CN114014862A - 一种治疗脑胶质瘤的新化合物及其制备和应用 - Google Patents

一种治疗脑胶质瘤的新化合物及其制备和应用 Download PDF

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CN114014862A CN202110718437.9A CN202110718437A CN114014862A CN 114014862 A CN114014862 A CN 114014862A CN 202110718437 A CN202110718437 A CN 202110718437A CN 114014862 A CN114014862 A CN 114014862A
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王良霄
于雅雯
吕亚男
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Abstract

本发明涉及化合物3‑甲基‑4‑氧代‑3,4‑二氢咪唑并[5,1‑d][1,2,3,5]四嗪‑8‑羧酸正十六酯及其制备方法或其应用，本发明通过实验制备化合物3‑甲基‑4‑氧代‑3,4‑二氢咪唑并[5,1‑d][1,2,3,5]四嗪‑8‑羧酸正十六酯，并对化合物进行确认，同时通过体内和体外研究，证实所述化合物对胶质瘤，特别是抗耐药性胶质瘤具有较好的治疗效果。

Description

一种治疗脑胶质瘤的新化合物及其制备和应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及化合物Ⅰ，化学名称：3-甲基-4-氧代-3,4-二氢咪唑并 [5,1-d][1,2,3,5]四嗪-8-羧酸正十六酯及其制备方法或其应用。
背景技术
胶质瘤是一种原发性脑肿瘤，其恶性程度高，约占所有原发性神经系统肿瘤的30％。致死率在35岁以下的全部恶性肿瘤中居第二位。其中，多形性胶质母细胞瘤(GBM)又占脑胶质瘤的一半以上，其恶性程度最高，每年的发病率约为百万分之五。因为GBM生长快速，侵袭性强，仅靠手术很难完全切除，这使得脑胶质瘤极易在术后复发。
替莫唑胺是口服新型烷化剂类抗肿瘤药物，具有广谱抗肿瘤活性，可通过血脑屏障，生物利用度接近100％，可有效治疗新诊断及复发的胶质母细胞瘤和间变性星形细胞瘤，延长患者生存期。目前脑胶质瘤的治疗模式仍为以手术为主的多学科综合治疗，即外科手术加术后放射治疗、化学治疗等，这也是当前脑胶质瘤治疗的金标准，临床实践证明化疗可以有效提高恶性胶质瘤患者的生存时间与生存率。
替莫唑胺通过攻击肿瘤细胞的DNA，致使DNA发生烷基化，肿瘤细胞DNA产生交联，从而诱导癌细胞死亡。有研究表明，用替莫唑胺治疗人脑胶质瘤的有效率约为45％；其中，脑胶质瘤对替莫唑胺产生耐药性是导致化疗失败的最主要原因。有文献研究发现，脑胶质瘤产生耐药性不是由单一因素影响导致的，主要包括DNA损伤修复，肿瘤细胞中促癌与抑癌基因的表达，化疗药物刺激后机体的应激反应以及药物对组织的渗透性等方面。
如何降低替莫唑胺的耐药性是提高治疗脑胶质瘤重点研究方向，近期科研人员研究认为相较于传统疗法而言，个体化的化疗方案可以降低胶质瘤对药物的耐药性，增加疗效，改善患者的预后，同时发现胶质瘤对替莫唑胺耐药性机制进展有助于找到某些导致肿瘤复发的新靶点，为胶质瘤的治疗提供有效的新方案。本发明通过针对相关分子的进一步研究，发现新化合物对耐药性降低提供新的思路。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新化合物，化合物Ⅰ，化学名称：3-甲基-4-氧代-3,4-二氢咪唑并[5,1-d][1,2,3,5]四嗪-8-羧酸正十六酯，说明书中也简称为TMZ-16E，其具有式Ⅰ结构式：
Figure BDA0003135961060000011
Figure BDA0003135961060000021
本发明的化合物用HPLC或UPLC测定时，该化合物纯度为至少80％，优选纯度为至少 90％，更优选纯度为至少95％，最优选纯度为至少98％。
本发明提供一种制备所述化合物I的方法，具体步骤：称取替莫唑胺酸溶于二氯亚砜 (SOCl2)中，滴加二甲基甲酰胺(DMF)，然后将体系升温至100℃，回流状态搅拌反应；待体系冷却后，减压浓缩蒸除溶剂，得淡黄色固体产物，将正十六醇溶于无水二氯甲烷(DCM)中，加入三乙胺(Et3N)，然后将体系降温，搅拌下慢慢加入前述淡黄色固体产物，升至室温搅拌反应；向体系中加入饱和碳酸氢钠溶液，分液，将有机相使用无水硫酸钠干燥，过滤滤渣，滤液于旋转蒸发仪减压浓缩，硅胶柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝3:1)，得权利要求1所述化合物。
Figure BDA0003135961060000022
本发明对化合物I结构进行确证，使用液质联用仪，获得其的质谱图，以d6-CDCl3为溶剂，采用核磁共振仪对其结构进行鉴定，获得其核磁氢谱和碳谱；并对化合物I的纯度进行检测结果为：98.7％。
同时对化合物I进行体外研究：采用MTT法探究化合物I对敏感及耐药脑胶质瘤细胞生长的抑制作用，结果表明，化合物I对敏感胶质瘤细胞U251及耐药胶质瘤细胞T98G的增殖抑制效果均强于替莫唑胺，一定程度上逆转了替莫唑胺耐药。采用细胞摄取实验，测定替莫唑胺、化合物I作用耐药T98G细胞6h后的细胞摄取情况发现细胞摄取效率明显增加，表明脂溶性增加可以促进T98G细胞对药物的摄取，采用免疫印迹实验，证明化合物I可以降低耐药胶质瘤细胞的耐药蛋白O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)，使耐药细胞对替莫唑胺增敏。
对化合物I进行体内研究：皮下接种T98G细胞后，体重结果显示，各组小鼠的体重之间没有明显变化，饲养期间饮食和行为活动正常，状态良好，表明在设置浓度下药物对小鼠无明显毒性，较为安全。进一步分析体重及肿瘤抑制效果发现，化合物I中、高剂量组对T98G 皮下肿瘤具有良好的抑瘤效果，这与体外细胞研究结果相符，同时也提示，剂量降低一半的化合物I中剂量组也可用于耐药胶质瘤的治疗，不仅减少了给药剂量，也提高了抗胶质瘤效果。采用免疫印迹检测发现，与替莫唑胺组相比，中、高剂量的化合物I更能显著降低MGMT 蛋白水平(p＜0.01)；以上结果表明，中、高剂量的化合物I能有效降低MGMT的水平，具有较好的抗耐药治疗效果。
附图说明
图1化合物I的高分辨质谱图。
图2化合物I核磁氢谱(A)和碳谱(B)。
图3化合物I的HPLC色谱图。
图4替莫唑胺、化合物I作用耐药T98G细胞72h的细胞存活率图
图5替莫唑胺、化合物I作用耐药T98G细胞72h后MGMT蛋白表达的情况
图6替莫唑胺、化合物I作用耐药T98G脑胶质瘤小鼠体重变化
图7替莫唑胺、化合物I作用耐药T98G脑胶质瘤小鼠肿瘤体积分析图(A)，瘤重统计图(B)
图8替莫唑胺、化合物I作用耐药T98G裸鼠肿瘤组织内MGMT蛋白定量相对水平图(A)，免疫印迹图(B)
具体实施方式
以下通过实施例和试验例来进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1 3-甲基-4-氧代-3,4-二氢咪唑并[5,1-d][1,2,3,5]四嗪-8-羧酸正十六酯的制备
将3.9g(20mmol)替莫唑胺酸溶于30mL二氯亚砜(SOCl2)中，滴加73mg(1.0mmol)二甲基甲酰胺(DMF)，然后将体系升温至100℃，回流状态搅拌反应2h。待体系冷却后，减压浓缩蒸除溶剂，得淡黄色固体产物替莫唑胺酰氯(4.2g)，产品不经纯化直接用于下一步反应。将1.21g(5.0mmol)正十六醇溶于20mL无水二氯甲烷(DCM)中，加入1.01g (10mmol)三乙胺(Et3N)，然后将体系降温至0℃，搅拌下慢慢加入1.12g(5.3mmol) 替莫唑胺酰氯，升至室温搅拌反应2h。向体系中加入10mL饱和碳酸氢钠溶液，分液，将有机相使用无水硫酸钠干燥，过滤滤渣，滤液于旋转蒸发仪减压浓缩，硅胶柱层析分离(石油醚：乙酸乙酯＝3:1)，得3-甲基-4-氧代-3,4-二氢咪唑并[5,1-d][1,2,3,5]四嗪-8-羧酸正十六酯，以下简称TMZ-16E。
使用安捷伦4500型液质联用仪，离子源为电喷雾离子化(ESI)源，取适量TMZ-16E终产物，用乙腈溶解后，正离子模式下获得TMZ-16E的质谱图，TMZ-16E质谱结果为，TMZ-16EMS(ESI+)m/z：420.4[M+H]+，具体质谱图见图1。
以d6-CDCl3为溶剂，采用AvaneⅡ600MHz核磁共振仪对其结构进行鉴定，核磁氢谱和碳谱的测定频率分别为600MHZ与150MHZ。对反应产物进行1H-NMR及13C-NMR的确证。
具体核磁氢谱和碳谱的图见图2.
核磁结果如下：
Figure BDA0003135961060000041
TMZ-16E：1H-NMR(600MHz,CDCl3):δ8.45(s,1H,H-6),4.47-4.43(t,2H,CH 2-O),4.04(s, 3H,CH 3-N),1.85-1.78(m,2H,CH 2-CH2-O),1.48-1.41(m,2H,CH 2-CH3),1.37-1.20(m,24H, C-(CH 2)12-C),0.88-0.84(t,3H,C-CH 3)。13C-NMR(150MHz,CDCl3):δ160.6(COO),138.7(C-4), 135.8(C-6),129.7(C-9),128.6(C-8),66.2(OCH2),36.7(NCH3),29.8(OCH2 CH2), 29.5(OCH2CH2 CH2),29.2(OCH2CH2CH2(CH2)9),28.7(O(CH2)12 CH2),25.9(CH2CH2CH3), 22.8(CH2CH3),14.2(CH2 CH3)。
TMZ-16E的液相检测条件为：流动相为乙腈-0.1％乙酸水(9：1，v/v)，流速：1mL·min-1，柱温：40℃，检测波长：327nm；采用HPLC方法测定化合物合成纯度。TMZ-16E的HPLC 色谱如图3所示。结果为：98.7％。
试验例1 3-甲基-4-氧代-3,4-二氢咪唑并[5,1-d][1,2,3,5]四嗪-8-羧酸正十六酯(TMZ-16E)的体外细胞毒性研究
样品准备：以MGMT低表达的替莫唑胺敏感脑胶质瘤细胞U251及MGMT高表达的替莫唑胺耐药脑胶质瘤细胞T98G为模型细胞，采用MTT法研究TMZ-16E对两种脑胶质瘤细胞的生长抑制作用。取对数生长期的U251、T98G细胞，均以每孔2000个的浓度接种于96 孔板中，每孔加100μL的细胞悬液，于细胞培养箱中培养24h。随后取出孔板，除去旧培养基，加入浓度分别为1μM、5μM、10μM、15μM、30μM的替莫唑胺、TMZ-16E含药培养基，每个浓度平行设置6个孔，以空白培养基为对照。继续培养72h后，向每孔中加入浓度为5mg·mL-1的20μL MTT液，继续孵育4h后，每孔加入150μL DMSO，室温震荡10min。待结晶溶解完全，采用细胞微孔成像检测仪检测490nm波长处各孔的吸光度(A)，并按照下列公式求算细胞存活率：
Figure BDA0003135961060000051
计算TMZ-16E、替莫唑胺对U251、T98G细胞的半数抑制浓度，结果见下表：
表1 TMZ-16E对U251、T98G细胞的半数抑制浓度(n＝6)
Figure BDA0003135961060000052
***p<0.001versus替莫唑胺
结果分析：采用MTT法探究TMZ-16E对敏感及耐药脑胶质瘤细胞生长的抑制作用，TMZ-16E对T98G细胞的生长抑制呈浓度依赖性趋势。在相同浓度下，TMZ-16E比替莫唑胺显现出更强的细胞抑制作用。由表1可知，在U251细胞中72h的IC50仅为0.04±0.01μM，抑制效果为替莫唑胺的715.8倍，在T98G细胞中72h的IC50为6.08±0.01μM，抑制效果为替莫唑胺的115.8倍。另外，替莫唑胺对U251细胞的IC50明显比对T98G细胞的IC50值小，说明U251对替莫唑胺更敏感。以上结果表明，TMZ-16E对敏感胶质瘤细胞U251及耐药胶质瘤细胞T98G的增殖抑制效果均强于替莫唑胺，一定程度上逆转了替莫唑胺耐药。图4为替莫唑胺、TMZ-16E处理耐药T98G细胞72h后细胞存活情况。
试验例2 3-甲基-4-氧代-3,4-二氢咪唑并[5,1-d][1,2,3,5]四嗪-8-羧酸正十六酯(TMZ-16E)的的体外细胞摄取研究
取对数生长期的T98G细胞，每孔接种2×105个细胞于六孔板中，每孔加2mL的细胞悬液，继续培养24h。分别加入2mL预先配好40μg·mL-1的替莫唑胺、TMZ-16E含药培养基，每个样品设置3个平行孔。继续培养6h后，胰酶消化细胞并分别收集细胞及细胞上清液。离心，预冷PBS清洗2遍，去离子水重悬细胞。将细胞悬液置于-80℃冷冻后，37℃融化，此过程重复2次，超声破碎细胞15min。取300μL细胞重悬液，加入等体积冷乙腈，涡旋，离心。取上清，过0.22μm微孔滤膜，置于液相小瓶待测。细胞培养液处理方法同上。采用HPLC 分别测定细胞和细胞培养上清液中的药物含量。液相检测条件为：流动相为乙腈-0.1％乙酸水 (9：1，v/v)，流速：1mL·min-1，柱温：40℃，检测波长：327nm。
测定替莫唑胺、TMZ-16E作用耐药T98G细胞6h后的细胞摄取情况，具体结果见下表
表2 T98G细胞对TMZ-16E的摄取效率
Figure BDA0003135961060000061
结果分析：表2为HPLC测定替莫唑胺、TMZ-16E作用耐药T98G细胞6h后的细胞摄取情况。结果显示，替莫唑胺、TMZ-16E与T98G细胞共孵育6h后，细胞内摄取率分别为 4.60％、50.67％，其中TMZ-16E的摄取百分率为替莫唑胺的11.02倍，细胞摄取效率明显增加，表明脂溶性增加可以促进T98G细胞对药物的摄取。
试验例3 3-甲基-4-氧代-3,4-二氢咪唑并[5,1-d][1,2,3,5]四嗪-8-羧酸正十六酯(TMZ-16E)的的体外免疫印迹研究
采用免疫印迹实验(Western blot)测定经TMZ-16E处理72h的T98G细胞内耐药蛋白 MGMT表达的情况。步骤如下：
(1)细胞处理：取对数生长期T98G细胞，以1×105个/mL的密度接种于6孔板中，培养24h后，弃上清，实验组分别加入2mL的替莫唑胺、TMZ-16E(以替莫唑胺计，2.5μM) 药物培养液，对照组加入不含药空白培养基，给药72h后进行后续处理。
(2)样品制备：收集细胞及培养液，离心弃上清，PBS洗两遍。加入50μL RIPA裂解液(RIPA裂解液：PMSF＝100:1)冰上裂解20min，用细胞刮轻轻刮下细胞，转移至1.5mL 离心管中，离心15min(4℃，12000rpm)，取上清，-80℃保存。
(3)BCA测定蛋白浓度：按50：1的比例将BCA试剂A与试剂B混合，制得蛋白工作液。分别取待测蛋白样品与浓度为0、0.5、1、2、4、6、8、10μg·mL-1的BSA系列标准样品于96孔板中，加入200μL蛋白工作液，每个样品三个平行，37℃孵育30min，于细胞微孔板成像检测仪562nm处测定吸光度。按蛋白上样量30μg来计算蛋白样品的上样体积，并加入相应PBS及蛋白上样缓冲液(5X)制成蛋白样品，100℃水浴煮沸15min，-20℃保存。
(4)SDS-PAGE电泳：将聚丙烯酰胺预制胶装入电泳槽，加入电泳液缓冲液，使液面刻度没过电泳槽。缓缓拔出梳子，将2.5μL蛋白Marker和30μg的蛋白样品加入上样孔中，电压140V，电泳60min。
(5)转膜：裁剪合适大小的PVDF膜，于甲醇中活化30s。在转膜夹上依次放置一层海绵、一层滤纸、PVDF膜、预制胶、一层滤纸、一层海绵，随后放入转膜盒中，连接好正负极，补加转膜液，电压106V，冰上转膜40min。
(6)封闭：待转膜完毕，取出PVDF膜，随后置于含5％脱脂奶粉的孵育盒中，室温震荡2h。
(7)抗体孵育：将封闭完的PVDF膜用1×TBST清洗3次，每次5min。随后置于一抗(兔抗人MGMT单克隆抗体＝1:1000，内参兔抗人GAPDH单克隆抗体＝1:1000)中，4℃，孵育过夜。用适量的1×TBST洗膜3次，每次5min。将PVDF膜置于二抗(辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)＝1:1000)中室温缓慢摇动1.5h。
(8)显影及检测：采用特超敏ECL化学发光试剂盒(BeyoECL Star)进行显影。按1:1比例混合BeyoECL Plus A液和B液，制得显影液。二抗孵育完成后，1×TBST洗膜3次，每次5min。将显影液均匀滴在膜上，放置1min后，采用化学发光成像仪进行检测。
结果分析：脑胶质瘤细胞中的耐药蛋白MGMT的高表达是产生耐药的主要原因，因此，降低MGMT的表达对逆转肿瘤耐药性具有重要意义。为进一步探究TMZ-16E逆转肿瘤耐药性的相关机制，采用Western blot检测经替莫唑胺、TMZ-16E治疗后T98G细胞中MGMT的表达情况。由图5可知，空白组MGMT蛋白表达均大于其余治疗组，说明T98G细胞是高表达MGMT蛋白的耐药细胞。与替莫唑胺组相比，TMZ-16E组可明显降低MGMT的水平，这是由于药物脂溶性增加可以促进细胞摄取，从而增加对MGMT的消耗。以上结果表明， TMZ-16E可以降低耐药胶质瘤细胞的耐药蛋白MGMT，使耐药细胞增敏。
试验例4 3-甲基-4-氧代-3,4-二氢咪唑并[5,1-d][1,2,3,5]四嗪-8-羧酸正十六酯(TMZ-16E)的抗耐药性胶质瘤作用的体内研究
皮下T98G裸鼠脑胶质瘤移植肿瘤模型的建造：建立5～6周龄雌性裸鼠皮下脑胶质瘤移植肿瘤模型，取对数生长期T98G细胞，胰酶消化，随后转移到10mL离心管中，于4℃的温度下，1000g离心10min，弃上清，然后将1×107个T98G细胞重悬于不含血清培养基与Matrigel基质胶混合液(1:1)中，轻轻混匀。用75％酒精棉球对裸鼠右侧腋下皮肤进行消毒，腋窝处皮下注射200μL/只的T98G细胞悬液。选取肿瘤体积相近的小鼠分组进行实验。
实验过程：胶质瘤成模小鼠随机分为四组，分别腹腔注射给予生理盐水组，替莫唑胺组 (50mg·kg-1)，TMZ-16E低剂量组(以替莫唑胺计，12.5mg·kg-1)，TMZ-16E中剂量组(以替莫唑胺计，25mg·kg-1)，TMZ-16E高剂量组(以替莫唑胺计，50mg·kg-1)，每天一次，连续给药5天，每组6只小鼠，共计30只。给药结束后第7天对小鼠实施安乐死，并收集肿瘤样品进行肿瘤体积、病理切片及免疫印迹检测。
检测过程：
体重及肿瘤抑制率：T98G细胞接种后(Day 0)，每三天对小鼠进行体重和肿瘤体积(V) 的监测。用游标卡尺量取肿瘤最大长度(L)和最大宽度(W)，肿瘤体积的计算公式即为V＝ 1/2×L×W2。于给药结束后第7天处死小鼠，剥离肿瘤组织，称重并拍照，求算肿瘤抑制率。
Figure BDA0003135961060000081
免疫印迹检测：取各组小鼠肿瘤组织，冷冻后采用Western blot检测MGMT蛋白表达水平。制备肿瘤组织中蛋白的上清液，进行电泳、转膜、封闭、孵育，化学发光仪显影。
结果分析：
体重及肿瘤抑制率：
体重及肿瘤抑制效果皮下接种T98G细胞后，每三天对小鼠的体重和肿瘤体积进行监测，结果如图6所示。体重结果显示，各组小鼠的体重之间没有明显变化，饲养期间饮食和行为活动正常，状态良好，表明在设置浓度下药物对小鼠无明显毒性，较为安全。
图7为T98G脑胶质瘤小鼠肿瘤体积分析图，由图(A)可知，腹腔注射给予生理盐水组，替莫唑胺组(50mg·kg-1)，TMZ-16E低剂量组(以替莫唑胺计，12.5mg·kg-1)，TMZ-16E中剂量组(以替莫唑胺计，25mg·kg-1)，TMZ-16E高剂量组(以替莫唑胺计，50mg·kg-1)脑胶质瘤小鼠后，生理盐水组、替莫唑胺组及TMZ-16E低剂量组肿瘤在观察期间生长迅速，表明替莫唑胺组与TMZ-16E低剂量组对T98G皮下肿瘤的生长没有明显抑制作用。而TMZ-16E 中剂量及高剂量组对皮下肿瘤的生长均有一定程度的抑制作用，中剂量的TMZ-16E即可产生明显的抑制作用，高剂量组抑制作用最强。图(B)为各组肿瘤组织瘤重图，由图可以明显看出TMZ-16E高剂量组抑制肿瘤生长效果最强，瘤重与瘤体积相对应。通过计算各组肿瘤抑制率发现，替莫唑胺组、TMZ-16E低剂量组的肿瘤抑制率仅为17.58％、11.38％，而TMZ-16E 中剂量组、TMZ-16E高剂量组肿瘤抑制率高达45.96％、68.59％。以上结果表明，与腹腔注射50mg·kg-1的替莫唑胺相比，给药剂量为25mg·kg-1、50mg·kg-1的TMZ-16E中、高剂量组对T98G皮下肿瘤具有良好的抑瘤效果，这与体外细胞研究结果相符，同时也提示，剂量降低一半的TMZ-16E中剂量组也可用于耐药胶质瘤的治疗，不仅减少了给药剂量，也提高了抗胶质瘤效果。
免疫印迹检测：
采用Western blot法检测了各组肿瘤组织中耐药蛋白MGMT的水平，结果如图8所示，生理盐水组、替莫唑胺组和TMZ-16E低剂量组的MGMT蛋白水平较高，且各组之间无明显差别，而TMZ-16E中剂量与TMZ-16E高剂量治疗胶质瘤小鼠后肿瘤内MGMT蛋白的水平明显发生变化，引起MGMT蛋白水平降低，其中TMZ-16E高剂量组的MGMT蛋白相对响应值降低至0.25。与替莫唑胺组相比，中、高剂量的TMZ-16E更能显著降低MGMT蛋白水平(p＜0.01)。以上结果表明，中、高剂量的TMZ-16E能有效降低MGMT的水平，具有较好的抗耐药治疗效果。

Claims (7)

1.一种具有式Ⅰ结构式的化合物：
Figure FDA0003135961050000011
2.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于所述方法步骤如下：称取替莫唑胺酸溶于二氯亚砜(SOCl2)中，滴加二甲基甲酰胺(DMF)，然后将体系升温至100℃，回流状态搅拌反应；待体系冷却后，减压浓缩蒸除溶剂，得淡黄色固体产物，将正十六醇溶于无水二氯甲烷(DCM)中，加入三乙胺(Et3N)，然后将体系降至适合温度，搅拌下慢慢加入前述淡黄色固体产物，升至室温搅拌反应；向体系中加入饱和碳酸氢钠溶液，分液，将有机相使用无水硫酸钠干燥，过滤滤渣，滤液于旋转蒸发仪减压浓缩，硅胶柱层析分离，得权利要求1所述化合物。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于方法中所述硅胶柱层析洗脱剂采用石油醚：乙酸乙酯进行洗脱。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于方法中所述硅胶柱层析洗脱剂采用石油醚：乙酸乙酯的比例为3:1。
5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于方法中所述将体系降至适合温度，其温度是0℃。
6.一种权利要求1所述化合物，其在制备治疗胶质瘤药物中的用途。
7.根据权利要求6所述用途，其特征在于所述胶质瘤为抗耐药性胶质瘤。
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