発現するＣＨＯ細胞に結合するが、しかし、マウス又はラットのＥｐＣＡＭには結合しない能力に基づいて選択した。選択したハイブリドーマクローンを表２中に示す。
Figure 2022531504000004
実施例２：条件付きで活性な生物学的（ＣＡＢ）抗ＥｐＣＡＭ抗体。
ハイブリドーマクローン１２Ｃ１０Ｆ１２により発現された抗ＥｐＣＡＭ抗体を、条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体を生成するためのテンプレート抗体として使用した。テンプレート抗体をコードするＤＮＡを、包括的な位置進化（ＣＰＥ（商標））を使用して変異させ、変異抗体を産生した。変異抗体を、非腫瘍微小環境において存在する通常の生理学的ｐＨでのＥｐＣＡＭへの結合活性との比較において、腫瘍微小環境のより低いｐＨでのヒトＥｐＣＡＭへの増加した結合活性を有する条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体について、図４及び表３中に示すようにスクリーニングした。抗体クローンＢＡＰ－１０５－０１－０１は、図４中に示すテンプレート抗体（ＷＴ）である。
Figure 2022531504000005
これらの条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体をさらに特徴付けた。
実施例３：条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性。
ＢＡＰ－１０５－０１－０３及びＢＡＰ－１０５－０１－０６により例示される、選択された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体を、コントロールとしてＢＡＰ－１０５－０１－０１を使用してＥｐＣＡＭへの結合について分析した。ＥｐＣＡＭ発現Ｃｏｌｏ２０５細胞へのこれらの抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を、６．０及び７．４の２つの異なるｐＨ値で蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により測定した。１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、及び０．０１μｇ／ｍＬの異なる投与量の抗体を使用した。条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ｐＨ７．４よりもｐＨ６．０でＥｐＣＡＭ発現Ｃｏｌｏ２０５細胞へのより高い結合活性を一貫して示した。図５Ａ～５Ｄを参照のこと。
同様のＦＡＣＳ分析を、また、ヒトＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞を使用して行った。条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体はまた、ｐＨ７．４よりもｐＨ６．０でＥｐＣＡＭ発現２９３細胞へのより高い結合活性を一貫して示した。図６Ａ～６Ｄを参照のこと。
実施例４：条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体コンジュゲートの細胞死滅。
選択した条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体ＢＡＰ－１０５－０１－０３及びＢＡＰ－１０５－０１－０６を、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）（強力な有糸分裂阻害剤）にコンジュゲートさせて、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を作製した。抗体ＢＡＰ－１０５－０１－０１を無条件で活性な抗体コントロールとして使用し、Ｂ１２をネガティブコントロールとして使用した。ＥｐＣＡＭ発現Ｃｏｌｏ２０５細胞のインビトロ細胞死滅を、６．０、６．２、及び７．４の３つのｐＨ値で測定した。条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体によるＣｏｌｏ２０５細胞のインビトロ死滅についてのＩＣ５０を、また、決定した。図７Ａ～７Ｃを参照のこと。
条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体ＡＤＣによるインビボ細胞死滅を、また、Ｃｏｌｏ２０５異種移植マウスモデルを使用して測定した。異種移植マウスモデルを、ＩＶ注射による断続的なスケジュールＱ４Ｄｘ４（４日毎に４回）を用いて処置した。２つの投与量を使用した：１ｍｇ／ｋｇ及び６ｍｇ／ｋｇ。８匹のマウスを各々の処置群において使用した。条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体ＡＤＣは、コントロールとの比較において、腫瘍の容積を有意に低下させたが、しかし、６ｍｇ／ｋｇの用量で動物の体重を有意に減少させなかった。図８Ａ～８Ｂを参照のこと。これは、条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体ＡＤＣが、腫瘍を処置する際に有効である一方で、低下した副作用を示すことを示した。
実施例５：条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体のヒト化。
条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の１つ、ＢＡＰ－１－５－０１－０６をヒト化し、追加のヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体を産生させた。
表４を参照のこと。
Figure 2022531504000006
実施例６：ヒトＥｐＣＡＭへの、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性。
ヒトＥｐＣＡＭへの、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を、コントロールとしてテンプレート抗体ＢＡＰ １０５－０１－０１を使用して、ＥＬＩＳＡにより測定した。図９Ａ～９Ｅを参照のこと。ｐＨ６．０及びｐＨ７．４でヒトＥｐＣＡＭに結合するための、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体のＥＣ５０値を表５中に要約している。
Figure 2022531504000007
ｐＨ滴定を用いた、ヒトＥｐＣＡＭへの、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を、また、ＥＬＩＳＡにより測定した。図１０を参照のこと。ヒトＥｐＣＡＭへの、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体のｐＨ屈曲点を、表６中に要約している。
Figure 2022531504000008
実施例７：カニクイザルＥｐＣＡＭへの、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性。
カニクイザルＥｐＣＡＭへの、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を、また、同様に測定した。図１１Ａ～１１Ｅを参照のこと。ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体についてのｐＨ６．０及びｐＨ７．４でのカニクイザルＥｐＣＡＭへの結合についてのＥＣ５０を、表７中に要約している。
Figure 2022531504000009
ｐＨ滴定を用いた、カニクイザルＥｐＣＡＭへの、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を、ＥＬＩＳＡにより同様に測定した。図１２を参照のこと。カニクイザルＥｐＣＡＭへの、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体のｐＨ屈曲点を、表８中に要約している。
Figure 2022531504000010
実施例８：ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の熱安定性。
ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の熱安定性を、熱処理後のそれらの結合活性を測定することにより評価した。ｐＨ６．０及びｐＨ７．４で、異なる温度での１時間にわたる加熱処理後の、ヒトＥｐＣＡＭへの、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を、ＥＬＩＳＡにより測定した。図１３Ａ～１３Ｂを参照のこと。４５℃までの熱処理は、結合親和性に著しく影響を及ぼすことはなかったが、これらの温度で良好な熱安定性を示している。
実施例９：ＦＡＣＳにより測定された、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性。
ヒトＥｐＣＡＭを発現するＣｏｌｏ２０５細胞への、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を、ｐＨ６．０及びｐＨ７．４でＦＡＣＳにより測定した。ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ｐＨ７．４よりもｐＨ６．０でヒトＥｐＣＡＭを発現するＣｏｌｏ２０５細胞へのより高い結合活性を一貫して示した。図１４Ａ～１４Ｂを参照のこと。ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体による、ヒトＥｐＣＡＭを発現するＣｏｌｏ２０５細胞への結合についてのＥＣ５０値を、表９中に要約している。
Figure 2022531504000011
同様のＦＡＣＳ分析を、また、ヒトＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞を使用して行った。ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体はまた、ｐＨ７．４よりもｐＨ６．０でヒトＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞へのより高い結合活性を一貫して示した。図１５Ａ～１５Ｂを参照のこと。ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体による、ヒトＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞への結合についてのＥＣ５０値を、表１０中に要約している。
Figure 2022531504000012
同様のＦＡＣＳ分析を、また、カニクイザルＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞を使用して行った。ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体はまた、ｐＨ７．４よりもｐＨ６．０でカニクイザルＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞へのより高い結合活性を一貫して示した。図１６Ａ～１６Ｂを参照のこと。ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体による、カニクイザルＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞への結合についてのＥＣ５０値を、表１１中に要約している。
Figure 2022531504000013
実施例１０：ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体ＡＤＣの結合活性。
ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体をＭＭＡＥにコンジュゲートさせて、抗体薬物コンジュゲートを作製した。ヒトＥｐＣＡＭへの、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を、異なる抗体濃度で、ｐＨ６．０及びｐＨ７．４でＥＬＩＳＡにより測定した。コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ｐＨ７．４よりもｐＨ６．０でヒトＥｐＣＡＭへのより高い結合活性を一貫して示した。図１７Ａ～１７Ｂを参照のこと。コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体によるヒトＥｐＣＡＭへの結合についてのＥＣ５０値を、表１２中に要約している。
Figure 2022531504000014
同様のＥＬＩＳＡ分析を、カニクイザルＥｐＣＡＭを使用して行い、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合親和性を測定した。コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体はまた、ｐＨ７．４よりもｐＨ６．０でカニクイザルＥｐＣＡＭへのより高い結合活性を一貫して示した。図１８Ａ～１８Ｂを参照のこと。コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体によるカニクイザルＥｐＣＡＭへの結合についてのＥＣ５０値を、表１３中に要約している。
Figure 2022531504000015
実施例１１：ｐＨ滴定を用いた、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体ＡＤＣの結合活性。
ヒトＥｐＣＡＭへの、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を、ｐＨ滴定を伴うＥＬＩＳＡにより測定した。コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ｐＨがｐＨ５．５から増加するにつれて、ヒトＥｐＣＡＭへの減少する結合活性を示した。図１９Ａを参照のこと。ヒトＥｐＣＡＭへの、ｐＨ６．０及びｐＨ７．４での、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性の比率、ならびにそれらのｐＨ屈曲点を、表１４中に要約している。
Figure 2022531504000016
カニクイザルＥｐＣＡＭへの、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を、また、ｐＨ滴定を伴うＥＬＩＳＡにより測定した。コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ｐＨがｐＨ５．５から増加するにつれて、カニクイザルＥｐＣＡＭへの同様の減少する結合活性を示した。図１９Ｂを参照のこと。カニクイザルＥｐＣＡＭへの、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体によるｐＨ６．０及びｐＨ７．４での結合活性の比率、ならびにそれらのｐＨ屈曲点を、表１５中に要約している。
Figure 2022531504000017
実施例１２：ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体ＡＤＣの熱安定性。
コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体（ＭＭＡＥを含む）の熱安定性を、熱処理後のそれらの結合活性を測定することにより評価した。異なる温度での１時間にわたる熱処理後の、ヒトＥｐＣＡＭへの、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を、ＥＬＩＳＡによりｐＨ６．０及びｐＨ７．４で決定した。図２０Ａ～２０Ｂを参照のこと。４５℃までの熱処理は、結合親和性に著しく影響を及ぼすことはなかったが、これらの温度で良好な熱安定性を示している。
実施例１３：ＦＡＣＳによる、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体ＡＤＣの結合活性。
ヒトＥｐＣＡＭを発現するＣｏｌｏ２０５細胞への、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体（ＭＭＡＥを伴う）の結合活性を、２つの異なるｐＨ：６．０及び７．４でＦＡＣＳにより測定した。コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ｐＨ７．４よりもｐＨ６．０で、ヒトＥｐＣＡＭを発現するＣｏｌｏ２０５細胞へのより高い結合活性を一貫して示した。図２１Ａ～２１Ｂを参照のこと。コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体による、ヒトＥｐＣＡＭを発現するＣｏｌｏ２０５細胞への結合についてのＥＣ５０値を、表１６中に要約している。
Figure 2022531504000018
同様のＦＡＣＳ分析を、また、ヒトＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞を使用して行った。コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体はまた、ｐＨ７．４よりもｐＨ６．０で、ヒトＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞へのより高い結合活性を一貫して示した。図２２Ａ～２２Ｂを参照のこと。ヒトＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞への、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体による結合についてのＥＣ５０値を、表１７中に要約している。
Figure 2022531504000019
同様のＦＡＣＳ分析を、また、カニクイザルＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞を使用して行った。コンジュゲートされた、ヒトの条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体（ＭＭＡＥを伴う）は、また、ｐＨ７．４よりもｐＨ６．０で、カニクイザルＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞へのより高い結合活性を一貫して示した。図２３Ａ～２３Ｂを参照のこと。カニクイザルＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞への、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体による結合についてのＥＣ５０値を、表１８中に要約している。
Figure 2022531504000020
実施例１４：ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体ＡＤＣの細胞死滅。
コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体（ＭＭＡＥを伴う）を細胞死滅について分析した。抗体ＢＡＰ－１０５－０１－０１を無条件で活性な抗体コントロールとして使用し、Ｂ１２をネガティブコントロールとして使用した。インビトロ細胞死滅を、６．０、６．５、及び７．４の３つのｐＨ値で、ヒトＥｐＣＡＭを発現するＣｏｌｏ２０５細胞を使用して分析した。コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体による、ヒトＥｐＣＡＭを発現するＣｏｌｏ２０５細胞のインビトロ死滅を図２４Ａ－２４Ｃ中に示す。ヒトＥｐＣＡＭを発現するＣｏｌｏ２０５細胞の細胞死滅についてのＩＣ５０値を表１９中に示す。
Figure 2022531504000021
ヒトＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞のインビトロ細胞死滅を、６．０、６．５、及び７．４の３つのｐＨ値で、ヒトＥｐＣＡＭを発現する２９３細胞を使用して同様に分析した。コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体による、ヒトＥＰＣＡＭを発現する２９３細胞のインビトロ死滅を、図２５Ａ～２５Ｃ中に示す。コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体による、ヒトＥＰＣＡＭを発現する２９３細胞の細胞死滅についてのＩＣ５０値を表２０中に示す。
Figure 2022531504000022
ヒトＥｐＣＡＭを含まない２９３Ｆ細胞のインビトロ細胞死滅を、６．０、６．２、及び７．４の３つのｐＨ値で、ＥｐＣＡＭを含まない２９３Ｆ細胞を使用して同様に分析した。コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体による２９３Ｆ細胞のインビトロ死滅を図２６Ａ～２６Ｃ中に示す。コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の細胞死滅は、コントロールから有意に異ならなかった。コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体による２９３Ｆ細胞の細胞死滅のＩＣ５０値を表２１中に示す。
Figure 2022531504000023
実施例１５：ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体ＡＤＣによる腫瘍の処置。
コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体（ＭＭＡＥを伴う）による腫瘍のインビボ処置を、Ｃｏｌｏ２０５異種移植マウスモデルにおいて測定した。抗体ＢＡＰ－１０５－０１－０１を無条件で活性な抗体コントロールとして使用し、Ｂ１２をネガティブコントロールとして使用した。異種移植モデルを、ＩＶ注射による断続的なスケジュールＱ４Ｄｘ４（４日毎に４回）を用いて処置した。３ｍｇ／ｋｇ及び６ｍｇ／ｋｇの２つの投与量を使用した。８匹のマウスを各々の処置群において使用した。コンジュゲートされた条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体（ＢＡＰ－１０５．４－０１－０２、ＢＡＰ－１０５．４－０１－０５、及びＢＡＰ－１０５．４－０２－０１）は、コントロールとの比較において、３及び６ｍｇ／ｋｇの用量で腫瘍の容積を有意に低下させたが、しかし、動物の体重を有意に低下させず、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体のより有効な処置及び低下した副作用の両方を示している。図２７Ａ～２７Ｃを参照のこと。
実施例１６：腫瘍微小環境におけるヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体ＡＤＣの結合活性。
選択された、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体を、ＭＭＡＥにコンジュゲートさせて、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を産生した。ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体は、ＢＡＰ－１０５．４－０１－０２、ＢＡＰ－１０５．４－０１－０５、及びＢＡＰ－１０５．４－０２－０１であった。ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体コンジュゲートの結合活性を、腫瘍微小環境におけるｐＨを模倣するためにｐＨ６．０で、及び通常の生理学的ｐＨ７．４で測定した。無条件で活性な抗体抗体を、また、ＭＭＡＥにコンジュゲートさせ、ネガティブコントロールとして使用した。組換えヒトＥｐＣＡＭ細胞外ドメインへの、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を、異なるＡＤＣ濃度でＥＬＩＳＡを使用して測定した。ＡＤＣは、通常の生理学的ｐＨでの結合活性との比較において、腫瘍微小環境ｐＨでより高い結合活性を示した。図２８Ａ～２８Ｂを参照のこと。
実施例１７：ヒトＥｐＣＡＭを発現するＣｏｌｏ２０５細胞の阻害における、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体コンジュゲートの細胞傷害性。
実施例１６のＡＤＣを使用し、腫瘍微小環境ｐＨ６．０及び通常の生理学的ｐＨ７．４で、ヒトＥｐＣＡＭを発現するＣｏｌｏ２０５細胞を処理した。ＡＤＣによって、通常の生理学的ｐＨよりも腫瘍微小環境ｐＨでより大きな阻害率（ＩＲ％）が誘導された。図２９Ａ～２９Ｂ。
ＡＤＣはまた、Ｃｏｌｏ２０５細胞誘導性の癌異種移植モデルを処置するために使用した。Ｃｏｌｏ２０５細胞を免疫不全マウス中に移植し、８０～１００ｍｍ3の容積で腫瘍を誘導した。担癌動物は、群当たり８匹のマウスを伴う処置群にランダム化した。２つの他のネガティブコントロールを処置のために使用した：賦形剤及びアイソタイプを一致させたコントロールＡＤＣ（アイソタイプｃｔｒｌ．ＡＤＣ）。ＡＤＣを３ｍｇ／ｋｇ Ｑ４Ｄｘ４の用量で投与した（４日毎に４回）。本発明の、コンジュゲートされ、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体によって、異種移植モデルにおいて完全な腫瘍退縮が達成された。図２９Ｃを参照のこと。
実施例１８：ヒトＥｐＣＡＭへの、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性。
ヒトＥｐＣＡＭへの、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を、コントロールとしてテンプレート抗体ＢＡＰ １０５－０１－０１を使用して、ＥＬＩＳＡにより測定した。図３０Ａ～３０Ｃを参照のこと。この実施例において使用された、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体は、以下の通りであった：
Figure 2022531504000024
ｐＨ６．０及びｐＨ７．４でヒトＥｐＣＡＭに結合するための、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体のＥＣ５０値を表２２中に要約している。
Figure 2022531504000025
実施例１９：カニクイザルＥｐＣＡＭへの、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性。
カニクイザルＥｐＣＡＭへの、ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体の結合活性を、また、同様に測定した。図３１Ａ～３１Ｃを参照のこと。実施例１８のヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体について、ｐＨ６．０及びｐＨ７．４でカニクイザルＥｐＣＡＭに結合するためのＩＣ５０を、表２３中に要約している。
Figure 2022531504000026
実施例２０：条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体コンジュゲートの細胞死滅。
選択した条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体ＢＡＰ－１０５－０６－０１及びＢＡＰ－１０５－０６－０２を、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）（強力な有糸分裂阻害剤）にコンジュゲートさせて、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を作製した。抗体ＢＡＰ－１０５－０１－０１を無条件で活性な抗体コントロールとして使用し、Ｂ１２をネガティブコントロールとして使用した。ＥｐＣＡＭを発現するＣｏｌｏ２０５細胞のインビトロ細胞死滅を、６．０及び７．４のｐＨ値で測定した。図３２Ａ～３２Ｂを参照のこと。ヒト化された条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体によるＣｏｌｏ２０５細胞のインビトロ死滅についてのＩＣ５０も決定し、下の表２４中に示す。
Figure 2022531504000027
実施例２１：二重特異性の単一条件的に活性な抗体。
条件付きで活性ではなかった抗ＥｐＣＡＭ抗体を一本鎖の条件付きで活性な抗ＣＤ３抗体に連結し、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ３の両方に特異性を有する二重特異性抗体（ＷＴ ＥｐＣＡＭ ｘ ＣＡＢ－ＣＤ３ ＢＡ－１５０－０６－ＢＦ３（配列番号３５－３８））を形成させた。二重特異性抗体を使用し、Ｃｒｏｗｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（カリフォルニア州サンディエゴ）により産生されたＭｉＸｅｎｏマウスモデルにおいて腫瘍異種移植マウスモデルを処置した。具体的には、結腸癌細胞株ＨＣＴ１１６細胞（ＥｐＣＡＭ陽性）を、ヒト末梢血単核細胞を用いて移植した三重免疫不全マウス中に移植し、マウスモデルにおいて腫瘍を誘導した。腫瘍容積が約１５０ｍｍ3に達した際、担癌動物を４つの処置群にランダム化した。４つの処置群を、ネガティブコントロールとしての賦形剤（群１）、ポジティブコントロールとしての非ＣＡＢ－ＣＤ３ベンチマーク抗体ＢＡ－１５０－０６－ＢＦ１（配列番号３１－３４）（群２）、ネガティブコントロールとしての二重特異性抗体ＢＡ－１５０－０６－ＢＦ３（群３）又はアイソタイプ一致抗体（群４）を用いて処置した。抗体を、隔週で２．５ｍｇ／ｋｇの用量で４週間にわたり投与した。
二重特異性抗体ＷＴ ＥｐＣＡＭ ｘ ＣＡＢ－ＣＤ３ ＢＡ－１５０－０６－ＢＦ３は、異種移植マウスモデルにおいて完全な腫瘍退縮を起こすことで、ポジティブコントロールの非ＣＡＢ－ＣＤ３ベンチマーク抗体ＢＡ－１５０－０６－ＢＦ１と同じくらい有効であった一方で、２つのネガティブコントロールは腫瘍退縮を起こすことができず、腫瘍のサイズはネガティブコントロール群について増加し続けた。
図３２Ａを参照のこと。
抗ＣＤ３抗体は典型的には、末梢循環系においてＴ細胞の活性化を起こすという副作用を有し、それは、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイを使用して血清ＩＮＦ－γレベルにより測定されうる。図３２Ｂを参照のこと。二重特異性抗体ＷＴ ＥｐＣＡＭ ｘ ＣＡＢ－ＣＤ３ ＢＡ－１５０－０６－ＢＦ３は、ポジティブコントロールの非ＣＡＢ－ＣＤ３ベンチマーク抗体ＢＡ－１５０－０６－ＢＦ１と比較し、有意に低下したＴ細胞活性化を起こした。図３２Ｂを参照のこと。このように、二重特異性抗体ＷＴ ＥｐＣＡＭ ｘ ＣＡＢ－ＣＤ３ ＢＡ－１５０－０６－ＢＦ３は、条件付きで活性な抗ＣＤ３抗体成分を有するため、有意に低下した副作用を起こしたが、しかし、ポジティブコントロールの非ＣＡＢ－ＣＤ３ベンチマーク抗体ＢＡ－１５０－０６－ＢＦ１との比較において同等の治療効果を有した。
実施例２２：二重特異性の二重条件付きで活性な抗体。
条件付きで活性な抗ＥｐＣＡＭ抗体を一本鎖の条件付きで活性な抗ＣＤ３抗体に連結させて、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ３の両方に特異性を有する、二重条件付きで活性な二重特異性抗体（ＣＡＢ ＥｐＣＡＭ ｘ ＣＡＢ－ＣＤ３ ＢＡ－１５０－１６－０１－０２－ＢＦ４５－配列番号４７－５０）を形成させた。単一条件付きで活性な二重特異性抗ＥｐＣＡＭ抗体を、また、条件付きで活性ではない抗ＥｐＣＡＭ抗体を、一本鎖の条件付きで活性な抗ＣＤ３抗体に連結させて、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ３の両方に特異性を有する二重特異性抗体（ＷＴ ＥｐＣＡＭ ｘ ＣＡＢ－ＣＤ３ ＢＡ－１５０－ １５－０１－０３－ＢＦ４６－配列番号４３－４６）を形成させることにより作った。二重特異性抗体ＢＡ－１５０－１６－０１－０２－ＢＦ４５及びＢＡ－１５０－１５－０１－０３－ＢＦ４６を使用して、Ｃｒｏｗｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（カリフォルニア州サンディエゴ）により産生されたＭｉＸｅｎｏマウスモデルにおける腫瘍異種移植マウスモデルを処置した。具体的には、結腸癌細胞株ＨＣＴ１１６細胞（ＥｐＣＡＭ陽性）を、ヒト末梢血単核細胞を用いて移植した三重免疫不全マウス中に移植し、マウスモデルにおいて腫瘍を誘導した。腫瘍容積が約１５０ｍｍ3に達した際、担癌動物を５つの処置群にランダム化した。５つの処置群を、ネガティブコントロールとしての賦形剤（群１）、ポジティブコントロールとしての非ＣＡＢ－ＣＤ３ベンチマーク抗体ＢＡ－１５０－１５－０１－０３－ＢＦ１（配列番号３９－４２）（群２）、二重条件付きで活性な二重特異性抗体ＣＡＢ ＥｐＣＡＭ ｘ ＣＡＢ－ＣＤ３ ＢＡ－ＢＡ－１５０－１６－０１－０２－ＢＦ４５（群３）、ネガティブコントロールとしてのアイソタイプ一致抗体（群４）、又は単一条件付きで活性な二重特異性抗体ＷＴ ＥｐＣＡＭ ｘ ＣＡＢ－ＣＤ３ ＢＡ－１５０－１５－０１－０３－ＢＦ４６（群５）を用いて処置した。抗体を、隔週で２．５ｍｇ／ｋｇの用量で４週間にわたり投与した。
二重条件付きで活性な二重特異性抗体ＣＡＢ ＥｐＣＡＭ ｘ ＣＡＢ－ＣＤ３ ＢＡ－１５０－１６－０１－０２－ＢＦ４５は、異種移植マウスモデルにおいて完全な腫瘍退縮を起こす際にポジティブコントロールの非ＣＡＢ－ＣＤ３ベンチマーク抗体ＢＡ－１５０－１５－０１－０３－ＢＦ１と同じくらい有効であった一方、２つのネガティブコントロールは腫瘍退縮を起こすことができず、腫瘍のサイズはネガティブコントロール群について増加し続けた。二重条件付きで活性な二重特異性抗体ＣＡＢ ＥｐＣＡＭ ｘ ＣＡＢ－ＣＤ３ ＢＡ－１５０－１６－０１－０２－ＢＦ４５は、単一条件付きで活性な二重特異性抗体ＷＴ ＥｐＣＡＭ ｘ ＣＡＢ－ＣＤ３ＢＡ－１５０－１５－０１－０３－ＢＦ４６よりもわずかに有効であった。図３３を参照のこと。
単一条件付きで活性な二重特異性抗体ＷＴ ＥｐＣＡＭ ｘ ＣＡＢ－ＣＤ３ ＢＡ－１５０－０６－ＢＦ３を、野生型ＷＴ ＥｐＣＡＭ ｘ ＷＴ ＣＤ３ ＢＡ－１５０－０６－ＢＦ１抗体に対してテストし、インターロイキン－６（ＩＬ６）レベルに対する毒性、効果及びＣＤ３ ＋レベルに対する効果を決定した。結果を図３４に示す。これらの結果から見ることができるように、単一条件付きで活性な二重特異性抗体ＷＴ ＥｐＣＡＭ ｘ ＣＡＢ－ＣＤ３ ＢＡ－１５０－０６－ＢＦ３は、野生型ＷＴ ＥｐＣＡＭ ｘ ＷＴ ＣＤ３ ＢＡ－１５０－０６－ＢＦ１抗体よりも有意に毒性が少なかった。また、単一条件付きで活性な二重特異性抗体ＷＴ ＥｐＣＡＭ ｘ ＣＡＢ－ＣＤ３ ＢＡ－１５０－０６－ＢＦ３は、テストの２日目に、望ましくないＩＬ－６の有意に低下したレベル及びＣＤ３＋における有意に改善された低下をもたらし、腫瘍処置における有効性を示している。
抗体、重鎖及び軽鎖可変領域、及び抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの配列は以下の通りである：
配列番号３１ ＝ ＢＡ－１５０－０６－ＢＦ１－ＶＫ（抗ＥｐＣＡＭ）
配列番号３２ ＝ ＢＡ－１５０－０６－ＢＦ１軽鎖
配列番号３３ ＝ ＢＡ－１５０－０６－ＢＦ１－抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ
配列番号３４ ＝ ＢＡ－１５０－０６－ＢＦ１－ＶＨ（抗ＥｐＣＡＭ）
配列番号３５ ＝ ＢＡ－１５０－０６－ＢＦ３－ＶＫ（抗ＥｐＣＡＭ）
配列番号３６ ＝ ＢＡ－１５０－０６－ＢＦ３軽鎖
配列番号３７ ＝ ＢＡ－１５０－０６－ＢＦ３－抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ
配列番号３８ ＝ ＢＡ－１５０－０６－ＢＦ３－ＶＨ（抗ＥｐＣＡＭ）
配列番号３９ ＝ ＢＡ－１５０－１５－０１－０３－ＢＦ１－ＶＫ（抗ＥｐＣＡＭ）
配列番号４０ ＝ ＢＡ－１５０－１５－０１－０３－ＢＦ１軽鎖
配列番号４１ ＝ ＢＡ－１５０－１５－０１－０３－ＢＦ１ 抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ
配列番号４２ ＝ ＢＡ－１５０－１５－０１－０３－ＢＦ１－ＶＨ（抗ＥｐＣＡＭ）
配列番号４３ ＝ ＢＡ－１５０－１５－０１－０３－ＢＦ４６－ＶＫ（抗ＥｐＣＡＭ）
配列番号４４ ＝ ＢＡ－１５０－１５－０１－０３－ＢＦ４６軽鎖
配列番号４５ ＝ ＢＡ－１５０－１５－０１－０３－ＢＦ４６－抗ＣＤ３－ｓｃＦＶ
配列番号４６ ＝ ＢＡ－１５０－１５－０１－０３－ＢＦ４６－ＶＨ（抗ＥｐＣＡＭ）
配列番号４７ ＝ ＢＡ－１５０－１６－０１－０２－ＢＦ４５－ＶＫ（抗ＥｐＣＡＭ）
配列番号４８ ＝ ＢＡ－１５０－１６－０１－０２－ＢＦ４５軽鎖
配列番号４９ ＝ ＢＡ－１５０－１６－０１－０２－ＢＦ４５－抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ
配列番号５０ ＝ ＢＡ－１５０－１６－０１－０２－ＢＦ４５－ＶＨ（抗ＥｐＣＡＭ）
ＶＫ配列は、ＥｐＣＡＭ結合のための軽鎖可変ドメインである。
軽鎖配列は、ＥｐＣＡＭ結合のためのＶＫ軽鎖可変ドメイン、カッパ定常領域、及び抗ＣＤ３－ｓｃＦｖを含む全長軽鎖である。
抗ＣＤ３－ｓｃＦｖ配列は抗ＣＤ３－ｓｃＦｖドメインである。
ＶＨ配列は、ＥｐＣＡＭ結合のための重鎖可変ドメインである。
実施例２３：エピトープマッピング。
ヒト／マウスＥｐＣＡＭ－ＥＣＤキメラの構築及びテスト
クローンはヒト及びカニクイザルのＥｐＣＡＭ細胞外ドメインに強く結合するが、マウスＥｐＣＡＭ－ＥＣＤとは交差反応しない。ヒトＥｐＣＡＭ－ＥＣＤ上の結合領域を同定するために、４つのキメラヒト／マウスＥｐＣＡＭ－ＥＣＤ分子を構築した。ヒトＥＰＣＡＭ－ＥＣＤのフラグメントを、ＰＣＲによりマウスＥｐＣＡＭ－ＥＣＤのフラグメントを用いて置換した。個々のマウスのフラグメントを、図３５中に示すように黒色縦線により示している。図３５の配列アラインメント中で、ヒトＥｐＣＡＭ－ＥＣＤ（上）を参照として使用している。他の分子中の同一のアミノ酸をドットとして示し、アミノ酸の違いだけを示している。アラインメント中のアミノ酸ナンバリングは、図３９中に示すＰＤＢエントリー４ｍｖｚ中のナンバリングと一致する。
ヒト、マウス、及び４つのキメラＥｐＣＡＭ細胞外ドメインを、ＣＨＯ細胞中でＣ末端Ｈｉｓタグを伴って発現させ、精製した。異なるＥｐＣＡＭ ＥＣＤへのクローンＢＡ－１０５－０４－０１－０５の結合を、ＥＬＩＳＡにより決定した。
良好な結合が、ヒトＥｐＣＡＭ－ＥＣＤならびにキメラ分子２、３、及び４に対して観察された。結合は、図３６中に示すように、キメラＥｐＣＡＭ－ＥＣＤ １（ｃｈ１ＥｐＣＡＭ－ｈｉｓ）及びマウスＥｐＣＡＭ－ＥＣＤとは観察されなかった。ＥＬＩＳＡデータは、ＢＡ－１０５－０４－０１－０５のための結合領域が、図３７中に示すように、ヒトＥｐＣＡＭのコンパクトでシステインに富むＮドメイン（残基２４－６２）内にあることを明確に示す。ヒトＥｐＣＡＭ－ＥＣＤ変異体の構築及びテスト。
エピトープ分析の解像度を増加させるために、変異を、ヒト、カニクイザル、及びマウスのＥｐＣＡＭ－ＥＣＤ．Ｎドメイン間の配列の違いに基づいてヒトＥｐＣＡＭ中に導入した。合計７つの変異体（Ｍ１－Ｍ７）を構築し、テストした。図３７中の配列アラインメント中で、ヒトＥｐＣＡＭ－ＥＣＤ（上）を参照として使用する。他の分子中の同一のアミノ酸をドットとして示し、このように、アミノ酸の違いだけを示している。アラインメント中のアミノ酸ナンバリングは、図３９中に示すＰＤＢエントリー４ｍｖｚ中のナンバリングと一致する。
残基２５／２６及び／又は５１をマウス配列に変化させることによって、結合がわずかに低下し、残基３６／３７を変化させることによって、結合が完全に無効になった。これは、残基２５／２６が主要な接触点であることを示す（図３９中に示す構造において赤色でマークしている）。これらの２つの残基は、表面上で残基２５／２６及び５１（図３９中でオレンジ色でマークしている）により隣接されており、ＢＡ－１０５－０４－０１－０５が、ヒトＥｐＣＡＭ細胞外ドメインのＮドメイン内の非線形エピトープを認識することを示している。実施例において使用されている方法。
ＥＬＩＳＡアッセイは、以下のプロトコールを使用して実施した：
１）炭酸塩－重炭酸塩コーティング緩衝液中の１００μＬの０．５μｇ／ｍＬ（０６＿２０＿１７及び０６＿２８＿１７実験）又は１μｇ／ｍＬ（０７＿０６＿１７及び０７＿１１＿１７実験）の組換えＥｐＣＡＭ抗原を用いてＥＬＩＳＡプレートにコーティングする。
２）プレートを、シーリングフィルムを用いて覆い、４℃で一晩インキュベートする。
３）プレートをデカントし、ペーパータオルのスタック上で残留液体を叩いて落とす。
４）サンプルマップに従って２００μＬの種々のｐＨインキュベーション緩衝液をウェルに分注することによりウェルを２回洗浄し、内容物を完全に吸引する。
５）サンプルマップに従って２００μＬの種々のｐＨインキュベーション緩衝液をウェルに加える。
シーリングフィルムを用いて覆い、プレートをプレートシェーカー（２００ｒｐｍに設定）上に室温で６０分間にわたり置く。
６）プレートをデカントし、ペーパータオルのスタック上で残留液体を叩いて落とす。
７）テスト物質を種々のｐＨインキュベーション緩衝液中で２５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、又は２５ｎｇ／ｍＬに段階希釈する。
８）サンプルマップに従って、１００μＬ／ウェルの希釈したテスト物質をプレートに加える。
９）シーリングフィルムを用いて覆い、プレートをプレートシェーカー（２００ｒｐｍに設定）上に室温で６０分間にわたり置く。
１０）プレートをデカントし、ペーパータオルのスタック上で残留液体を叩いて落とす。
１１）サンプルマップに従って２００μＬの種々のｐＨ洗浄緩衝液をウェルに分注することによりウェルを３回洗浄し、内容物を完全に吸引する。
１２）ＨＲＰ二次抗体を種々のｐＨインキュベーション緩衝液中で１：２５００に希釈する。
１３）サンプルマップに従って、種々のｐＨインキュベーション緩衝液中で希釈した１００μＬのＨＲＰ二次抗体を各々のウェルに加える。
１４）シーリングフィルムを用いて覆い、プレートをプレートシェーカー（２００ｒｐｍに設定）上に室温で６０分間にわたり置く。
１５）プレートをデカントし、ペーパータオルのスタック上で残留液体を叩いて落とす。
１６）サンプルマップに従って２００μＬの種々のｐＨ洗浄緩衝液をウェルに分注し、内容物を完全に吸引することにより、ウェルを３回洗浄する。
１７）５０μＬ／ウェルのＴＭＢ基質溶液をプレートの全てのウェル中に分注する。
室温で３分間にわたりインキュベートする。
１８）５０μＬ／ウェルの１Ｎ ＨＣｌをプレートの全てのウェル中に加える。
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０マイクロプレートリーダーを使用して４５０ｎｍでプレートを読み取る。
１９）ＯＤ４５０ｎｍの生データを測定する。
２０）Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用し、緩衝液のｐＨに対して異なるｐＨ値での平均ＯＤ値（２回の繰り返しから）をプロットする。曲線適合を、ソフトウェア中に組み込まれている４パラメーターモデルを使用して行った。ｐＨ曲線の屈曲点（５０％の結合活性）は、適合方程式のパラメーターＣに等しい。ｐＨ６．０での結合活性を１００％に設定した。９０％の結合活性についてのｐＨを、Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏソフトウェアの「ＩｎｔｅｒｐＸ」機能を使用して適合曲線から補間した。
表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）アッセイを、以下のプロトコールを使用して実施した：
ＳＰＲ ２／４機器、ＳＰＲ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｎｓｏｒｓ－Ａｍｉｎｅ Ｆｌａｔ、及びＩｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ緩衝液キットはＳｉｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓにより製造されている。ＳＰＲセンサーは４つのフローセル（ＦＣ１－ＦＣ４）を含み、それらの各々を個別に又は群中で対処することができる。ＥｐＣＡＭ細胞外ドメインはＦＣ２及びＦＣ４において固定化され、ＢＳＡはＦＣ１及びＦＣ３（コントロール表面）において固定化された。
固定化は、ベンダーにより提案されたプロトコールに従って行った：
（１）アクチベーターは、注入直前に２００ｍＭ ＥＤＣ及び５０ｍＭ ＮＨＳ（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ）を混合することにより調製した。
アミンセンサーチップは、２５μＬ／分の流速で混合物を用いて４８０秒間にわたり活性化させた。
（２）１０ｍＭ ＮａＡｃ（ｐＨ５．０）中の２５μｇ／ｍＬのヒトＥｐＣＡＭを、２５μＬ／分の流速で４８０秒間にわたりＦＣ２及びＦＣ４にそれぞれ注入した。チップ表面を、ＦＣ１－４を２５μＬ／分の流速で４８０秒間にわたり泳動した１ Ｍエタノールアミン－ＨＣｌ（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ）を用いて不活化した。
（３）コントロール表面を、タンパク質を注入することを伴わずに、同じ条件を使用して活性化及び不活化した。
（４）泳動緩衝液を、分析物の注入前に、要求されるｐＨを伴うＰＢＳＴに切り替えた。
機器を、最初の分析物注入の前に１時間にわたり泳動緩衝液を用いて平衡化した。
（５）全ての分析対象物の注入を、２５℃で２５μＬ／分で行った。
固定化タンパク質を伴わないフローセル１（又は３）を、レファレンスサブトラクションのためのコントロールサーフェスとして使用した。また、分析物としてだけ緩衝液を用いたデータ（０ｎＭ分析物）を、各々の実行から差し引いた。二重に差し引かれたデータを、１：１結合モデルを使用し、提供された分析ソフトウェアＡｎａｌｙｚｅｒ Ｒ２（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ）に適合させた。分子量１４６ｋＤａを使用し、分析物のモル濃度を計算した。
蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）アッセイを、以下のプロトコールを使用して実施した：
ヒト又はカニクイザルＥｐＣＡＭの表面発現を決定するための細胞染色
１）３×１０6個細胞をＴ－７５フラスコに播種し、ベンダーの説明書に従って培養する。
２）ＦＡＣＳ分析の日に、培養培地を除去して廃棄する。
３）細胞層を、ＰＢＳ溶液を用いて簡単にリンスする。
４）１．５ｍＬのデタチン溶液をＴ－７５フラスコの各々に加える。
細胞層が分散するまで待つ。
５）４．５ｍＬの培地を対応する細胞株に加え、穏やかなピペッティングにより細胞を再懸濁する。
６）細胞をプールし、細胞懸濁液を５０ｍＬコニカルチューブに移す。
７）１５００ｒｐｍで５分間にわたる４℃での遠心分離前に、トリパンブルー染色を用いて細胞をカウントする。
８）細胞を、ＰＢＳを用いて１回洗浄し、３×１０5個の細胞をエッペンドルフチューブに移す。
９）２μＬのマウス抗ＥｐＣＡＭ（ＰＥコンジュゲートマウスＩｇＧ１）又はＰＥアイソタイプマウスＩｇＧ１を、チューブ当たり１％ＢＳＡを伴う１００μＬのＰＢＳ溶液中に加え、氷上で１時間にわたり１００ＲＰＭで振盪させる。
１０）１５０μＬのＰＢＳ溶液中で細胞を３回洗浄する。
１１）細胞を、４％ＰＦＡを用いて周囲温度で１０分間にわたり固定し、次にＰＢＳを用いて１回洗浄する。
１２）細胞を１００μＬのＰＢＳ中に再懸濁し、ＮｏｖｏＣｙｔｅフローサイトメーターで細胞を分析する。
テストした抗体を使用し、ヒトＥｐＣＡＭ又はカニクイザルＥｐＣＡＭを発現するＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ分析。
１）細胞を回収し（３．３の通り、工程１から７）、ＰＢＳを用いて細胞を１回洗浄する。
２）３×１０6個細胞／ｍＬの濃度でｐＨ６．０又はｐＨ７．４のＦＡＣＳ緩衝液で細胞を再懸濁する。
３）９６ウェルＵ底プレート中の１００μＬのｐＨ６．０又はｐＨ７．４のＦＡＣＳ緩衝液中に３×１０5個細胞を分注する。
４）細胞をスピンダウンし、緩衝液を廃棄する。
５）ｐＨ６．０又はｐＨ７．４のＦＡＣＳ緩衝液中で１０μｇ／ｍＬで開始し、テスト品を３倍希釈中で段階希釈する。
６）１００μＬ／ウェルの希釈したテスト品を細胞に加え、穏やかに十分に混合し、氷上で振盪（１００ｒｐｍ）を伴って１時間にわたりインキュベートする。
７）細胞を１５００ｒｐｍで５分間にわたり４℃で遠心分離する。
１５０μＬのｐＨ６．０又はｐＨ７．４の洗浄緩衝液を用いて細胞を２回洗浄する。
８）ヤギ抗ヒトＩｇＧ ＡＦ４８８抗体１：３００をｐＨ６．０又はｐＨ７．４のＦＡＣＳ緩衝液中で希釈する。
９）上の工程８）からの１００μＬの希釈抗体を細胞に加え、光から保護しながら氷上で４５分間にわたりインキュベートする。
１０）細胞をペレット化し、１５０μＬのｐＨ６．０又はｐＨ７．４の洗浄緩衝液を用いて３回洗浄する。
１１）１×ＰＢＳ中で希釈した４％ＰＦＡを用いて周囲温度で１０分間にわたり細胞を固定し、次に細胞を、１×ＰＢＳを用いて洗浄する。
１２）細胞を１００μＬの１×ＰＢＳ中に再懸濁する。
１３）Ｅｘ４８８ｎｍ／Ｅｍ５３０ｎｍを使用したＮｏｖｏＣｙｔｅフローサイトメーターを使用して細胞を分析する。少なくとも２０，０００個の細胞を収集する。
ＦＡＣＳデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン７．０３中に組み込まれている非線形適合（可変勾配、４つのパラメーター）モデルを使用して分析した。
しかし、本発明の多数の特徴及び利点が、本発明の構造及び機能の詳細と一緒に前述の記載において示されているとしても、本開示は例証だけであり、変化が、詳細において、特に、本発明の原理の範囲内での部品の形状、サイズ、及び配置の問題において、添付の特許請求の範囲が表される用語の広い一般的な意味により示される完全な範囲まで作られうる。
本明細書中で言及する全ての文書が、参照によりそれらの全体において、あるいはそれらが特に頼った開示を提供するために本明細書中に組み入れられる。出願人は、任意の開示された実施形態を公に捧げることを意図しておらず、任意の開示された修正又は変更が特許請求の範囲内に文字通り入らない場合、それらは均等論の下で本明細書の一部であるとみなされる。

Claims (51)

  1. ヒトＥｐＣＡＭに特異的に結合する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む単離ポリペプチドであって、前記重鎖可変領域は、配列Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３を有する３つの相補性決定領域を含み、
    前記Ｈ１配列はＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨ（配列番号１）であり；
    前記Ｈ２配列はＸ1ＩＲＰＳＴＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２）であり；及び
    前記Ｈ３配列はＧＤＮＷＶＧＦＡＮ（配列番号３）であり；ここでＸ1はＹ又はＤであり；ならびに
    前記軽鎖可変領域は、配列Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３を有する３つの相補性決定領域を含み、
    前記Ｌ１配列はＳＡＳＳＳＩＳＹＭＨ（配列番号４）であり；
    前記Ｌ２配列はＳＴＳＮＬＸ2Ｓ（配列番号５）であり；及び
    前記Ｌ３配列はＸ3ＱＷＳＴＹＸ4Ｔ（配列番号６）であり；ここでＸ2はＡ又はＨであり；Ｘ3はＨ又はＥであり；Ｘ4はＨ又はＥであり；但し、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、及びＸ4は同時にＹ、Ａ、Ｈ、及びＨであることはできない、単離ポリペプチド。
  2. 前記Ｈ２配列がＹＩＲＰＳＴＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２２）である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
  3. 前記Ｈ２配列がＤＩＲＰＳＴＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２３）である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
  4. 前記重鎖可変領域が、配列番号７～１３より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
  5. 前記Ｌ２配列がＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号２４）である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
  6. 前記Ｌ２配列がＳＴＳＮＬＨＳ（配列番号２５）である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
  7. 前記Ｌ３配列がＨＱＷＳＴＹＨＴ（配列番号２６）である、請求項２～６のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
  8. 前記Ｌ３配列がＨＱＷＳＴＹＥＴ（配列番号２７）である、請求項２～６のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
  9. 前記Ｌ３配列がＥＱＷＳＴＹＨＴ（配列番号２８）である、請求項２～６のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
  10. 前記軽鎖可変領域が、配列番号１４～２１より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１又は４に記載の単離ポリペプチド。
  11. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドを含む抗ＥｐＣＡＭ抗体又は抗体フラグメント。
  12. 重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むヒトＥｐＣＡＭタンパク質に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントであって、前記重鎖可変領域は３つの相補性決定領域を含み、前記領域は配列Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３を有し、
    前記Ｈ１配列はＧＹＴＦＴＳＹＷＭＨ（配列番号１）であり；
    前記Ｈ２配列はＸ1ＩＲＰＳＴＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２）であり；及び
    前記Ｈ３配列はＧＤＮＷＶＧＦＡＮ（配列番号３）であり；
    ここでＸ1はＹ又はＤであり、ならびに
    前記軽鎖可変領域は３つの相補性決定領域を含み、前記領域は配列Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３を有し、
    前記Ｌ１配列はＳＡＳＳＳＩＳＹＭＨ（配列番号４）であり；
    前記Ｌ２配列はＳＴＳＮＬＸ2Ｓ（配列番号５）であり；及び
    前記Ｌ３配列はＸ3ＱＷＳＴＹＸ4Ｔ（配列番号６）であり；
    ここでＸ2はＡ又はＨであり；Ｘ3はＨ又はＥであり；及びＸ4はＨ又はＥであり；但し、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、及びＸ4は同時にそれぞれＹ、Ａ、Ｈ、及びＨであることはできない、抗体又は抗体フラグメント。
  13. 前記Ｈ２配列がＹＩＲＰＳＴＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２２）である、請求項１２に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  14. 前記Ｈ２配列がＤＩＲＰＳＴＧＹＴＥＹＮＱＫＦＫＤ（配列番号２３）である、請求項１２に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  15. 前記重鎖可変領域が配列番号７～１３より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  16. 前記Ｌ２配列がＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号２４）である、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  17. 前記Ｌ２配列がＳＴＳＮＬＨＳ（配列番号２５）である、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  18. 前記Ｌ３配列がＨＱＷＳＴＹＨＴ（配列番号２６）である、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  19. 前記Ｌ３配列がＨＱＷＳＴＹＥＴ（配列番号２７）である、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  20. 前記Ｌ３配列がＥＱＷＳＴＹＨＴ（配列番号２８）である、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  21. 前記軽鎖可変領域が、配列番号１４～２１より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１２及び１５のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  22. 各々の領域が、独立して、配列番号８及び１４、配列番号９及び１４、配列番号７及び１５、配列番号７及び１６、配列番号７及び１７、配列番号１１及び２０、配列番号１２及び２１、配列番号１１及び１８、配列番号１３及び１８、ならびに配列番号１０及び１９よりそれぞれ選択されるアミノ酸配列の対と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の同一性を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体又は抗体フラグメントであって、前記抗体又は抗体フラグメントが、ヒトＥｐＣＡＭタンパク質に特異的に結合する、抗体又は抗体フラグメント。
  23. 前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域が、対：配列番号８及び１４、配列番号９及び１４、配列番号７及び１５、配列番号７及び１６、配列番号７及び１７、配列番号１１及び２０、配列番号１２及び２１、配列番号１１及び１８、配列番号１３及び１８、配列番号１０及び１９より選択される配列の任意の１対を有する、請求項２２に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  24. 前記抗体又は抗体フラグメントが、腫瘍微小環境における条件の値で、非腫瘍微小環境において生じる同じ条件の異なる値との比較において、ＥｐＣＡＭタンパク質へのより高い結合親和性を有する、請求項１２～２３のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  25. 前記条件がｐＨである、請求項２４に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  26. 前記腫瘍微小環境におけるｐＨが５．０～６．８の範囲中にあり、前記非腫瘍微小環境におけるｐＨが７．０～７．６の範囲中にある、請求項２５に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  27. 前記抗体又は抗体フラグメントが、少なくとも約１．５：１、少なくとも約２：１、少なくとも約３：１、少なくとも約４：１、少なくとも約５：１、少なくとも約６：１、少なくとも約７：１、少なくとも約８：１、少なくとも約９：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約２０：１、少なくとも約３０：１、少なくとも約５０：１、少なくとも約７０：１、又は少なくとも約１００：１の、腫瘍微小環境における条件の値でのＥｐＣＡＭタンパク質への結合親和性と、非腫瘍微小環境における同じ条件の異なる値でのＥｐＣＡＭタンパク質への結合親和性との比率を有する、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  28. 前記抗体が多重特異性抗体又は抗体フラグメントである、請求項１２～２７のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  29. 前記抗体が二重特異性抗体又は抗体フラグメントである、請求項１２～２７のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  30. 前記二重特異性抗体又は抗体フラグメントが抗ＣＤ３－ＳｃＦｖを含む、請求項２９に記載の抗体又は抗体フラグメント。
  31. 各々の領域が、独立して、配列番号３５、４３、及び４７からなる群より選択されるＶＫ領域ならびに配列番号３７、４５、及び４９からなる群より選択されるＶＨ領域の組み合わせと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む二重特異性抗体又は抗体フラグメント。
  32. 配列番号３６、４４、及び４８からなる群より選択される軽鎖と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する軽鎖を含む、請求項３１に記載の二重特異性抗体又は抗体フラグメント。
  33. 配列番号３８、４６、及び５０からなる群より選択される抗ＣＤ３－ｓｃＦｖと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する抗ＣＤ３－ｓｃＦｖを含む、請求項３１～３２のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又は抗体フラグメント。
  34. 請求項１２～３３のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメントを含む、イムノコンジュゲート。
  35. 前記イムノコンジュゲートが、化学療法剤、放射性原子、細胞分裂阻害剤、及び細胞傷害性薬剤より選択される少なくとも１つの薬剤を含む、請求項３４に記載のイムノコンジュゲート。
  36. 前記の少なくとも２つの薬剤を含む、請求項３５に記載のイムノコンジュゲート。
  37. 前記の少なくとも１つの薬剤が放射性薬剤である、請求項３５～３６のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  38. 前記放射性薬剤が、アルファエミッター、ベータエミッター、及びガンマエミッターより選択される、請求項３７に記載のイムノコンジュゲート。
  39. 前記抗体又は抗体フラグメント及び前記の少なくとも１つの薬剤がリンカー分子に共有結合的に結合されている、請求項３５～３８のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  40. 前記の少なくとも１つの薬剤が、メイタンシノイド、オーリスタチン、ドラスタチン、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、及びアントラサイクリンより選択される、請求項３５～３６のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
  41. 請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１２～３３のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント、あるいは請求項３４～４０のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲートと、医薬的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
  42. 等張化剤をさらに含む、請求項４１に記載の医薬組成物。
  43. 約１３５ｍｇ、２３５ｍｇ、３３５ｍｇ、４３５ｍｇ、５３５ｍｇ、６３５ｍｇ、７３５ｍｇ、８３５ｍｇ、９３５ｍｇ、１０３５ｍｇ、１１３５ｍｇ、１２３５ｍｇ、又は１３８７ｍｇの前記ポリペプチド、前記抗体又は抗体フラグメント、あるいは前記イムノコンジュゲートの量を含む、単一用量の、請求項４１～４２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  44. １３５～２３５ｍｇ、２３５～３３５ｍｇ、３３５～４３５ｍｇ、４３５～５３５ｍｇ、５３５～６３５ｍｇ、６３５～７３５ｍｇ、７３５～８３５ｍｇ、８３５～９３５ｍｇ、９３５～１０３５ｍｇ、１０３５～１１３５ｍｇ、１１３５～１２３５ｍｇ、又は１２３５～１３８７ｍｇの範囲中の前記ポリペプチド、前記抗体又は抗体フラグメント、あるいは前記イムノコンジュゲートの量を含む、単一用量の、請求項４１～４２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  45. 免疫チェックポイント阻害剤分子をさらに含む、請求項４１～４４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  46. 前記免疫チェックポイント阻害剤分子が、免疫チェックポイントに対する抗体又は抗体フラグメントである、請求項４５に記載の医薬組成物。
  47. 前記免疫チェックポイントが、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＧＩＴＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＣＤ２７、ＣＤ７０、ＤＲ３、及びＩＣＯＳより選択される、請求項４６に記載の医薬組成物。
  48. 前記免疫チェックポイントが、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、又はＰＤ－Ｌ１である、請求項４７に記載の医薬組成物。
  49. ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＡＸＬ、ＲＯＲ２、ＣＤ３、ＨＥＲ２、Ｂ７－Ｈ３、ＲＯＲ１、ＳＦＲＰ４、及びＷＮＴタンパク質より選択される抗原に対する抗体又は抗体フラグメントをさらに含む、請求項４５～４８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  50. 癌を伴う患者へ、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１２～３３のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント、請求項３４～４０のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート、あるいは請求項４１～４９のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、癌を処置する方法。
  51. 診断又は処置用のキットであって、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１２～３３のいずれか一項に記載の抗体又は抗体フラグメント、あるいは請求項３４～４０のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲートあるいは請求項４１～４９のいずれか一項に記載の医薬組成物と、診断又は処置のための前記抗体又は抗体フラグメント、前記イムノコンジュゲート及び／又は前記医薬組成物を使用するための説明書とを含む、キット。
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