CN113981001A - 一种组织内可视化邻近标记方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种组织内可视化邻近标记方法。所述组织内可视化邻近标记方法包括：(1)将质粒载体1和质粒载体2转化入待观察组织；其中，所述质粒载体1携带表达目的蛋白与PafA的融合基因，所述质粒载体2携带表达标签蛋白与Pup(E)的融合基因；(2)待所述目的蛋白表达后通过所述标签蛋白观察标记结果。可将本发明PUPIL运用于动物体内蛋白质可视化的研究，能够直观地在活体组织神经元中标记电突触和抑制性化学突触蛋白的亚细胞定位信息。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质示踪成像领域，特别是涉及一种组织内可视化邻近标记方法。
背景技术
大脑执行的高级功能依赖于复杂的神经网络，神经细胞通过化学突触和电突触两种连接方式进行信号传递。化学突触和电突触相关蛋白的标记，能够帮助我们更直观地研究神经元间突触的功能和状态，对研究大脑发育、神经环路投射以及神经退行性疾病等有重要意义。
目前，很多标记方法被应用于化学突触和电突触的研究中，如突触蛋白直接融合GFP(green fluorescent protein)，蛋白酶BirA修饰标记法，或者通过GRASP(GFPreconstitution across synaptic partners)进行标记等。但是这些方法依赖化学突触和电突触持续存在，难于追踪神经元间连接的高度动态变化。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种组织内可视化邻近标记方法，以用于蛋白质亚细胞定位可视化的成像研究。为了解决上述技术问题，本发明提供了改造的PupE标签蛋白，在肽段PupE的N端通过连接肽段(图1)融合荧光蛋白、钙指示蛋白等标签蛋白。
本发明提供PUPIL(pupylation-based interaction labeling)，将其应用于在实验动物活体组织中进行神经元间电突触和化学突触的标记。与目的蛋白融合的连接酶PafA，能够将融合标签的PupE催化至邻近蛋白上，标记出目的蛋白的亚细胞定位。PUPIL为组织内研究突触蛋白或其他蛋白，提供了一个强大的标记工具。
本发明主要通过如下技术方案解决上述技术问题。
本发明的技术方案之一为：一种组织内可视化邻近标记方法，其包括：
(1)将质粒载体1和质粒载体2转化入待观察组织；其中，所述质粒载体1携带表达目的蛋白与PafA的融合基因，所述质粒载体2携带表达标签蛋白与Pup(E)的融合基因；
(2)待所述目的蛋白表达后通过所述标签蛋白观察标记结果。
本发明中所述表达目的蛋白与PafA的融合基因中，可以根据目的蛋白自身属性调整两者的相对位置，两者可以相互位于彼此的上下游位置，也可以将表达PafA的基因(PafA)插入到表达目的蛋白的基因之中，只要实现该融合基因能够表达目的蛋白和PafA，且不影响目的蛋白自身功能即可。关于表达标签蛋白与Pup(E)的融合基因中，两者的相对位置亦同。
其中，表达目的蛋白的基因优选位于表达PafA的基因的5’端。
表达目的蛋白的基因与表达PafA的基因优选通过linker连接，该linker可为本领域常规，例如可为氨基酸序列为GSSGS(SEQ ID NO:1)的linker。
在本发明一较佳实施方案中，所述质粒载体1自5’端到3’端依次包含：
pCAG-表达目的蛋白的基因-linker 1-PafA-IRES-EGFP。
本发明中，所述质粒载体1还可以使用其他的质粒骨架，最终获得载体例如为：
phSyn-目的蛋白-PafA-IRES-EGFP质粒或rtTA-biTRE-目的蛋白-PafA-IRES-EGFP质粒。
本发明中，表达标签蛋白的基因优选位于表达Pup(E)的基因的5’端。
本发明中，表达标签蛋白的基因与表达Pup(E)的基因可以直接连接，也可以通过linker等元件可操作地连接；例如，氨基酸序列为(G4S)1、(G4S)3、(G4S)5或者(G4S)9的linker。
在本发明一较佳实施方案中，所述质粒载体2自5’端到3’端依次包含：
pCAG-表达标签蛋白的基因-linker 2-Pup(E)-IRES-EGFP。
本发明中所述质粒载体2还可以使用其他质粒骨架，最终获得的载体例如为：
AAV2-pCAG-EGFP-(G4S)3-PUPE质粒或者RV-pCAG-BCCP-PUPE-IRES-CRE质粒。
本发明中，步骤(1)中优选通过电转或病毒载体将所述质粒载体1和所述质粒载体2转化入待观察组织。
在本发明一较佳实施方案中，所述质粒载体1和所述质粒载体2的用量为3:1(个数)。
本发明步骤(2)中较佳地通过免疫荧光染色或者活体组织成像观察所述标签蛋白。
本发明中，所述标签蛋白可为本领域常规，例如钙指示蛋白或者荧光蛋白。
本发明还提供了上述标记方法的应用。
本方法至少包含如下步骤：
(1)将目的蛋白与连接酶PafA融合表达；
(2)通过电转或利用病毒作为载体，在真核生物组织内表达PafA和PupE；
(3)通过免疫荧光染色或者活体组织成像，观察标记结果。
本发明中术语之后的数字，如linker 1和linker 2之后的“1”和“2”没有实际含义，仅为区分相同术语。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明将PUPIL运用于动物组织内蛋白质可视化的研究，能够直观地在活体组织神经元中标记电突触和化学突触蛋白的亚细胞定位信息。同传统的抗体免疫染色相比，目的蛋白融合PafA催化形成的PupE信号具有高度特异性，避免了抗体染色实验中的非特异信号影响。与目的蛋白直接融合GFP等荧光蛋白相比，PafA在邻近蛋白形成聚集的PupE信号，进一步放大了目的蛋白的标记，更利于在组织内观察蛋白踪迹。
附图说明
图1为使用不同连接肽段的筛选。a为使用不同肽段连接荧光蛋白EGFP的PupE标记效果；b为图a的量化统计；c为PupE标签N端融合荧光蛋白的示意图。
图2为实施例1中在小鼠体内应用PUPIL进行电突触和化学突触标记。a为CX26-PafA和游离PafA在小鼠皮层神经元中的标记结果；b为CX26-PafA形成的标记与CX26抗体共标；c为图b的量化统计；d图显示Gephyrin-PafA可催化形成抑制性化学突触标记；e为Gephyrin-PafA标记效率的量化统计；f为表达CX26-PafA和N端融合荧光蛋白PupE的活细胞成像。
图3为实施例2中运用PUPIL进行免疫电镜标记。a为电镜下CX26-PafA标记形成的纳米金颗粒与电突触结构共标；b图为早期未成熟的化学突触中形成的电突触标记。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
1.1小鼠饲养方式
本发明中使用的实验小鼠为ICR小鼠品系。小鼠饲养在SPF级动物设施中，12小时光照12小时黑暗，饲养温度为22-25℃，保证饮水和食物充足供给。所有动物实验均严格遵守上海科技大学动物护理与使用委员会的规章制度。
1.2构建目的蛋白融合PafA质粒和荧光蛋白融合PupE质粒
电突触蛋白CX26序列从新生小鼠皮层cDNA文库中PCR扩增获得，抑制性化学突触蛋白Gephyrin序列由成年小鼠皮层cDNA文库中克隆得到。CX26和Gephyrin均使用Gly-Ser-Ser-Gly-Ser(GSSGS，如SEQ ID NO:1所示)序列与PafA融合，通过In-Fusion cloning试剂盒，构建入XhoI单酶切的pCAG-IRES-EGFP质粒载体中。荧光蛋白EGFP序列筛选了不同连接序列与PupE融合，非特异性的LEVLFQGPGS序列，Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(G4S)序列，及3-9个重复的(G4S)序列。结果显示，当使用(G4S)1或者(G4S)3进行连接时，效果更佳标记效率最高(图1)。然后EGFP-PupE同样使用In-Fusion cloning试剂盒，构建入XhoI和BglII双酶切切除IRES-EGFP部分的pCAG-IRES-EGFP质粒载体中。
phSyn-CX36(目的蛋白)-PafA-IRES-EGFP质粒、rtTA-biTRE-CX36(目的蛋白)-PafA-IRES-EGFP质粒、AAV2-pCAG-EGFP-(G4S)3-PUPE质粒以及RV-pCAG-BCCP-PUPE-IRES-CRE质粒。使用不同质粒骨架所得结果没有特别明显的区别，故本发明中仅以pCAG-CX26-PafA质粒和pCAG-BCCP-PupE-IRES-EGFP质粒为例进行示例性说明。
1.3小鼠胚胎电穿孔手术
孕14天的ICR小鼠，经异氟烷麻醉后置于带有电热毯的手术台上。利用洁净消毒后的手术器械，打开小鼠腹腔，使用研磨后的注射用玻璃电极(Drummond Scientific)，将1μL的质粒复合物注射至胚胎小鼠的侧脑室中。质粒复合物由目的蛋白融合PafA质粒(pCAG-CX26-PafA,pCAG-Gephyrin-PafA,pCAG-PafA等)和PupE标签质粒(pCAG-BCCP-PupE-IRES-EGFP,pCAG-EGFP-PupE,pCAG-GCaMPs-PupE等)以3:1比例用磷酸缓冲液配成终浓度2μg/μL溶液。注射后，质粒溶液充盈侧脑室中，使用9mm直径的电极夹轻轻夹住胚胎小鼠头部，给与5次50ms 50mV间隔950ms的脉冲刺激，对胚胎小鼠皮层进行电穿孔操作。电转过程中，用37℃PBS保持胚胎湿润。电转后将胚胎放回孕鼠腹腔利用缝合线进行缝合，并用伤口夹闭合伤口，最后将孕鼠置于温暖的培养箱中等待其恢复再放回笼中饲养。
1.4免疫荧光染色
出生后小鼠经麻醉后用4％w/v多聚甲醛心脏灌流固定，解剖出大脑置于4％w/v多聚甲醛4℃后固定过夜。使用振动切片机(Leica VT1200 S)将鼠脑切成70μm厚度的切片。在荧光体视镜下，挑选出电转区域带有荧光细胞的脑片进行免疫荧光染色。首先使用PBS清洗脑片3次，每次10分钟。再使用0.3％v/v Triton-X穿孔15分钟，之后常温封闭2小时。封闭液由0.4％v/vTriton-X-100,1％w/v甘氨酸,3％w/v牛血清蛋白,和10％v/v羊血清在0.01MPBS中配制而成。脑片在一抗中4℃孵育过夜，经3次漂洗后，使用二抗室温下孵育2小时，使用的抗体包括chicken anti GFP(Aveslabs GFP-1020；1:500),rabbit anti CX26(ThermoFisher 51-2800；1:500),mouse anti Gephyrin(SynapticSystems 147021；1:500),rabbit anti GAD65/67(Millipore-Sigma AB1511；1:500)；使用的荧光二抗包括goat anti-chicken Alexa-488(Invitrogen A11039；1:1000),goat anti-rabbit Alexa-546(Invitrogen A11010；1:1000)goat anti-rabbit Alexa-647(Invitrogen A21244；1:1000),goat anti-mouse Alexa-647(Invitrogen A21235；1:1000),Alexa-546conjugatedstreptavidin(Invitrogen S11225；1:1000),Alexa-647conjugated streptavidin(Invitrogen S21374；1:1000)。最后将染色脑片贴在载玻片上放置于阴暗处风干，滴加封片剂并用盖玻片制作好封片，等待上机观察。
1.5PUPIL的体内标记结果
P3小鼠皮层神经元PUPIL标记结果如图2.a所示，与电转游离PafA和PupE质粒的对照组相比，电转了pCAG-CX26-PafA-IRES-EGFP和pCAG-BCCP-PupE-IRES-EGFP的神经元中，出现了特异的标记信号。经与CX26抗体共同染色，发现约78％的标记信号与CX26抗体共定位(图2.b)。与电突触标记相似，在图2.c中，将PUPIL运用于抑制性化学突触标记实验，将PafA与Gephyrin蛋白融合表达，在电转pCAG-Gephyrin-PafA-IRES-EGFP和pCAG-BCCP-PupE-IRES-EGFP的神经元中也发现特异的标记信号，且这些标记中82％与化学突触的标记蛋白(Gephyrin和GAD65/67)共定位(图2.d,e)。经抗体的共定位染色实验验证，PUPIL能够在动物体内进行电突触、化学突触的标记成像，也希望以后能够应用于各类蛋白在体内的标记实验中。
1.6PUPIL的活体组织成像
将胚胎期电转pCAG-CX26-PafA和pCAG-EGFP-PupE或pCAG-GCaMPs-PupE质粒组合的小鼠麻醉，迅速解剖其大脑并置入预冷的人造脑脊液(artificial cerebrospinalfluid,ACSF)中，其成分包括126mM NaCl,4.9mM KCl,1.2mM KH2PO4,2.4mM MgSO4,2.5mMCaCl2,26mM NaHCO3 and 10mM glucose,300mOsm,pH 7.3。在充氧且低温的ACSF中，将鼠脑用振动切片机制成350μm厚度的脑片。将脑片固定于充满ACSF的培养皿中，利用激光共聚焦显微镜(Leica SP8)进行图像采集和观察。
结果如2.f所示，在小鼠皮层神经元中，EGFP-PupE和GCaMPs-PupE均可被CX26-PafA催化形成电突触标记，神经元中形成的自发荧光点状标记与免疫染色中的结果一致。表明PUPIL能够适用于活细胞成像，无需将脑片化学固定和免疫染色，在脑片和细胞活体状态下，即可标记并观察蛋白的亚细胞定位及运动情况，以研究目的蛋白的生理功能。
实施例2
2.1透射电镜样品制备
取胚胎期电转pCAG-CX26-PafA-IRES-EGFP和pCAG-BCCP-PupE-IRES-EGFP质粒组合的小鼠，经麻醉后采用2％多聚甲醛(TED PELLA,EM grade)2％戊二醛混合溶液进行心脏灌流，快速解剖出小鼠大脑。大脑后固定3小时候，制成150μm厚度切片，浸泡于固定液中4℃过夜。挑选带有荧光细胞的脑片，浸于30％蔗糖溶液脱水3小时后，在液氮中反复冻融3次。以1:150稀释比例加入带有纳米金标的链霉亲和素(Nanogold-Streptavidin,Nanoprobes2016)，室温孵育2小时，使用金颗粒放大试剂盒(GoldEnhance EM Plus kit,Nanoprobes2114)对纳米金标记进行放大。免疫实验过后，脑片中的皮层区域被切下，用0.1％锇酸固定后置于2％醋酸铀溶液中过夜。皮层组织在乙醇梯度脱水后，包埋于812树脂中，经超薄切片机(Leica ultramicrotomy)切成80nm厚度超薄切片存放于铜网上。图像采集使用JEM-1230JEOL透射电镜，和Talos L120C透射电镜完成。
2.2免疫电镜成像结果
如图3.a所示，在电镜下拍摄到的电突触超显微结构附近，有显著的经PUPIL催化形成的纳米金颗粒标记，证明PUPIL标记可应用于蛋白的免疫电镜标记。同时在PUPIL帮助下，发现早期未成熟的化学突触附近，也存在电突触的标记(图3.b)。PUPIL通过将BCCP-PupE催化至邻近互作蛋白的标记信号，同直接采用抗体免疫标记相比，标记信号更显著特异，且在电镜制样环节中不易丢失。PUPIL标记方法能够很好地适用于免疫电镜，为在超微结构下研究蛋白的功能性质提供了一种新工具。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海科技大学
<120> 一种组织内可视化邻近标记方法
<130> P21018197C
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker 1
<400> 1
Gly Ser Ser Gly Ser
1 5
Claims (10)
1.一种组织内可视化邻近标记方法，其特征在于，其包括：
(1)将质粒载体1和质粒载体2转化入待观察组织；其中，所述质粒载体1携带表达目的蛋白与PafA的融合基因，所述质粒载体2携带表达标签蛋白与Pup(E)的融合基因；
(2)待所述目的蛋白表达后通过所述标签蛋白观察标记结果。
2.如权利要求1所述的组织内可视化邻近标记方法，其特征在于，表达所述目的蛋白的基因位于表达所述PafA的基因的5’端。
3.如权利要求2所述的组织内可视化邻近标记方法，其特征在于，表达所述目的蛋白的基因与表达所述PafA的基因通过linker 1连接；
较佳地，所述质粒载体1自5’端到3’端依次包含：
pCAG-表达目的蛋白的基因-linker 1-PafA-IRES-EGFP；
所述linker 1的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:1所示。
4.如权利要求1所述的组织内可视化邻近标记方法，其特征在于，表达所述标签蛋白的基因位于表达所述Pup(E)的基因的5’端。
5.如权利要求4所述的组织内可视化邻近标记方法，其特征在于，表达所述标签蛋白的基因与表达所述Pup(E)的基因通过linker 2连接；
较佳地，所述质粒载体2自5’端到3’端依次包含：pCAG-表达标签蛋白的基因-linker2-Pup(E)-IRES-EGFP。
6.如权利要求5所述的组织内可视化邻近标记方法，其特征在于，所述linker 2的氨基酸序列为(G4S)1或者(G4S)3。
7.如权利要求1～6任一项所述的组织内可视化邻近标记方法，其特征在于，所述标签蛋白为钙指示蛋白或者荧光蛋白。
8.如权利要求1～6任一项所述的组织内可视化邻近标记方法，其特征在于，步骤(1)中通过电转或病毒载体将所述质粒载体1和所述质粒载体2转化入待观察组织。
9.如权利要求1～6任一项所述的组织内可视化邻近标记方法，其特征在于，所述质粒载体1和所述质粒载体2的用量为3:1。
10.如权利要求1～6任一项所述的组织内可视化邻近标记方法，其特征在于，步骤(2)中通过免疫荧光染色或者活体组织成像观察所述标签蛋白。
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