CN1139982A - 放射流动检测 - Google Patents
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Abstract
一种将样品过渡并传递到检测表面的传递部件，包括具有样品接收表面和将样品传递到检测表面的传递表面的预过滤器。预过滤器的接收表面上的扩散材料用于将样品迅速均匀地扩散于预过滤器的接收表面。这样，样品就可被迅速均匀地传递到检测表面。一种检测固相，具有包括载着固定化物和不载固定化物的区域的表面。加入样品和标记物后，标记物的均匀分布性就指示样品的均匀分布性。一种包括传递部件和检测表面的药盒。
Description
本发明人在提交本申请的同时，还提交了Dorval等人发明的名称为“使用蛋白质和抗体的检测”的共悬未决美国专利申请。在此通过引述将该申请合并于本申请。本发明所属技术领域
本发明涉及检测试剂、方法和设备。进而言之，本发明涉及在各种检测中提供对被检测物的快速和灵敏的放射流量检测设备和方法。与本发明相关的背景技术
免疫检测可以用于检测流体样品中所存在的不需要的物质，例如，体液中的细菌和水中的污染物等等。它们还可以用于检测体液中存在的抗体，作为确定感染物、癌细胞和自体免疫疾病的指标。
用于免疫检测的用品已经有众多种类，其中的一些应用了流体通过多孔介质的毛细流动原理。采用这种毛细流动现象的检测有时已被不准确地称作“色谱检测”，而且有些则仅为一步检测程序。例如，1990年9月11日授予Gorden等人的美国专利第4,956,302号所揭示的检测用品包括一种色谱介质，并且该介质上的反应位点固定有特异性结合试剂，在靠近该结合位点的上游方有样品添加井，在该反应位点的下游方有液体吸收点域。样品被加入添加井内，再通过色谱介质，通过反应位点而到达点域，然后将反应位点与标记的特异性结合物质相接触，洗去未结合的物质，再检测标记物。
英国专利申请第8809867号，在1988年11月9日以公开号第2204398A号被公开，揭示了硝化纤维素介质，包括样品添加区，在其下游方的对第一种被分析物为特异性的并已被标记的非固定化结合试剂，更下游方的对第二种被分析物为特异性的未被标记的固定化结合试剂。流体中的被分析物被流体运载去与标记的试剂接触，流体还将被分析物与标记的试剂一起运载去与固定化的未被标记的试剂相接触。检测结束时，如在固定化区观察到标记物。就指示在样品中存在着被分析物。
在以上所述的各种用品中，色谱介质起到的作用是过滤样品中不需要的颗粒物，使流体的流过速度减慢以便特异性结合的发生，并运载非固定化的试剂到其它固定化试剂的位点。但是，这种缓慢的流动也促进非特异性的结合，而且要等待以分钟计的时间才能得到结果。
多孔介质，例如硝化纤维素已经被用来对大量的血清和血浆进行过滤。但是，要想完成这种过滤，就必须在硝化纤维素两边造成显著的压力差。
多孔介质已经被用来制备检测设备中的所谓“预过滤器”，并且这种预过滤器将样品从局部添加区扩散到更大的检测表面区域。1990年3月27日授与Kalra等人的美国专利第4,912,034号描述了这种预过滤器。这些预过滤器一般由玻璃纤维构成，能迅速湿润检测表面，但过滤效果关差，如果选用能提供适度过滤的孔径的预过滤器，则其就会显著地降低湿润过程的速度。也就是说，使用先胡技术的预过滤器，就使良好的过滤与对检测表面的迅速湿润的互相排斥的。此外，玻璃纤维很大的空腔体积(滞留)，所以，可以吸收大量的样品。因此，如果只有少量的样品，就要对其给以足够的稀释才能检测表面得到适当的湿润。所以，为了提高灵敏性，通常都使用酶标记物。
虽然很多的这类检测都对以往的确定样品中存在着的物质的方法有着明显的改进，但是，建立快速和灵敏的免疫检测仍然是所追求的目标。现在使用的几乎所有免疫检测中共存的缺陷是速度慢(5～30分钟)，或速度较快而灵敏度不足(或两种缺点同时存在)。当对疾病进行检测时，灵敏度的降低是无法接受的，而且现有的那些最灵敏的检测也显得麻烦和缓慢。本发明的有益效果
本发明的目的是提供可用于众多检测的产品和方法，用提高的灵敏度对很少量样品中的被分析物进行测定，本发明还能对样品中的被分析物进行快速检测，省去先有技术的检测中的许多步骤，例如清洗步骤。本发明的目的
本发明的上述目的可以通过将样品快速地分布在膜上，然后将该膜与检测表面均匀接触而实现。
根据本发明的一个方面，提供了将样品传递到检测表面的传递部分。该传递部分包括具有样品接收表面的预过滤器。该预过滤器还包括将样品传递到检测表面的样品传递表面。在预过滤器的样品接收表面上有扩散材料，用于在样品被加到传递部分时，将样品迅速地水平分散开来。根据本发明的优选实施方案，传递部分为基本上圆形的，并将样品加到接收表面的中心。然后样品就迅速地从其加入位置被扩散开来。
扩散材料可以是例如膜或表面活性剂。因此，传递部分可以由一对膜组成并处于面对面的位置，其中一个膜起扩散材料作用，另一个起预过滤器作用。该扩散膜的孔径和厚度为能将流体样品迅速水平扩散到预过滤器接收表面。该预过滤器基本上是平面膜，其孔径和厚度要能在对样品中以大于预定尺寸的颗粒物过滤的同时也能将样品从接收表面转移到传递表面。在一具体方案中，扩散材料是孔径为约5～25微米的膜，传递材料是孔径为约0.1～约1.0微米且厚度为约50～约300微米的膜。
如果扩散材料是表面活性剂，则传递部分的结构就可以按以下所述的本发明的各种实施方案来进行。但是，不论如何，传递部分的构造都优选能将样品迅速地水平扩散到预过滤器的接收表面，并随后将样品均匀地传递到检测表面。
根据本发明的另一方面，提供了将样品传递到检测表面的传递部分的制造方法。另外，还提供了基本上为平面的多孔的并且具有样品接收表面的预过滤器。在样品接收表面上加一层扩散材料，该扩散材料可以是圆周形的，并且具有能将所加在其接收表面上的样品迅速水平扩散开的多孔结构扩散膜。此时，该扩散膜是与预过滤器处于面对面的关系，优选用与预过滤器和扩散膜的外周相近似的连接器将它们装配在一起。
根据本发明的另一方面，提供了一种将样品传递到检测表面的方法。预过滤器的传递表面被与检测表面吻合接触。然后将流体样品加到预过滤器接收表面上的扩散材料上，由此使流体样品迅速平面流到接收表面，这样流体样品就在与平面流动为垂直的方向上渗透到预过滤器中。换句话说，样品首先是按照与接收表面和检测表面所限定的平面为平行的方向上流动，然后按与该方向为垂直的方向而流过预过滤器而到达检测表面。
根据本发明的另一方面，提供了确定被检测物的检测试剂盒。该检测试剂盒是这样一种包装，其中含有检测固相，该检测固相具有固定化的被检测物的结合配体的检测表面。该包装还含有包括样品接收表面和样品传递表面的预过滤器，其中样品传递表面与检测表面处于面对面的关系，并且是可以移去的，在其样品接收表面上有扩散材料。该包装还包括将预过滤器的传递表面和检测表面吻合接触的压紧部分。该压紧部分可以是一种吸收材料，并与检测固相相接触。最优选的预过滤器是平面的纤维素膜，扩散材料是基本上为平面的纤维素膜，检测表面是平面膜的表面，该检测表面具有比被分析物尺寸更大的孔径，传递部分具有比检测表面小的孔径。该包装还可以进一步包括本文所述的检测试剂，其又包括被标记的检测试剂。传递部分的详细构造可以是如上所述的。该检测试剂药盒还可以包括有将预先确定的数量的样品加到传递表面的指示。
根据本发明的另一方面，提供了一种确定被检测物的检测试剂药盒。该试剂药盒包括这样一种包装，其中含有用于支持检测反应的检测表面，以及多孔纤维素预过滤器，该预过滤器的孔径为0.1～约1.0微米，并且有与检测表面处于面对面的传递表面。
根据本发明的另一方面，提供了检测被分析物的检测药盒的制备方法。该方法包括在检测表面上使被分析物的结合配体固定化；在基本上为平面的预过滤器的样品接收表面上添加扩散材料而构制成传递部分；并且为了使传递表面与检测表面处于吻合接触而放置压紧部分。然后将检测表面、传递部分和压紧部分包装在一起而形成该检测药盒。在将这些材料装入该包装之前，可以使压紧部分与多孔传递部分或检测固相之一相吻合接触，该方法还可以包括制备含有被标记的被检测物结合配体的检测试制。
根据本发明的另一方面，还提供了测定被分析物的检测方法。被怀疑含有被分析物的流体样品加到多孔性传递部分的接收表面上，该传递部分还具有与检测表面吻合接触的传递表面。该流体样品首先迅速地平面流动，然后该流体样品就渗透到传递部分并被均匀地转移到检测表面。
根据本发明的另一方面，提供了测定被分析物的测试方法。被怀疑含有被分析物的流体样品加到多孔性传递部分的接收表面上，该传递部分还具有与检测表面吻合接触的传递表面，该检测表面上载有被固定化的被检测物的结合配体。该流体样品迅速地在与接收表面基本平行的方向上平面流动。这样该流体样品就渗透到传递部分并被均匀地转移到检测表面。然后将该传递部分从检测表面上移去。检测表面是与含有标记的被分析物的一种结合配体或被固定化的结合配体标记的结合配体的检测试剂相吻合接触。然后对标记物进行检测。优选的是检测表面具有的孔径大于被分析物的尺寸，而且传递部分的孔径大于检测表面的孔径。
根据本发明的另一方面，提供了一种确定被分析物的检测方法，样品是加到具有能够发生非特异性结合的检测表面上。该样品包括仅能够部分封闭结合区的有效量的封闭剂。然后将该结合区与包括有标记物的检测试剂相接触。随后测定被标记的物质所产生的均匀分布的非特异性结合，在此处，均匀性是用来确定样品加到检测表面上的平均程度。优选的是在这些区域中没有任何被固定化的生物制剂。
根据本发明的另一方面，提供了具有检测表面的检测固相。该检测固相可以按此前所述的本发明的方法而使用。检测表面包括具有化学功能性的区域，该区域可以使被标记的检测试剂发生非特异性的结合，且该非特异性结合的程度能够指示加到该区域上的样品的程度。因此，当把样品首先加到该区域并达到某一程度时，然后添加标记的试剂，则标记的试剂就表现出某一相应程度。当把样品在该区域上以不同于第一程度的第二程度加入并随后加入标记的检测试剂时，那么标记的结合试剂在该区域发生的非特异性结合就是与第一程度相区别的第二程度。该检测固相表面还可以包含固定有被分析物结合配体的第二区域。
根据本发明的另一方面，提供了将流体样品加到检测表面的方法。该方法包括将预过滤器的传递表面与检测表面吻合接触的步骤，在预过滤器的接收表面上形成流体样品膜的步骤，并允许该流体样品膜渗透过预过滤器并将检测表面均匀湿润的步骤。
根据本发明的另一方面，还提供了包括使用预过滤器的检测试剂药盒和装置的改进型免疫检测。其改进之一是使用孔径为约0.1～1.0微米的预过滤器，其另一处改进是使用了一对面对面相处的膜的预过滤器。改进的另一处是具有样品接收表面的预过滤器，而且其构造和安排使流体样品可以迅速地在接收表面上平面扩散，并使样品渗透过预过滤器而且均匀地传递到检测表面上。改进的再一处是这样一种预过滤器，其具有样品接收表面以及将样品传递到检测表面的传递表面，并且在预过滤器的样品接收表面上有扩散材料。本发明的这些和其它各方面都将在以下结合附图给以详细描述。附图的简要说明
图1表示的是根据本发明一个实施方案的传递部分以及包括检测表面的检测固相；
图2a～2f表示的是根据本发明的一个实施方案的使用检测试剂药盒进行检测的程序，以在一个样品中确定IgG和IgA或IgM之一、或它们的组合；
图3a～3c表示的是根据本发明的一个实施方案在进行了图2所示的检测之后分别为错误、阴性和阳性结果的检测表面的外表；
图4是根据本发明的一个实施方案的检测试剂药盒的俯视图；
图5是图4中沿5-5的剖面图。本发明的技术方案
很多成对的生物物质表现出相互间的亲和力或相互间的结合力，一般被定义为特异性或非特异性的结合或相互作用。这种相互作用一般是在成对的分子间发生，其中的一个成员具有一个或多个暴露出来的可与另一个成员的一种或多种特定的暴露区相结合的特定区。所述的可以进行结合的暴露区域一般是受特定空间结构和/或极性限定的。在本说明书中，“结合配体(binding partners)”定义的是表现出这种相互亲和力的一对成员。例如这种结合配体包括抗体/抗原、抗体/半抗原、酶/底物、酶/抑制剂、酶/辅助因子、生物素/抗生物素蛋白、结合蛋白/底物、载体蛋白/底物、外源凝集素/碳氢化合物、受体/荷尔蒙、受体/效应物、核酸的互补链、阻遏物/诱导物等等。
在很多检测中，都需要一对具有相互亲和力的生物物质中的一员来捕捉和确定被分析物。已经有很多免疫检测是按照捕获这种被分析物而设计和发展出来的，例如捕捉在动物中相应于抗原而产生的抗体。根据这种免疫检测的一例，抗原是被固定在检测表面上，将血清样品与该检测表面相接触，则该表面就捕捉到对该固定化的抗原为特异性的抗体，然后包括有标记的被分析物抗体的结合配体的检测制剂就与检测表面相接触，这样，在该表面上固定下来的标记物就只存在着被分析物。
本发明的检测是快速灵敏的，并且可以用于很少量的样品。其中所提供的传递部分可以起到过滤作用，并且能迅速均匀地将检测样品传递到检测表面。此外，在检测中还使用了检测固相。该检测固相将检测表面选择性地暴露出来，从而能够有效地测定样品在检测表面上的分布情况。
在本文中术语“样品”定义的是被怀疑含有需要经过检测而确定的被分析物的溶液或流体混合物。当在生物检测中使用本发明的各种成分时，则样品一般都是按照水性溶液或水性悬浮液而使用。根据本发明的另一实施方案，在检测试剂盒中可以同时包括传递部分和检测表面，这两部分可参见图1。
在图1中，根据本发明的多孔传递部分表示为20，包括预过滤器18，在该预过滤器上有样品接收表面24和样品传递表面22。在预过滤器28的接收表面24上有扩散材料26。检测固相11包括检测表10，而且预过滤器28的传递表面22是与检测表面10相吻合的。根据本发明预过滤器28和检测固相11基本上都是平面型的，但是也不一定必须如此。最重要的是传递部分20的结构要能使样品均匀地湿润检测表面10，因此只要传递表面22和检测表面10是相吻合的形状和/或传递表面22以及检测表面10相互吻合就可以了。
预过滤器28以及检测固相11(可任选的)是由多孔材料构成的，该材料应该是对样品成分、检测制剂和其它的与在检测中与其发生接触的成分为惰性的，或者是可以将其转化为惰性的材料。在本文中术语“惰性”定义的是这样一种化学或生物学状态，即该材料并不与检测样品中的任何成分相互作用而使全体一对结合配体间在检测中发生相互作用或防碍进行所需的检测反应。当检测成分与预过滤器28或检测固相11的材料发生非特异性结合时，则本发明的特征之一就是这种非特异性的结合相对特异性结合来讲是很小的，在此，特异性结合指的是在流体样品中对被分析物按照本发明所述的检测方法来确定。正如以下更为详细的讨论所述，在根据本发明的一个方面中标记的试剂与检测固相发生某一程度的非特异性结合是有利的。
此外，用于构成预过滤器28以及检测固相11的材料应该在与检测流体介质接触时表现出毛细现象，并且具有用流体运送非固定化的试剂和样品成分的能力。术语“毛细现象(capillarity)”定义的是多孔材料同检测样品流体介质之间的关系，其中样品的流体介质与多孔材料的接触角度是准确的；或者是指这样一种关系，即样品流体通过多孔材料并不与重力对流体样品的作用相关。
适合于预过滤器28以及检测固相11(可任选的)的材料举例有用于色谱的纺织型或无纺型纤维材料、用于微孔或微颗粒薄层色谱的基质、多孔聚合材料包括聚链烯例如聚乙烯和聚丙烯；聚氯乙烯；聚酰胺如尼龙；聚芳基化合物例如聚苯乙烯；聚芳基砜；聚卤乙烯和聚偏卤乙烯；聚乙烯醇和聚偏乙烯醇；聚碳酸酯；多糖类包括纤维素例如乙酸丁酸纤维和硝化纤维素；聚酯例如聚对苯二甲酸乙二醇酯；聚酰亚胺和聚氨基甲酸乙酯例如聚醚聚氨基甲酸乙酯或它们的结合，此外，也可以对它们进行预处理(例如对固相11)，从而提供在1988年7月12日授权的美国专利第4,757,014号中所述的结合能力，该专利通过在此引述合关于本文；纤维素水合物例如在1986年8月5日授权的美国专利第4,604,208号中所述的发生电荷改变的微孔膜，该专利通过在此引述结合于本文；氟化的聚合物例如聚四氟乙烯、聚偏氟乙烯；多孔的芳香聚合物包括多芳基化合物例如聚甲基丙基酸甲酯；多孔的称作生物马赛克的聚合物，即含有至少一种可聚合单体的乳化液在有生物活性材料存在的条件下而聚合形成的聚合物，例如在欧洲专利申请第90312532.6号、以公开号0430517A2号在1991年6月5日公开的文本中所述，该文通过在此引述合并于本文；硅石；矾土；硅藻土；硫酸镁或其它的无机的细微物质并可以被均匀地分布在多孔聚合材料上；天然或合成性布料；琼脂糖；糊精；凝胶等等。适用于预过滤器28的材料还可见1982年12月28日授权给Tom等人的美国专利第4,366,241号，该专利通过引述合并于本文。适用于预过滤器28和检测固相11(可任选的)的多种微孔膜可以从Amicon、Geleman、Millipore、Schleicher and Schuell和Pall Corporation获得。
根据本发明的一个实施方案在预过滤器28的接收表面24的扩散材料26是表面活性剂。在本文中术语“表面活性剂”指的是那些可以被连接到或涂布在接收表面24上并且能够造成加在接收表面24上的流体样品的表面张力或界面张力的降低的物质。因此，该术语就包括润湿剂和乳化剂以及洗涤剂。表面活性剂可以被选择性地与接收表面24化学结合或以吸收的方式涂布到表面24上。要想将表面活性剂稳固地化学连接到接收表面24上，还可以另外采用已知的化学或物理方式，或对预过滤器进行适当时间的加热。虽然选择那些能够与接收表面24稳固地结合并使其在样品通过预过滤器28时被洗掉的表面活性剂是有意的，但也不一定必须如此。如果选用一次性或可丢弃的预过滤器，则在加入样品时对表面活性剂的去除程度就不是非常关键的，只要表面活性剂能够迅速地将样品在接收表面24上平面扩散开来并且对检测中的反应活性和测定不产生影响就可以了。表面活性剂可以渗透过预过滤器28而超过其接收表面24，但是优选的是表面活性剂基本上都停留在接收表面24。
有众多的表面活性剂可以被选择为本发明传递部分20的扩散材料26。可选择的但并不仅局限于此的实例有烷基硫酸酯和烷基季酯类，包括不均匀的聚氧乙烯类、葡糖胺、毛地黄皂苷、胆酸、硫代内铵盐、内铵盐、烷基二甲基胺氧化物、烷基葡糖苷、烷基麦牙糖苷、卵磷脂、溶血卵磷脂、均匀的聚氧乙烯和烷基硫代葡糖苷。具体而言，有聚乙二醇十二烷基醚，辛酰-N-甲基葡糖胺，壬酰-N-甲基葡糖胺，癸酰-N-甲基葡糖胺，壬基葡糖苷，壬乙二醇辛基苯醚，辛基葡糖苷，辛基硫代葡糖苷，聚乙烯聚丙烯二醇，牛磺胆酸一钠，脱氧牛磺胆酸钠，壬基乙二醇单十二烷基醚，壬基乙二醇辛基酚醚，壬基乙二醇辛基环己基醚，庚乙二醇辛基苯醚，庚乙二醇环己基醚，聚氧乙烯山梨糖醇单月桂酸酯，聚氧乙烯山梨糖醇一油酸，正辛基硫代内铵盐，正癸基硫代内铵盐，正十二烷基硫代内铵盐，正十四(烷)基硫代内铵盐，正十六(烷)基硫代内铵盐，N，N，双(3-D-葡糖胺丙基)乙醇胺，聚氧乙烯月桂基醚，辛基乙二醇单十二烷基醚，壬乙二醇单十二烷基醚，cetrimmonium bromide，3-[(3-乙醇胺丙基)二甲基胺]-1-丙烷磺酸酯，3-[(3-乙醇胺丙基)二甲基胺]-2-羧基丙烷-1-磺酸酯，胆酸(一钠盐)，癸基葡糖酐，癸基麦牙糖酐，N，N-双(3-D-葡糖胺丙基)脱氧乙醇胺，脱氧胆酸(钠盐)，毛地黄皂苷，十二烷基麦牙糖酐，N-十二烷基-N，N-二甲基甘氨酸，二辛基硫代琥珀酸钠，月桂基二甲基氨氧化物，癸氧乙烯单月桂醚，辛乙二醇异三癸基醚，聚氧乙烯异三癸基醚，甘胺胆酸(钠盐)，甘胺脱氧胆酸(钠盐)，庚基葡糖酐，己基葡糖酐，庚基硫代葡糖酐，N，N-二甲基-N-十二烷基氨氧化物，十二烷基硫酸钠，还可以选用其它的表面活性剂等同物。此外，还有众多的适合的表面活性剂出售，例如商标为TRITON，TWEEN，ZWITTERGENT，MEGA，PLURONIC，GENAMINIOX，GENAPOL等可购置于Calbiochem Corporation，La Jolla California。
当以表面活性剂作为扩散材料26时，则最好使传递部分20的接收表面向上，也就是说基本与地面平行。这样就可以使样品被在各方向上以放射形式均匀扩散。此外还可将传递部分处于与地面不平行的状态，并将样品加到接收表面的非中心部分，这样也可以使样品在重力的作用下扩散于接收表面。
当本发明的传递部分20是由表面活性剂作为预过滤器28的接收表面24的扩散材料26时，则应理解的是扩散材料/预过滤器的组合方式可以选用多种方式之一。其中的一种方式是将扩散材料由仅仅涂布在预过滤器28的接收表面24上的表面活性剂来限定，而预过滤器28的其余部分并不涂布有表面活性剂。在另一方式中，第一表面活性剂或封闭剂可以涂布在预过滤器28的多孔网络的全部或一部分上，而用第二表面活性剂涂布接收表面24并限定扩散材料26。根据这种安排，在接收表面24存在的第二表面活性剂就可以使加到预过滤器上的液体样品的表面张力比该预过滤器的其余部分低。例如，可以使用比第一表面活性剂性质更好的润湿剂来作为第二表面活性剂，或者使其用量大于第一表面活性剂。根据另一种安排，用一种表面活性剂涂布预过滤器28的任何一部分或全部，并用同样的表面活性剂以过量的方式涂布在接收表面24上，这样就可以使接收表面24上的流体样品的表面张力远远低于该预过滤器28的其余部分。在另一种安排中，用一种表面活性剂涂布接收表面24，并且用同样的表面活性剂或另外的表面活性剂来涂布预过滤器28的其余部分，但是在接收表面24所涂布的表面活性剂与预过滤器28其余部分所涂布的表面活性剂之间保留至少一段空间使其没有表面活性剂。例如接收表面24可以涂布有第一种表面活性剂，传递表面22可以涂布有同样或另外的表面活性剂，而在它们两者之间的预过滤器28上的那一部分则不涂布任何表面活性剂。这样当扩散材料26被表面活性剂限定时，就可以使一种或多种的表面活性剂被涂布在预过滤器28的一个或更多的部分。只要是传递部分20的构造和安排方式能使流体样品的表面张力在接收表面24上远远地低于预过滤器28上的紧挨着该接收表面24的部分，并使样品在到达检测表面以前被迅速地平面扩散开来。
根据本发明的另一实施方案，预过滤器28的接收表面24上的扩散材料26是多孔的惰性材料并且具有对所加样品产生毛细现象的能力，优选的是能通过毛细作用使流体样品迅速地平面扩散于接收表面24上的多孔膜，根据本实施方案，扩散材料26就被认作是扩散膜26。扩散膜26可以是用以上所述的构造预过滤器28的材料中的一种或数种结合而构成。此外，还可以使用玻璃料或尼龙材料来构造。在一个传递部分20中，预过滤器28和扩散膜26可以用相同的或不相同的材料构成。
扩散膜26可以用很多的方法与预反应器28的接收表面并置起来，例如通过化学或物理的结合如通过粘接即优选在很小的独立区将膜连接起来，或者通过缝纫以及微型铆钉(microrivets)等方法将它们连接起来，优选的传递部分20包括连接器例如标签或供悬挂用的小突出物(在图1中没有表示出来)，将预过滤器28的边缘与扩散膜26的边缘连接起来并使扩散膜与预过滤器的接收表面24处于面对面的位置。在本文中术语“面对面地位置”指的是很靠近的、相并列的一种位置关系，但是也并不一定完全吻合地接触。在本文中术语“吻合接触”指的是这样一种关系，即某一部件的表面被施加在其上的恒定力压迫到与另一部件的表面相接触，例如一种弹性部分的情况那样，因此两个表面就可以在它们的全部操作区吻合地相接触。当本发明的膜被处在面对面的位置时就可以用一种外力将它们吻合地相接触，即不需要通过重力而将外力作用在膜中的一个或它们两者之上而完成这一步骤。从以下可以清楚看出，扩散膜26和接收表面24可以在传递膜20将流体样品转移到检测表面10上的过程中被吻合地接触。
在使用扩散膜26将流体样品迅速地平面扩散到预过滤器的接收表面24时，有诸多的因素需要被考虑以对扩散膜26和预过滤器28进行选择。这些因素包括多孔性、毛细现象、空腔体积、厚度和可湿润性。在本文中术语“多孔性”指的是对膜的多孔材料的特性的定义，包括孔径、孔的方向、孔的封闭度和开放度等等。扩散膜26和作为预过滤器28的膜之间的组合的例子之一是扩散膜26的孔径比预过滤器28的孔径大。在这种安排中，并参见图1，在扩散材料26的中央部位加入样品就可以使流体样品被迅速地平面渗透过膜26，造成这种迅速平面扩散的部分原因是相对较大的孔径可以使样品以相对较快的速度在膜26内流动，以及由于预过滤器28的相对较小的口径而使样品在其中的流动速度较慢而共同造成。当样品接触到预过滤器28的接收表面24时，它就被迫平面流过扩散膜26。在另一种安排中，扩散膜26具有与接收表面24基本平行方向的孔，即孔的方向性分布有利于在该膜内产生水平毛细流动。以这种方式，扩散膜26就造成样品的迅速平面扩散。根据另一种安排，扩散膜26的毛细作用大于预过滤器28的毛细作用，其原因是在扩散膜26内流体样品的表面张力被更大地降低了。
在任何情况下，当传递部分20由扩散膜26和预过滤器28构成时，则对膜26和预过滤器28的选择就要使在将样品加入到扩散膜26时能够在预过滤器28的接收表面24上迅速形成流体样品膜，并且要使这层液体膜可以渗透过预过滤器28而将检测表面10均匀相等地润湿。在本文中，术语“液体膜”指的是与接收表面24和检测表面10基本平行的液体表面。这一点是要与先有技术中在其接收表面上没有扩散材料时加入流体样品所形成的液体表面以示区别。在先有技术的预过滤器中加入流体时，就会发生流体在预过滤器的各个方向上同等的放射渗透，这样该流体就会在完全平面渗透到该预过滤器各个边缘之前首先渗透过该预过滤器而到达其传递表面并与检测表面相接触，而且流体就会从中心部位开始逐渐地以放射形将检测表面10润湿。当把这种先有技术的预过滤器与本发明的检测表面和检测制剂共同使用时，就会在检测表面10上造成不均匀的标记物分布。这一现象将在以下给予更详细的描述。
对本发明的预过滤器28和扩散材料26的选择，是要使传递部分20将检测表面10的整个表面基本上均匀地同时湿润，其原因是在接收表面28上形成了样品液体膜，并且使该液体膜渗透过预过滤器而到达检测表面。这就保证了使样品中的被分析物是均匀地加到检测表面上。
为了要使流体样品迅速地平面流动在预过滤器28的检测表面24上，特别是当扩散膜26和预过滤器28是由相同材料构成时，则对扩散膜26的孔径以及其厚度就可以按此前所述的相对于预过滤器28的孔径关系范围内进行选择。同样地，为了在将样品从接收表面24以与该表面相垂直的方向迅速地传递过预过滤器26并均匀地接触检测表面10，则预过滤器28就可以按此前所述的范围对孔径进行选择。此外，传递部分20的构造要使很小量的未稀释过的流体样品可以被迅速地均匀地传递到检测表面10。要达到这一目的可以采用的方法有：例如选用孔径尺寸为0.1～约1.0微米的预过滤器28，较优选的是孔径为约0.2～约0.7微米，更优选的是孔径为约0.33～约0.53微米，而且扩散膜26的孔径为约5～约40微米，优选约8～约30微米，更优选的是约10～约20微米。根据对构成预过滤器28和扩散膜26的材料的一个具体的最优选择，它们两者都是由纤维素膜材料构成，优选硝化纤维素，预过滤器28的厚度为约50～约300微米，优选的是约110～约185微米，扩散材料26的厚度为约105～约165微米。
如果选择的预过滤器的直径与在此所述不相同，可能就需要在构造传递部分20时考虑对预过滤器28的接收表面24上的扩散材料26的数量进行相应的调整。例如，如果接收表面26包括表面活性剂，则在预过滤器28的直径增大的时候就要增大加在接收表面24上的表面活性剂的数量。或者在构造传递部分20时，在预过滤器28的接收表面24上以不均匀的方式加入表面活性剂，在该表面的中央部分多加一些表面活性剂并由该中央部分向周围放射形逐渐降低表面活性剂的用量。
当选用膜作为扩散材料26时，传递部分20的构造就可以选用这样一种膜来作为扩散材料26，即其厚度是由中心向外放射形地逐渐降低。这样，在预过滤器28的中心部厚度较大，而其边缘部位厚度较小。或者在需要增大预过滤器28的直径来覆盖更大的检测表面时，就需要增大扩散膜26的厚度。此外，扩散材料26可以包括这样一种组合，即一种膜以及加到该膜的任何部位上的表面活性剂，或将该表面活性剂加到预过滤剂28的接收表面24上。也就是说传递部分20可以包括预过滤器28、加到该预过滤器的接收表面24上的表面活性剂，以及在使用了表面活性剂以后在接收表面24上施加扩散膜26。这样做在构造直径很大的传递部分时是很有利的。预过滤器28的厚度在很大的直径变化范围内都可以保持基本不变，如果选择的扩散材料26是能够使样品被迅速均匀地传递到该直径很大的预过滤器28的接收表面24上。然而，预过滤器28的厚度还可以进行调整以便于获得较大的或较小的样品表面张力、较大的或较小的过滤、或针对于其它不同的原因进行调整。
当传递部分20按照将样品转移到检测表面10而确定其位置时，则传递部分20就应该是按照与检测表10基本平行的位置而定位，而且传递表面22要与检测表面10吻合相接触。参见图1(在该图中，为了表达清楚起见，传递表面22并没有按照与检测表面10吻合相接而表达出来)，表示的是将样品在靠近扩散材料26的中央部位添加时，样品被迅速均匀地平面扩散或从中心放射扩散，其在扩散材料26上的方向以箭头30表示，并且将样品在预过滤器28的整个接收表面24上迅速均匀地分散开来。扩散材料26和预过滤器28的选择是使平面扩散相对于样品对预过滤器28的渗透而言是足够快的，并能在接收表面24上形成样品液体膜。预过滤器28在对样品中的小颗粒进行过滤的同时，能够将样品迅速均匀地以液体膜的形式从接收表面24按照与接收表面24基本垂直的方向转移到检测表面10上。在此术语“膜”的定义是流体样品的薄层而且其液面被保持在与检测表面10基本平行的状态，因而样品在接触表面10时就是以几乎同时的形式进行的，并且在表面10的任何一个部分都施加了相同数量的样品。
对传递部分20的材料的选择可以同所选用的检测介质的流体的情况结合起来考虑。当检测流体介质是水时，纤维素特别是硝化纤维素就是优选的预过滤器28和扩散膜26的材料。当用传递部分20来转移生物样品，例如血清或血样到达检测表面时，传递部分20(包括预过滤器28以及传递膜26，在一个具体实施方案中)最好被封闭起来以防止样品中的组分与它们之间发生结合。为达到这一目的的封闭剂是能够对以溶剂转移样品成分或本发明的制剂造成不利影响的结合位点进行封闭的物质。对样品中任一成分为惰性的封闭剂都可以被选用，也就是说，要避免使用那些与样品中某一成分发生特异性相互作用的制剂。适宜的封闭剂可以包括有天然性的或合成性的、蛋白质的或非蛋白质的。这种适宜的封闭剂的非局限性名单包括：酪蛋白、明胶、清蛋白例如牛血清蛋白、α球蛋白、脱铁铁蛋白、卵清蛋白、抗生物素蛋白、肽、聚氨基酸和合成性聚氨基化合物、全血清、非蛋白质聚氨基酸和合成性聚氨基化合物。此外，预过滤器28和传递膜26可以按以上所述用表面活性剂涂布来达到封闭。
加到传递部分20的接收表面24上的任何样品应该结合该传递部分的尺寸及其滞留(空腔)体积来考虑，即要求样品的体积不能超过传递部分20的对所需流动特性产生有害作用的数量。当以多孔材料作为固相11时，则选用的样品量就不能超过使固相11和传递部分20的滞留体积被完全充满的数量。优选的是样品的量要能够渗透过传递部分20，对固相11的检测表面10进行湿润，而且正好完成该免疫检测。例如，如果所有被固定化的检测试剂都基本上处于检测表面10的表面上，而不是处于检测固相内，则最好不要使样品在检测固相11中产生非常巨大程度的渗透。而另一方面，当被固定化的检测制剂是处在固相11内时，即处在表面10的下面，则最好要使样品能够渗透到检测固相11中并达到与固定化试剂相接触的程度。此外，最好要使检测流体对检测表面10的湿润程度能够产生所需程度的后加被标记制剂的非特异性的结合。对此，在以下给予更详细的描述。
此外，在选用样品的体积时最好要使该体积能够促进由毛细作用而非重力作用造成对传递部分20的渗透。优选的样品体积是在扩散材料26的帮助下能够迅速并均匀地在接收表面24上形成液体膜，并且随后由毛细作用而使其迅速均匀地渗透到预过滤器28中，并均匀地几乎同时地将检测表面10的各部分润湿。对这种流动特性产生有害影响的这种样品数量会依据样品中所含的颗粒物质的数量而不同。当采用血样品时，其数量就要根据对血样品的处理来决定。如果在将该样品加到接收表面24之前先经过处理并去除了大部分的颗粒形物质时，就可以使用比较大的数量的样品。一般而言，优选的样品体积是传递部分20的滞留体积的1～3倍，优选约1～2倍，最优选约1.1～1.4倍。
传递部分20在免疫检测程序中是非常有用的，但是并不仅限于这种免疫检测，它还可以广泛地应用于其它各种检测中，只要该检测中需要将流体样品迅速均匀地传递到某一表面，其中对该样品的过滤是可有可无的。一般来说，流体样品中含有被检测物，包括各种的物质，包括药物、荷尔蒙、大分子物质、微生物(所有这些物质都可以在临床或生理液体中发现，例如脑脊液、眼液、全血、血清、血浆、唾液、眼泪、尿液)、合成性化合物、水中或空气中的污染物、微量化合物、食品中的毒素和微生物、以及它们的稀释品。流体载体可以是水性或有机性的，用于构造传递部分20的材料可以在很大程度上根据流体载体来选择。可以对样品中的各种被检测物的存在及其数量进行确定，例如，在以上所引述的1982年12月28日授予TOM等人的美国专利第4,366,241号中所述。
检测固相11，特别是表面10的选择是要使其能够将检测试剂方便地固定在其上面。表面10可以包括一个或多个将一种或多种检测试剂固定在该处的特定区域。一般而言，被固定的检测试剂都选择为一对结合配体中的一员。
对一对结合配体中的一员在检测表面10上的固定化是通过共价键或吸收性连接而实现的。根据本发明的一个实施方案，检测表面10包括被暴露出来的功能性基团，例如但不仅限于羧基、磺酸基、氨基、硫基、羟基、吡啶基、磷酰基及它们的衍生物，或者是本技术领域的技术人员所熟知的那些能够促进固定化的功能性基团。这些功能基团可以按活化的形式存在，通过加入取代物而对其进行活化，这些取代物包括有例如卤素、苯基、羧基或磺酰基等等。检测固相11的构成可以包括在其上或其中固定有被检测物的结合配体，这种方法可见于1978年7月4日授权的美国专利第4,098,645号，该专利通过在此引述而合并于本文。此外，将蛋白质用等离子固定化方法固定到合成性基质上的方法可见于1991年7月2日授权的美国专利第5,028,657号，该专利通过在此引述而合并于本文，而且这种固定化是在本发明的范围之内。DNA、RNA和某些抗原都可以通过对溶剂转移的烘焙而加到检测表面10上。一般而言，当检测表面10包括硝化纤维素或为硝化纤维素酯的混合物，则将检测试剂被固定化时就不需要特殊的化学连接。也就是说，这种固定化可以是吸附性的。本发明的最佳实施例
如图1所述，表面10包括有固定着第一检测试剂14的第一区域12(在图中为蛋白质A)以及固定着第二检测试剂18的第二区域16(在图中为HIV)。在检测表面10上可以有任何数目的载着固定的检测试剂的区域，而且这些试剂可以作为被分析物的结合配体、对照的结合配体或它们两者的结合。对检测固相11的检测表面10可按照本发明进行封闭，但不一定如此。
应该注意的是在本发明的一个实施方案中，检测固相11是多孔的，而且可以用以上所述的适于构造预过滤器28的材料来构成。根据该实施方案，特别是当检测固相11和预过滤器18由同种材料构成时，固相11的孔径可以同预过滤器28的孔径一样大或更大。另外，固相11的孔径可以依照使样品和检测试剂迅速流过的标准来选择，从而使在检测表面10上发生的非特异性结合最小化。具体而言，固相11的孔径可以是1～100微米，优选的是约5～40微米，更优选的是约8～约30微米，最优选的是约10～约20微米。
传递部分20和检测固相11的尺寸和形状可以在很宽的范围内变化，例如传递部分20和检测固相11并不一定要为相同尺寸和型号。只有固相11的一部分暴露出来的表面可以限定检测表面10，或者由整个暴露出来的表面来限定检测表面。此外，传递部分20的传递表面22可以由一部分的或全部的传递部分20的暴露出的表面来限定。重要的一点是限定传递表面22的任何传递部分20的部分要与限定检测表面10时的整个暴露出来的固相11的表面相吻合接触。
根据所述的实施方案，传递部分20和检测固相11都基本上是圆形的，各自的直径约为1.5厘米。检测固相11的厚度在本发明中并不是非常关键的，但是如果选用了多孔的固相11，则就要按照滞留体积等于或大于所加样品体积与传递部分20的滞留体积之差来选择。按照这种方法，固相11就有助于将流体样品从接收表面24迅速并均匀地转移到检测表面10。
参见图2a～2f，给出的是检测的实例，使用的是本发明的检测试剂药盒。在所有图中，在数个图内为相同的各部分都以同一数字表示。该药盒包括(图2a)传递部分20，并且使用了本申请的共悬未决美国专利申请“使用蛋白质和抗体的检测”中所充分描述的检测试剂。图中所示的是根据本发明的灵敏度很高的HIV检测分析。在图2中，该检测包括将蛋白质A作为第一固定化检测试剂14并用HIV作为第二检测试剂18，并分别位于检测表面10上的第一区域12和第二区域16。
在图2中，传递部分20是图示性的，扩散材料26没有在图中表示出来。因而，预过滤器28(未标出)的接收表面24是代表着传递部分20的接收表面这一整体。传递部分20放置在检测固相11上并使传递表面22与检测表面10相吻合接触。样品加入到传递部分20的接收表面24(图2b和2e)，优选将样品加入到表面24的中间部位，并在此使样品通过扩散材料26(在图中没有具体给出)被迅速地以放射形状扩散并形成液体膜，并进而将该液体膜均匀地转移到检测表面时，以便几乎同时地接触表面时的所有部分。传递部分20包括预过滤器(在图中没有给出)，该预过滤器将比其最小孔径还大的颗粒物质32过滤出来。
当把样品通过传递部分20传递到检测表面11后，第一或第二固定化试剂14和18的任何结合配体就与其结合。如图2b所示，含有HIV特异性的全部IgG，IgA和IgM的样品就被第二固定检测试剂区16上所固定HIV捕获。并且IgG也被第一固定检测试剂区12上所固定的蛋白质A所捕获，由于IgG在所有的血清样品中都是大量存在的，因而可以将这一现象作为对照。如果没有疾病存在，也就是说，如果在样品中没有HIV的抗体，则样品中的物质就不会在区域16与固定化的HIV相结合(图2e)不可避免的是，样品中的一些成分会停留在检测表面10上，但又不与任何固定化的检测试剂相结合，以数字34表示。
此后，将传递部分20移去，并将过量的检测试剂加到检测表面10上(图2e、2f)。根据这一检测，检测试剂包括偶联有疏水标记物的蛋白质A36，具体的标记物是靛蓝，它同表面10的区域12上的与蛋白质A相结合的IgG发生结合，并同表面10的区域16上的与HIV相结合的IgG发生结合。该检测试剂还包括抗-IgA-IgG38，其与表面10的区域16上的与HIV相结合的IgA发生结合，并与表面10的区域16上的与HIV相结合的IgM发生结合的抗-IgM-IgG40。靛蓝是与抗-IgA-IgG38和抗-IgA-IgM40相疏水偶联的，同时起到标记物和封闭剂的作用，封闭的是它们各自与蛋白质A36的结合位点。
如上所述，检测固相11的孔径最优选为约10～20微米。检测固相11的相对较大的孔径以及由此而造成的过量检测试剂迅速通过固相11的流动速率，就可以使外源物质34同检测表面10通过固相11时发生的非特异性结合被降低，并且可以省去在加入样品和加入检测试剂之间的清洗步骤。再者，快速地加入样品到检测表面10以及快速地加入检测试剂都使得非特异性结合的发生无法获得足够的时间。
当加入检测试剂后，在第一固定化检测试剂区12和第二固定化检测试剂区16都存在着肉眼可见的靛蓝标记物，都指示样品中含有HIV抗体(图2c)。如果仅在第一固定化检测试剂区12上存在有标记物(即在区域16没有标记物)表明没有HIV抗体的存在(图2f)。
该检测的一个方面是确定样品在检测表面上的分布的均匀性。检测试剂被固定在区域12和16，还可以固定在另外的区域(未标出)，但表面10的其他区域则不固定任何检测试剂。对表面10的选择是在不含有固定化的检测试剂的区域上暴露出化学功能团，并且使表面10在第一次加入样品到第一程度时发生被标记的检测试剂的某种程度的非特异性结合，并且，在表面10与样品以第二程度接触时发生另一程度的结合。换句话说，在加入了样品以后，被标记的检测试剂与表面10的低水平的非特异性结合也还会发生。如果样品是非均匀地加到表面10上，那么那些加入较少样品的区域就会发生较多的与标记物的非特异性结合。这样，在表面10上的均匀的径迹就表示样品的均匀分布，而不均匀的径迹就表示不均匀的分布。根据本发明，如果在某一区域没有加入样品则在该区域就会有很强的标记物的非特异性结合，并且表面10上就会有暗癍。优选的是，样品只部分地封闭标记物的非特异性结合以提供对样品分布的绝对测量值和相对测量值。由于血清样品在检测过程中对表面10进行封闭，因而过量的靛蓝42在检测表面10上的分布的均匀性就指示着传递部分20将血清样品在表面10上所进行的分布的均匀性。因此，这一指示也可以用来确定某一测试的可靠性。
参见图3a～c，在进行了图2所示的检测后，检测表面10的外表分别指示错误结果(a)，阴性结果(b)和阳性结果(c)。图3a表示的是错误结果，染料被不均匀地且非特异性地结合到检测表面10，指示着血清被不均匀地加到表面10。另一个对错误结果指示的(未给出)是检测表面完全黯淡，指示染料彻底地涂布了表面10。这种情况也可能是在加入检测制剂之前血清没有对表面10进行适当的涂布。在图3b中，区域12上存在染料以及整个表面10存在着淡淡的染料背景，并且在区域16上没有染料存在都表示没有感染发生。IgG与区域12上所固定的蛋白质A相结合并进而与检测试剂中的染料偶联的蛋白质A相偶联。然而，在区域16没有HIV的抗体被固定下来，这一点是由在区域16上缺少被固定的标记检测试剂而指明的。在图3c中，检测试剂中的标记物被结合到区域12和16上，指明有感染发生，也表明在区域16上的与固定化的HIV结合的血清样品中的HIV抗体的存在。在所有这些情况下，依据本发明所展示的检测，在区域12上结合的标记物都被作为对照。
在图4和图5中，表明了根据本发明的检测试剂盒的安排，其整体以44来表示，包括基座46，该基座有空腔48。空腔48在其底表面有向上的凸起60，空腔48内装有弹性吸收部件50，例如棉花球，该棉花球的安排是在其发生自然膨胀时会向上顶起该基座46的上部。弹性的吸收部件50在空腔48的顶部支持着检测固相11，也就是说当外力向下压迫部件50的扩张力时，它就与基座46的上表面平行。样品传递部分20被装在其中，并且与四边形的突出52为一整体，该整体是延伸在基座46的一部分上并跨过腔体48以使传递部分20位于检测固相11之上。当膜限定了预过滤器28和扩散部分26(在图4、图5中没有标出)，突出52就起到将预过滤器28的边缘和扩散膜26的边缘连接起来的作用，并将预过滤器28的接收表面与扩散膜26面对面地放置在一起。盖54将突出52和传递部分20连接在一起，盖54可以通过铆接、紧箍56或超声焊接等方式与基座46连接起来。盖54上有一个开孔58能将大部分的传递部分20暴露出来，且其周边与吸收部分50通过检测固相11向上传递到传递部分20的力相抗衡。这样，传递部分20的传递表面22就与检测固相11的检测表面10吻合相接。如果是用膜限定扩散部分26，则扩散膜26和预过滤器28的接收表面24就会在此时吻合相接。盖54的开孔58的周边就对传递部分20的扩散材料26的周边产生向下的力，而弹性吸收部分50就作为压紧部件对检测固相11产生向上的力。突出52从盖54下面向外伸展，以使得传递部分20可以被方便而又快速地从盖54和检测固相11下面移去。
当把样品加到传递部分20的接收表面24(预过滤器28没有被标示出来)，则样品就被过滤并且由传递部分20迅速而均匀地传递到检测表面10，这一点在进行检测时就是所观察到的接收表面24(或扩散膜26的上表面的)放射形湿润。当表面24被彻底湿润后，需要经过几秒钟的时间才可以使样品液体膜完全渗透过预过滤器28并润湿检测表面10。此后，可以将突出52从盖54下移出，弹性的吸收部件50就可以将检测固相11向上沿着盖54的开孔58的边缘而顶起。在盖54上含有沿开孔58的液体小井。将检测试剂加到该液体小井中，就可以迅速地流过检测固相11并被弹性吸收部件50所吸收。此后，检测表面10就可以产生可见的对阳性或阴性反应或错误结果的指示，如图3a～c所示。整个检测操作过程历时不到1分钟，一般约为30秒。
如果突出52将基座46内的空腔48完全盖住，则就要在空腔内形成一个小孔以使得被吸收部件50所吸收的液体而排出的空气可以被释放出来。如果突出52并不完全覆盖空腔48，则就不需要小孔，因为空气就可以沿着突出52释放出来。
如同以上所述，弹性吸收部件50造成检测固相和传递膜的稍微向上的突起。应该理解，这种安排是与本发明的检测试剂盒的各成分相适应的，其中传递部分特别是预过滤器28的传递表面24以及检测表面10是处于基本相互平行的位置。此外，以上所述的由扩散表面26而造成的检测液的放射扩散是以与传递表面24基本相平行的方式进行的，而且还应该理解的是这种扩散也包括在如图5所示的传递部分20上的稍微向上突起的那一部分的扩散。
以下的各实施例都是用来说明本发明的，并不对本发明的范围进行限制。例如，虽然在各实施例中都以染料或色素作为标记物，但很多种其它的标记物也都可被采用。同样，虽然在各实施例中都以硝化纤维素作为传递部分和检测表面的材料，但其它的各种多孔材料也可以用来制造这些部分。虽然在实施例中给出的检测表面基本上都为圆形，但也可以采用其它的各种不同形状及其尺寸。在各实施例中，虽然都是用固定化的抗原去检测血清样品中的对该固定化抗原为特异性的抗体，并且用固定化的蛋白质去捕获IgG来作为对照，但是，还可以采用任何其它的检测方式。以上所述的以及其各种修饰和等同物都是属于本发明的范围之内。
实施例1
HIV1冷冻物的生产程序
在本实施例及以后的实施例中，除了另有说明外，所有使用的化学品都是从Sigma Chemical Corporation(St.Louis，MO)获得的。制备所需溶液
制备LB溶液是将5克酵母提取物(DIFCO/VWR)，10克胰蛋白胨(DIFCO/VWR)以及10克氯化钠溶于1升MilliQ水，将pH值调节至7.2，然后高压消毒。MilliQ水是将水通过MilliQ水系统(Millipore Corp.，Bedford，MA)过滤而制备。该溶液被冷却并加入氨苄青霉素使其最终溶液为0.1mg/ml。
SOB液体培养基的制备是将5克酵母提取物和20克胰蛋白胨溶于1升含10毫升1M氯化钠的MilliQ水中，调节pH值至7.5，将该溶液高压消毒并冷却。加入10毫升1M氯化镁和10毫升1M硫酸镁使最终溶液被调节至20mM氯化镁/硫酸镁。
FSB溶液是依据Maniatis(Molecular Cloning)，§1.78所述制备。在MilliQ水中加入以下各成分：10毫升1M乙酸钾(pH7.5)，8.91克MnCl24H2O，1.47克CaCl22H2O，7.46克氯化钾，0.80克氯化六氨合高钴，100毫升甘油(Amresco)。用MilliQ水将该溶液调至1升，并且用0.1N盐酸(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)调节pH值至6.4。制备E.ColiHIV1原料
LB液体培养基(10ml)用0.2ml甘油(Amresco)接种，然后在摇动培养器上以28℃、300RPM过夜培养。将该过夜培养物加入到1升PyrexFembach烧杯中含有的20mM氯化镁/硫酸镁的200mlSOB中，继续使该培养物生长直至光密度为0.6～0.7。然后将细胞转移到无菌、可废弃的、冰冷的50ml聚丙乙烯试管(Falcon)中，然后将该试管放在冰上10分钟，使其冷却至0℃。随后的步骤都是在无菌条件下进行的。
用TZ-28转子(Sorvall)的RC-5B离心机(Sorvall)以4000RPM在4℃离心10分钟回收细胞。在把上清液完全去除以后，将片状沉淀物以轻微的涡旋重悬浮于大约80ml(每个50ml的试管内加入20ml)的冰冷FSB。将该细胞放置在冰上10分钟，再以4000RPM在4℃离心10分钟回收细胞。在把上清液完全去除以后，将片状沉淀物以轻微的涡旋重悬浮于大约20ml(每个50ml的试管内加入5ml)的冰冷FSB。0.7ml(每50ml的试管加入175微升)的DMSO被轻缓搅动加入到该溶液中，然后将该悬浮液放置在冰浴上。然后再加入175微升(每50ml试管)的DMSO，轻微搅动该悬浮液并将其放回至冰浴上。将该悬浮液等分(0.2ml)到冷却的、无菌的微离心管(microfuge tube)中，然后将其盖紧并插入到甲醇干冰浴中冷冻。将这些微离心管保存在-80℃直至取用时为止。从冰冻的DMSO原液制备HIV1
在冰冻了这些细胞至少两天以后，可以从开始培养物，即从冰冻的DMSO原液中生长出来的培养物中确定高产诱导的HIV1。为了进行本分析，将该原液从-80℃冷冻柜中取出并放置在冰上解冻。将0.2ml细胞加到1mlSOB培养基中，然后在28℃培养1小时。将1.2ml这种培养物加入到200mlLB培养基中(0.1mg/ml氨苄青霉素(Amresco))，并在28℃过夜培养而制备起始培养物。然后按实施例2所述的方法提纯HIV1。
实施例2
HIV1的提纯和生产制备所需溶液
制备LB溶液是将17克酵母提取物(DIFCO/VWR)，34克胰蛋白胨(DIFCO/VWR)以及34克氯化钠溶于3.4升MilliQ水(Millipore Corp.)，调节pH值至7.2，然后高压消毒。该溶液被冷却并加入氨苄青霉素(Amresco)并使其最终溶液为0.1mg/ml。
1升50mM Tris-HCl，2mM EDTA，pH8.0的制备如下：在MilliQ水中溶解6克氨基丁三醇碱(TRIZMA BASE)和744毫克EDTA，用盐酸(J.T.Baker)调节该溶液的pH值至8.0，用MilliQ水将该溶液的最终体积调至1升。
在含有1毫升TWEEN20(0.1％，聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯，Calbiochem，La Jolla，CA)的MilliQ水中溶解480.5克UREA(8M)(Amresco)，4.08克BICINE(25mM)，1.54克DTT(10mM)和1.86克EDTA(5mM)来制备1升的提取物缓冲液(Extract Buffer)。将该溶液的pH值调节至8.5并用MilliQ水将其体积调节至1升。
在1升的MilliQ水中溶解250克硫酸铵来制备1升的25％硫酸铵溶液。培养和诱导3升的含HIV1的E.Coli
实施例1的培养物接种到含200毫升LB液体培养基的Pyrex Fembach烧瓶中，在摇动培养床上以300RPM、25℃过夜培养。保留10毫升该培养物并在4℃保藏以用作试验的对照(非诱导的对照)。第二天，对三个含1升LB液体培养液的2.8升Pyrex Fembach烧瓶各接种50毫升该培养物。在摇动培养床上以300RPM、30℃培养该培养物直至其光密度在600nm处为0.6-1.0时为止(2～3小时)。
将该培养物从30℃的摇动培养床上取出并以160～170毫升的等分转移到无菌的0.5升Pyrex Fernbach烧瓶中。将该烧瓶放入60～70℃的水浴中使等分培养物的温度被迅速提高。在水浴中时摇动该烧瓶并对其内部温度进行监测。当培养物一达到42℃(2～3分钟后)，就将烧瓶中的内容转移到被预热的2.8升Pyrex Fembach烧瓶中(6个空的并消毒过的2.8升的Pyrex Fembach烧瓶被放在200RPM的摇动床上以42℃预热)。重复该过程直至6个烧瓶中的每一个都含有0.5升被诱导的培养物为止。将该烧瓶盖住并使其摇动速率升高至400RPM。从6个烧瓶中各取1毫升并保存起来作为诱导实验的对照(诱导的对照)。将培养物以400RPM、42℃培养过夜。第二天用Sorvall RC-5B离心机以8000RPM离心20分钟收取细胞。如果这些细胞不需要立即进行提纯的话，就将其储存在-80℃。内含体的提取和纯化
将细胞的片状沉淀物解冻并重悬浮于总量为300毫升的50mMTris-HCl pH8.0，2mM EDTA(100ml/1L培养物比率)。为了有效地进行重悬浮对该溶液进行声处理(Branson sonifier Model450)，并加入溶菌酶使其最终浓度为100mg/ml(使用了3毫升10mg/ml的原液，该原液是从50mMTris-HCl pH8.0，2mM EDTA新制备的)。向该溶液中加入1/100体积的10％Triton X-100(3ml)，并在30℃培养15分钟，然后将该溶液放在GS-3转子的Sorvall RC-5B离心机上以8000RPM离心1小时。如果上清液不是清澈的，那么就将其再离心1小时或将该溶液放在TZ-28转子以15000RPM进行离心。收集上清液并放在4℃保存直至等分(100微升)试样被用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(LYSOZYME SUP)分析为止。将片状沉淀物以声处理重新悬浮于总量为300毫升的50mM Tris-HCl pH8.0，2mM EDTA(100ml/1L培养物比率)中并取出100微升(LYSOZYME PREC)进行PAGE分析。按以上所述进行离心(在GS-3转子(Sorvall)的RC-5B离心机以8000RPM离心1小时)并移出100微升上清液以进行PAGE分析(WASH SUP)。将片状头沉淀物以声处理重悬浮于总量为60毫升的提取物缓冲液(20ml/1L培养物比率)中取出20微升的等分并保存，用作实验对照(提取物1)。该细胞悬浮液放在RC-5B离心机的TZ-28转子以15000RPM进行离心30分钟。该上清液被转移至新的试管以作进一步的提纯(溶液1)。片状沉淀物被重悬浮于30毫升的提取物缓冲液中，并按前述步骤进行离心(在TZ-28转子以15000RPM的速率离心30分钟)。在进行此次离心之前，移出20毫升的等分试样以用作试验对照(提取物2)。该上清液被转移到新的试管中进行进一步的提纯(溶液2)。从溶液1和溶液2中各取20毫升等分试样用作试验对照。
合并溶液1和溶液2，加入5体积的25％硫酸铵(450ml)对内含体进行沉淀。该溶液放在RC-5B离心机的GS-3转子以8000RPM进行离心1小时。如果上清液不是清澈的，那么就将其再离心1小时或将该溶液放在TZ-28转子以15000RPM进行离心。移出20微升的上清液等分试样以用作试验对照(溶液3)。再加入60毫升提取物缓冲液并以声处理使片状沉淀物再次溶解。移出20微升重悬浮的片状沉淀物用作实验对照(提取物3)。用300毫升(5体积)25％硫酸铵对该溶液进行沉淀，并按以上所述进行离心(GS-3转子以8000RPM进行离心1小时)。移出20微升上清液的的等分试样用作实验对照(溶液4)。将片状沉淀物以声处理再次悬浮于100毫升(原始培养物体积的1/30)的提取物缓冲液中(内含体)。用电洗脱提纯(Electroelution)HIV1
13毫升甘油(Amresco)和13毫升的10％SDS(GIBCO BRL，Helgerman，CT)被加入到按前述步骤所获得的内含体的悬浮液中(100ml)，移出16～17毫升的等分试样用于电泳，剩余的样品被储存在4℃(或在-80℃进行长期保存)。
制备性SDS聚丙烯酰胺凝胶(37mm ID)是按照BIO-RAD Model 491准备细胞的说明书(13～15页)来制备。在浇入凝胶时使用了80毫升(10cm)的12％凝胶分离液和28毫升(3.5cm)的凝胶堆积液。该Model 491细胞制备仪(BIO-RAD)是按照其说明书(第15～20页)而组装的。在加样以前，向每一个16～17毫升等分样品加入含有溴酚蓝和160微升β-巯基乙醇的50微升样品缓冲液。将该样品加热至90℃10分钟(即通过将等分小样转移到eppendorf试管中并将其放在加热区而实现的)。在每一个制备性凝胶中都加入总量为16～17毫升的样品。加样以后，该Model 491仪器的工作条件是恒电流40mA、22小时，洗脱缓冲液的速率是30毫升/小时(0.5ml/分)，收集各组分20分钟。
当对溴酚蓝进行洗脱以后，收集10微升的等分样品。将这些等分试样走12％SDS(GIBCO/BRL)聚丙烯酰胺凝胶以确定其中每一个含有27.3kd的HIV1蛋白质。随后合并含有HIV1的各组分并按以下所述的沉淀和重悬浮方法进行纯化。
对每一份对照都按照所述的方法进行处理，并将各样品的10微升等分试样在还原条件下走12％SDS(GIBCO/BRL)聚丙烯酰胺凝胶。
诱导的和未被诱导的对照：将每一份样品都转移到eppendorf试管并旋转以分离出不溶物质，将上清液弃去，并将片状沉淀物重悬浮于0.1毫升的MilliQ水中。
溶菌酶悬浮液，溶菌酶沉淀，溶液1、2、3和4以及提取物1、2和3：将这些对照都以80微升稀释，并用10微升等分试样在PAGE凝胶上走电泳。检测表面渍点的HIV1沉淀和重悬浮
从电洗脱中收集到的各HIV1组分被加到新的离心管(50ml，Sarstedt，Newton，NC；250ml，Corning，Corning，NY，或等同物)，该离心管可以容纳3倍的初始体积。将二体积的100％乙醇加到其中并与其内的成分相混合。在室温下至少培养30分钟后将该悬浮液放在SS34转子(Sorvall)SorvallRC-5离心机上以4000RPM连续离心30分钟。将上清液移出并保存，将该试管倒置以取出所有流体，则沉淀物是白色的蜡状并有光泽的非常细致的物质(即没有颗粒)。将该沉淀物用最少量的0.1N氢氧化钠重悬浮。在进行这一步骤时，氢氧化钠必须以200微升的量分次加入直至没有残存的可见固体时为止。然后将该溶液用离心机离心5分钟以去除剩余的固体，对该溶液的蛋白质浓度进行确定，然后以每道5μg样品的量在走还原的和未还原的条件走15％SDS-PAGE。最后按照实施例4所述的方法将含有2μg HIV1的0.5微升液体渍点化。
实施例3
制备直链淀粉柱和洗脱缓冲液以及对HIV2的生产和纯化程序制备所需的溶液
在900毫升MilliQ水中溶解1.2克氨基丁三醇碱、11.7克氯化钠和372毫克EDTA来制备直链淀粉柱缓冲液。当这些化学物质彻底溶解后，加入700微升β-巯基乙醇并用10N盐酸将pH值调至7.4(偏差不超过0.1)。将该溶液通过0.45mm过滤器(Costar，Cambridge，MA)过滤以达到对溶液的消毒。消毒过的溶液被储存在4℃。如果该溶液的储存期超过30天，就不要再使用了。
直链淀粉洗脱缓冲液的制备是将1.2克氨基丁三醇碱、11.7克氯化钠、372毫克EDTA和3.42克麦芽糖加入到900毫升MilliQ水中。当这些化学物质彻底溶解后，加入700微升β-巯基乙醇并用10N盐酸(J.T.Baker)将pH值调至7.4(偏差不超过0.1)。将该溶液通过0.45mm过滤器过滤以达到对溶液的消毒。消毒过的溶液被储存在4℃。如果该溶液的储存期超过30天，就不要再使用了。
制备LB液体培养基是将5克酵母提取物(DIFCO/VWR)，10克胰蛋白胨(DIFCO/VWR)以及10克氯化钠溶于1升MilliQ水，调节pH值至7.2，然后高压消毒。该溶液被冷却并加入氨苄青霉素(Amresco)并使其最终溶液为0.1mg/ml。将该LB液体培养基以1升的等分加到6个2.8升的每个Pyrex Fembach烧瓶中，并将400毫升的该LB液体培养基的等分试样加到1升Pyrex Fembach烧瓶中。
100ml的100mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)
500ml的20％乙醇(V/V)
8升由1X磷酸盐缓冲的生理盐水(PBS)pH7.26升E.coli/MBP结构的生长
含在1升Pyrex Fembach烧瓶中的400毫升LB液体培养基(100mg/ml氨苄青霉素，Amresco)用被转染的培养物进行接种，然后放在摇动培养床上以250RPM、37℃过夜培养。将10毫升的该培养物保存在4℃用作试验对照(未诱导的)。6个2.8升的含有1升LB液体培养基的PyrexFernbach烧瓶用50毫升在前一步骤中生长的培养液进行接种。将其放置在摇动培养床上以250RPM、37℃使培养物生长直至光密度在600nm处为0.6～1.0时为止(2～2.5小时)。将3毫升的该培养物移出用SDS-PAGE分析其诱导(未诱导2)。
对每个烧瓶中加入10毫升100mM IPTG对培养物进行诱导。盖住烧瓶并放在37℃以250RPM培养3小时。测定其最后光密度并取出3毫升该培养物的等分试样，用SDS-PAGE分析其诱导(诱导)。用SorvallRC-5B以8000RPM离心20分钟收取细胞。如果对细胞不需要进行立即纯化，则将其储存在-80℃。
通过对以上分离出的对照样品进行电泳来分析其诱导。未诱导、未诱导2和诱导样品各1毫升用微离心机离心，将沉淀物重悬浮于100微升的MilliQ水中。10微升的该细胞悬浮液的等分试样在还原条件下走15％SDS-PAGE凝胶。内含体的提取
将细胞沉淀物解冻并重悬浮于直链淀粉柱缓冲液中，其比率为每克沉淀物对10毫升缓冲液。对该样品进行声处理直至获得完全悬浮。在声处理过程中将该悬浮液放置在冰浴下冷却。当达到完全悬浮后，将该样品于室温下在摇动平台或滚筒中培养4小时(或过夜培养)。但是，要收取1毫升的该悬浮液以进行SDS-PAGE的对提以物的分析(溶液1)。
将样品转移到高速离心试管中并在SorvallRC-5B(TZ-28转子)离心机上以18000RPM离心20分钟。将上清液移入到250毫升的锥形试管中并用相同体积的直链淀粉柱缓冲液稀释。再用500毫升0.45mm过滤器对该混合物进行无菌过滤，过滤后的溶液含有不含细胞的提取物(CFE)。
将溶液1和CFE的等分试样走凝胶以确定上述过程的有效性。将0.5毫升的溶液1的等分试样装入到新的eppendorf试管中并用微离心机离心得到沉淀物。弃去上清液，将沉淀物重悬浮于0.5毫升MilliQ水中。将溶液1的沉淀物悬浮液的5微升等分试样以及5微升的CFE在还原条件下走15％SDS-PAGE凝胶。用直链淀粉柱时MBP结构进行提纯
给2.5cm×30cm HPLC柱(Amicon，Beverly，MA)配置蠕动泵(Pharmacia LKB Pump P-l，Piscataway，NJ)，UV检测器(Pharmacia LKBUvicord SII)，和图谱记录仪(Pharmacia LKB Recl)。当该设备被预热后(使用前30-60分钟)，向该柱内加入60-80毫升的直链淀粉树脂，并用4-5柱体积的MilliQ水过柱。该树脂用两柱体积的直链淀粉柱缓冲液平衡。
开动图谱启示仪并在其开始记录到稳定的底线时，用4号泵(×10)将CFE加入到其中。在250毫升锥形试管(Corning/VWR，Corning，NY)中收集100毫升的流过(FT)的液体的等份试样(在该柱达到饱和以后所收集到的各组份被放在另一个柱上走柱)。一旦全部的CFE都通过树脂后，就用直链淀粉柱缓冲液洗柱直至达到底线时为止。
一旦达到底线后，就用直链淀粉洗脱缓冲液对该柱走柱。在最初的3～5组份中有所述的结构被洗脱下来，在色谱上造成非常突起的峰。收集各组份直至再次达到底线时为止。
在还原条件下的15％SDS-PAGE凝胶上根据峰的大小不同而选取2-5微升各组份的等份试样(非常弱的峰需要更多的样品)走胶。同时还对每一个峰的两个组份以及FT组份进行走胶。对FT组份走胶为的是确定是否树脂已达到饱和。如果达到了饱和，就将其整体或一部份通过另外的第二个柱。如果用SDS-PAGE确定的蛋白质的纯度大于90％，则就将峰的各组份收集在一起并用MWCO25,000透析膜(Spectrum，Los Angeles，CA)在4℃对4升体积的1×PBS PH7.2进行透析。每一循环至少为4小时。如果有显著的杂质存在的话，就对透析过的蛋白质进行SDS-PAGE和Western Blot分析。
直链淀粉树脂在丧失其结合能力之前可以被反复使用五次。在保存柱的时候，是要将20％乙醇(Aaper Alcohol，Shelbyville，KY)对该柱走过2-3体积，然后保存在室温之下。
实施例4
固定在检测表面上的HIV1和HIV2的制备
将HIV1和HIV2抗原要连接在其上的多孔硝化纤维膜(Millipore704，10-20μm，SA3M214H2，nitrocellulose)切割成20mm的方块，并放置在试验台上的兰色隔离层上面。在每一方块前沿的底中部都作好标记以保证带有渍点的一面向上并且保证方向是准确的。用0.1N氢氧化钠将HIV1抗原稀释至8mg/ml，并且用0.2μm过滤的蒸馏水(FDW)将HIV2抗原稀释至4mg/ml。将等体积的HIV2溶液加到等体积的HIV1的溶液中并充分混合且不产生泡沫(HIV1/2 combo-antigen)。将蛋白质A(Repligen，RPA-100)以1mg/ml溶解于过滤的蒸馏水中作为对照。这些溶液要在使用的当天进行配置。
用0.5微升的HIV1/2蛋白质溶液在检测表面的底中部接点(靠近标记号)，并且将0.5微升的蛋白质A在顶中部接点。各接点在检测表面的中央部分被分开，没有互相重叠，并且在室温下干燥至少30分钟。将接点过的膜放在齿合封口塑料袋中保藏在4℃。
实施例5
预过滤的封闭程序
将多孔的硝化纤维预过滤膜(Millipore，HATF 08250，0.45μm，nitrocellulose)切成20mm方块，并浸泡在含有5％小牛血清(FBS，JRH#12-10378P)的PBS中20分钟。然后将所得到的每一个过滤膜都从封闭缓冲液中取出，浸泡在PBS中以清洗掉多余的FBS，随后转移到PBS-2％聚乙二醇(PEG；3000-3700MW)中。一旦把过滤膜从PBS-PEG中取出以后，就将它们放在滤纸上，在室温下干燥至少30分钟。将这些膜放到齿合封口塑料袋中于4℃保存。
实施例6
传递部分的组装方法
用切割成20mm见方的多孔扩散材料膜(Millipore704，10-20μm，SA3M214H2，nitrocellulose)来制备传递部分。将每一方块的膜放在由两层粘性材料组成的标签的向上的粘性层上，以完全覆盖住在标签上的1.5厘米的孔。在标签上部作出记号以区别于标签的下部。将实施例5的被封闭的检测表面的膜从塑料袋中取出(Millipore，HATF 08250，0.45μm，nitrocellulose；有时使用的是Millipore HAHY0000)。然后将每一块膜粘附到标签的没有进行标记的粘性底面的1.5厘米孔上。所述的膜都是被小心地粘附到标签的粘性表面以保证均匀地接触。仔细地将所有的标签都叠加起来(粘性面相对)以保证标签上的孔都对齐，然后将多余的标签部分去除。这样标签就起到了连接的作用，将扩散膜和预过滤膜放置成面对面的状态。将该组装好的传递部分储存在齿合封口塑料袋中于4℃保存。
实施例7
检测试剂药盒的组装方法
从Porex Technologies获取到具有长3.5厘米，宽2.1厘米，深0.7厘米腔体的塑料容器。在该腔体的底部有一个直径约为1.5厘米，高度约为0.3厘米的向上的圆形突起。一种吸收材料特别是棉花球，被压放在该腔体的底部并使该棉花球放到该底部表面的1/2英寸的地方，在该棉花球的上部放置实施例4的点涂过的膜，并在其上再放置一个预过滤膜(预过滤膜选自实施例6)。从Porex Technologies公司还获取到塑料盖，该塑料盖上有一个直径约为1.0厘米的开孔，并且紧挨该开孔形成小井，将该塑料盖放置在膜的上面以使该膜对该开孔居中，将该塑料盖下压并锁紧。这样膜就显现出稍微的向上突起，并在向下压时表现为很坚实的，这就证明组装已经正确地完成。也就是说检测固相的检测表面(实施例4的点涂过的膜)是与传递部分的传递表面均匀相接触。同样地，传递部分的扩散膜和预过滤膜都与实施例6的标签连接部分处于面对面的状态，并且是处于均匀地接触形式。
实施例8
用靛蓝标记的蛋白质A的制备方法
将靛蓝(Aldrich，22，929-6)放入到研钵中并用研杵研碎直至粉末很细很均匀为止(约15分钟)。将1.5克研磨过的靛蓝悬浮到500ml的Erlenmeyer烧瓶内的300毫升MilliQ水中，并将该溶液在65℃加热10分钟。将该溶液用声处理90分钟(Branson450，duty cycle70，output4)然后使其冷却至室温(约90分钟)。用0.1N盐酸将该溶液的pH值调至5.5。1mg/ml蛋白质A溶液(Repligen，RPA-100)在氘水中制备，将1.75毫升该溶液加到处于50毫升试管(Nalgene polypropylene-capped，需要8个试管)的35毫升靛蓝悬浮液中。所得溶液为50μg/ml。在室温下培育10分钟以后将该溶液放到SS34转子(Sorvall，RC-5)上以18000RPM离心50分钟。移去上清液，将沉淀物重悬浮于30ml的10mM Na2HPO4的含有0.5M氯化钠和1％BSA(PBSBSA)并且pH值为7.4的溶液中。将该溶液放在SS34转子(Sorvall，RC-5)以18000RPM离心25分钟，并将沉淀物重悬浮于含有10％甘油(PBSBSAG)的30毫升PBSBSA溶液中。将该溶液放在SS34转子(Sorvall，RC-5)以18000RPM再次离心25分钟，并将沉淀物重悬于30毫升PBSBSAG溶液中。用8μm过滤器(Whatman)过滤该溶液，历时约20分钟并且损失很小。然后用2μm过滤器(Whatman)过滤该溶液，历时约1小时并且损失约30％。将4微升PAI加入到750微升的氘水中，并用PBSBSAG将其光密度OD610调至0.0075。将1.5毫升的稀释的PAI等分装入小瓶(Sarstedt，72730-005)并保存在4℃。
实施例9
靛蓝标记的抗-IgM-IgG和抗-IgA-IgG的制备方法
将2克靛蓝(Aldrich，22，929-6)放入到研钵中并用研杵研碎直至粉末很细很均匀为止(约15分钟)。将1.5克研磨过的靛蓝悬浮到500ml的Erlenmeyer烧瓶的300毫升MilliQ水中，用锡纸盖住，并将该溶液在65℃加热10分钟，然后冷却至室温(约90分钟)。用0.1N盐酸将该溶液的pH值调至1.5。450μg/ml的抗体溶液的制备如下：将3.4mg/ml的12mlBethyl山羊抗-人IgA#A920-6(亲和纯化的)加入到2mg/ml的16ml Bethyl山羊抗-人IgM#M21-6(亲和纯化的)中，总体积为28ml，并且总量为78毫克。将18毫升该靛蓝悬浮液加入到8个40毫升的试管中(Sorvall，03530)，再将3.5ml的Ab combo加入到每一试管中得到500μg/ml的溶液。室温下培养该溶液30分钟，将该溶液以18000RPM离心(SS34转子Sorvall，RC-5)50分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬浮于含0.5M氯化钠(Sigma)和1％BSA(Miles，Pentax，Fract V，81003-40[PBSBSA])的pH7.4的18ml的10mM Na2HPO4(Sigma)中。将该溶液以18000RPM离心(SS34转子Sorvall，RC-5)25分钟，并且关闭制动。沉淀物重悬浮于含10％甘油(Amresco，0845)(PBSBSAG)的18毫升PBSBSA中。将该溶液以18000RPM再次离心(SS34转子Sorvall，RC-5)25分钟且关闭制动，并将沉淀物再次悬浮于18ml的PBSBSAG中。对该溶液进行过滤，依次使用8μm过滤器(S&S固定化膜，#AE99)、5μm过滤器(MSI，magna尼龙转移膜)，和2μm过滤器(Millipore，Immobilion AV-2，SA3J898E8)。在610nm检测该溶液的光密度值，将8微升Ab-I加入到1.5毫升PBSBSAG中，并用PBSBSAG将其光密度值调至0.03。例如，如果8微升的光密度值是0.12，则用PBSBSAG将PAI按1∶4稀释。在最终浓度的溶液中加入NaN3并将该溶液保存在4℃。
实施例10
检测试剂的制备
将15.6毫升的IMA(实施例9所制备的溶液)与109.4毫升的IPA(实施例8的溶液)相混合。向该溶液内加入含有40μg/ml NaN3的375毫升PBSBSAG。溶液的总体积为500毫升，并且其光密度OD610＝0.015。向该溶液内加入含有40μg/ml NaN3的500毫升PBSBSAG，其最终溶液的光密度值OD610＝0.0075。
实施例11
蛋白质A、抗-IgA、抗-IgM-色素检测剂的制备方法
将100mg色素，即17份红#235-7515，23份紫#246-1670或7份绿#264-3120(Sun Chemical，4526 Chickering Avenue，Cincinnati，OH45232)加入到50毫升的锥形试管(Sarstedt)中。向含有色素的试管加入下述成分中的一种：1)1mg/ml蛋白质A(RAP-100，Repligen)的蒸馏水溶液20毫升；2)6毫升山羊抗-人IgA(A80-102A，Lot A92G，3.4mg/ml，Bethyl Labs，Montgomery，TX)；或3)8毫升山羊抗-人IgM(A80-100A，Lot M121G，2.0mg/ml Bethyl Labs)。每一个试管中的物质都是通过来回颠倒而使之悬浮(约30分钟)，但要小心的是不要产生很多的泡沫。含有凝块的悬浮液是没有被充分悬浮的，而清澈的液体是没有吸收色素的。向每一个试管中加入PBSBSAG(10mM Na2HPO4，0.5M氯化钠，1％BSA：#81003-40，Miles，Pentax，10％Glycerol：#0854-1，Amresco)使其最终体积达到45毫升，将每一试管中的物质都反复颠倒而使其悬浮，并用不锈钢搅棒将成块的物质打碎，但要小心不可产生过多的泡沫(约15分钟)。将已经开始吸收色素但仍有凝块并且没有被充分悬浮的悬浮液在室温下培养45分钟，再以18000RPM离心25分钟，离心时关闭制动(Sorvall，RC-5离心机，SS34转子，使用50毫升离心管，Sorvall，#03530)。弃去上清液，沉淀物重悬浮于100毫升PBSBSAG。先用8μm过滤器(S&S，AE99)，再用2μm的过滤器(Millipore，Immobilion AV-2，SA31898E8)对该悬浮液进行过滤，再向该溶液加入NaN3并使最终浓度为20μg/ml。
实施例12
检测
将120微升血清样品直接加到本发明的检测试剂盒的传递部分的中心，经过了10～15秒后将传递部分移出并弃去。将实施例10所得的检测试剂1.5ml(0.015 OD单位)加入到小井中并允许其流通过膜(约10秒钟)。记录其结果。
实施例13
使用检测试剂盒的阳性、阴性和错误结果的比较
阳性和阴性HIV血清样品各120微升被分别加到本发明的检测试剂药盒的传递部分的中心。经过大约10～15秒后将各自的预过滤膜移去。将1.5ml本发明实施例10的检测制剂加到免疫药盒的小井中并以约10秒的时间使其通过该检测膜。图2c显示的是加入了检测试剂之后阳性血清样品对检测表面所造成的结果。图2b表示的是加入了检测试剂之后阴性血清样品对检测表面所造成的结果。作为对照实例(错误)，即将按照本发明实施例10所制备的检测试剂盒的预过滤部分移去之后，用阴性血清样品均匀地湿润其检测表面的结果。也就是说，检测表面与血清的接触程度超过其它部分。随后，将本发明实施例10所制备的检测制剂1.5ml加入到该检测膜上并使其通过该膜。这一结果见于图2a。用肉眼可以观察到在该检测表面上的标记物的不均匀分布。这就表明血清加在该检测膜的表面上是不均匀的。
在此以前所给出的各实施例，都是用来说明本发明的，并不对本发明的范围给予任何限制。本技术领域的普通技术人员可以在不脱离本发明的实质和精神及范围之内寻找到其它的实施例和变型。
Claims (25)
1. 一种将样品传递到检测表面的传递部件，包括：
预过滤器，该预过滤器具有接收样品的表面和将样品传递到检测表
面的表面；和
在预过滤器的样品接收表面上有扩散材料。
2. 根据权利要求1所述的传递部件，其中所述的扩散材料包括表面活
性剂。
3. 根据权利要求1所述的传递部件，其中所述的扩散材料包括多孔隋
性、疏水性基质。
4. 根据权利要求3所述的传递部件，其中所述的扩散材料是以化学方
式连接到预过滤器上的。
5. 根据权利要求3所述的传递部件，其中所述的扩散材料是以物理方
式连接到预过滤器上的。
6. 根据权利要求3所述的传递部件，其中所述的扩散材料包括扩散
膜，该扩散膜的孔径和厚度选择为能够使流体样品迅速平面扩散到
预过滤器的接收表面，并且所述的预过滤器包括基本为平面的膜，
该膜的多孔性和厚度选择为在对以预定尺寸大的样品中的颗粒物
质进行过滤的同时能够迅速地将样品从接收表面转移到传递表
面。
7. 根据权利要求3所述的传递部件，其中所述的扩散材料包括扩散
膜，该扩散膜具有边缘，并且所述的传递部件进一步包括连接到预
过滤器边缘和扩散膜边缘上，并能够将扩散膜与预过滤器的样品接
收表面面对面相置的连接器。
8. 根据权利要求7所述的传递部件，其中所述的扩散膜的孔径比预过
滤器的孔径大。
9. 根据权利要求3所述的传递部件，其中所述的预过滤器包括孔径为
约0.1～约1.0微米的基本上为平面的膜。
10. 根据权利要求3所述的传递部件，其中所述的预过滤器的厚度为约
50～约300微米。
11. 根据权利要求1所述的传递部件，其中所述的预过滤器包括基本上
为平面的纤维素膜。
12. 根据权利要求1所述的传递部件，其中所述的样品传递表面是与检
测表面相吻合的。
13. 一种用于确定被分析物的检测药盒，包括一种包装，该包装含有：
用于支持检测反应的检测表面；和
孔径为约0.1～约1.0微米，并且具有与检测表面处于面对面位置
的传递表面的多孔纤维素预过滤器。
14. 一种检测固相，具有检测表面，该检测表面包括带有能使样品首先
以第一程度加在该区域上，从而发生第一程度的标记试剂的非特异
性结合的化学功能团的区域，并能在将样品以不同于第一程度的第
二程度加到该区域时，能够产生与第一程度相区别的第二程度的标
记检测试剂的非特异性结合。
15. 根据权利要求14所述的检测固相，其中所述的检测表面包括载有
固定化的被检测物的结合配体的第二区域。
16. 一种用于确定被分析物的检测方法，包括：
在具有能够发生非特异性结合的区域的检测表面上加入含有仅能
部分封闭该区域的数量的封闭剂的样品；
用包括载有标记物的物质的检测试剂与该区域相接触；和
通过确定标记物在该区域上的均匀或非均匀的分布来确定样品加
到检测表面时的均匀性。
17. 根据权利要求16所述的检测方法，其中所述的能够发生非特异性
结合的区域上不结合有任何被固定化的生物制剂。
18. 一种将流体样品传递到检测表面的传递方法，包括：
将预过滤器的传递表面与检测表面吻合接触；
在预过滤器的接收表面上形成样品液体膜；和
使所述的样品液体膜渗透过预过滤器并将检测表面均匀地润湿。
19. 一种将样品传递表检测表面的传递部件，包括：
具有样品接收表面和将样品传递到检测表面的传递表面的预过滤
器，所述的预过滤器的构造和安排是能够将流体样品迅速平面扩散
到接收表面，并且能够使样品渗透过预过滤器从而将样品由传递表
面传递到检测表面。
20. 一种采用了传递样品的预过滤器的检测试剂药盒，其该进之处包
括：
孔径为约0.1～约1.0微米的预过滤器。
21. 根据权利要求20所述的检测试剂药盒，其中所述的改进之处包括
孔径为约0.2～约0.7微米的预过滤器。
22. 根据权利要求21所述的检测试剂药盒，其中所述的改进之处包括
孔径为约0.33～约0.53微米的预过滤器。
23. 根据权利要求22所述的检测试剂药盒，其中所述的改进之处包括
孔径为约0.45微米的预过滤器。
24. 一种采用了传递样品的预过滤器的检测试剂药盒，其该进之处包
括：
包括一对面对面相置的膜的预过滤器。
25. 一种采用了传递样品的预过滤器的检测试剂药盒，其该进之处包
括：
具有样品接收表面的预过滤器，且其构造和安排是能够使流体样品
被迅速平面扩散到接收表面上从而使样品渗透过预过滤器而被传
递到检测表面。
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