CN113984814A - 一种使用MicroED技术测定手性样品结构和绝对构型的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种使用MicroED技术测定手性样品结构和绝对构型的方法，包括：将等摩尔量的待测定手性样品与已知手性的手性酸/碱混合，经处理使手性样品和手性酸/碱溶解形成盐溶液，过滤并干燥盐溶液中自然析出或经干预析出的晶体得到手性样品和手性酸/碱的手性盐晶体；利用MicroED技术，获取手性盐晶体的衍射图谱，根据衍射图谱和手性酸/碱的已知手性解析手性样品的结构和绝对构型。该测定方法原理简单明确，无需推测过程，即可准确鉴定手性样品的绝对构型；降低了对样品使用量、样品晶体尺寸、样品纯度的要求；降低了MicroED技术检测样品绝对构型的成本，无需借助冷冻电镜之外的装置即可鉴定样品的绝对构型。

Description

一种使用MicroED技术测定手性样品结构和绝对构型的方法
技术领域
本发明涉及化合物结构和绝对构型测定技术领域，具体涉及一种使用MicroED技术测定手性样品结构和绝对构型的方法。
背景技术
手性化合物是化学结构镜像对称，但不能完全重合的一对化合物分子，手性化合物的研究在农药、医药、分析科学以及其他应用实践领域中具有重要的意义。其中，正确地确定一个手性化合物的结构和绝对构型，是有机化学工作者尤其是药物研究工作者不可或缺的工作，现有手性化合物结构测定方案主要包括核磁共振Mosher法、旋光色散光谱法(ORD)、圆二色散光谱法、X射线衍射法等。
核磁共振Mosher法是采用手性Mosher试剂与待测手性样品中的羟基或氨基生成衍生物，根据1H-NMR谱中化学位移的差值和模型图来推测手性样品的绝对构型。该方法要求对样品的特定基团进行化学反应，因此限制了可测样品的范围且对样品量要求毫克级以上，并且要求样品纯度大于95％。旋光色散光谱法(ORD)是通过测定手性样品在紫外及可见光(200-700nm)内的旋光，使用八区律对分子特定基团手性进行判断。该方法需求样品量在毫克级，需要样品纯度高于95％，而且只能应用于在可见或紫外区存在吸收的手性分子，且结构一般为环形结构；而且该方法为经验性方法，存在一定概率的误差。圆二色散光谱法是以不同波长的平面偏振光的波长为横坐标，以光学活性物质对左圆和右圆偏振光的吸收系数之差为纵坐标，得到圆二色光谱，如果某手性化合物在紫外可见区域有吸收，就可以得到具有特征的圆二色光谱。该方法缺点与ORD类似同样对样品本身有要求、经验性判断以及要求样品纯度大于95％。X射线衍射法是通过X射线照射晶体之后所形成的衍射图样与晶体中原子的空间排列计算出样品的结果。目前X射线晶体学已经成为结构模型确定的黄金标准，但当使用普通衍射仪时，它需要获得足够的尺寸(大于一百微米)且形状规则的晶体。这通常是这种方法中最困难的部分，因为许多分子无法形成这样的晶体，而且即使是形成了满足条件的晶体，要找到合适的条件往往需要反复试验，筛选大量的条件。
可以看出，目前已经手性化合物结构的测定方法所需样品量需要在毫克级别以上，样品纯度要求较高、而且一些结构测定的方法经为验性方法，存在一定概率的误差。使用较多的能够精准解析手性化合物结构的X射线衍射方法需要样品形成尺寸较大的晶体，这对于样品制备要求非常高。
微晶电子衍射(MicroED)是一种新兴的小分子结构解析技术。它是通过冷冻电镜获得小分子微晶的衍射图谱，从而解析小分子的高分辨结构(一般好于1.0埃)。而MicroED技术可直接利用这些纳米级微晶来鉴定结构，完美的跳过了X射线衍射技术的痛点。很多小分子化合物在生产的过程中会自发形成微晶，通过MicroED技术可直接得到其结构。MicroED技术在药物晶型鉴定、天然产物结构鉴定等过程中的杂质鉴定等领域有着巨大的应用前景。
MicroED技术应用于解析手性化合物结构已经有所报道，主要是通过直接法进行手性化合物结构测定，用直接法检测化合物的绝对构型时需要在冷冻电镜设备的基础上添加旋进式衍射仪或/和双倾斜样品杆两个仪器，才能够正确解析出手性化合物的绝对构型，这无疑增加了解析化合物结构的成本，而且此种方法对化合物晶体的衍射能力要求非常高。MicroED较之于传统解析化合物结构的方法来说，无需样品形成大尺寸的单晶，只需要纳米级(200纳米左右)的微晶就可以测试。因此可以利用化合物酸碱成盐的特点，通过筛选多种不同的已知绝对构型的手性酸/碱化合物，使其与绝对构型未知的目的手性化合物进行成盐反应，形成目的手性化合物与已知绝对构型的手性酸/碱的手性盐分子。使用MicroED技术解析手性盐分子的晶体结构，然后通过已知手性酸/碱的已知绝对构型来指认目的手性化合物分子的绝对构型。该方法可以降低MicroED解析手性化合物绝对构型的成本，目前使用该方法解析手性化合物的绝对构型的应用还未报道。因此，本发明提供了一种使用MicroED技术利用手性化合物成盐的方式解析未知手性化合物绝对构型的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种使用MicroED技术测定手性样品结构和绝对构型的方法，此方法无需额外的旋进式衍射仪和双倾杆等装置，降低了设备所需的成本，且此方法对样品微晶的衍射能力无特别要求，增加了适用范围。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
一种使用MicroED技术测定手性样品结构和绝对构型的方法，步骤包括：
步骤一、将等摩尔量的待测定手性样品与已知绝对构型的手性酸/碱混合，经处理使手性样品溶解，形成盐溶液，通过自然析出或经干预析出晶体的方式得到待测定手性样品和已知手性酸/碱的手性盐晶体。
步骤二、利用MicroED技术，获取手性盐晶体的衍射图谱，根据衍射图谱和手性酸/碱的已知绝对构型解析手性样品的结构和绝对构型。
进一步改进在于，所述手性样品为纯手性样品。
进一步改进在于，所述已知绝对构型的手性酸/碱为纯手性样品，且该已知绝对构型的手性酸/碱是通过手性样品在不同溶剂中溶解度试验筛选出的能成盐的手性酸/碱。
进一步改进在于，所述已知绝对构型的手性酸/碱中用于与手性样品碱成盐的手性酸分子包括D-酒石酸、L-酒石酸、D-二苯甲酰酒石酸、L-二苯甲酰酒石酸、R-扁桃酸、S-扁桃酸、R-O-乙酰扁桃酸、S-O-乙酰扁桃酸、D-樟脑磺酸、L-樟脑磺酸、D-苹果酸、L-苹果酸、N-乙酰-L-谷氨酸、N-乙酰-D-谷氨酸、S-2-(2，5-二硝基苯甲酰胺)-2-苯乙酸、R-2-(2，5-二硝基苯甲酰胺)-2-苯乙酸中的一种或多种，用于与手性样品酸成盐的手性碱分子包括L-赖氨酸、D-赖氨酸、(R)-(+)-1-苯基乙胺、(S)-(-)-1-苯基乙胺、(+)-鹰爪豆碱、(-)-鹰爪豆碱中的一种或多种。
进一步改进在于，步骤一中所述处理具体为搅拌、超声和/或加热。
进一步改进在于，步骤一中所述干预析出具体为蒸发结晶、冷却结晶和/或溶析结晶；
其中，所述蒸发结晶指的是通过自然蒸发或旋转蒸发仪减压浓缩以析出晶体，所述冷却结晶指的是将盐溶液降温至0℃或以下来析出晶体，所述溶析结晶指的是向盐溶液中滴加适量的良溶剂/不良溶剂使其析出晶体。
进一步改进在于，所述良溶剂/不良溶剂包括水、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、异丙醇、丙醇、正己烷、正戊烷、乙醚、异丙醚、甲基叔丁基醚、乙二醇二甲醚、1，4-二氧六环、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷中的一种或多种。
进一步改进在于，在进行步骤二前，通过研磨方式或加入有机溶剂形成悬浊液后超声的方式对手性盐晶体进行处理，该有机溶剂包括正己烷、乙醚等、超声的参数调节包括超声时间、体积等。
进一步改进在于，步骤二的具体操作包括：冷冻电镜检测手性盐晶体的衍射，收集手性盐晶体的电子衍射数据，衍射数据处理和晶体结构解析，根据已知手性酸/碱指认手性样品的绝对构型。
进一步改进在于，在数据收集过程中，通过调整数据收集的电子计量参数提高有效照片数量、提高衍射分辨率，所述电子计量参数包括Gun lens、Spotsize、曝光时间、样品台转速。
本发明的有益效果在于：
(1)该测定方法原理简单明确，无需推测过程，即可准确鉴定手性样品的绝对构型；该方法降低了对样品使用量的要求，只需微克至毫克级别样品即可完成手性鉴定；降低了对样品晶体尺寸的要求，无需培养大尺寸单晶即可准确鉴定样品的绝对构型；该方法降低了样品纯度的要求，只要有手性盐微晶形成即可，样品中的杂质不影响结构和绝对构型的鉴定；降低了MicroED技术检测样品绝对构型的成本，无需借助冷冻电镜之外的装置即可鉴定样品的绝对构型。
(2)该测定方法可广泛使用于医药产业，用于活性未知天然产物结构和手性确认、新药开发前期活性先导物结构构型确认、活性药物分子手性确定、药物杂质分子结构确认等，能够加速新药研发和药物生产的推进，亦可用于化妆品行业/日化行业等任何需要进行小分子结构确认的领域。
附图说明
图1为本发明整体的方法流程图；
图2为本发明中手性化合物成盐的操作流程图；
图3为本发明中MicroED确定手性化合物绝对构型的操作流程图；
图4为实施例1中样品经MicroED解析的结构图；
图5为实施例2中样品经超声处理后在电镜下的分布示意图；
图6为实施例2中样品经MicroED解析的结构图；
图7为实施例3中样品经MicroED解析的结构图；
图8为实施例4中样品经MicroED解析的结构图；
图9为实施例5中样品经MicroED解析的结构图。
图10为实施例6中样品经MicroED解析的结构图。
图11为实施例7中样品经MicroED解析的结构图。
图12为实施例8中样品经MicroED解析的结构图。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
如图1所示，一种使用MicroED技术测定手性样品结构和绝对构型的方法，步骤包括：
步骤一、手性化合物成盐：将等摩尔量的待测定手性样品与已知绝对构型的手性酸/碱混合，经处理使手性样品溶解，形成盐溶液，通过自然析出或经干预析出晶体的方式得到待测定手性样品和已知手性酸/碱的手性盐晶体。
步骤二、MicroED确定手性化合物绝对构型：利用MicroED技术，获取手性盐晶体的衍射图谱，根据衍射图谱和手性酸/碱的已知绝对构型解析手性样品的结构和绝对构型。
其中，针对手性化合物成盐的步骤：如图2所示，本发明所用到的成盐方法主要是通过手性样品在不同溶剂中溶解度测试结果，筛选出的能与之成盐的已知绝对构型的手性酸/碱，再将待测手性样品与等摩尔量能成盐的对应的纯手性酸/碱的溶液混合，通过搅拌/超声/加热等方式使其溶解成盐，成盐反应完成后将析出晶体进行MicroED检测。如果在成盐反应完成后未析出或析出的晶体量过少的情况下，可以尝试选择蒸发结晶、冷却结晶和溶析结晶三种方法来获得晶体。蒸发结晶是通过自然蒸发或旋转蒸发仪减压浓缩以析出晶体；冷却结晶是通过各种手段把溶液降温至0℃或以下来析出晶体；溶析结晶是向手性盐溶液中滴加适量的不良溶剂使其析出晶体。
其中，针对MicroED确定手性化合物绝对构型的步骤，如图3所示：
(1)手性盐晶体的衍射测试
将粘有手性盐样品微晶的载网放在样品杆上，然后将之缓慢插入电镜并添加液氮，等待电镜真空系统及样品杆稳定后，打开电镜光源观察样品分布情况，当样品在载网上分布均匀且形态大小合适时，进行下一步试验。首先打开电镜数据采集软件EPU-D，在220倍左右的放大倍数下拍摄整个载网的大地图，获得晶体在载网上的分布情况，然后可根据大地图上样品的分布情况选择合适的位置拍摄中地图(即在940倍左右的放大倍数下拍摄载网上样品的照片)，从大地图/中地图上挑选具有合适大小的(200纳米左右)、且具有一定规则形状的颗粒进行衍射测试，观察此颗粒的衍射情况。随机从载网上选择多个颗粒(不低于30个)进行测试，使得测试结果具有统计学的意义。如果检测到衍射较好的晶体，则进行下一步电子衍射数据收集。
(2)电子衍射数据的收集和处理
对步骤(1)中检测到的衍射较好的晶体进行衍射数据收集。在4300左右的放大倍数下将目标晶体移动到视野中间，然后反复调整晶体的Zhight，直至目标晶体在样品杆从负60度到正60度的转动过程中基本不发生位移。然后将电镜调整到衍射模式，使用EPU-D软件，采集目标晶体匀速且连续转动时的衍射图片。从载网上挑选出多颗晶体(不低于10颗)进行电子衍射数据收集，使收集的数据更具有代表性。使用晶体学软件(如XDS等)对收集到的每套数据分别进行处理，可以得到每颗晶体的晶胞参数和包括分辨率在内的可反应晶体数据质量的统计参数。然后从收集的多套衍射数据中挑选出较好的一套或几套进行合并，采用合并之后的hkl文件进行结构解析。
(3)晶体结构解析和绝对构型确认
使用晶体学软件(如shelx)对处理之后的数据进行结构解析。一般采用直接法、dual space等方法进行相位解析，得到初步的结构之后可根据电子密度及样品的已知信息(如元素组成，原子连接情况等)，采用最小二乘法对结构进行修正。修正完成后，可以看到手性盐的晶体结构中含有已知绝对构型的手性酸/碱结构，通过invert structure将手性酸/碱的绝对构型调整到与已知绝对构型一致，此时手性盐结构中目的样品的绝对构型即为其真实的绝对构型。
本发明主要提供一种可以利用手性酸碱化合物成盐的特点，将待测手性样品与已知绝对构型的手性酸/碱在一定的溶液下成盐，然后得到手性盐晶体。使用MicroED解析出手性盐晶体的结构，通过手性酸/碱的的已知绝对构型指认出待测手性样品的绝对构型。
本发明所检测的手性样品均为市购且已经确定绝对构型的样品，通过本发明方法的鉴定结果和已知的绝对构型进行对比，来验证本发明方法的准确性。
下面结合具体实施例对本发明测定化合物绝对构型的方法进行说明：
实施例一：本实施例所用的手性盐为1，其中待测的手性样品为1-1，已知绝对构型的手性酸/碱为1-2。
(1)手性盐晶体的获得方法
待测的手性样品与已知绝对构型的手性酸/碱的成盐方法如下：取32.8mg化合物1-1溶于2ml乙腈:0.2ml水(乙腈:水＝10:1)溶液中，加入27.6mg手性酸1-2，加热至80℃，形成澄清溶液后停止加热，冷却，析出大量固体，成盐方程式如下：
Figure BDA0003320758310000101
(2)数据收集及结构解析
该固体为颗粒粉末，在进行MicroED检测前对样品进行研磨处理。具体处理方式为：选用两个盖玻片，将样品放在两个盖玻片之间轻轻研磨，将大块儿的样品颗粒研磨成细碎颗粒。按照上述晶体衍射测试的方法，用载网蘸取样品，然后轻轻抖动载网去除结合不牢固的样品颗粒。将粘有样品载网放在样品杆中，缓慢插入电镜中并加入液氮。待电镜真空系统及样品杆稳定后，打开电镜光源观察样品分布情况，样品在Grid上的分布均匀且形态大小不同。测试不同大小和形态的晶体颗粒约30颗，其中大多数晶体有较好的衍射，分辨率约
Figure BDA0003320758310000102
然后按照上述电子衍射数据收集和处理的方法，样品台以每秒1度的转速进行数据收集。最终收集并处理了8套衍射数据，选择其中最好的3套进行合并得到最终的衍射数据，并通过dual space法和最小二乘法进行结构解析和修正解析了化合物1的结构。修正完成后根据已知绝对构型的手性酸分子1-2的已知绝对构型，确定了目的化合物1-1的绝对构型，通过本发明方法测定所得的绝对构型与市购样品的已知手性完全一致。其结构见图4。
实施例二：本实施例所用的手性盐为2，其中待测的手性样品为2-1，已知绝对构型的手性酸/碱为2-2。
(1)手性盐晶体的获得方法
待测的手性样品与已知绝对构型的手性酸/碱的成盐方法如下：将200mg手性化合物2-1溶于1ml甲醇中，按照1:1(V/V)分别加入不同种类溶于甲醇中的手性酸(0.2mmol)，超声混合后，静置等待自然蒸发析出。其中尝试的手性酸包括：L-酒石酸、D-酒石酸、L-二苯甲酰酒石酸、D-二苯甲酰酒石酸、L-扁桃酸、D-扁桃酸、L-樟脑磺酸、D-樟脑磺酸，最后2-1与D-酒石酸(2-2)形成了较好的盐，其成盐方程式如下：
Figure BDA0003320758310000111
(2)数据收集及结构解析
用载网蘸取样品，然后轻轻抖动载网去除结合不牢固的样品颗粒。将粘有样品载网放在样品杆中，缓慢插入电镜中并加入液氮。待电镜真空系统及样品杆稳定后，测试了多颗晶体的衍射情况，大多数晶体的分辨率约为
Figure BDA0003320758310000112
不足以解析结构。为了提高样品晶体的衍射能力，在样品中加入正己烷，用超声仪器对样品进行超声处理，移吸取3μl样品悬浊液滴加到载网上，室温通风晾干载网，然后载网放在样品杆中，缓慢插入电镜中并加入液氮。待电镜真空系统及样品杆稳定后，打开电镜光源观察样品分布情况，样品在Grid上的分布均匀且形态大小不同。而且通过改变超声的时间可以明显提高样品在Grid上的分布情况(如图5所示)。测试不同大小和形态的晶体颗粒约50颗，其中大多数晶体有较好的衍射，分辨率约
Figure BDA0003320758310000113
然后按照上述电子衍射数据收集和处理的方法，样品台以每秒1度的转速进行数据收集。最终收集并处理了34套衍射数据，选择其中最好的5套进行合并得到最终的衍射数据，并通过dual space法和最小二乘法解析了化合物2的结构。修正完成后根据化合物2-2的已知绝对构型，确定了目的化合物2-1的绝对构型，通过本发明方法测定所得的绝对构型与市购样品的已知手性完全一致(如图6所示)。
本实施例通过将手性盐晶体样品与有机溶剂混合后通过超声破碎的方式增加测试时有效晶体的数量(如图5所示)。
实施例三：本实施例所用的手性盐为3，其中待测的手性样品为3-1，已知绝对构型的手性酸/碱为3-2。
(1)手性盐晶体的获得方法
待测的手性样品与已知绝对构型的手性酸/碱的成盐方法如下：将1ml浓度为1M的3-1溶液，分别与1ml不同的浓度均为1M的手性酸溶剂混合，参见下表1：
表1：
Figure BDA0003320758310000121
Figure BDA0003320758310000131
“-”表示因手性酸或碱溶解度不够而未实施实验。
超声1分钟后过夜，都未析出固体，然后在0度冷却放置1小时后，只有乙醇/L-酒石酸和乙醇/L-二苯甲酰酒石酸两个配对析出固体。经过晶体挑选，选择乙醇/L-酒石酸(3-2)送样分析，成盐方程式如下：
Figure BDA0003320758310000132
(2)数据收集及结构解析
该固体为颗粒粉末，在进行MicroED检测前对样品进行研磨处理。具体处理方式为：选用两个盖玻片，将样品放在两个盖玻片之间轻轻研磨，将大块儿的样品颗粒研磨成细碎颗粒。按照上述晶体衍射测试的方法，用载网蘸取样品，然后轻轻抖动载网去除结合不牢固的样品颗粒。将粘有样品载网放在样品杆中，缓慢插入电镜中并加入液氮。待电镜真空系统及样品杆稳定后，打开电镜光源观察样品分布情况，样品在Grid上的分布均匀且形态大小不同。测试不同大小和形态的晶体颗粒约30颗，其中大多数晶体有较好的衍射，分辨率约
Figure BDA0003320758310000133
因为样品辐射损伤非常严重，所以通过调节gun lenz降低了电子束的强度，并使样品台以每秒2度的转速进行数据收集。最终收集并处理了27套衍射数据，选择其中最好的5套进行合并得到最终的衍射数据，并通过dual space法和最小二乘法进行结构解析和修正解析了化合物3的结构。修正完成后根据手性酸分子的3-2已知绝对构型，确定认了目的化合物3-2的绝对构型，通过本发明方法测定所得的绝对构型与市购样品的已知手性完全一致，结构如图7所示。
本实施例通过降低衍射的电子剂量参数和和增加样品转动速度的方式，解决了辐射损伤导致的数据收集不足的问题。
实施例四：本实施例所用的手性盐为4，其中待测的手性样品为4-1，已知绝对构型的手性酸/碱为4-2。
(1)手性盐晶体的获得方法
待测的手性样品与已知绝对构型的手性酸/碱的成盐方法如下：将0.5ml的浓度为4M的4-1溶液与0.5ml不同种类的同样溶剂的手性酸(4M)混合，混合后晶体析出情况如下表2：
表2：
手性酸/溶剂 水 甲醇
D-酒石酸 无析出 立即析出
L-酒石酸 放置后析出送检 立即析出
D-二苯甲酰酒石酸 - 放置后析出
L-二苯甲酰酒石酸 - 立即析出
R-扁桃酸 - 无析出
S-扁桃酸 - 无析出
R-O-乙酰扁桃酸 - 无析出
S-O-乙酰扁桃酸 - 无析出
D-樟脑磺酸 - 无析出
L-樟脑磺酸 - 无析出
D-苹果酸 放置后析出 无析出
L-苹果酸 无析出 无析出
“-”表示因手性酸或碱溶解度不够而未实施实验。
可以看出，部分立即析出固体，将混合溶液超声30秒，放置30min后又有部分析出固体。选择固体形态较好的在水溶液中与L-酒石酸(4-2)形成盐的化合物进行MicroED检测，成盐方程式如下：
Figure BDA0003320758310000151
(2)数据收集及结构解析
该固体为颗粒粉末，在进行MicroED检测前对样品进行研磨处理。具体处理方式为：选用两个盖玻片，将样品放在两个盖玻片之间轻轻研磨，将大块儿的样品颗粒研磨成细碎颗粒。按照上述晶体衍射测试的方法，用载网蘸取样品，然后轻轻抖动载网去除结合不牢固的样品颗粒。将粘有样品载网放在样品杆中，缓慢插入电镜中并加入液氮。待电镜真空系统及样品杆稳定后，打开电镜光源观察样品分布情况，样品在Grid上的分布均匀且形态大小不同。测试不同大小和形态的晶体颗粒约30颗，其中大多数晶体有较好的衍射，分辨率约
Figure BDA0003320758310000152
因为样品辐射损伤非常严重，所以通过调节gun lenz降低了电子束的强度，并使样品台以每秒2度的转速进行数据收集。最终收集并处理了15套衍射数据，选择其中最好的4套进行合并得到最终的衍射数据，并通过dual space法和最小二乘法进行结构解析和修正解析了化合物4的结构。修正完成后根据手性酸分子4-2的已知绝对构型，确认了目的化合物4-1的绝对构型，通过本发明方法测定所得的绝对构型与市购样品的已知手性完全一致，结构见(图8)。
实施例五：本实施例所用的手性盐为5，其中待测的手性样品为5-1，已知绝对构型的手性酸/碱为5-2。
(1)手性盐晶体的获得方法
待测的手性样品与已知绝对构型的手性酸/碱的成盐方法如下：将450mg化合物5-1加入到等摩尔量的L-酒石酸(5-2)的75％乙醇溶液(1M)中，保持搅拌，加完后溶液变为澄清，又立即析出大量固体，继续搅拌过夜后过滤干燥，送样分析。成盐方程式如下：
Figure BDA0003320758310000161
(2)数据收集及结构解析
该固体为颗粒粉末，在进行MicroED检测前对样品进行研磨处理。具体处理方式为：选用两个盖玻片，将样品放在两个盖玻片之间轻轻研磨，将大块儿的样品颗粒研磨成细碎颗粒。按照上述晶体衍射测试的方法，用载网蘸取样品，然后轻轻抖动载网去除结合不牢固的样品颗粒。将粘有样品载网放在样品杆中，缓慢插入电镜中并加入液氮。待电镜真空系统及样品杆稳定后，打开电镜光源观察样品分布情况，样品在Grid上的分布均匀且形态大小不同。测试不同大小和形态的晶体颗粒约30颗，其中大多数晶体有较好的衍射，分辨率约
Figure BDA0003320758310000162
然后按照上述电子衍射数据收集和处理的方法，样品台以每秒1度的转速进行数据收集。最终收集并处理了10套衍射数据，选择其中最好的9套进行合并得到最终的衍射数据，并通过dual space法和最小二乘法进行结构解析和修正解析了化合物5的结构。修正完成后根据手性酸分子5-2的已知绝对构型，确定了目的化合物5-1的绝对构型，通过本发明方法测定所得的绝对构型与市购样品的已知手性完全一致，结构如图9所示。
实施例六：本实施例所用的手性盐为6，其中待测的手性样品为6-1，已知绝对构型的手性酸/碱为6-2。
(1)手性盐晶体的获得方法
待测的手性样品与已知绝对构型的手性酸/碱的成盐方法如下：将化合物6-1(1mmol)加入到L-酒石酸(6-2)的甲醇溶液(0.5ml，2M)中，保持搅拌。反应明显放热，然后溶液变为澄清，接着立即析出固体，搅拌过夜后过滤干燥，送样分析。成盐方程式如下：
Figure BDA0003320758310000171
(2)数据收集及结构解析
该固体为颗粒粉末，在进行MicroED检测前对样品进行研磨处理。具体处理方式为：选用两个盖玻片，将样品放在两个盖玻片之间轻轻研磨，将大块儿的样品颗粒研磨成细碎颗粒。按照上述晶体衍射测试的方法，用载网蘸取样品，然后轻轻抖动载网去除结合不牢固的样品颗粒。将粘有样品载网放在样品杆中，缓慢插入电镜中并加入液氮。待电镜真空系统及样品杆稳定后，打开电镜光源观察样品分布情况，样品在Grid上的分布均匀且形态大小不同。测试不同大小和形态的晶体颗粒约30颗，其中大多数晶体有较好的衍射，分辨率约
Figure BDA0003320758310000172
然后按照上述电子衍射数据收集和处理的方法，样品台以每秒1度的转速进行数据收集。最终收集并处理了15套衍射数据，选择其中最好的8套进行合并得到最终的衍射数据，并通过dual space法和最小二乘法进行结构解析和修正解析了化合物6的结构。修正完成后根据手性酸分子6-2的已知绝对构型，确定了目的化合物6-1的绝对构型，通过本发明方法测定所得的绝对构型与市购样品的已知手性完全一致，结构如图10所示。
实施例七：本实施例所用的手性盐为7，其中待测的手性样品为7-1，已知绝对构型的手性酸/碱为7-2。
(1)手性盐晶体的获得方法
待测的手性样品与已知绝对构型的手性酸/碱的成盐方法如下：将化合物7-1分别配成甲醇、乙醇、丙酮溶液，加入等摩尔量的N-乙酰-L-谷氨酸(7-2)，搅拌过夜，结果如下表。
Figure BDA0003320758310000181
选择乙醇(2M)条件析出的固体过滤干燥，送样分析。成盐方程式如下：
Figure BDA0003320758310000182
(2)数据收集及结构解析
该固体为颗粒粉末，在进行MicroED检测前对样品进行研磨处理。具体处理方式为：选用两个盖玻片，将样品放在两个盖玻片之间轻轻研磨，将大块儿的样品颗粒研磨成细碎颗粒。按照上述晶体衍射测试的方法，用载网蘸取样品，然后轻轻抖动载网去除结合不牢固的样品颗粒。将粘有样品载网放在样品杆中，缓慢插入电镜中并加入液氮。待电镜真空系统及样品杆稳定后，打开电镜光源观察样品分布情况，样品在Grid上的分布均匀且形态大小不同。测试不同大小和形态的晶体颗粒约80颗，其中大多数晶体有较好的衍射，分辨率约
Figure BDA0003320758310000192
然后按照上述电子衍射数据收集和处理的方法，样品台以每秒1度的转速进行数据收集。最终收集并处理了52套衍射数据，选择其中最好的20套进行合并得到最终的衍射数据，并通过dual space法和最小二乘法进行结构解析和修正解析了化合物7的结构。修正完成后根据手性酸分子7-2的已知绝对构型，确定了目的化合物7-1的绝对构型，通过本发明方法测定所得的绝对构型与市购样品的已知手性完全一致，结构如图11所示。
实施例八：本实施例所用的手性盐为8，其中待测的手性样品为8-1，已知绝对构型的手性酸/碱为8-2。
(1)手性盐晶体的获得方法
待测的手性样品与已知绝对构型的手性酸/碱的成盐方法如下：将手性酸8-1的乙醇溶液(10ml，1M)与L-赖氨酸的水溶液(8-2)(1.7ml，6M)混合，搅拌30分钟，得到澄清的手性盐溶液(0.855M)。成盐方程式如下：
Figure BDA0003320758310000191
取1ml盐溶液，边搅拌边滴加4ml丙酮，溶液渐渐混浊，析出固体，滴完搅拌1小时后过滤干燥，得到固体样品。同样操作，将丙酮换做乙醇，也得到固体样品。经过电镜筛选固体后，选择丙酮析出的样品进行分析。
(2)数据收集及结构解析
该固体为颗粒粉末，在进行MicroED检测前对样品进行研磨处理。具体处理方式为：选用两个盖玻片，将样品放在两个盖玻片之间轻轻研磨，将大块儿的样品颗粒研磨成细碎颗粒。按照上述晶体衍射测试的方法，用载网蘸取样品，然后轻轻抖动载网去除结合不牢固的样品颗粒。将粘有样品载网放在样品杆中，缓慢插入电镜中并加入液氮。待电镜真空系统及样品杆稳定后，打开电镜光源观察样品分布情况，样品在Grid上的分布均匀且形态大小不同。测试不同大小和形态的晶体颗粒约30颗，其中大多数晶体有较好的衍射，分辨率约
Figure BDA0003320758310000201
然后按照上述电子衍射数据收集和处理的方法，样品台以每秒1度的转速进行数据收集。最终收集并处理了12套衍射数据，选择其中最好的6套进行合并得到最终的衍射数据，并通过dual space法和最小二乘法进行结构解析和修正解析了化合物8的结构。修正完成后根据手性碱分子8-2的已知绝对构型，确定了目的化合物8-1的绝对构型，通过本发明方法测定所得的绝对构型与市购样品的已知手性完全一致，结构如图12所示。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种使用MicroED技术测定手性样品结构和绝对构型的方法，其特征在于，步骤包括：
步骤一、将等摩尔量的待测定手性样品与已知绝对构型的手性酸/碱混合，经处理使手性样品和手性酸/碱溶解形成盐溶液，通过自然析出或经干预析出晶体的方式得到待测定手性样品和已知手性酸/碱的手性盐晶体；
步骤二、利用微晶电子衍射MicroED技术，获取手性盐晶体的衍射图谱，根据衍射图谱解析手性盐晶体的结构，然后根据手性酸/碱的已知手性，鉴定出未知手性样品的绝对构型。
2.根据权利要求1所述的一种使用MicroED技术测定手性样品结构和绝对构型的方法，其特征在于，所述手性样品为纯手性样品。
3.根据权利要求1所述的一种使用MicroED技术测定手性样品结构和绝对构型的方法，其特征在于，所述已知绝对构型的手性酸/碱为纯手性样品，且该已知绝对构型的手性酸/碱是通过手性样品在不同溶剂中溶解度试验筛选出的能成盐的手性酸/碱。
4.根据权利要求3所述的一种使用MicroED技术测定手性样品结构和绝对构型的方法，其特征在于，所述已知绝对构型的手性酸/碱中用于与手性样品碱成盐的手性酸分子包括D-酒石酸、L-酒石酸、D-二苯甲酰酒石酸、L-二苯甲酰酒石酸、R-扁桃酸、S-扁桃酸、R-O-乙酰扁桃酸、S-O-乙酰扁桃酸、D-樟脑磺酸、L-樟脑磺酸、D-苹果酸、L-苹果酸、N-乙酰-L-谷氨酸、N-乙酰-D-谷氨酸、S-2-(2，5-二硝基苯甲酰胺)-2-苯乙酸、R-2-(2，5-二硝基苯甲酰胺)-2-苯乙酸中的一种或多种，用于与手性样品酸成盐的手性碱分子包括L-赖氨酸、D-赖氨酸、(R)-(+)-1-苯基乙胺、(S)-(-)-1-苯基乙胺、(+)-鹰爪豆碱、(-)-鹰爪豆碱中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的一种使用MicroED技术测定手性样品结构和绝对构型的方法，其特征在于，步骤一中所述处理具体为搅拌、超声和/或加热。
6.根据权利要求1所述的一种使用MicroED技术测定手性样品结构和绝对构型的方法，其特征在于，步骤一中所述干预析出具体为蒸发结晶、冷却结晶和/或溶析结晶；
其中，所述蒸发结晶指的是通过自然蒸发或旋转蒸发仪减压浓缩以析出晶体，所述冷却结晶指的是将盐溶液降温至0℃或以下来析出晶体，所述溶析结晶指的是向盐溶液中滴加适量的良溶剂/不良溶剂使其析出晶体。
7.根据权利要求6所述的一种使用MicroED技术测定手性样品结构和绝对构型的方法，其特征在于，所述良溶剂/不良溶剂包括水、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、异丙醇、丙醇、正己烷、正戊烷、乙醚、异丙醚、甲基叔丁基醚、乙二醇二甲醚、1，4-二氧六环、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的一种使用MicroED技术测定手性样品结构和绝对构型的方法，其特征在于，在进行步骤二前，通过研磨或加入有机溶剂形成悬浊液后超声的方式对手性盐晶体进行处理。
9.根据权利要求1所述的一种使用MicroED技术测定手性样品结构和绝对构型的方法，其特征在于，步骤二的具体操作包括：冷冻电镜检测手性盐晶体的衍射情况，收集手性盐晶体的电子衍射数据，衍射数据处理和手性盐晶体结构解析，根据已知手性酸/碱指认手性样品的绝对构型。
10.根据权利要求9所述的一种使用MicroED技术测定手性样品结构和绝对构型的方法，其特征在于，在数据收集过程中，通过调整数据收集的电子计量参数提高有效照片数量、提高衍射分辨率，所述电子计量参数包括Gun lens、Spotsize、曝光时间、样品台转速。
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