CN114019045A - 4-(o-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的应用及2,3-反式无色花青素检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物缩合单宁检测技术领域，具体涉及4‑(O‑抗坏血酸)‑(+)‑儿茶素的应用及2,3‑反式无色花青素检测方法。该内源指示物4‑(O‑抗坏血酸)‑(+)‑儿茶素的含量与2,3‑反式无色花青素含量水平成正比。该检测方法先提取样品中的可溶性缩合单宁，再通过UHPLC‑QToF和UHPLC‑QqQ进行定性和定量分析。该检测方法具有准确、高效的特点，有助于解析植物类黄酮路径的碳流向分配、深入阐明缩合单宁的生物合成机制。

Description

4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的应用及2,3-反式无色花青素 检测方法
技术领域
本发明涉及植物缩合单宁检测技术领域，具体而言，涉及4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的应用及2,3-反式无色花青素检测方法。
背景技术
2,3-反式无色花青素是植物中二氢黄酮醇还原酶(DFR)的产物，是类黄酮途径，尤其是缩合单宁生物合成支路的重要中间产物，其化学结构式为:
Figure BDA0003329064990000011
该化合物可进一步被花色素合成酶(ANS)催化生成花青素，而后经UDP-类黄酮糖苷转移酶(UFGT)或花色素还原酶(ANR)分别催化形成花色苷或缩合单宁(-)-表儿茶素型单元。该物质也可作为无色花色素还原酶(LAR)的底物被转化为缩合单宁的(+)-儿茶素型起始单元。此外，游离的2,3-反式无色花青素可以直接作为(+)-儿茶素型延伸单元参与植物缩合单宁的非酶促聚合。
2,3-反式无色花青素极其不稳定。尽管体外化学或酶促反应即时合成的2,3-反式无色花色素通常可使用液相色谱(LC)在280nm下或利用液相色谱-质谱联用(LC/MS)进行定性和定量分析，但目前对植物体内的2,3-反式无色花色素的直接提取检测仍存在挑战。
2,3-反式无色花青素可以在植物体内自发转变为具有亲电性的(+)-儿茶素型碳正离子，能够与亲核试剂反应形成较为稳定的加合物。基于该原理，2018年，夏涛等人在《一种儿茶素中间体的生物合成及检测方法》(专利号：CN 108410886 A)中利用80％甲醇与0.2％盐酸作为溶剂对植物体内的黄烷醇碳正离子进行提取，并借助LC/MS测定黄烷醇-甲醇加合物来间接衡量体内儿茶素碳正离子的水平。然而，该方法中采用的溶剂亦可裂解样品中的缩合单宁，进而造成额外儿茶素或表儿茶素型碳正离子的释放，使得2,3-反式无色花青素来源与缩合单宁裂解来源的碳正离子不易区分，从而影响了定量的准确性。
此外，已报道的儿茶素碳正离子提取液与缩合单宁研究中常用的提取体系不兼容，这导致在获得可溶性缩合单宁后，需要增加独立的提取步骤才能对儿茶素碳正离子进行检测，使检测方法复杂、检测速度降低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的应用及2,3-反式无色花青素检测方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素作为内源指示物在检测植物中2,3-反式无色花青素含量水平中的应用。
进一步，所述4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的含量与2,3-反式无色花青素含量水平成正比。
本发明提供一种植物中2,3-反式无色花青素的检测方法，所述检测方法以4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素作为内源指示物作为内源指示物对2,3-反式无色花青素的含量进行检测，具体的检测步骤为：
先检测至少两个样品中，4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的含量；
再对比检测到的4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的含量，4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素含量高的样品相较于4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素含量低的样品具有更高水平的2,3-反式无色花青素含量。
进一步，至少两个所述样品分别为至少两种植物、或同一种类不同发育时期的植物。
进一步，所述4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的含量的检测方法包括：样品前处理、定性检测以及定量检测；
所述样品前处理的步骤为，分别提取每个样品中的可溶性缩合单宁；
所述定性检测的步骤为，采用超高液相色谱-高分辨率质谱分析法分别检测每个样品中的可溶性缩合单宁及4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素标准品，分别得到每个样品的质谱信息及所述4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素标准品的质谱系信息；
其中，具有以下质谱信息的样品为含有4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的样品，不具有以下质谱信息的样品中4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的含量为零；
所述质谱信息为，保留时间与所述4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素标准品的保留时间相同，并且所述质谱信息中含有母离子m/z 463，所述母离子含有二级离子m/z 327、m/z289、m/z 175、m/z 115、m/z 59；
所述定量检测的步骤为，采用超高液相色谱-串联三重四级杆质谱分析法检测含有4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的所述样品，得到4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的色谱峰面积；再根据4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的标准品曲线进行计算，得到4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的含量。
进一步，所述4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素标准品的制备方法包括以下步骤，
采用3,4-反式无色花青素和L-抗坏血酸进行化学合成反应生成4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素，反应方程式如下：
Figure BDA0003329064990000041
进一步，所述化学合成反应在避光条件下放置0.5～1.5h。
进一步，所述4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的标准品曲线通过以下步骤得到：
分别配置不同浓度的4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的标准品，再分别对不同浓度的所述标准品进行所述定量检测；
根据所述定量检测得到的每种浓度的4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的标准品的峰面积绘制浓度-峰面积曲线，得到所述4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的标准品曲线。
进一步，所述超高液相色谱-高分辨率质谱分析法采用的分析仪参数为：
色谱柱为Agilent Zorbax RRHD SB-C18色谱柱，规格为3×150mm，填料粒径为1.7μm；
采用第一流动相，所述第一流动相的A相为含有体积分数为0.1％的甲酸的超纯水溶液，所述第一流动相的B相为含有体积分数为0.1％的甲酸的乙腈溶液；所述第一流动相的流速为0.4mL/min；洗脱方式为梯度洗脱；
高分辨率质谱的检测器条件为：鞘气流速10L/min，温度400℃；干燥气流速8L/min，温度350℃；雾化气压40psig；喷嘴电压1kV；毛细管电压4kV；负离子扫描模式；一级质谱质荷比扫描范围为m/z 100-1700，采集频率4spectra/s，碎裂电压150V；二级质谱质荷比扫描范围为m/z[100至(待测化合物分子量+50)]，采集频率4spectra/s，碰撞能量20-30eV。
进一步，所述超高液相色谱-串联三重四级杆质谱分析法采用的分析仪参数为：
色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse Plus-C18色谱柱，规格为2.1×50mm，填料粒径为1.8μm；
采用第二流动相，所述第二流动相流动相的A相为含有体积分数为0.1％的甲酸的超纯水溶液，所述第二流动相流动相的B相为含有体积分数为0.1％的甲酸的乙腈溶液；所述第二流动相的流速为0.2mL/min；洗脱方式为梯度洗脱；
串联三重四级杆质谱的检测器条件为：鞘气流速11L/min，温度325℃；干燥气流速7L/min，温度300℃；雾化气压30psig；喷嘴电压1.5kV；毛细管电压3.5kV；负离子扫描模式；定量离子对为m/z(463.1→175.0)；碎裂电压100V、碰撞能量15eV、驻留时间150ms、弯管池加速电压5V。
本发明的有益效果在于：
1)本发明提供了一种全新的内源指示物用于检测植物体内2,3-反式无色花青素，为2,3-反式无色花青素的检测提供了新的方法；
2)本发明的4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素制备方法，具有简便高效的特点；
3)本发明的2,3-反式无色花青素检测方法，先提取植物中的可溶性单宁，再检测其中的4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素含量，避免了采用黄烷醇-甲醇进行检测时可能引入的其他来源的儿茶素或表儿茶素型碳正离子，使检测结果更加准；
4)本发明的2,3-反式无色花青素检测方法，采用UHPLC-QToF进行定性分析，采用UHPLC-QqQ进行定量分析，进一步提高了检测结果的可靠性和准确性；
5)本发明的2,3-反式无色花青素检测方法，能够准确检测植物体内2,3-反式无色花青素含量水平，有助于解析植物类黄酮路径的碳流向分配、深入阐明缩合单宁的生物合成机制。
附图说明
图1为本发明的实施例1中，2,3-反式无色花青素与亲核试剂反应形成稳定的加合物中，C4位与“X”间的共价键断裂，释放出(+)-儿茶素或(-)-表儿茶素型碳正离子的示意图；
图2为本发明的实施例1中，拟南芥tds4-4突变体和野生型样品的检测图谱；其中，图2-A为液相色谱图，图2-B为拟南芥突变体的液相色谱图中三种物质对应的母离子扫描图；
图3为本发明的实施例1中，拟南芥tds4-4突变体的液相色谱图中三种物质对应的二级离子扫描图；
图4为本发明的实施例2中，UHPLC-QToF对tds4-4突变体和野生型拟南芥样品高分辨率扫描的多个离子信息及其所对应的化学结构的对照图；
图5为本发明的实施例2中，抗坏血酸分别与无色花青素(Leu+ASA)、4β-S-半胱氨酸-(+)-儿茶(Cys-C+ASA)和4β-S-半胱氨酸-(-)-表儿茶素(Cys-EC)分别反应得到的三种产物的UHPLC-QToF图谱；
图6为本发明的实施例2中，拟南芥突变体tds4-2、tds4-4突变体以及野生型植株的超高液相色谱图，sd为标准品；
图7为本发明的实施例3中，4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素标准品纯度检测图谱，其中，图7-A为LC/MS的色谱图，图7-B为LC/MS的质谱图；
图8为本发明的实施例4中，4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的标准曲线。
附图中，各标号所代表的部件列表如下：
1、第一物质，2、第二物质，3、第三物质。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明的用于检测植物中2,3-反式无色花青素的内源指示物为4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素；在植物体内，4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素含量与2,3-反式无色花青素含量水平成正比。
本发明的植物中2,3-反式无色花青素的检测方法，采用4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素作为内源指示物进行检测，具体的检测步骤为：
先检测至少两个样品中4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的含量；再对比检测到的4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的含量，4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素含量高的样品相较于4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素含量低的样品具有更高水平的2,3-反式无色花青素含量。
理论上，本发明的检测方法也可以检测一个样品中的4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的含量，再根据得到的4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的含量，推测该样品中2,3-反式无色花青素含量的数量级；例如，在本发明的一个实施例中，当检测到一个样品中的4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的含量为0.1μmol g-1FW(FW：鲜重)，可换算并推知该样品中的2,3-反式无色花青素至少已达到μg g-1FW数量级。
但是，在该检测过程中，由于对于不同的样品而言，4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的含量与2,3-反式无色花青素含量之间的具体关系并没有确定的统一标准，该检测的结果仅能够大致判断该样品中的2,3-反式无色花青素含量的数量级；因此，本发明的检测方法以在两个样品之间进行2,3-反式无色花青素含量水平的比较为主。
本发明的植物中2,3-反式无色花青素的检测方法，主要包括样品前处理、定性检测以及定量检测；其中，样品前处理具体为提取每个样品中的可溶性缩合单宁；定性检测采用超高液相色谱-高分辨率质谱法(UHPLC-QToF)质谱分析法，定量检测采用超高液相色谱-串联三重四级杆质谱法(UHPLC-QqQ)分析。
本发明的检测方法，主要用于比较至少两份植物材料中2,3-反式无色花青素含量。
本发明的植物中2,3-反式无色花青素的检测方法中，采用的4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素标准品是采用3,4-反式无色花青素和L-抗坏血酸进行化学合成反应得到的，反应方程式如下：
Figure BDA0003329064990000081
上述化学合成反应的温度为28～32℃；反应的pH值通过添加NaOH调节至7.3～7.5；上述化学合成反应在避光条件下放置0.5～1.5h。
以下通过实施例，对本发明筛选内源指示物的思路和具体的验证实验进行具体说明，以证明4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素能够作为检测植物中2,3-反式无色花青素候选内源指示物。
实施例1植物中2,3-反式无色花青素候选内源指示物的筛选
本实施例对内源指示物筛选实验的设计思路为，由于2,3-反式无色花青素在植物体内可以自发转变为具有亲电性的(+)-儿茶素型碳正离子，能够与亲核试剂反应形成较为稳定的加合物。因此，检测该加合物的含量即可得到2,3-反式无色花青素的含量，并且两者的含量关系是正相关的。
如式(1)所示，根据对2,3-反式无色花青素分子结构可知，其C4位易形成(+)-儿茶素或(-)-表儿茶素型碳正离子；该位置受到潜在亲核化合物的攻击，最终形成稳定的共价键；因此，2,3-反式无色花青素与亲核试剂反应后形成的加合物的结构通式为式(2)。
Figure BDA0003329064990000091
如图1所示，为了进一步确定内源指示物的具体结构，可以在质谱负离子检测模式下使这些化合物的延伸单元C4与“X”间的共价键断裂，释放出(+)-儿茶素或(-)-表儿茶素型碳正离子。这两种碳正离子对应的离子信息是已知的，分别为m/z 289和m/z 287。另外，延伸单元C4与“X”之间共价键断裂后释放的“[X]-”与母离子m/z的差值为288，相当于化合物在碎裂过程中丢失了一个质量数为288的中性碎片，可以采取该中性丢失扫描的策略，检测离子碎片的质谱信息，符合上述分析的物质即可作为内源性标志物。
为了实施上述思路，本实施例采用拟南芥的突变型和野生型作为待检测的样品。其中，拟南芥的突变型具体为ans突变体tds4-4，野生型(WT)具体为拟南芥7DAP长角果。
选择这两种植物的原因是，拟南芥tds4-4突变体丧失了花色素还原酶(ANS)的全部活性，无法将由二氢黄酮醇还原酶(DFR)生成的2,3-反式无色花青素催化成下游产物，因此，该突变体中2,3-反式无色花青素及其在体内可能形成的加合物积累水平高于野生型。本实施例中，对于上述两种植物的样品处理方法为，分别提取各样品中的可溶性缩合单宁；提取的具体步骤为：
(1)将样品在液氮下充分研磨，称取100mg样品粉末；
(2)加入1mL提取缓冲液(含0.5％乙酸的70％丙酮/水溶液)，混合均匀，在冰水中超声30min后12,000g下离心5min，留取上清液；
(3)对步骤(2)中得到的沉淀部分重复步骤(2)中，加入提取缓冲液、混合、超声、离心及取上清液的步骤，重复操作2次，并将3次所得的上清液合并；
(4)步骤(3)得到的合并的上清液中，加入等体积氯仿，剧烈震荡，在5,000g下离心5min，再次留取离心后得到的上清液；
(5)对步骤(4)得到的上清液再次加入氯仿、震荡和离心的步骤，并重复2次；
(6)将步骤(5)得到的离心后的上清液完全冷冻干燥，再采用200μL50％LC/MS级甲醇复溶，存于-80℃冰箱中待用。
经过上述处理后，对两种样品进行中性丢失扫描分析，分析对象为碎裂过程中丢失质量数为288中性碎片的物质。具体仪器参数如下：Agilent 1200HPLC与6410triplequadrupole质谱联用系统，配备Poroshell 120EC C18色谱柱。HPLC洗脱条件和质谱主要参数参照已发表方法(Li S Y,He F,Zhu B Q,et al.Comparison of phenolic andchromatic characteristics of dry red wines made from native Chinese grapespecies and Vitis vinifera[J].International Journal of Food Properties,2017,20(9):2134-2146.)。
为此，本实施例首先利用原花青素二聚体B2(PB2)和原花青素二聚体B3(PB3)对离子源和检测器的参数进行优化，使得两个物质能够被中性丢失扫描模式稳定地检出。
在上述检测条件下，对处理后的拟南芥tds4-4突变体和野生型样品进行扫描和比较，扫描范围为m/z 300-1000。如图2-A所示，扫描后，得到了三种在拟南芥tds4-4突变体样品中明显高于野生型样品的物质的母离子信息，如图2-B所示，这三种物质的例子信息分别为，第一物质1：m/z 625、第二物质2：m/z 463和第三物质3：m/z 465。
如图3-A和图3-B所示，在上述三种物质中，只有第二物质2的二级离子中含有离子信息为m/z 289的中性离子碎片，也就是说，只有母离子信息为m/z 463的物质丢失了(+)-儿茶素或(-)-表儿茶素型碳正离子；因此，可以认为母离子信息为m/z 463的物质即为2,3-反式无色花青素的候选指示化合物。
实施例2确认母离子信息为m/z 463的物质的具体结构
为了准确推断低分辨质谱下m/z 463物质的结构，本实施例利用UHPLC-QToF对tds4-4突变体和野生型拟南芥样品进行m/z 100-1700的高分辨率扫描(MS1 scan)。
UHPLC-QToF检测仪器为Agilent 1290Infinity II UPLC液相色谱与Agilent6546Q-ToF质谱联用系统，配备Agilent Zorbax RRHD SB(3×150mm，1.7μm，C18)色谱柱。液相色谱洗脱程序为：A相(含0.1％甲酸的超纯水)，B相(含0.1％甲酸的乙腈)，流速0.4mL/min；程序：0-1min，5％B；1-2min，5-10％B；2-17min，10-31％B；17-18min，31-95％。质谱检测器参数为：鞘气流速10L/min，温度400℃；干燥气流速8L/min，温度350℃；雾化气压40psig；喷嘴电压1kV；毛细管电压4kV；负离子扫描模式；一级质谱(MS1)质荷比扫描范围为m/z 100-1700，采集频率4spectra/s，碎裂电压150V；二级质谱(MS2)质荷比扫描范围为m/z[100-(待测化合物分子量+50)]，采集频率4spectra/s，碰撞能量20-30eV。
检测后，提取离子信息为m/z 462.8～463.2(±20p.p.m)范围内的离子碎片进行比对分析。在该离子信息范围内，选择仅存在于拟南芥tds4-4样品中的离子，根据检测结果可得，在实施例1中，低分辩率质谱下的离子信息为m/z 463的第三物质3，其高分辨率下的离子信息m/z为463.0863±20p.p.m。
本实施例利用UHPLC-QToF对拟南芥tds4-4样品以m/z 463.0863±20p.p.m母离子为靶向检测母离子，重新分析其产物离子组成。
图4为产物离子谱图及其中主要离子碎片对应的离子结构。如图4所示，在产物离子谱图中，m/z 289.0712碎片推测为(+)-儿茶素或(-)-表儿茶素型碳正离子(理论值m/z289.0718)；m/z 175.0251碎片推测为抗坏血酸(ascorbic acid,AsA)(理论值m/z175.0248)；m/z 115.0036碎片应为AsA的特征离子(理论值m/z 115.0031)，且推测该碎片由理论值m/z 59.0139的有机酸特征碎片离去后经重排生成。在pH近中性条件下，AsA的C3位-OH容易失去质子而使之成为亲核试剂，从而具备与碳正离子形成加合物的可能性。
如图4所示，(+)-儿茶素或(-)-表儿茶素骨架的C4位和抗坏血酸的C3位O是最有可能形成共价键的位置，且该加合物负离子下m/z理论值为463.0882，与设定的靶向检测母离子的误差范围相符。
为进一步鉴定该候选物质的结构，本实施例将抗坏血酸分别与无色花青素(AsA+Leu)、4β-S-半胱氨酸-(+)-儿茶素(Cys-C)和4β-S-半胱氨酸-(+)-儿茶素(Cys-EC)在pH7.4 30℃下反应1h，分别得到三种产物，再将三种产物与处理后的拟南芥tds4-4和野生型样品再次采用与上述相同的UHPLC-QToF检测方法进行分析，分析结果如图5所示。
根据图5可知，tds4-4比野生型多出的候选物质，与“抗坏血酸+无色花青素”及“抗坏血酸+(+)-儿茶素”反应组的目标产物具有相同的保留时间，并早于“抗坏血酸+(-)-表儿茶素”组目标产物保留时间近1min。除野生型拟南芥样品外，其他四组样品目标物(m/z463.2880±20p.p.m)的特征产物离子均与图3所示一致。因此，可确认，加合物为4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素(AsA-C)，其化学结构式如式(3)所示：
Figure BDA0003329064990000131
为排除突变体表型的偶然性，本实施例继续对采用上述UHPLC-QToF检测方法对拟南芥ANS失活程度较弱的突变体tds4-2进行了AsA-C的靶向检测。
如图6所示，检测结果表明，拟南芥突变体tds4-2样品同样积累AsA-C，但其含量要明显低于tds4-4突变体株系的样品，即随着ANS活性丧失程度的增大，会有更多的上游底物流向AsA-C。这一实验结果进一步验证了4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素来源于2,3-反式无色花青素，并可以作为2,3-反式无色花青素的内源指示物。图6中的sd为标准品。
实施例3 4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的标准品合成
根据实施例2的结果，本实施例采用3,4-反式无色花青素与L-抗坏血酸制备4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素；具体的制备过程如下：
(1)取500μM 3,4-反式无色花青素与等摩尔的L-抗坏血酸水溶液混合后，用NaOH将溶液体系的pH值调至7.4；3,4-反式无色花青素可采用化学合成的方式获得，也可采购成品。
(2)将混合溶液体系在30℃下避光放置1h。
(3)采用乙酸乙酯对步骤(2)中反应后的溶液体系进行抽提，抽提后保留水相；其中，抽提使用的乙酸乙酯的体积是溶液体系的3倍。
(4)HPLC分离制备；采用Agilent 1200HPLC系统配备Agilent Zorbax SB(9.4×250mm，5μm，C18)色谱柱。
洗脱程序如下：A相(含0.1％甲酸的超纯水)，B相(含0.1％甲酸的乙腈)，流速3mL/min；程序：0-5min，5％B；5-10min，5-10％B；10-20min，10-15％B；20-23min，15-95％B。制备HPLC进样体积为100μL。在该洗脱条件下，收集17min左右流分。
将所有收集的流分进行冷冻干燥，得到4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素标准品粉末。
采用LC/MS对本实施例制备的4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素标准品纯度进行检测。具体步骤为，先将制得的标准品粉末采用20倍体积的超纯水复溶，得到标准品溶液；再采用LC/MS对标准品溶液进行检测。
LC/MS检测结果如图7所示。通过图7可以看出，该4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素标准品的纯度良好。
实施例4 4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的定量检测
本实施例对经过实施例1～2提取和定性检测的拟南芥tds4-4与tds4-2两种不同的独立突变体，4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的含量进行定量检测，定量检测采用UHPLC-QqQ检测仪器。
UHPLC-QqQ检测仪器为Agilent 1290Infinity II UPLC液相色谱与Agilent6470B QqQ质谱联用系统，配备Agilent Zorbax Eclipse Plus(2.1×50mm,1.8μm,C18)色谱柱。液相色谱洗脱程序为：A相(含0.1％甲酸的超纯水)，B相(含0.1％甲酸的乙腈)，流速0.2mL/min；程序：0-0.5min，5％B；0.5-1.5min，5-10％B；1.5-6.5min，10-20％B；6.5-7.5min，20-95％。质谱检测器参数为：鞘气流速11L/min，温度325℃；干燥气流速7L/min，温度300℃；雾化气压30psig；喷嘴电压1.5kV；毛细管电压3.5kV；驻留时间150ms；弯管池加速电压5V；负离子扫描模式。根据UHPLC-QToF获得的二级质谱信息，选择丰度最高的子离子m/z 175.0作为定量离子，尝试不同的碰撞能量10eV、15eV、20eV、25eV、30eV；不同的碎裂电压90V、95V、100V、110V、120V。
利用MassHunter软件进行处理后，比较各参数下定量离子的丰度。其中，最佳碰撞能量为：15eV；最佳碎裂电压为：135V。
采用实施例3得到的4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素标准品制作标准曲线。具体为，分别配制浓度梯度为0.03μM、0.15μM、0.73μM、3.65μM的AsA-C标准品溶液，制作标准曲线。
图8为标准曲线，该标准曲线的标准方程为y＝2E-0.5x+0.0131,R2＝1；根据该标准曲线可以看出，该定量方法在0至3.65μM的浓度范围内具有良好的线性。
利用该标准曲线可计算得到，本实施例中，拟南芥tds4-4突变体样品中，4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的含量为0.1μmol g-1FW(FW：鲜重)，tds4-2突变体中，4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的含量为0.05μmol g-1FW，因此，可以得知，拟南芥tds4-4突变体植株中2,3-反式无色花青素含量远高于tds4-2突变体植株中2,3-反式无色花青素的含量。该定量检测的结果与理论上拟南芥tds4-4型植物体中2,3-反式无色花青素含量更高的结论相同，因此可以证明，4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素可以作为内源指示物，对植物中2,3-反式无色花青素的含量水平进行指示，并且其含量与2,3-反式无色花青素的含量正相关。
本发明的检测方法，在检测未知2,3-反式无色花青素含量的植物时，可先采用实施例1中的样品处理方法提取待检测植物中的可溶性单宁，再采用实施例2中的UHPLC-QToF检测方法对处理后的样品中的4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素进行定性检测，再采用实施例4中的UHPLC-QqQ检测方法进行定量检测，得到检测结果。在定性检测和定量检测中，需要采用4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的标准品得到保留时间和标准曲线，4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的标准品通过实施例3中的制备方法制得。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素作为内源指示物在检测植物中2,3-反式无色花青素含量水平中的应用。
2.根据权利要求1所述4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素作为内源指示物在检测植物中2,3-反式无色花青素含量水平中的应用，其特征在于，所述4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的含量与2,3-反式无色花青素含量水平成正比。
3.一种植物中2,3-反式无色花青素的检测方法，其特征在于，所述检测方法以4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素作为内源指示物作为内源指示物对2,3-反式无色花青素的含量进行检测，具体的检测步骤为：
先检测至少两个样品中，4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的含量；
再对比检测到的4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的含量，4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素含量高的样品相较于4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素含量低的样品具有更高水平的2,3-反式无色花青素含量。
4.根据权利要求3所述一种植物中2,3-反式无色花青素的检测方法，其特征在于，
至少两个所述样品分别为至少两种植物、或同一种类不同发育时期的植物。
5.根据权利要求4所述一种植物中2,3-反式无色花青素的检测方法，其特征在于，所述4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的含量的检测方法包括：样品前处理、定性检测以及定量检测；
所述样品前处理的步骤为，分别提取每个样品中的可溶性缩合单宁；
所述定性检测的步骤为，采用超高液相色谱-高分辨率质谱分析法分别检测每个样品中的可溶性缩合单宁及4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素标准品，分别得到每个样品的质谱信息及所述4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素标准品的质谱系信息；
其中，具有以下质谱信息的样品为含有4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的样品，不具有以下质谱信息的样品中4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的含量为零；
所述质谱信息为，保留时间与所述4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素标准品的保留时间相同，并且所述质谱信息中含有母离子m/z 463，所述母离子含有二级离子m/z 327、m/z 289、m/z 175、m/z 115、m/z 59；
所述定量检测的步骤为，采用超高液相色谱-串联三重四级杆质谱分析法检测含有4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的所述样品，得到4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的色谱峰面积；再根据4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的标准品曲线进行计算，得到4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的含量。
6.根据权利要求5所述一种植物中2,3-反式无色花青素的检测方法，其特征在于，所述4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素标准品的制备方法包括以下步骤，
采用3,4-反式无色花青素和L-抗坏血酸进行化学合成反应生成4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素，反应方程式如下：
Figure FDA0003329064980000021
7.根据权利要求6所述一种植物中2,3-反式无色花青素的检测方法，其特征在于，所述化学合成反应在避光条件下放置0.5～1.5h。
8.根据权利要求5所述一种植物中2,3-反式无色花青素的检测方法，其特征在于，所述4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的标准品曲线通过以下步骤得到：
分别配置梯度浓度的4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的标准品，再分别对相应浓度的所述标准品进行所述定量检测；
根据所述定量检测得到的每种浓度的4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的标准品的峰面积绘制浓度-峰面积曲线，得到所述4-(O-抗坏血酸)-(+)-儿茶素的标准品曲线。
9.根据权利要求5所述一种植物中2,3-反式无色花青素的检测方法，其特征在于，所述超高液相色谱-高分辨率质谱分析法采用的分析仪参数为：
色谱柱为Agilent Zorbax RRHD SB-C18色谱柱，规格为3×150mm，填料粒径为1.7μm；
采用第一流动相，所述第一流动相的A相为含有体积分数为0.1％的甲酸的超纯水溶液，所述第一流动相的B相为含有体积分数为0.1％的甲酸的乙腈溶液；所述第一流动相的流速为0.4mL/min；洗脱方式为梯度洗脱；
高分辨率质谱的检测器条件为：鞘气流速10L/min，温度400℃；干燥气流速8L/min，温度350℃；雾化气压40psig；喷嘴电压1kV；毛细管电压4kV；负离子扫描模式；一级质谱质荷比扫描范围为m/z 100-1700，采集频率4spectra/s，碎裂电压150V；二级质谱质荷比扫描范围为m/z[100至(待测化合物分子量+50)]，采集频率4spectra/s，碰撞能量20-30eV。
10.根据权利要求5所述一种植物中2,3-反式无色花青素的检测方法，其特征在于，所述超高液相色谱-串联三重四级杆质谱分析法采用的分析仪参数为：
色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse Plus-C18色谱柱，规格为2.1×50mm，填料粒径为1.8μm；
采用第二流动相，所述第二流动相流动相的A相为含有体积分数为0.1％的甲酸的超纯水溶液，所述第二流动相流动相的B相为含有体积分数为0.1％的甲酸的乙腈溶液；所述第二流动相的流速为0.2mL/min；洗脱方式为梯度洗脱；
串联三重四级杆质谱的检测器条件为：鞘气流速11L/min，温度325℃；
干燥气流速7L/min，温度300℃；雾化气压30psig；喷嘴电压1.5kV；毛细管电压3.5kV；负离子扫描模式；定量离子对为m/z(463.1→175.0)；碎裂电压100V、碰撞能量15eV、驻留时间150ms、弯管池加速电压5V。
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