CN113995766B - 地高辛在制备治疗和/或预防骨关节炎的药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了地高辛在制备治疗和/或预防巨噬细胞M1型极化相关疾病的药物中的用途。本发明通过实验证明了地高辛在抑制滑膜巨噬细胞M1型极化的同时，促使巨噬细胞产生特定的外泌体，可有效延缓骨关节炎软骨损伤和滑膜炎。本发明给出了地高辛用于治疗骨关节炎的治疗机制，为临床治疗骨关节炎提供新思路。

Description

地高辛在制备治疗和/或预防骨关节炎的药物中的用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及地高辛在制备治疗和/或预防巨噬细胞M1型极化相关疾病的药物中的用途。
背景技术
骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是50岁以上人群中高发的关节疾病，常累及膝、髋等关节。预计到2030年，其患病率将高达40％以上，OA将成为致残的最大病因。软骨损伤是OA的主要病变，关键诱因为滑膜巨噬细胞M1型极化增多。健康滑膜组织中，存在于滑膜衬里层的巨噬细胞的主要作用是维持关节体内平衡，OA病理状态下，巨噬细胞通过经典途径活化为M1型，即促炎型巨噬细胞。本研究团队前期发表的研究成果(Haiyan Zhang,C.L.,ChunZeng,Zhenyu Wang,Hua Wang,Jiansen Lu,Xin Liu,Yan Shao,Chang Zhao,Jia nyingPan,Song Xu,Yue Zhang,Denghui Xie,Daozhang Cai,Xiaochun Bai,Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partiallythrough R-spondin-2.Ann Rheum Dis.2018,77(10),1524-1534.)表明：OA滑膜组织中存在大量M1型巨噬细胞的积累，通过分泌炎性细胞因子等促炎信号，引起软骨和基质的降解。因此，抑制滑膜巨噬细胞M1型极化，在控制炎症应答的同时提供一个促软骨生成的微环境，是有效治疗OA的关键所在。
目前临床上OA的治疗主要以疼痛缓解和晚期关节置换为主。这些治疗除了给患者和医疗系统造成巨大的经济负担外，并不能达到病人期望的治疗效果，因为这些治疗既不能控制软骨细胞的炎症应答，也不能促进软骨的再生。因此，临床上迫切需要有效的OA治疗药物(disease-modifying osteoarthritis drugs，DMOADs)。迄今为止，未见关于DIG治疗OA的研究报道。
发明内容
为了解决现有技术中不足，本发明的目的是提供地高辛在制备治疗和/或预防巨噬细胞M1型极化相关疾病的药物中的用途。地高辛(Digotin，DIG)最早于1930年从植物Digitalis lanata中分离而来，属强心苷类化合物。
本发明第一方面提供地高辛在制备治疗和/或预防巨噬细胞M1型极化相关疾病的药物中的用途。
本发明第二方面提供一种治疗和/或预防巨噬细胞M1型极化相关疾病的药物组合物，所述药物组合物的活性成分包括地高辛。
本发明第三方面提供地高辛在制备治疗和/或预防骨关节炎的药物中的用途。
本发明第四方面提供一种治疗和/或预防骨关节炎的药物组合物，所述药物组合物的活性成分包括地高辛。
本发明第五方面提供地高辛在制备治疗和/或预防滑膜炎的药物中的用途；
优选地，所述滑膜炎为骨关节炎滑膜炎。
本发明第六方面提供一种治疗和/或预防滑膜炎的药物组合物，所述药物组合物的活性成分包括地高辛；
优选地，所述滑膜炎为骨关节炎滑膜炎。
本发明第七方面提供地高辛在制备抑制巨噬细胞的M1型极化的药物或制剂中的用途。
优选地，所述巨噬细胞为滑膜巨噬细胞。
本发明第八方面提供一种抑制巨噬细胞的M1型极化的药物组合物或制剂，所述药物组合物或制剂的活性成分包括地高辛。
优选地，所述巨噬细胞为滑膜巨噬细胞。
本发明的有益效果为：
本发明实验证明地高辛在抑制滑膜巨噬细胞M1型极化的同时，促使巨噬细胞产生特定的外泌体，可有效延缓骨关节炎软骨损伤和滑膜炎，这是DIG的一种新功能，也是滑膜巨噬细胞来源的外泌体调控软骨功能的直接证据。本发明给出了地高辛用于治疗滑膜炎相关的骨关节炎的治疗机制，为临床治疗骨关节炎提供新思路。
附图说明
图1为DIG可抑制巨噬细胞M1型极化的实验结果。A，MTT实验检测DIG对巨噬细胞活力的影响。B-C，LPS处理的RAW 264.7细胞(诱导巨噬细胞向M1型极化)中iNOS(M1型巨噬细胞Marker)mRNA和蛋白水平的表达。D-E，免疫荧光染色结果。
图2为DIG可减弱OA滑膜炎症，延缓关节软骨损伤的实验结果。A，HE染色结果。B，番红O-快速绿染色结果。L：0.02mg/kg，H：0.2mg/kg。
图3为DIG促进巨噬细胞产生的特异性外泌体的分离鉴定。A，TEM观察外泌体的典型形状。B，NTA检测外泌体的大小峰值均在120nm左右。C，Western blot检测外泌体的标志物(CD9和TSG 101)。D，免疫荧光实验观察外泌体进入原代软骨细胞的过程。E，Westernblot检测Col2A1(2型胶原，软骨细胞marker)的表达水平。
图4为体内实验验证DIG促进巨噬细胞产生的特异性外泌体可延缓OA软骨损伤及疾病进程。A，番红O-快速绿及甲苯胺蓝染色(TBS)。B，OARSI评分(软骨损伤程度的分级评分，可分为0-6级，6级为软骨损伤程度最高)。C-D，免疫组织化学检测MMP13的表达及相应的统计学分析。E-F，免疫荧光染色检测Col2A1的表达及相应的统计学分析。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
实施例1：DIG抑制滑膜巨噬细胞的M1型极化，延缓关节软骨损伤
1、MTT实验检测DIG对小鼠巨噬细胞RAW 264.7活力的影响，筛选用于细胞炎症抑制的浓度。
具体操作为：用3×浓度的巨噬细胞铺96孔板，分别加入不同浓度的DIG药物(20μM、40μM、60μM、80μM)，处理24小时后每孔加入10μl MTT溶液，37℃孵育2-4小时，随后每孔加入200μl DMSO。室温条件下摇床上低速震荡10分钟，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪OD 490nm处测量个孔的吸光值。
存活细胞％＝(OD实验/OD对照)x 100％
MTT实验检测DIG对小鼠巨噬细胞RAW 264.7活力的影响，结果如图1A，用于细胞炎症抑制的浓度为60μM。
2、Real-time PCR和Western blot实验分别检测DIG在mRNA和蛋白水平上抑制LPS(1μg/ml，脂多糖，诱导巨噬细胞向M1型极化)处理的RAW 264.7细胞(M1型巨噬细胞)中iNOS(M1型巨噬细胞Marker)的表达。
具体操作为：
Real-time PCR：采用TRizol试剂(TianGen biotech)收集细胞，提取总RNA，按照逆转录试剂盒(RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit，Thermo Scientific)说明书将mRNA转录为cDNA，以cDNA为模板扩增iNOS(PowerUp SYBR Green Master Mix，ThermoScientific)。Actin为内参基因。(引物序列见表1)
Westernblot：实验方法为本领域常规方法和常规条件。
表1所用基因引物序列
Real-time PCR和Westernblot的结果分别如图1B、C，结果表明DIG在mRNA和蛋白水平上抑制LPS处理的RAW 264.7细胞中iNOS的表达。
3、胶原酶诱发的实验性小鼠OA模型(CIOA)中，关节腔注射DIG(低剂量组(L)：0.02mg/kg，高剂量组(H)：0.2mg/kg)，每周两次，分别于造模后7天和28天收集小鼠膝关节组织，进行免疫荧光染色、HE染色和番红O-快速绿染色。
免疫荧光染色结果如图1D、E，结果表明DIG可减少CIOA小鼠滑膜衬里层巨噬细胞(F4/80+)中iNOS阳性细胞比例。HE染色结果表明DIG可减弱滑膜炎症(图2A)，番红O-快速绿染色证明DIG可延缓OA关节软骨损伤(图2B)
实施例2：M1型巨噬细胞在DIG处理前后产生的外泌体的分离纯化及功能鉴定
1、培养RAW 264.7细胞，分别设空白组、LPS处理组(1μg/ml)、LPS(1μg/ml)+DIG(60μM)处理组，超速离心法分离培养细胞上清中的外泌体(Exos)。NTA检测所得外泌体粒径大小，透射电镜检测形状，Westernblot检测外泌体Marker(CD9，TSG 101)。
M1型巨噬细胞在DIG处理前后产生的外泌体，透射电镜检测形状(图3A)，NTA检测所得外泌体粒径大小(图3B)，Western blot检测外泌体Marker(图3C)。
2、分离小鼠原代软骨细胞，PKH67染色标记巨噬细胞来源的外泌体，并与原代软骨细胞共孵育，观察其进入细胞的过程。
分离小鼠原代软骨细胞：选取出生1～7天内的小鼠，断颈处死后用75％酒精消毒1～3分钟，将其移至解剖显微镜上，用眼科镊子与眼科剪刀将小鼠的肋骨分离开，并剔除上面的膜性组织。加入II型胶原酶，放入摇床内摇2～4个小时，之后1000rpm离心5分钟，用移液枪将软骨细胞吹打重悬，移入六孔板中培养备用。PKH67染色标记巨噬细胞来源的外泌体，并与原代软骨细胞共孵育，共聚焦荧光显微镜观察其进入细胞的过程。
免疫荧光实验观察外泌体进入原代软骨细胞的过程，结果如图3D，表明巨噬细胞来源的外泌体可有效进入软骨细胞。
3、体内、体外实验验证DIG促进巨噬细胞产生的特异性外泌体对OA软骨损伤及疾病进程的影响。
具体操作为：
细胞水平：分离培养小鼠原代软骨细胞，实验设空白对照组、M1型巨噬细胞来源的外泌体共培养组以及DIG作用的M1型巨噬细胞来源的外泌体共培养组，Western blot检测软骨细胞中Col2a1的表达水平，评价DIG作用的M1型巨噬细胞来源的外泌体是否可调控软骨OA相关基因的表达。
动物水平：CIOA小鼠造模后3天开始同一关节腔注射DIG作用的M1型巨噬细胞来源的外泌体(1.0×1012/ml)10μL，每周注射两次。实验分假手术组、CIOA组、CIOA+M1型巨噬细胞来源的外泌体组及CIOA+DIG作用的M1型巨噬细胞来源的外泌体组。于注射后28天分离实验小鼠膝关节组织样本，经石蜡包埋、切片后进行番红O-快速绿及甲苯胺蓝染色(TBS)观察关节软骨及基质的组织学改变并进行评分，同时，免疫组化染色和免疫荧光染色检测软骨Col2a1、MMP13的水平。
结果如图3E和图4，结果表明DIG作用的M1型巨噬细胞来源的外泌体可延缓OA疾病进程及软骨损伤。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (4)

1.地高辛作为唯一活性物质在制备治疗和/或预防骨关节炎的药物中的用途。
2.地高辛作为唯一活性物质在制备治疗和/或预防骨关节炎滑膜炎的药物中的用途。
3.地高辛作为唯一活性物质在制备抑制骨关节炎所致的巨噬细胞的M1型极化的药物中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述巨噬细胞为滑膜巨噬细胞。
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