CN114015721A - 一种组织内印迹目的蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种组织内印迹目的蛋白的方法以及一种质粒复合物。所述方法包括：(1)将质粒载体1和质粒载体2转化入待观察组织；其中，所述质粒载体1携带表达所述目的蛋白的基因与PafA的融合基因，所述质粒载体2携带表达标签蛋白与Pup(E)的融合基因；(2)待所述目的蛋白表达后通过所述标签蛋白观察标记结果。本发明将PUPIL运用于皮层发育中短暂出现的电突触研究，能够直观地在活体组织神经元中标记电突触的位置信息。

Description

一种组织内印迹目的蛋白的方法
技术领域
本发明属于蛋白质示踪成像领域，特别涉及一种组织内膜蛋白印迹的方法以及一种质粒复合物。
背景技术
真核动物的生理活动离不开细胞中各类蛋白质，蛋白质的正常表达和正确定位是其行使生理功能的关键。蛋白质间的相互调控，构成了细胞中复杂的蛋白信号通路。特定时期特定蛋白的表达或降解，维持着细胞正确地分裂、分化和迁移等各项活动。如在哺乳动物皮层发育中，皮层神经元由脑室区的放射状胶质细胞不均等分裂产生，并沿放射状凸起迁移。新生神经元间依赖缝隙连接蛋白CX26形成电突触，早期神经元的电突触耦合和同步化放电被认为与神经元的树突发育及化学突触生成有关。但实验证明小鼠出生一周后，神经元中CX26蛋白表达逐渐减少，电突触耦合逐渐解聚。诸如此类，蛋白质并不是一成不变，其动态变化维持了生物体的稳定。
膜蛋白的亚细胞定位和成像是一种十分广泛的生物学技术。实验中通常将目的蛋白与荧光蛋白融合，通过荧光信号追踪目的蛋白的亚细胞定位。也有文献发明了蛋白受体探针，利用荧光蛋白与目的蛋白融合后不同构象引发的亮度变化，指示目的蛋白的工作状态。但是融合蛋白在实际实验中，需考虑融合后是否影响蛋白自身结构，且这种荧光信号十分依赖目的蛋白自身的表达情况。实际生理条件下，众多蛋白处于动态变化中，普通标记方法很难追踪瞬时变化的膜蛋白的定位与功能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中缺乏有效的蛋白示踪方法的缺陷，提供一种组织内印迹目的蛋白的方法以及一种质粒复合物。
有文献利用PUP-IT(Pupylation-based interaction tagging)实现了蛋白质相互作用的捕捉(Liu,Q.；Zheng,J.；Sun,W.；Huo,Y.；Zhang,L.；Hao,P.；Wang,H.；Zhuang,M.,A proximity-tagging system to identify membrane protein-protein ineraction)。PUP-IT技术利用原核生物Pup连接酶PafA，将临近蛋白催化上Pup从而实现蛋白质间相互作用的标记。
现本发明提供PUPIL(pupylation-based interaction labeling)，将其应用于印迹膜蛋白的研究。PUPIL标记临近蛋白的功能，能够通过互作蛋白印迹电突触曾经存在的位置。PUPIL的体内印迹功能为研究特定生理时期或短暂表达的蛋白质提供了一种强大的示踪工具。
为标记体内动态变化的膜蛋白，本发明提供了一种体内印迹膜蛋白的方法，该方法通过Pup连接酶PafA将带有标签蛋白融合的PupE标记，催化修饰至与目的蛋白相互作用的蛋白质上，通过标志信号印迹目的蛋白曾经出现的位置。
本发明主要通过如下技术方案解决上述技术问题。
本发明的技术方案之一为：一种组织内印迹目的蛋白的方法，所述方法包括：
(1)将质粒载体1和质粒载体2转化入待观察组织；其中，所述质粒载体1携带表达所述目的蛋白与PafA的融合基因，所述质粒载体2携带表达标签蛋白与Pup(E)的融合基因；
(2)待所述目的蛋白表达后通过所述标签蛋白观察标记结果。
本发明中所述表达目的蛋白与PafA的融合基因中，可以根据目的蛋白自身属性调整两者的相对位置，两者可以相互位于上下游位置，也可以将表达PafA的基因(PafA)插入到表达目的蛋白的基因之中，只要实现该融合基因能够表达目的蛋白和PafA，且不影响目的蛋白自身功能即可。关于所述表达标签蛋白与Pup(E)的融合基因中，两者的相对位置亦同。
其中，表达所述目的蛋白的基因优选位于基因PafA的5’端。
表达所述目的蛋白的基因与基因PafA优选通过linker连接，该linker可为本领域常规，例如可为氨基酸序列为GSSGS的linker。
在本发明一较佳实施方案中，所述质粒载体1自5’端到3’端依次包含：
pCAG-表达目的蛋白的基因-linker 1-PafA-IRES-EGFP。
本发明中，所述质粒载体1还可以使用其他的质粒骨架，最终获得载体例如为：
phSyn-目的蛋白-PafA-IRES-EGFP质粒或rtTA-biTRE-目的蛋白-PafA-IRES-EGFP质粒。
本发明中，表达所述标签蛋白的基因优选位于表达Pup(E)的基因的5’端。
表达所述标签蛋白的基因与表达Pup(E)的基因可以直接连接，也可以通过linker等元件可操作地连接；例如，氨基酸序列为(G4S)1、(G4S)3、(G4S)5或者(G4S)9的linker。
在本发明一较佳实施方案中，所述质粒载体2自5’端到3’端依次包含：
pCAG-表达标签蛋白的基因-linker 2-Pup(E)-IRES-EGFP。
本发明中所述质粒载体2还可以使用其他质粒骨架，最终获得的载体例如为：
AAV2-pCAG-EGFP-(G4S)3-PUPE质粒或者RV-pCAG-BCCP-PUPE-IRES-CRE质粒。
本发明中，步骤(1)中优选通过电转或病毒载体将所述质粒载体1和所述质粒载体2转化入待观察组织。
在本发明一较佳实施方案中，所述质粒载体1和所述质粒载体2的用量为3:1(个数)。
本发明步骤(2)中较佳地通过免疫荧光染色或者活体组织成像观察所述标签蛋白。
本发明的技术方案之二为：一种质粒复合物，其包含质粒载体1和质粒载体2；所述质粒载体1携带表达目的蛋白与PafA的融合基因，所述质粒载体2携带表达标签蛋白与Pup(E)的融合基因；
所述质粒载体1和所述质粒载体2的个数比优选3:1。
如技术方案之一，表达所述目的蛋白的基因可位于表达PafA的基因(基因PafA)的5’端。
较佳地，表达所述目的蛋白的基因与基因PafA通过linker 1连接；所述linker 1的氨基酸序列优选GSSGS(SEQ ID NO:3)。
在本发明一较佳实施方案中，所述质粒载体1自5’端到3’端优选依次包含：
pCAG-表达目的蛋白的基因-linker 1-PafA-IRES-EGFP。
表达所述标签蛋白的基因优选位于表达Pup(E)的基因的5’端。
表达所述标签蛋白的基因与表达Pup(E)的基因可以直接连接，也可以通过linker等元件可操作地连接；例如，氨基酸序列为(G4S)1、(G4S)3、(G4S)5或者(G4S)9的linker。
在本发明一较佳实施方案中，所述质粒载体2自5’端到3’端依次包含：
pCAG-表达标签蛋白的基因-linker 2-Pup(E)-IRES-EGFP。
本发明中，所述标签蛋白可为本领域常规，例如生物素羧基载体蛋白BCCP、钙指示蛋白或者荧光蛋白等。
所述BCCP优选包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，更优选通过SEQ ID NO:2所示的核酸序列编码。
本发明还提供了上述印迹方法的应用。
所述应用应包括以下步骤：
(1)构建目的蛋白融合PafA的质粒载体；
(2)通过电转或利用病毒作为载体，在体内表达PafA和PupE；
(3)通过免疫荧光染色或者活体组织成像，观察标记结果。
本发明中术语之后的数字，如linker 1和linker 2之后的“1”和“2”没有实际含义，仅为区分相同术语。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明将PUPIL运用于皮层发育中短暂出现的电突触研究，能够直观地在活体组织神经元中标记电突触的位置信息。同时在小鼠成年后，PUPIL的标记可以保留，邻近互作蛋白的信号印迹了神经元发育过程中形成电突触的位置。PUPIL为体内研究表达期短暂的膜蛋白，提供了一种强大的印迹工具。
附图说明
图1为实施例中PUPIL印迹早期电突触的信号及印迹的亚细胞定位。A小鼠P3时期未成熟神经元中CX26-PafA形成的电突触标记信号与CX26抗体共定位情况；B P30成年小鼠成熟神经元中保留的电突触印迹信号与CX26抗体共定位情况；C早期和成熟期标记印迹信号与CX26抗体的共标情况统计；D成熟神经元中保留的印迹信号；E印迹信号大部分与树突分支相关，F为印迹信号在分支点的量化统计；G,H部分印迹信号分别与兴奋性和抑制性化学突触共标；I为共定位情况的量化统计。
图2为使用不同连接肽段的筛选。a为使用不同肽段连接荧光蛋白EGFP的PupE标记效果；b为图a的量化统计；c为PupE标签N端融合荧光蛋白的示意图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
1.1小鼠饲养方式
本发明中使用的实验小鼠为ICR小鼠品系。小鼠饲养在SPF级动物设施中，12小时光照12小时黑暗。所有动物实验均严格遵守上海科技大学动物护理与使用委员会的规章制度。
1.2CX26融合PafA质粒构建
CX26 cDNA片段序列由引物：
FP:CCTGCAGGCCTCGAGGCCACCATGGATTGGGGCACACTACAGA(SEQ ID NO:4)；
RP:GGATCCGCTGCTGCCGACTGGTCTTTTGGACTTCCCT(SEQ ID NO:5)从新生小鼠皮层cDNA文库中PCR扩增所得。反向引物中GGATCCGCTGCTGCC为CX26与PafA间的连接肽段Gly-Ser-Ser-Gly-Ser(GSSGS)。CX26-GSSGS-PafA利用无缝连接试剂盒(In-Fusion cloning,Clontech)，在XhoI单酶切位点，构建入pCag-IRES-EGFP载体中，形成pCAG-CX26(目的蛋白)-linker-PafA-IRES-EGFP质粒。荧光蛋白EGFP序列筛选了不同连接序列与PupE融合，非特异性的LEVLFQGPGS序列，Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G4S)序列，及3-9个重复的(G4S)序列。结果显示，当使用(G4S)1或者(G4S)3进行连接时，标记效率最高(图2)。
此外，本发明还基于不同的质粒骨架做了如下尝试：
phSyn-CX36(目的蛋白)-PafA-IRES-EGFP质粒、rtTA-biTRE-CX36(目的蛋白)-PafA-IRES-EGFP质粒、AAV2-pCAG-EGFP-(G4S)3-PUPE质粒以及RV-pCAG-BCCP-PUPE-IRES-CRE质粒。使用不同质粒骨架所得结果没有特别明显的区别，故本发明中仅以pCAG-CX26-PafA质粒和pCAG-BCCP-PupE-IRES-EGFP质粒为例进行示例性说明。
1.3小鼠胚胎电穿孔手术
将孕14天的ICR小鼠，经异氟烷麻醉后置于带有电热毯的手术台上，手术全程通过呼吸装置保持麻醉状态。利用洁净消毒后的手术器械，打开小鼠腹腔，手术过程中应避免出血。小心找出胚胎，使用研磨后的注射用玻璃电极(Drummond Scientific)，将1μL的质粒复合物注射至胚胎小鼠的侧脑室中。质粒复合物由目的蛋白融合PafA质粒(pCAG-CX26-PafA,pCAG-PafA等)和PupE标签质粒(pCAG-BCCP-PupE-IRES-EGFP,pCAG-EGFP-PupE,等)以3:1比例用磷酸缓冲液事先配成终浓度2μg/μL溶液。注射后，使用9mm直径的电极夹(BTX,ECM830)，施加5次时长50ms，电压50mV，间隔950ms的电脉冲刺激，对胚胎小鼠脑部进行电穿孔操作。电转后将胚胎轻柔放回孕鼠腹腔并缝合，将孕鼠置于温暖的培养箱中等待其恢复再放回笼中饲养。
1.4免疫荧光染色
将出生后的适龄小鼠经3％w/v浓度水合氯醛麻醉，使用洁净的手术器械打开小鼠的胸腔腹腔，使用冰浴的PBS溶液进行心脏灌流，后用4％w/v浓度的多聚甲醛灌流固定，解剖出小鼠大脑置于4％w/v多聚甲醛后固定过夜。将后固定的鼠脑采用PBS清洗，用滤纸吸干多余水分后，放置在6cm培养皿中，倒入3％w/v浓度低熔点琼脂糖包埋。包埋后的鼠脑经振动切片机(Leica VT1200 S)切成70μm厚度的大脑切片。挑选出带有荧光细胞的脑片进行免疫荧光染色，其中一抗4℃孵育过夜，二抗室温下孵育2小时，使用的抗体包括chicken antiGFP(Aveslabs GFP-1020；1:500),rabbit anti CX26(ThermoFisher 51-2800；1:500),mouse anti Gephyrin(SynapticSystems 147021；1:500),rabbit anti GAD65/67(Millipore-Sigma AB1511；1:500)；使用的荧光二抗包括goat anti-chicken Alexa-488(Invitrogen A11039；1:1000),goat anti-rabbit Alexa-546(Invitrogen A11010；1:1000)goat anti-rabbit Alexa-647(Invitrogen A21244；1:1000),goat anti-mouseAlexa-647(Invitrogen A21235；1:1000),Alexa-546conjugated streptavidin(Invitrogen S11225；1:1000),Alexa-647conjugated streptavidin(InvitrogenS21374；1:1000)。
1.5PUPIL对于电突触位置的印迹标记
将电转pCAG-CX26-PafA-IRES-EGFP和pCAG-BCCP-PupE-IRES-EGFP质粒组合的幼年鼠仔或成年小鼠灌流，大脑切片，与CX26抗体一起进行免疫染色。结果如图1中A和B所示，CX26-PafA在早期能够高效且特异地形成电突触标记，约70％的标记与CX26抗体共定位；在P30小鼠成熟神经元中，虽然标记信号仍然存在，仅只有极少数标记与CX26共标(图C)。因此PUPIL在早期电突触活跃时期能够标记神经元间电突触的定位信息，随着发育进行电突触逐渐消失，保留下的标记信号在神经元成熟后印迹了电突触曾经出现的位置。图D中，印迹信号在成熟神经元的顶部树突、底部树突和胞体中均有分布。观察印迹信号的亚细胞定位情况发现，约有80％的树突分支处存在印迹信号(图1中E和F)，表明神经元早期的电突触耦合，可能与树突的生长及分支有关。在保留下的印迹信号中，分别有26％和37％的标记与兴奋性和抑制性化学突触的标志性蛋白共定位(图1中G、H和I)，进一步证明电突触形成的神经连接可能是形成化学突触的基础。因此PUPIL标记方法不仅能够在生物体内进行标记功能，基于其邻近标记原理，PUPIL形成的标记信号能够在一定时间内印迹蛋白曾经存在的位置信息，印迹方法为研究如CX26这类表达短暂且重要的蛋白提供了一种便捷高效的标记工具。
SEQUENCE LISTING
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BCCP氨基酸序列
<400> 1
Ala Gly Lys Ala Gly Glu Gly Glu Ile Pro Ala Pro Leu Ala Gly Thr
1 5 10 15
Val Ser Lys Ile Leu Val Lys Glu Gly Asp Thr Val Lys Ala Gly Gln
20 25 30
Thr Val Leu Val Leu Glu Ala Met Lys Met Glu Thr Glu Ile Asn Ala
35 40 45
Pro Thr Asp Gly Lys Val Glu Lys Val Leu Val Lys Glu Arg Asp Ala
50 55 60
Val Gln Gly Gly Gln Gly Leu Ile Lys Ile Gly Asp Tyr Asp Ile Pro
65 70 75 80
Thr Thr Ala Ser
<210> 2
<211> 252
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BCCP碱基序列
<400> 2
gccgggaagg caggcgaggg agagatcccc gcacccttgg ccggcacggt cagcaaaatc 60
ctggtcaagg aaggcgacac cgtgaaggct ggacagacgg tgttggtact ggaggcgatg 120
aagatggaga cagagatcaa tgccccgacc gatgggaagg tggagaaggt gctggttaag 180
gagagggacg ccgtgcaggg cggtcaggga ctgatcaaga tcggcgacta cgacatcccg 240
acaaccgcca gc 252
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker 1
<400> 3
Gly Ser Ser Gly Ser
1 5
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FP引物
<400> 4
cctgcaggcc tcgaggccac catggattgg ggcacactac aga 43
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RP引物
<400> 5
ggatccgctg ctgccgactg gtcttttgga cttccct 37

Claims (11)

1.一种组织内印迹目的蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)将质粒载体1和质粒载体2转化入待观察组织；其中，所述质粒载体1携带表达所述目的蛋白与PafA的融合基因，所述质粒载体2携带表达标签蛋白与Pup(E)的融合基因；
(2)待所述目的蛋白表达后通过所述标签蛋白观察标记结果。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，表达所述目的蛋白的基因位于表达PafA的基因的5’端；
较佳地，表达所述目的蛋白的基因与表达PafA的基因通过linker 1连接；
更佳地，所述质粒载体1自5’端到3’端依次包含：
pCAG-表达目的蛋白的基因-linker 1-PafA-IRES-EGFP；
所述linker 1的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:3所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，表达所述标签蛋白的基因位于表达Pup(E)的基因的5’端；
较佳地，表达所述标签蛋白的基因与表达Pup(E)的基因通过linker 2连接；
更佳地，所述质粒载体2自5’端到3’端依次包含：
pCAG-表达标签蛋白的基因-linker 2-Pup(E)-IRES-EGFP；
所述linker 2的氨基酸序列优选(G4S)1或者(G4S)3。
4.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述标签蛋白为生物素羧基载体蛋白BCCP、钙指示蛋白或者荧光蛋白。
5.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)中通过电转或病毒载体将所述质粒载体1和所述质粒载体2转化入待观察组织。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述质粒载体1和所述质粒载体2的用量为3:1。
7.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中通过免疫荧光染色或者活体组织成像观察所述标签蛋白。
8.一种质粒复合物，其包含质粒载体1和质粒载体2；所述质粒载体1携带表达目的蛋白与PafA的融合基因，所述质粒载体2携带表达标签蛋白与Pup(E)的融合基因；
所述质粒载体1和所述质粒载体2的个数比优选3:1。
9.如权利要求8所述的质粒复合物，其特征在于，表达所述目的蛋白的基因位于表达PafA的基因的5’端；表达所述目的蛋白的基因与表达PafA的基因优选通过linker 1连接；
较佳地，所述质粒载体1自5’端到3’端优选依次包含：
pCAG-表达目的蛋白的基因-linker 1-PafA-IRES-EGFP；
所述linker 1的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:3所示。
10.如权利要求8或9所述的质粒复合物，其特征在于，表达所述标签蛋白的基因位于表达Pup(E)的基因的5’端；表达所述标签蛋白的基因与表达Pup(E)的基因通过linker 2连接；
较佳地，所述质粒载体2自5’端到3’端优选依次包含：
pCAG-表达标签蛋白的基因-linker 2-Pup(E)-IRES-EGFP；
所述linker 2的氨基酸序列优选(G4S)1或者(G4S)3。
11.如权利要求8或9所述的质粒复合物，其特征在于，所述标签蛋白为生物素羧基载体蛋白BCCP、钙指示蛋白或者荧光蛋白。
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